CN116194150A - 靶向egfr和muc1的双特异性抗体-药物缀合物及其用途 - Google Patents

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R·亨宁森
S·周
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Abstract

提供了免疫缀合物及其药物组合物，所述免疫缀合物包含通过可切割接头缀合至基于哈米特林的部分的双特异性抗‑MUC1/EGFR抗体。还提供了使用这样的免疫缀合物和药物组合物治疗癌症的方法。

Description

靶向EGFR和MUC1的双特异性抗体-药物缀合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月3日提交的美国临时专利申请号63/034,296的权益和优先权，其整个内容特此通过引用整体并入用于所有目的。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交，且特此通过引用整体并入。所述ASCII副本(创建于2021年6月1日)命名为EMD-016WO_Sequence_Listing.txt，且大小为38千字节。
技术领域
本发明的领域是分子生物学、免疫学和肿瘤学。更具体地，该领域是治疗性抗体-药物缀合物。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR；也被称作ErbB1)是在若干种上皮癌中过表达的跨膜蛋白。一些EGFR突变(包括缺失突变、点突变、插入突变和基因扩增)已经与癌症相关联。一些EGFR突变以及EGFR过表达与不良预后和/或对靶向EGFR抑制剂和其它受体酪氨酸激酶抑制剂的耐药性相关联。最近已经报道了导致从抗-EGFR疗法逃逸的若干种新途径，突出了抗-EGFR疗法的挑战。
此外，EGFR基本上在全身的正常组织中表达。因此，靶向EGFR的抗体疗法可能导致不希望的脱靶效应和增强的毒性。
尽管迄今为止做出了努力，但仍然需要改进的抗癌疗法。
发明内容
本公开内容提供了新颖的双特异性抗体-药物缀合物，其解决了用一些抗-EGFR治疗剂观察到的效力缺乏和肿瘤选择性缺乏。
一方面，提供了免疫缀合物，其包含：(a)结合EGFR和MUC1的双特异性抗体和(b)多个哈米特林(hemiasterlin)部分。双特异性抗体包含：(i)第一多肽，其包含第一工程化Fc结构域和单链Fv(scFv)，其中scFv结合MUC1，(ii)第二多肽，其包含第二工程化Fc结构域和Fab片段的重链，和(iii)第三多肽，其包含Fab片段的轻链；其中第二和第三多肽链一起限定结合EGFR的Fab片段。第一多肽和第二多肽通过在第一工程化Fc结构域和第二工程化Fc结构域之间形成的一个或多个二硫键共价地连接。第二多肽和第三多肽通过在第二多肽的重链和第三多肽的轻链之间形成的一个或多个二硫键共价地连接。免疫缀合物还包含(b)多个哈米特林部分，例如，四个哈米特林部分。第一多肽和第二多肽各自包含至少一个非天然氨基酸残基，且每个哈米特林部分独立地通过接头缀合至第一多肽或第二多肽的非天然氨基酸残基之一。
在某些实施方案中，第一工程化Fc结构域不同于第二工程化Fc结构域。例如，第一和第二工程化Fc结构域各自包含链交换工程化结构域，其可以例如包含人IgA和IgG恒定重链-3(CH3)序列的交替区段(alternating segment)。
在某些实施方案中，第一工程化Fc结构域包含两个非天然氨基酸残基，例如，在根据EU索引的重链位置F241和F404处。在一些实施方案中，第一工程化Fc结构域包含不超过两个非天然氨基酸残基。
在某些实施方案中，第二工程化Fc结构域包含一个非天然氨基酸残基，例如，在根据EU索引的重链位置F241处。在一些实施方案中，第二工程化Fc结构域包含不超过一个非天然氨基酸残基。
在某些实施方案中，Fab片段包含一个非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，在第二多肽内的Fab片段的重链包含一个非天然残基，例如，在根据EU索引的重链位置Y180处。在一些实施方案中，Fab片段包含不超过一个非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，在第二多肽内的Fab片段的重链在根据EU索引的重链位置Y180处包含一个非天然氨基酸残基。
在某些实施方案中，至少一个非天然氨基酸残基中的每一个选自对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、氟代苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对丙炔氧基苯丙氨酸和对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸。在某些实施方案中，至少一个非天然氨基酸残基中的每一个是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)。
在某些实施方案中，双特异性抗体被去糖基化。
在某些实施方案中，第一多肽包含互补性决定区(CDR)：
CDR-L1，其包含在SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列；
CDR-L2，其包含在SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列；和
CDR-L3，其包含在SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一多肽包含互补性决定区(CDR)：
CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，
CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，和
CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一多肽包含互补性决定区(CDR)：
(a)(i)CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列；或
(b)(i)CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一多肽包含：(a)重链可变(VH)区域，其包含在SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列；和(b)轻链可变(VL)区域，其包含在SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一多肽包含互补性决定区(CDR)：
(a)(i)CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列；或
(b)(i)CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一多肽包含：
(a)重链可变(VH)区域，其包含在SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列；和(b)轻链可变(VL)区域，其包含在SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二多肽包含互补性决定区(CDR)：
CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，
CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列，和
CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列，
在某些实施方案中，第三多肽包含互补性决定区(CDR)：
CDR-L1，其包含在SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列，
CDR-L2，其包含在SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，和
CDR-L3，其包含在SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一多肽的氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少99％同一性。在一些实施方案中，第一多肽具有在SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二多肽的氨基酸序列与在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少99％同一性。在一些实施方案中，第二多肽具有在SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，第三多肽的氨基酸序列与在SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少99％同一性。在一些实施方案中，第三多肽具有在SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，接头是可切割的接头，例如，缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲醇(PABA)。
在某些实施方案中，哈米特林部分是哈米特林衍生物，例如，3-氨基苯基-哈米特林。
在某些实施方案中，免疫缀合物包含以下结构：
Figure BDA0004113529250000041
其中n是4。
在某些实施方案中，提供了免疫缀合物，其包含：
(a)结合EGFR和MUC1的双特异性抗体，双特异性抗体包含：
(i)第一多肽，其包含第一工程化Fc结构域和单链Fv片段(scFv)，其中scFv结合MUC1，第一多肽链包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，其在根据EU索引的重链位置F241和F404处包含非天然氨基酸残基，
(ii)第二多肽，其包含第二工程化Fc结构域和Fab片段的重链，第二多肽包含SEQID NO:12的氨基酸序列，其在根据EU索引的位置Y180和F241处包含非天然氨基酸残基，和
(iii)第三多肽，其包含Fab片段的轻链，第三多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
其中第二和第三多肽链一起限定结合EGFR的Fab片段，
其中第一多肽和第二多肽通过在第一工程化Fc结构域和第二工程化Fc结构域之间形成的一个或多个二硫键共价地连接，且
其中第二多肽和第三多肽通过在第二多肽的重链和第三多肽的轻链之间形成的一个或多个二硫键共价地连接；和
(b)多个3-氨基苯基哈米特林部分，各自独立地通过可切割的缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲醇接头缀合至非天然氨基酸残基之一。
在某些实施方案中，免疫缀合物包含四个3-氨基苯基哈米特林部分。在某些实施方案中，每个非天然氨基酸是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)。
另一方面，提供了药物组合物，其包含本文中公开的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
另一方面，提供了治疗癌症的方法，其包含以下步骤：将治疗有效量的本文中公开的免疫缀合物或药物组合物施用给有此需要的哺乳动物受试者，例如，人哺乳动物受试者和/或被诊断为患有癌症的受试者。
在某些实施方案中，癌症包含实体瘤。例如，癌症可以选自乳腺癌、肺癌、食管癌、头颈癌、子宫颈癌、卵巢癌和胃癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌，例如三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)，诸如包含腺癌和/或鳞状细胞癌的NSCLC。在一些实施方案中，癌症是食管癌，例如鳞状食管癌。在一些实施方案中，癌症是头颈癌，例如头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是子宫颈癌。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是胃癌。在一些实施方案中，癌症是间皮瘤。在一些实施方案中，实体瘤是转移性的。
在某些实施方案中，癌症包含非实体瘤，例如多发性骨髓瘤。
在某些实施方案中，癌症包含EGFR野生型的细胞。例如，癌症可以主要包含EGFR野生型的细胞。在某些实施方案中，癌症包含EGFR突变型的细胞。例如，癌症可以主要包含EGFR突变型的细胞。在某些实施方案中，癌症包含表达高水平的EGFR的细胞。例如，癌症可以主要包含表达高水平的EGFR的细胞。在某些实施方案中，癌症包含表达低或中水平的EGFR的细胞。例如，癌症可以主要包含表达低或中水平的EGFR的细胞。在某些实施方案中，癌症包含表达高水平的MUC1的细胞。例如，癌症可以主要包含表达高水平的MUC1的细胞。在某些实施方案中，癌症包含表达低或中水平的MUC1的细胞。例如，癌症可以主要包含表达低或中水平的MUC1的细胞。
在某些实施方案中，给哺乳动物受试者施用免疫缀合物的步骤包含通过全身途径(例如，静脉内途径或皮下途径)施用。
视情况而定，在将免疫缀合物施用给哺乳动物受试者以后，肿瘤生长相对于参照水平降低。例如，在向哺乳动物受试者施用免疫缀合物以后，肿瘤生长可以部分地或完全地消退。
在某些实施方案中，施用步骤包含施用至少两剂免疫缀合物，其中至少两剂共同构成治疗有效量。在某些实施方案中，施用步骤包含施用构成治疗有效量的单剂量的免疫缀合物。
在前述实施方案中的任一个中，第一多肽的scFv可以结合MUC1表位，其序列包含TRPAP(SEQ ID NO:27)。
附图说明
图1A显示了SC239的结构，SC239是用于合成分子1(本公开内容的双特异性抗-MUC1/EGFR抗体-药物缀合物)的接头-药物分子。SC239包含DBCO基团、Val-Cit-PABA可切割接头和3-氨基苯基-哈米特林。图1B显示了描绘本公开内容的一种示例性抗体-药物缀合物的结构的示意图。在分子1中，n(SC239部分的数目)是4。
图1C是描绘根据本公开内容的一种示例性MUC1/EGFR双特异性抗体的结构的示意图。
图2显示了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)和对照分子对具有MUC1和EGFR表达水平的各种组合的细胞的体外细胞杀死曲线。分子1是H02/hC225-SC239，即一种包含与3-氨基苯基-哈米特林缀合的双特异性抗-MUC1/EGFR抗体的ADC。分子2、3和4是具有在分子1中使用的相同药物、药物/抗体比率(大约4)和接头的单特异性ADC。分子2是1992-H02-SC239，即一种抗-MUC1 ADC。分子3是hC225-SC239，即一种抗-EGFR ADC。分子4是aGFP-SC239，即一种抗-GFP ADC。分子9是西妥昔单抗，即一种抗-EGFR抗体。所试验的细胞是：(1)MDA-MB-468乳腺癌细胞(MUC1+/EGFR+++)、WISH子宫颈癌细胞(MUC1+++/EGFR+)、OVCAR-3卵巢癌细胞(MUC1++/EGFR+)、HepG2肝癌细胞(MUC1+/-/EGFR+/-)和CHO-k(中国仓鼠卵巢细胞；MUC1-/EGFR-)。将所有图呈现为一式三份值的平均值±SD。
图3显示了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC分子1对Hekn细胞(原代正常人表皮角质形成细胞，新生儿)、MDA-MB-468癌细胞、OVCAR-3癌细胞和MCF-10A细胞的体外细胞杀死曲线。将所有图呈现为一式三份值的平均值±SD。
图4A和4B显示了平均荧光强度的图，所述平均荧光强度代表在两种癌细胞系中评估的pHrodoTM标记的抗体向酸性隔室(诸如溶酶体)的内化和运输。在MDA-MB-468(图4A)和OVCAR-3(图4B)细胞中评估了pHrodoTM标记的(1)H02/hC225 SEED(分子10)(一种双特异性抗-MUC1/EGFR抗体)、(2)H02 IgG1(分子11)(一种抗-MUC1抗体)、(3)西妥昔单抗(分子9)(一种抗-EGFR抗体)和(4)利妥昔单抗(对照Ab)的内化。向酸性细胞隔室中的内化由pHrodo信号的平均强度相对于测量时间点的关系表示。将所有图呈现为一式两份值的平均值±SD。
图5显示了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC分子1以及单特异性对照ADC(分子2和3；参见关于图2的描述)对不同的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的体外细胞杀死曲线。显示了n＝1-4个单独实验中的一个代表性实验。将所有图呈现为一式三份值的平均值±SD。
图6显示了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC分子1和EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)对NSCLC细胞NCI-H292(左图)和NCI-H1975(右图)的体外细胞杀死曲线。显示了n＝3-4个单独实验中的一个代表性实验。将所有图呈现为一式三份值的平均值±SD。分子1是H02/hC225-SC239，分子12是厄洛替尼，分子13是吉非替尼，分子14是阿法替尼，而分子15是奥希替尼。
图7的图解释了在CB17 SCID小鼠和Sprague-Dawley大鼠中静脉内快速推注施用5mg/kg剂量以后分子1的血浆浓度-时间概况。
图8A和8B的图解释了在两个独立研究中以不同剂量施用分子1的单次注射以后携带WISH肿瘤异种移植物的小鼠的体重变化。(图8A：研究1，用媒介物和0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.75mg/kg和1.5mg/kg剂量；图8B：研究2，用媒介物和1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg剂量)。
图9A和9B的图解释了以不同剂量施用分子1的单次注射以后在携带WISH肿瘤异种移植物的小鼠中的肿瘤生长曲线(图9A)和散点图(图9B)以及第21天的最终肿瘤大小(研究1)。
图10的图解释了以不同剂量施用分子1的单次注射以后在携带WISH肿瘤异种移植物的小鼠中的肿瘤生长曲线(研究2)。
图11的图解释了以不同剂量施用分子1的单次注射以后在携带OVCAR-3肿瘤异种移植物的小鼠中的体重变化。
图12A和12B的图解释了以不同剂量施用分子1的单次注射以后在携带OVCAR-3肿瘤异种移植物的小鼠中的肿瘤生长曲线(图12A)和散点图(图12B)以及第28天的最终肿瘤大小。
图13的图解释了以不同剂量施用分子1的单次注射以后在携带MDA-MB-468肿瘤异种移植物的小鼠中的体重变化。
图14的图解释了以不同剂量施用分子1的单次注射以后在携带MDA-MB-468肿瘤异种移植物的小鼠中的肿瘤生长曲线。
图15A和15B的图解释了以不同剂量施用分子1的单次注射以后在携带NSCLC患者衍生出的异种移植物LUX089的小鼠中的肿瘤生长曲线(图15A)和在实验过程中的动物重量(图15B)。
图16A的图解释了与施用单特异性EGFR和MUC1 ADC(分别是分子3和2，如在关于图2的描述中所述)的小鼠相比，施用双特异性ADC分子1以后在携带NSCLC患者衍生出的异种移植物的小鼠中的肿瘤生长曲线。
图16B的图解释了相同剂量的双特异性ADC分子1以及单特异性EGFR和MUC1 ADC在NSCLC患者衍生出的异种移植物模型LUX019、LUX003和LUX089中诱导的肿瘤体积变化百分比(TV％)。
图17A和17B的图解释了施用相同总剂量的8mg/kg的分子1但是使用不同的治疗计划以后，在携带NSCLC患者衍生出的异种移植物的小鼠中的肿瘤生长曲线。
图18A、18B和18C的图解释了单个8mg/kg剂量的双特异性ADC分子1在多种患者衍生出的异种移植物模型(来自NSCLC、食管鳞状细胞癌以及头颈鳞状细胞癌)中诱导的肿瘤体积变化百分比(TV％)。
图19A描绘了与H02-scFv形成复合物的MUC1肽的结构。虚线指示MUC1肽和H02-scFv之间的氢键。
图19B描绘了MUC1肽-H02-scFv相互作用的细节。虚线指示MUC1肽(复合物的顶部)和H02-scFv分子(复合物的底部)之间的氢键。
图20描绘了来自亲本抗体HT186-D11和来自在亲和力成熟期间获得的抗体的重链可变序列的序列比对(参见实施例1)。对应于Chothia互补性决定区(CDR)的氨基酸残基在黑框中标出。对应于Kabat CDR的氨基酸残基以黄色突出显示。
具体实施方式
MUC1(一种I型跨膜糖蛋白)在许多癌细胞上表达，但在正常细胞中也表现出一些表达。在肿瘤细胞中，MUC1与EGFR共定位并相互作用，并且它们的相互作用会阻断配体活化的EGFR降解。本文中公开的双特异性抗体-药物缀合物靶向MUC1和EGFR两者。通过用相同抗体靶向MUC1和EGFR两者，目前公开的免疫缀合物不仅增强抗体内化和肿瘤生长抑制或肿瘤生长的减少，它们还能够更高特异性地结合癌细胞，从而可以减少对正常细胞的影响。
目前公开的双特异性抗-MUC1/EGFR抗体-药物缀合物(ADC)对一系列癌症表现出治疗效果，癌症在组织类型、MUC1和EGFR的表达模式以及EGFR突变状态方面存在差异。此外，与单特异性ADC相比，本文中公开的双特异性抗-MUC1/EGFR ADC在各种非小细胞肺癌(NSCLC)患者衍生出的异种移植物模型中表现出优异的肿瘤生长抑制或减少。
定义
本文中使用的术语“约”、“大约”和“相当的”当在本文中参考一个值使用时，表示与在该参考值的上下文中的参考值相似的值。一般而言，熟悉上下文的本领域技术人员将理解在该上下文中被“约”、“大约”和“相当的”包括的相关变化程度。例如，在一些实施方案中，术语“约”、“大约”和“相当的”可以包括在参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小以内的范围的值。
本文中使用的“抗体”表示多肽，其氨基酸序列包括特异性地结合指定抗原或其片段的免疫球蛋白及其片段。根据本发明的抗体可以属于任何类型(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或亚型(例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本领域普通技术人员将理解，抗体的特征序列或部分可以包括在抗体的一个或多个区域(例如，可变区、高变区、恒定区、重链、轻链和它们的组合)中发现的氨基酸。此外，本领域普通技术人员将理解，抗体的特征序列或部分可以包括一条或多条多肽链，并且可以包括在相同多肽链或不同多肽链中发现的序列元件。
抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”包含完整抗体的一部分，所述部分仍然能够结合抗原。通常，这样的部分包含抗体的可变区。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残留的“Fc”片段(该名称反映了容易结晶的能力)。Fab片段由完整的轻链以及重链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面都是单价的，即它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab')2片段，它大致对应于两个具有不同抗原结合活性的二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基端处具有几个另外残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH表示其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团的Fab'。F(ab')2抗体片段最初作为Fab'片段对而产生，所述Fab'片段对在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键连接在一起的两条重链的羧基端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定，该区域也被在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别。
本文中使用的“多肽”表示通过肽键彼此附着的至少两个氨基酸的串。在一些实施方案中，多肽可以包括至少3-5个氨基酸，其中每个经由至少一个肽键附着至其它氨基酸。本领域普通技术人员将理解，多肽可以包括一个或多个“非天然”氨基酸或仍然能够整合到多肽链中的其它实体。在一些实施方案中，多肽可以被糖基化，例如，多肽可以含有一个或多个共价连接的糖部分。在一些实施方案中，单个“多肽”(例如抗体多肽)可以包含两条或更多条单独的多肽链，它们在一些情况下可以彼此连接，例如通过一个或多个二硫键或其它方式。
本文中使用的短语“参照水平”通常表示出于对比目的被认为“正常”的水平，例如适当对照的水平。例如，在肿瘤生长抑制或减少的上下文中，“参照水平”可以表示在未接受目的治疗剂的受试者中预期的肿瘤生长水平(例如，在给受试者施用目的治疗剂之前所述受试者中的肿瘤生长水平，或在未接受目的治疗剂的另一位受试者中的肿瘤生长水平)，或在接受目的治疗剂以外的治疗(例如当前的护理标准)的受试者中的肿瘤生长水平。可以同时确定或可以预先确定参照水平，例如已知或从过去的观察推断。
本文中使用的短语“治疗有效量”和“有效量”互换使用并表示有效达到期望的治疗结果所需的剂量和时间段的量。治疗有效量可能根据诸如以下因素而变化：疾病类型(例如癌症)、疾病状态、个体的年龄、性别和/或体重以及免疫缀合物(或其药物组合物)在个体中引发期望的应答的能力。有效量还可以是免疫缀合物或其药物组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益作用所超过的量。
本文中使用的“治疗”病况或病况(例如本文描述的病况，诸如癌症)的“治疗”是获得有益的或期望的结果(诸如临床结果)的方法。有益的或期望的结果可以包括但不限于：一种或多种症状或病况的缓解或改善；疾病、病症或病况的程度的减轻；疾病、病症或病况的稳定化(即没有恶化)状态；预防疾病、病症或病况(例如，原发性癌症和/或继发性转移灶)的传播；疾病、病症或病况的进展的延迟或减慢；疾病、病症或病况的改善或减轻；和缓解(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“减轻”疾病、病症或病况是指，与在没有治疗存在下的程度或时程相比，疾病、病症或病况的程度和/或不希望的临床表现减轻和/或进展的时程减慢或延长。
免疫缀合物
双特异性抗-MUC1/EGFR抗体
包含本公开内容的双特异性抗-MUC1/EGFR抗体的免疫缀合物通常包含(i)第一多肽，其包含第一工程化Fc结构域和单链Fv(scFv)，其中所述scFv结合MUC1；(ii)第二多肽，其包含第二工程化Fc结构域和Fab片段的重链，和(iii)第三多肽，其包含Fab片段的轻链，其中所述第二和第三多肽链一起限定结合EGFR的Fab片段。
本文中使用的术语“Fc结构域”表示免疫球蛋白的CH2结构域和CH3结构域。因而，两个Fc结构域的同源二聚体或异源二聚体是Fc片段。根据本公开内容使用的Fc结构域可以工程化，其含义是，它们(1)包含工程化CH3结构域(如本文中所述)和/或(2)包含一个或多个非天然氨基酸。
本文中使用的术语“scFv”根据其在本领域中的常用用法使用以表示这样的单链：其中来自抗体的VH结构域和VL结构域连接，通常通过接头。
本文中使用的术语“Fab片段”根据其在本领域中的常用用法使用。Fab片段通常包含完整轻链(VL和CL1结构域)、重链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)。
通常，第一和第二多肽各自在一个或多个预定位点处包含至少一个非天然氨基酸以用于缀合。非天然氨基酸可以位于例如Fc结构域、Fab结构域的重链或两者中。合适的非天然氨基酸的非限制性例子包括对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、氟代苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对丙炔氧基苯丙氨酸和对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(参见，例如美国专利号9,732,161)。在一些实施方案中，非天然氨基酸是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)。
在第一多肽中，工程化Fc结构域可以融合至scFv，例如，铰链区介于工程化Fc结构域的CH2结构域和scFv的VH结构域之间。在一些实施方案中，第一多肽的氨基酸序列与在SEQID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少99％同一性。例如，第一多肽的氨基酸序列可以与在SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列具有100％同一性。
在第二多肽中，工程化Fc结构域可以融合至Fab的重链，例如，铰链区介于工程化Fc结构域的CH2结构域和Fab片段的CH1结构域之间。在一些实施方案中，第二多肽的氨基酸序列与在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少99％同一性。例如，第二多肽的氨基酸序列可以与在SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列具有100％同一性。
在一些实施方案中，第三多肽的氨基酸序列与在SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少99％同一性。在一些实施方案中，第三多肽的氨基酸序列与在SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有100％同一性。
通常，第一多肽和第二多肽通过在第一工程化Fc结构域和第二工程化Fc结构域之间形成的一个或多个二硫键共价地连接。第二多肽和第三多肽还通常通过在第二多肽的重链和第三多肽的轻链之间形成的一个或多个二硫键共价地连接。
在一些实施方案中，第一多肽的scFv结合MUC1表位，其序列包含TRPAP(SEQ IDNO:27)。
在一些实施方案中，使用基于链交换工程化结构域(SEED)的CH3异源二聚体平台设计所述双特异性抗体，如例如在美国专利号8,891,912和9,505,848中所述。在该平台中，每个SEED-CH3结构域包含人IgA和IgG序列的交替区段。“AG SEED”表示在N-端末端上具有IgA1序列区段的CH3结构域，而“GA seed”表示在N-端末端上具有IgG1序列区段的CH3。SEEDbody抗体的每个Fc异源二聚体包含与GA SEED配对的AG SEED。
一旦为双特异性抗-MUC1/EGFR抗体的每条链(例如，第一多肽、第二多肽和第三多肽)设计构建体，就还可以为了在要用作缀合位点的特定位点处引入非天然氨基酸(如本文中讨论的)的目的对构建体进行诱变。可以使用本领域已知的多种表达系统中的任一种来表达这些构建体。
在一些实施方案中，使用无细胞系统生产双特异性抗-MUC1/EGFR抗体。双特异性抗-MUC1/EGFR抗体可以具有某些反映它们如何产生的特征。例如，在无细胞系统中产生的抗体可能被去糖基化并且可能缺乏效应子功能。
双特异性抗-MUC1/EGFR抗体可能任选地在进行另外的步骤(诸如缀合)之前被纯化。
哈米特林部分和分子
哈米特林是一种从海绵中分离出来的三肽，其结合微管蛋白上的长春花结合位点。因此，哈米特林可能抑制或减少微管蛋白聚合，这可以引发有丝分裂停滞和细胞凋亡。本文中使用的术语“哈米特林分子”表示哈米特林或保留哈米特林的至少一些功能(例如微管蛋白结合)的哈米特林衍生物。术语“哈米特林部分”表示已经与另一种分子缀合的哈米特林分子。在一些实施方案中，哈米特林衍生物是3-氨基苯基-哈米特林。
如本文进一步描述的，每个免疫缀合物的哈米特林部分的数目可以通过使用位点特异性的缀合方法来控制，其中哈米特林部分与插入在双特异性抗体的链内的特定位点处的非天然氨基酸缀合(参见，例如，国际专利公开WO 2019/055931)。
在一些实施方案中，每个免疫缀合物具有多个哈米特林部分，例如，2、3、4、5、6个哈米特林部分。在某些实施方案中，免疫缀合物含有四个哈米特林部分。
缀合和接头
可以使用官能化的接头-药物分子进行缀合反应，其中所述接头是可切割的接头。无铜点击化学反应可以与某些官能化的基团一起使用。在一些实施方案中，通过使双特异性抗-MUC1/EGFR抗体与SC239接头-药物分子反应而产生免疫缀合物，其结构如图1A所示。SC239包含3-氨基苯基-哈米特林和可切割的缬氨酸瓜氨酸对氨基苯甲醇(Val-Cit-PABA)接头，所述接头用二苯并环辛炔(DBCO)官能化(参见，例如，WO 2019/0055931 A1)。
缀合位点
通常，将非天然氨基酸残基在可以用于缀合一个或多个部分(例如，哈米特林部分)的位点处引入第一、第二或第三多肽中。因此，非天然氨基酸残基的位置可能对应于缀合位点。
在一些实施方案中，第一工程化Fc结构域包含两个非天然氨基酸残基，例如，在根据EU索引的重链位置F241和F404处。在一些实施方案中，第一工程化Fc结构域包含不超过两个非天然氨基酸残基。
在一些实施方案中，第一多肽上的单链scFv包含非天然氨基酸残基，例如，在重链可变结构域内在根据EU索引的位置S7、T22处或它们的组合。
在一些实施方案中，第二工程化Fc结构域包含非天然氨基酸残基，例如，在根据EU索引的重链位置F241处。在一些实施方案中，第二工程化Fc结构域包含不超过一个非天然氨基酸残基。
在一些实施方案中，Fab片段包含非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，第二多肽内的Fab片段的重链包含非天然残基，例如，在根据EU索引的重链位置S136、Y180、S190处或它们的组合。在一些实施方案中，Fab片段包含不超过一个非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，第二多肽内的Fab片段的重链在根据EU索引的重链位置Y180处包含非天然氨基酸残基。
示例性的缀合物
在某些实施方案中，免疫缀合物具有在式II中所示的结构：
Figure BDA0004113529250000141
其中n大于1。在一些实施方案中，n是至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或更大。在一些实施方案中，n是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，n是4。
药物组合物
在某些实施方案中，将提供的免疫缀合物与一种或多种药学上可接受的载体一起掺入适合施用给受试者的药物组合物中。本文中使用的“药学上可接受的载体”表示生理上相容的多种溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等中的任一种。药学上可接受的载体的例子包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种张度剂或稳定剂。这样的张度剂或稳定剂的非限制性实例包括糖(例如蔗糖)、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)和氯化钠。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种填充剂和/或冻干保护剂(例如甘露醇或甘氨酸)、缓冲剂(例如磷酸盐、乙酸盐或组氨酸缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨酯)、抗氧化剂(例如甲硫氨酸)和/或金属离子或螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂(例如苯甲醇)或缓冲剂，其可以提高本文公开的免疫缀合物的贮存期限和/或有效性。
可以以多种形式中的任一种提供药物组合物。这些包括，例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如可注射的和可输注的溶液)、分散体或混悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。某些形式的适合性可能取决于预期的施用模式和治疗用途。
在一些实施方案中，药物组合物是可注射或可输注溶液的形式。
药物组合物在制造、运输和储存的条件下通常是无菌的和稳定的。药物组合物可以配制为例如溶液、微乳剂、分散体、脂质体或其它有序结构。在一些实施方案中，药物组合物被配制为特别适合于高药物浓度的结构。例如，可以如下制备无菌可注射溶液：将所需量的治疗剂(例如免疫缀合物)与本文列举的一种成分或多种成分的组合一起掺入适当的溶剂中，任选地随后灭菌(例如过滤灭菌)。通常，可以如下制备分散体：将免疫缀合物掺入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和其它成分，诸如本文提及的那些另外成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法的实例包括真空干燥和冷冻干燥以产生免疫缀合物和任何另外期望成分(例如来自其先前无菌过滤溶液)的粉末。
可以维持溶液的适当流动性，例如，通过使用包衣诸如卵磷脂，通过维持特定颗粒大小(例如，在分散体的情况下)，和/或通过使用表面活性剂。可以实现可注射组合物的延长吸收，例如，通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和/或明胶)。
治疗方法
本文中公开的治疗癌症的方法通常包含将治疗有效量的本公开内容的免疫缀合物(或其药物组合物)施用给有需要的哺乳动物受试者(例如，人受试者)的步骤。在一些实施方案中，受试者被诊断为患有癌症。
可以通过单剂量或通过多剂量(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个剂量)施用治疗有效量。当通过多剂量施用时，可以使用多种合适的治疗方案中的任一种，包括定期施用(例如，每隔一天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次等)。
在治疗方法中有效的剂量方案(例如，每种治疗剂的量、疗法的相对时机等)可能取决于疾病或病况的严重程度以及受试者的体重和一般状态。例如，普通技术人员可以在考虑哺乳动物的年龄、体重和状况的个体差异的情况下确定应用于哺乳动物(例如人类)的包含治疗剂的特定组合物的治疗有效量。治疗上有效的和/或最佳的量也可以由本领域技术人员凭经验确定。在一些实施方案中，给受试者施用每3天0.4mg/kg至每3天20mg/kg的剂量。可以通过多种合适途径中的任一种施用免疫缀合物及其药物组合物，包括但不限于全身途径诸如胃肠外(例如，静脉内或皮下)或肠内途径。
在某些实施方案中，受试者被诊断患有癌症。
癌症
在一些实施方案中，癌症包含实体瘤。例如，癌症可以选自腺癌、肺癌、食管癌、头颈癌、子宫颈癌、卵巢癌和胃癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌，例如，三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌，例如，非小细胞肺癌(NSCLC)，诸如包含腺癌和/或鳞状细胞癌的NSCLC。在一些实施方案中，癌症是食管癌，例如，鳞状食管癌。在一些实施方案中，癌症是头颈癌，例如，头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是子宫颈癌。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是胃癌。在一些实施方案中，癌症是间皮瘤。在一些实施方案中，实体瘤是转移性的。
在一些实施方案中，癌症包含非实体瘤，例如，多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，癌症包含在基因型上为EGFR野生型的细胞。
在一些实施方案中，癌症包含表达EGFR的突变形式的细胞。与癌症有关的EGFR突变的实例包括但不限于缺失突变(例如外显子19缺失)、点突变(例如L858R突变)、插入突变(例如外显子20插入)和基因扩增。一些EGFR突变造成改变的EGFR表达水平，例如EGFR的过表达。一些EGFR突变与不良预后和/或对靶向EGFR抑制剂的耐药性有关。
在一些实施方案中，癌症包含在基因型上为MUC1野生型的细胞。
在一些实施方案中，癌症包含表达MUC1的突变形式的细胞。与癌症有关的MUC1突变的实例包括但不限于点突变(例如T112P)。一些MUC1突变造成改变的MUC1表达水平，例如MUC1的过表达，这已经与一些癌症的不良预后有关。
癌细胞可以被表征为具有低/中或高水平的EGFR表达，以及低/中或高水平的MUC1表达(例如，低/中水平的EGFR和低/中水平的MUC1；高水平的EGFR和低/中水平的MUC1；低/中水平的EGFR和高水平的MUC1；和高水平的EGFR和高水平的MUC1)。对应于基因产物的低、中或高水平(包括过表达)的数值水平可能随特定基因产物而变化，并且可以通过多种方式中的任一种进行评估，诸如评估表面表达(例如，通过FACS的细胞表面染色)、蛋白表达(通过IHC)、转录物水平(例如，通过RNASeq或qPCR)等。
在一些实施方案中，表达“高水平的MUC1”的癌细胞是以特定水平表达MUC1的癌细胞，所述特定水平的特征在于以下一项或多项：(1)超过200的中位荧光强度(MFI)比率(MFI抗-MUC1抗体/MFI同种型)(例如，如通过FACS所确定的，例如，如在实施例7中所述)；(2)与在WISH细胞的标准细胞培养条件下培养的WISH(子宫颈癌)细胞所表达的水平相当的或比其更高；和(3)比在OVCAR-3细胞的标准细胞培养条件下培养的OVCAR-3(卵巢癌)细胞所表达的水平更高。
在一些实施方案中，表达“中水平的MUC1”的癌细胞是以特定水平表达MUC1的癌细胞，所述特定水平的特征在于以下一项或多项：(1)超过100但不超过200的中位荧光强度(MFI)比率(MFI抗-MUC1抗体/MFI同种型)(例如，如通过FACS所确定的，例如，如在实施例7中所述)；(2)与在OVCAR-3细胞的标准细胞培养条件下培养的OVCAR-3细胞所表达的水平相当的；和(3)(i)比在MDA-MD-468细胞的标准细胞培养条件下培养的MDA-MD-468(乳腺癌)细胞所表达的水平更高，和(ii)比在WISH细胞的标准细胞培养条件下培养的WISH细胞所表达的水平更低。
在一些实施方案中，表达“低水平的MUC1”的癌细胞是以特定水平表达MUC1的癌细胞，所述特定水平的特征在于以下一项或多项：(1)至多100的中位荧光强度(MFI)比率(MFI抗-MUC1抗体/MFI同种型)(例如，如通过FACS所确定的，例如，如在实施例7中所述)；(2)与在MDA-MD-468细胞的标准细胞培养条件下培养的MDA-MD-468细胞所表达的水平相当的或比其更低；(3)比在OVCAR-3细胞的标准细胞培养条件下培养的OVCAR-3细胞所表达的水平更低；(4)与NCI-H292(非小细胞肺癌)细胞所表达的水平相当的或比其更低；(5)与HCC827(非小细胞肺癌)细胞所表达的水平相当的或比其更低；和(6)与NCI-H1975(非小细胞肺癌)细胞所表达的水平相当的或比其更低。
在一些实施方案中，表达“高水平的EGFR”的癌细胞是以特定水平表达EGFR的癌细胞，所述特定水平的特征在于以下一项或多项：(1)超过200的中位荧光强度(MFI)比率(MFI抗-EGFR抗体/MFI同种型)(例如，如通过FACS所确定的，例如，如在实施例7中所述)；(2)与在MDA-MD-468细胞的标准细胞培养条件下培养的MDA-MD-468细胞所表达的水平相当的或比其更高；(3)与在HCC827细胞的标准细胞培养条件下培养的HCC827(非小细胞肺癌)细胞所表达的水平相当的或比其更高；和(4)比在NCI-H292细胞的标准细胞培养条件下培养的NCI-H292(非小细胞肺癌)细胞所表达的水平更高。
在一些实施方案中，表达“中水平的EGFR”的癌细胞是以特定水平表达EGFR的癌细胞，所述特定水平的特征在于以下一项或多项：(1)超过100但不超过200的中位荧光强度(MFI)比率(MFI抗-EGFR抗体/MFI同种型)(例如，如通过FACS所确定的，例如，如在实施例7中所述)；(2)与在NCI-H292细胞的标准细胞培养条件下培养的NCI-H292细胞所表达的水平相当的；(3)(i)比在WISH细胞的标准细胞培养条件下培养的WISH细胞所表达的水平更高，和(ii)比在MDA-MD-468细胞的标准细胞培养条件下培养的MDA-MD-468细胞所表达的水平更低；(4)(i)比在OVCAR-3细胞的标准细胞培养条件下培养的OVCAR-3细胞所表达的水平更高，和(ii)比在MDA-MD-468细胞的标准细胞培养条件下培养的MDA-MD-468细胞所表达的水平更低；和(5)(i)比在NCI-H1975细胞的标准细胞培养条件下培养的NCI-H1975(非小细胞肺癌)细胞所表达的水平更高，和(ii)比在HCC827细胞的标准细胞培养条件下培养的HCC827细胞所表达的水平更低。
在一些实施方案中，表达“低水平的EGFR”的癌细胞是以特定水平表达EGFR的癌细胞，所述特定水平的特征在于以下一项或多项：(1)至多100的中位荧光强度(MFI)比率(MFI抗-EGFR抗体/MFI同种型)(例如，如通过FACS所确定的，例如，如在实施例7中所述)；(2)与在WISH细胞的标准细胞培养条件下培养的WISH细胞所表达的水平相当的或比其更低；(3)与在OVCAR-3细胞的标准细胞培养条件下培养的OVCAR-3细胞所表达的水平相当的或比其更低；(4)与在NCI-H1975细胞的标准细胞培养条件下培养的NCI-H1975细胞所表达的水平相当的或比其更低；和(5)比在NCI-H292细胞的标准细胞培养条件下培养的NCI-H292细胞所表达的水平更低。
在一些实施方案中，癌症在EGFR突变状态、EGFR表达水平和MUC1表达水平中的一个或多个方面是异质的。在一些这样的异质性癌症中，癌症可以主要包含一种或另一种细胞类型(在EGFR突变状态、EGFR表达水平和/或MUC1表达水平方面)。如本文中使用的，当至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的癌症细胞属于一种细胞类型时，癌症被描述为“主要”包含该细胞类型。
在一些实施方案中，施用导致受试者中可测量的改善。例如，这种改善可以包括肿瘤生长抑制(TGI)、肿瘤生长减少、肿瘤消退、转移灶的抑制或减少、改善的存活或指示癌症状态或进展的任何临床征象的改善中的任一种或任何组合。通过措施诸如估计的或测量的肿瘤体积，可以评估肿瘤生长。在一些实施方案中，肿瘤生长抑制或减少是至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％(例如，基于相对于参照而言更低的肿瘤体积，诸如代表未接受治疗的受试者中的肿瘤体积的参照值)。在一些实施方案中，施用导致肿瘤的消退，即相对于涉及免疫缀合物的治疗方案开始时的大小，肿瘤大小或体内癌症程度的减小。这种肿瘤消退可以是部分的(即，一些肿瘤或癌症仍然存在)或完全的(例如，肿瘤体积达到大约零和/或肿瘤不再是可测量的或可检测的)。
实施例
以下具体实施例应被解释为仅仅示例性的，并且不以任何方式限制本公开内容的其余部分。
实施例1.序列优化和亲和力成熟以开发抗-MUC1 scFv序列
使用核糖体展示选择，通过抗-MUC1抗体HT186-D11的亲和力成熟来开发抗-MUC1scFv(H02)(参见Thie H.等人.PLoS One 201,6,1,e15921)。对于scFv文库，靶向CDR H1、H2、H3和L3(SEQ ID NO:4、5、6和9)。然后针对MUC的生物素化合成VNTR肽(APDTRPAPGSTAPPAC-生物素)(SEQ ID NO:10)进行scFv核糖体展示选择。
抗体变体的筛选和表征尤其基于与表达MUC1的细胞(WISH、MDA-MB-468和OVCAR-3癌细胞，用HepG2细胞作为MUC1-阴性对照)的结合(关于另外细节，参见实施例4)、与MUC1的生物素化合成VNTR肽(APDTRPAPGSTAPPAC-生物素；SEQ ID NO:10)的结合、缔合动力学、储存稳定性、以及抗体变体的药物缀合物(ADC)对MUC-1阳性细胞的细胞杀死。
使用无细胞表达系统和与SC239(一种可切割接头-哈米特林衍生物)的缀合，通过位点特异性的缀合产生ADC(关于SC239的详细信息，参见实施例3)。
图20描绘了来自亲本抗体HT186-D11和来自亲和力成熟期间获得的抗体的重链可变序列的序列比对。对应于Chothia互补性决定区(CDR)的氨基酸残基在黑框中划定。对应于Kabat CDR的氨基酸残基以灰色阴影显示。
基于这些研究，选择了抗体变体“1993-H02”(在下文中称作H02)并开发为scFv。在表1A中提供了H02序列的结合特征的总结；在表1B中提供了来自细胞杀死测定的结果的总结。
表1A:具有HT186-D11轻链的1993-H02的H02表征
Figure BDA0004113529250000201
表1B:缀合至SC239的1993-H02的ADC细胞杀死测定结果(DAR＝4)
Figure BDA0004113529250000202
NK＝没有杀死
实施例2.双特异性抗-MUC1/EGFR抗体的构建
使用基于链交换工程化结构域(SEED)的CH3异源二聚体平台(参见，例如，如在美国专利号8,891,912和9,505,848中所述)，开发了双特异性抗-MUC1/EGFR抗体。
设计了一种双特异性抗体(在下文中称作“分子10”)作为以下抗体的异源二聚体：
-与人IgG1 Fc融合的抗-MUC1 scFv(H02)(AG SEED)；和
-与人IgG1 Fc融合的抗-EGFR Fab(衍生自人源化的西妥昔单抗)(GA SEED)。
构建了表达构建体，其编码抗-MUC1 scFvFc(AG SEED)、与IgG1 Fc融合的抗-EGFRFab的重链(GA SEED)和抗-EGFR Fab的轻链。在蛋白表达和异源二聚体形成后，得到的产物是双特异性抗-MUC1/EGFR抗体(H02/hC225 SEED或“分子10”)。
出于在实施例3中描述的缀合位点优化研究的目的，使用类似的方法来构建类似的双特异性抗-MUC1/EGFR抗体(D11/hC225)。在D11/hC225中，抗-MUC1臂是基于与人IgG1Fc融合的HT186-D11 scFv(从其开发出H02的亲本序列；参见实施例1)(AG SEED)，并且抗-EGFR臂是基于与IgG1 Fc融合的人源化的西妥昔单抗(hC225)的Fab(GA seed)。
实施例3.分子1即缀合至3-氨基苯基-哈米特林的双特异性抗-MUC1/EGFR抗体 (“双特异性抗-MUC1/EGFRADC”)的合成
使用XpressCF+TM(Sutro Biopharma)无细胞表达系统和位点特异性的缀合方法(参见，例如，美国专利号9,732,161和国际专利公开号WO 2019/055931A1)产生基于在实施例1中描述的双特异性抗-MUC1/EGFR抗体H02/hC225 SEED(分子10)的抗体-药物缀合物。
对于优化缀合位点的初始实验，通过在TAG位点(琥珀终止密码子)掺入非天然氨基酸对叠氮基甲基L-苯丙氨酸(pAMF)，对D11/hC225的抗-MUC1臂(AG SEED)和D11/hC225的抗-EGFR臂的重链(GA SEED)(参见实施例1)进行诱变。为每个臂(抗-MUC1 scFvFc(AGSEED)臂或抗-EGFR Fab(重链)Fc(GA SEED)臂)生成一系列突变体，每个突变体仅掺入一个pAMF残基。使用SC239通过无铜点击化学将每个突变体臂中的pAMF残基与哈米特林衍生物缀合，其包含靶向微管蛋白的3-氨基苯基哈米特林和可切割的缬氨酸瓜氨酸对氨基苯甲醇(Val-Cit-PABA)接头，所述接头用二苯并环辛炔(DBCO)官能化(参见，例如，WO 2019/0055931 A1)。
SC239具有在式I中所示的结构：
Figure BDA0004113529250000221
将缀合的抗-MUC1 scFvFc(AG)和抗-EGFR Fab(重链)Fc(GA)臂分别在体外试验了与MUC1和EGFR的结合，以及对MDA-MB-468(人乳腺癌)细胞的杀死。还对抗-MUC1 scFvFc(AG)和抗-EGFR Fab(重链)Fc(GA)臂的组合在体外试验了与EGFR的结合、与MUC1的结合和MDA-MB-468细胞杀死。还考虑了影响可制造性的因素，诸如蛋白表达、产量和热稳定性。
基于来自缀合位点优化研究的结果，选择了以下缀合位点，所有位置根据EU索引进行编号：
-在抗-MUC1 scFv上的重链位置F404；
-在抗-MUC1 scFv上的重链位置F241；
-在抗-EGFR Fab上的重链位置F241；和
-在抗-EGFR Fab上的重链位置Y180。
使用这些缀合位点，使用在实施例2中描述的H02/hC225 SEED双特异性抗体(分子10)的序列，合成了具有式II的结构的ADC(也显示在图1B中)(n＝4)。
Figure BDA0004113529250000222
该ADC(在下文中称作“分子1”)具有大约4的药物/抗体比率且包含具有抗-MUC1scFvFc(AG SEED)、抗-EGFR Fab(重链)Fc(GA SEED)和抗-EGFR Fab(轻链)的双特异性抗体，其中H02/hC225 SEED双特异性抗体在上述缀合位点中的每一个处通过Val-Cit-PABA可切割接头缀合至3-氨基苯基-哈米特林分子。
实施例4-20使用的分子
表2总结了在实施例4-20所述的实验中使用的分子。
具体而言，分子1、2和3是抗体-药物缀合物，如实施例2中所述生成。分子10是如实施例2中所述生成的双特异性抗体。分子9和11是单特异性抗体。分子12-15是本领域已知的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(参见，例如，Hirano等人,In vitro modeling todetermine mutation specificity of EGFR tyrosine kinase inhibitors againstclinically relevant EGFR mutants in non-small-cell lung cancer.Oncotarget2015,6,38789-38803)。
表2:在实施例4-16中使用的分子
Figure BDA0004113529250000231
Figure BDA0004113529250000241
*根据EU索引编号系统。
实施例4.双特异性抗-MUC1/EGFR ADC有效地杀死体外癌细胞
为了评估双特异性抗-MUC1/EGFR ADC对癌细胞的影响，使用表达不同水平的MUC1和EGFR的各种人癌细胞进行分子1的细胞杀死测定：MDA-MD-468(乳腺癌；MUC1+/EGFR+++)、WISH(子宫颈癌；MUC1+++/EGFR+)、OVCAR-3(卵巢癌；MUC1++/EGFR+)和HepG2(肝癌；具有低的但非零的MUC1和EGFR表达)细胞。还在非癌性CHO-k(中国仓鼠卵巢；MUC1-/EGFR-)细胞上试验了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC。
方法
WISH、OVCAR-3、HepG2、MDA-MB-468和CHO-k细胞购自ATCC(美国典型培养物保藏中心)，并将细胞维持在补充了10％热灭活胎牛血清(Thermo Fisher
Figure BDA0004113529250000242
)、2mMglutamax(Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000243
)和1x青霉素/链霉素/>
Figure BDA0004113529250000244
的高葡萄糖DMEM/F12(1:1)/>
Figure BDA0004113529250000245
中。
通过细胞增殖测定测量ADC对癌细胞的细胞毒性作用。在实际测定开始前一天，将25μL体积的总共625个细胞接种到384-孔平底白色聚苯乙烯平板中。将ADC和游离药物在细胞培养基中以2倍起始浓度配制，并通过SpinX 0.22μm醋酸纤维素过滤，用2ml离心管
Figure BDA0004113529250000251
过滤。将过滤灭菌的样品在无菌条件下连续稀释(1:3)，并将25μL每种稀释液一式三份地添加给细胞。将平板在37℃在CO2培养箱中培养120小时。对于细胞生存力测量，将30μL的Cell Titer-/>
Figure BDA0004113529250000252
试剂(PromegaTMCorp,Madison,WI)添加到每个孔中，并按照产品说明书处理平板。在/>
Figure BDA0004113529250000253
平板读数器(Perkin-Elmer；Waltham,MA)上测量相对发光。使用未处理的细胞作为对照，将相对发光读数转换为生存力百分比。使用GraphPad Prism使用log(抑制剂)相对于应答、可变斜率、4参数拟合方程对数据进行非线性回归分析。将数据表示为％相对细胞生存力相对于ADC剂量(以纳摩尔为单位)的关系图，误差棒表示一式三份的标准差(SD)。
结果
在具有不同表达水平的EGFR和MUC1抗原的细胞上评价如实施例2中所述产生的双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)的细胞杀死活性。以下包含相同药物(3-氨基苯基-哈米特林)的单特异性ADC与抗-EGFR抗体一起用作对照：
-抗-MUC1 ADC(分子2)
-抗-EGFR ADC(分子3)
-商品级西妥昔单抗(抗-EGFR抗体)(分子9)
-抗-GFP ADC(分子4)。
在(表3)中将细胞杀死曲线(图2)和结果报告为IC50(曲线的中点，或观察到最大抑制的50％时的浓度)以及杀死跨度(在试验物质的最大效果水平不再存活的细胞相对于未经处理的对照的总百分比，％效力)。
表3:ADC和对照分子的IC50值和杀死跨度
Figure BDA0004113529250000254
Figure BDA0004113529250000261
DAR＝药物/抗体比率
*估计
NC＝由于稀释曲线不完整而无法计算
NK＝没有杀死
在共表达MUC1和EGFR的所有三种癌细胞系中，分子1有效地以高效力抑制细胞生存力，与MUC1和EGFR表达水平无关。
在MDA-MB-468细胞上，抗-EGFR ADC(分子3)显示出比抗-Muc1 ADC(分子2)好得多的细胞杀死(图2)，这与下述以前结果密切相关：MDA-MB-468细胞在细胞表面上具有比MUC1更高的EGFR表达。双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)的细胞杀死活性与抗-EGFR ADC(分子3)的细胞杀死活性类似(图2)，这可能是该细胞系中的EGFR高表达的反映。
在WISH细胞上，抗-EGFR ADC(分子3)未显示出细胞杀死活性，而抗-MUC1 ADC(分子2)和双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)显示出有效的细胞杀死活性(图2)，这与下述以前结果相关：WISH细胞在细胞表面上具有比EGFR更高的MUC1表达。
在OVCAR-3细胞上，抗-EGFR ADC(分子3)和双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)显示出比抗-MUC1 ADC(分子2)更有效的细胞杀死，但抗-EGFR ADC(分子3)的效力(细胞杀死跨度)(65％)低于抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)(88％)和抗-MUC1 ADC(分子2)(89％)的效力(图2)。
除了在OVCAR-3细胞上的最高浓度外，抗-GFP ADC在试验的任何细胞上均未观察到非特异性的细胞杀死活性(图2)。在CHO-k细胞上，所试验的ADC均未显示出任何细胞杀死活性(图2)。
总体来说，这些结果指示，在大多数浓度，分子1特异性地杀死表达MUC1和EGFR的癌细胞。
实施例5. 双特异性抗-MUC1/EGFR ADC对体外正常细胞的影响
为了确定双特异性抗-MUC1/EGFR ADC对正常(非癌性)细胞的影响，用分子1对HeKn细胞(原代正常人表皮角质形成细胞，新生儿)和MCF-10a细胞(非致瘤性乳腺上皮细胞)进行细胞杀死测定。为了对比，用分子1对MDA-MB-468细胞(人转移性乳腺癌)和OVCAR-3细胞进行相同的测定。
方法
在补充了10％胎牛血清(FBS)(
Figure BDA0004113529250000271
Sigma)和1mM丙酮酸钠(/>
Figure BDA0004113529250000272
Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000273
或/>
Figure BDA0004113529250000274
Sigma)的、含有稳定的300mg/L L-谷氨酰胺和2.0g/L NaHCO3(/>
Figure BDA0004113529250000275
Sigma,Billerica,MA,USA)的RPMI1640中培养MDA-MB-468细胞。
在补充了20％ FBS,1mM丙酮酸钠(
Figure BDA0004113529250000276
Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000277
或
Figure BDA0004113529250000278
Sigma),10μg/ml胰岛素(/>
Figure BDA0004113529250000279
Sigma)的、含有稳定的300mg/L L-谷氨酰胺和2.0g/L NaHCO3的RPMI1640中培养OVCAR-3细胞。
在用涂布基质涂布的烧瓶上，在包括人角质形成细胞生长补充物(HKGS)的基础EpiLifeTM培养基中培养新生儿原代人表皮角质形成细胞(HeKn)(都是
Figure BDA0004113529250000281
购自Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000282
Waltham,MA,USA)。
还培养了MCF-10A细胞，其为非致瘤性乳腺上皮细胞，并用于试验。在含有稳定的谷氨酰胺(包括10％马血清)(
Figure BDA0004113529250000283
Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000284
)和20ng表皮生长因子(EGF)(Sigma)以及500ng氢化可的松(/>
Figure BDA0004113529250000285
Sigma)的、含有稳定的谷氨酰胺和Ham氏F12(Biochrom)的1:2Dulbecco氏改良eagle氏培养基(DMEM)(/>
Figure BDA0004113529250000286
Sigma/Biochrom)中培养MCF 10A细胞。
通过细胞增殖测定来测量分子l对细胞的细胞毒性作用。用
Figure BDA0004113529250000287
D-PBS(Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000288
)洗涤细胞单层一次，并使用/>
Figure BDA0004113529250000289
(/>
Figure BDA00041135292500002810
Sigma)或/>
Figure BDA00041135292500002811
胰蛋白酶/EDTA(#R-001-100)和胰蛋白酶中和剂(/>
Figure BDA00041135292500002812
#R-002-100)脱离细胞。使用0.4％/>
Figure BDA00041135292500002813
锥虫蓝溶液(ThermoFisher/>
Figure BDA00041135292500002814
)，使用自动化细胞计数器LUNA或LUNA-FLTM(Logos Biosystems,Annandale,Virginia,USA)对活细胞进行计数。将总共2,000个细胞接种在96-孔平底细胞培养平板(Thermo Fisher/>
Figure BDA00041135292500002815
)的每孔100μl细胞培养基(Hekn或MDA-MB-468细胞)或90μl细胞培养基(OVCAR-3或MCF-10a细胞)中，将其在CO2培养箱中在37℃温育过夜。次日，对于Hekn和MDA-MB-468细胞，将培养基替换为90μl含有减小量的FBS(3％)的新鲜细胞培养基。将相同的培养基用于制备10倍起始浓度的ADC和相应的系列稀释物(1:4)。对于MCF-10a细胞或OVCAR-3细胞，没有培养基变化。使用相应的细胞培养基完成10倍起始浓度的ADC和相应的1:4系列稀释物。向各个孔提供10μlADC溶液(所有处理一式三份进行)并且将平板在37℃在CO2培养箱中培养144小时。然后，将100μl Cell Titer-/>
Figure BDA00041135292500002816
试剂(Promega Corp,Madison,WI,USA)移液到每个孔中，并根据制造商的说明书进一步处理平板以测量细胞生存力。在/>
Figure BDA00041135292500002817
Flash平板读数器或Lux平板读数器(Thermo Fisher/>
Figure BDA00041135292500002818
)上测量发光信号。在/>
Figure BDA00041135292500002819
Excel(版本16.0,/>
Figure BDA00041135292500002820
Corporation,Redmond,WA,USA)中如下处理相对发光单位的原始数据：通过减去背景值(无细胞对照，仅培养基)，和通过转换为％生存力(未经处理的对照细胞＝100％)或％作用(％生存力-100％)。通过数据转换和随后使用非线性回归分析函数的数据拟合(log(抑制剂)相对于应答变量斜率(对于MDA-MB-468细胞或Hekn细胞，三个参数；对于OVCAR-3和MCF-10a细胞，四个参数))，在Graph Pad Prism(版本8.2.0)中(/>
Figure BDA0004113529250000291
GraphPad软件,La Jolla California USA,www.graphpad.com)，获得剂量-应答曲线和IC50值。将数据表示为％作用相对于ADC浓度[nM]，误差棒指示技术一式三份的SD。
结果
双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)显示出对角质形成细胞细胞生存力和非肿瘤上皮细胞的微小影响(图3和表4)。
表4:分子1对肿瘤和非肿瘤细胞的IC50和几何平均跨度(％效力)
Figure BDA0004113529250000292
n＝3-4；NC＝IC50不可计算
*在分子1的最高试验浓度
与MDA-MB-468细胞(％作用:-99，在最高浓度)相比，分子1对Hekn(％作用:-54，在最高浓度)和对MCF-10A(％作用:-12，在最高浓度)显示出降低的细胞杀死效力。此外，与角质形成细胞(IC50:82nM)相比，分子1对MDA-MB-468癌细胞(IC50:0.05nM)显示出高了>1000倍的效能。
因而，如在图3中所示，在特定浓度范围内，分子1有效地杀死MDA-MB-468乳腺癌细胞，而对正常细胞具有微小影响。
实施例6.癌细胞对双特异性抗-MUC1/EGFR抗体的内化
方法
在体外在癌细胞系MDA-MB-468和OVCAR-3(二者购自ATCC,Manassas,VA,USA)上评价了双特异性抗-MUC1/EGFR抗体(分子10)、西妥昔单抗(抗-EGFR抗体)(分子9)和H02 IgG1(抗-MUC1抗体)(分子11)的内化。在补充了10％ FBS和1mM丙酮酸钠(
Figure BDA0004113529250000293
ThermoFisher/>
Figure BDA0004113529250000294
或/>
Figure BDA0004113529250000295
Sigma)的、含有稳定的300mg/L L-谷氨酰胺和2.0g/LNaHCO3的RPMI1640中培养MDA-MB-468细胞。在补充了20％ FBS、1mM丙酮酸钠(/>
Figure BDA0004113529250000301
Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000302
或/>
Figure BDA0004113529250000303
Sigma)、10μg/ml胰岛素(/>
Figure BDA0004113529250000304
Sigma)的、含有稳定的300mg/L L-谷氨酰胺和2.0g/L NaHCO3的RPMI1640中培养OVCAR-3细胞。对于传代培养，用/>
Figure BDA0004113529250000305
D-PBS(Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000306
)洗涤细胞单层一次，并使用
Figure BDA0004113529250000307
脱离细胞。使用0.4％/>
Figure BDA0004113529250000308
锥虫蓝溶液使用自动化细胞计数器LUNA-FLTM对活细胞进行计数。将总共6,000个MDA-MB-468细胞或10000OVCAR-3细胞接种在96-孔板(
Figure BDA0004113529250000309
NY,USA)的每孔90μl细胞培养基中。将平板在培养箱中在37℃和5％ CO2下温育过夜。次日，使用终浓度为0.5μg/ml的Hoechst33342(Thermo Fisher/>
Figure BDA00041135292500003010
)进行核染色。每孔加入10微升在PBS中制备的10倍储备溶液。将平板在培养箱中在37℃和5％ CO2下温育30分钟。然后除去培养基，并向孔中提供90μl新鲜细胞培养基。将用于试验的每种抗体与ZenonTMpHrodoTMiFL Red Human IgG标记试剂(Thermo Fisher/>
Figure BDA00041135292500003011
)一起在黑暗中温育5分钟(使用的蛋白:染料摩尔比为1:3)。每孔加入终浓度为100nM抗体的抗体-pHrodoTM混合物(进行技术一式两份)，随后在37℃和5％ CO2下温育25分钟以启动内化。在添加抗体-pHrodoTM混合物后30分钟、150分钟、390分钟、24小时和48小时进行测量。使用以下成像条件，使用共焦定量图像细胞计数器CQ1(/>
Figure BDA00041135292500003012
Electric Corporation,Tokyo，日本)对细胞进行成像：20倍物镜，405nM激光(Hoechst)，561nM激光(pHrodoTMiFLRed)。收集每孔五个z堆叠图像(z堆叠范围：20μm，切片:1μm)，并使用CQ1软件(版本1.04.02.04,Yokogawa)通过量化pHrodoTM红色信号(源自细胞核周围的特定区域)的平均强度确定向酸性细胞隔室中的内化。对于数据处理，使用了/>
Figure BDA00041135292500003013
Excel(版本16.0,
Figure BDA00041135292500003014
Corporation,Redmond,WA,USA)和Graph Pad Prism(版本8.2.0，
Figure BDA00041135292500003015
GraphPad软件,La Jolla California美国)。将内化数据显示为平均强度相对于时间[h]的关系图，误差棒指示一式两份的标准差(SD)。
结果
对于内化研究，将双特异性抗-MUC1/EGFR抗体(分子10)以及单特异性对照抗体H02 IgG1(抗-MUC1抗体)(分子11)和西妥昔单抗(抗-EGFR抗体)(分子9)用ZenonTMpHrodoTMiFL Red染料(Thermo Fisher
Figure BDA00041135292500003016
)标记，其在酸性环境中发荧光。通过使用CQ1装置的活细胞成像和通过测量pH敏感染料的平均荧光强度，在OVCAR-3和MDA-MB-468细胞中评价pHrodoTM-iFL-标记的抗体随时间向酸性细胞隔室的内化(参见图4A和4B)。
在MDA-MB-468和OVCAR-3细胞上，双特异性抗-MUC1/EGFR抗体H02/hC225(分子10)显示出向酸性隔室的快速内化和转运。分子10在48小时的温育时间内继续被内化，如由随时间增加的平均荧光强度所确定的(图4A和4B)。在两种细胞系中，用分子10获得的平均荧光强度比用单特异性对照抗体H02 IgG1(分子11)和西妥昔单抗(分子9)获得的值强的多。
实施例7.双特异性抗-MUC1/EGFR ADC杀死体外野生型和突变型EGFR癌细胞
为了确定双特异性抗-MUC1/EGFR ADC对具有不同EGFR突变状态的癌细胞的影响，使用分子1对EGFR野生型(wt)细胞、EGFR外显子缺失突变细胞和EGFR双置换突变细胞进行细胞杀死测定。
方法
NSCLC细胞NCI-H292(EGFR野生型(wt))、HCC827(EGFR缺失E746-A750)和NCI-H1975(EGFR L858R/T790M)都购自ATCC。在含有稳定的L-谷氨酰胺(
Figure BDA0004113529250000311
Sigma)、10％ FBS(/>
Figure BDA0004113529250000312
Sigma)和1mM丙酮酸钠(/>
Figure BDA0004113529250000313
Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000314
或
Figure BDA0004113529250000315
Sigma)的RPMI1640培养基中培养NCI-H292和NCI-H1975。在含有稳定的2mM L-谷氨酰胺、2.5g/L D-(+)-葡萄糖溶液(/>
Figure BDA0004113529250000316
Sigma)、10mM HEPES(/>
Figure BDA0004113529250000317
Sigma)、10％ FBS和1mM丙酮酸钠(/>
Figure BDA0004113529250000318
Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000319
或/>
Figure BDA00041135292500003110
Sigma)的RPMI1640培养基中培养HCC827细胞。
通过FACS分别使用H02 IgG1(抗-MUC1抗体)或西妥昔单抗(抗-EGFR抗体)，和通过计算中位荧光强度(MFI)比率(MFI靶标特异性抗体/MFI同种型)，评价MUC1或EGFR在NSCLC细胞上的表达水平。MFI比率至多100，表达水平被确定为+；MFI比率>100，表达水平被确定为++；或者MFI比率>200，表达水平被确定为+++。据此，NSCLC细胞的表达水平被定义为MUC1+/EGFR++(NCI-H292细胞)、MUC1+/EGFR+++(HCC827细胞)或MUC1+/EGFR+(NCI-H1975)。
对于细胞毒性试验，将细胞单层用
Figure BDA00041135292500003111
D-PBS(Thermo Fisher/>
Figure BDA00041135292500003112
)洗涤一次，并使用/>
Figure BDA00041135292500003113
(/>
Figure BDA00041135292500003114
Sigma)从细胞培养瓶脱离。使用0.4％/>
Figure BDA00041135292500003115
锥虫蓝溶液(Thermo Fisher/>
Figure BDA00041135292500003116
)使用自动化细胞计数器LUNA-FLTM(LogosBiosystems)对活细胞进行计数。将共计625个细胞(NCI-H292)、1250个细胞(NCI-H1975)或3000个细胞(HCC827)铺板到96-孔黑色/透明平底TC-处理过的成像微量培养板
Figure BDA0004113529250000321
的每孔90μl细胞培养基中并培养过夜。在即将使用前在细胞培养基中制备10倍起始浓度的ADC或化合物和相应系列稀释物(1:4)。向孔提供10μl ADC或化合物溶液。技术一式三份进行处理。随后将平板在37℃和5％ CO2下温育144小时。ADC或EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的未经处理的对照细胞分别接受相应量的稀释培养基或二甲基亚砜(DMSO；Millipore Sigma)。对于随后的细胞生存力测量，将100μl Cell Titer-/>
Figure BDA0004113529250000322
试剂(PromegaTMCorp,Madison,WI,USA)移到每个孔中，并根据制造商的说明书进一步处理平板。在/>
Figure BDA0004113529250000323
Flash平板读数器(Thermo Fisher/>
Figure BDA0004113529250000324
)上测量发光信号。在
Figure BDA0004113529250000325
Excel(版本16.0,/>
Figure BDA0004113529250000326
Corporation,Redmond,WA,USA)中如下处理相对发光单位的原始数据：通过减去背景值(无细胞对照，仅培养基)和通过计算％生存力(未经处理的对照细胞＝100％)或％作用(％生存力-100％)。通过数据转换和随后使用非线性回归分析函数的数据拟合(log(抑制剂)相对于应答变量斜率(四个参数))，在Graph PadPrism(版本8.2.0,/>
Figure BDA0004113529250000327
GraphPad软件,La Jolla California USA)中，获得剂量-应答曲线和IC50值。将数据表示为％作用相对于化合物浓度剂量[M]，误差棒指示技术一式三份的SD。
结果
在具有不同EGFR突变状态的NSCLC细胞(NCI-H292:EGFR wt；HCC827:EGFR缺失E746_A750；和NCI-H1975:EGFR L858R/T790M)上评价了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)的细胞杀死活性。将单特异性ADC抗-MUC1 ADC(分子2)和抗-EGFR ADC(分子3)用作对照分子(图5，表5)。对于NCI-H292和NCI-H1975细胞，用分子1和EGFR TKI厄洛替尼(分子12)、吉非替尼(分子13)、阿法替尼(分子14)和奥希替尼(分子15)进行另外的细胞杀死测定(图6，表6)。在若干个单独实验中将ADC或EGFR TKI的效能确定为几何平均IC50[nM]，作为观察到细胞生存力的最大抑制的50％时获得的细胞杀死曲线的平均浓度。此外，确定几何平均跨度(％)(在使用的最高试验浓度，相对于未经处理的对照细胞，被杀死的细胞的平均百分比)。几何平均跨度代表ADC或化合物在细胞生存力测定中的效力。
如在图5中所示，分子1在细胞生存力测定中显示出对NSCLC细胞的高效力和效能，与它们的MUC1和EGFR表达水平以及它们的EGFR突变状态(EGFR wt、EGFR L858R/T790M或EGFR缺失E746_A750)无关。
对于NCI-H292(EGFR wt)细胞，抗-EGFR ADC(分子3)显示出比抗-MUC1 ADC(分子2)更高的效能(图5，表5)。对分子3比对分子2更高的敏感性可能是这些细胞中更高的EGFR表达水平和相对低的MUC1表达水平的结果。根据这些结果，双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)的细胞杀死活性介于单特异性ADC(分子2和3)的细胞杀死活性之间。但是，分子1显示出比每种单特异性ADC稍微更好的效力，这可能指示协同作用。
表5.图5的几何平均IC50值[nM]和几何平均跨度(％效力)(n＝1-4)
Figure BDA0004113529250000331
DAR＝药物/抗体比率
*估计值
#1对于NCI-H292和NCI-H1975；#2对于HCC-827
双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)在亚纳摩尔范围内显示出对EGFR突变细胞HCC827(EGFR缺失E746_A750)的细胞杀死活性，具有与单特异性抗-EGFR ADC(分子3)相当的杀死跨度(％)(图5，表5)。在这些具有高表达水平的EGFR的细胞中，分子3和分子1都以相当的效能抑制细胞生存力。
在以较低水平表达两种抗原的EGFR双重突变体(L858R/T790M)NCI-H1975细胞上，抗-EGFR ADC(分子3)显示出在细胞生存力抑制方面优于抗-MUC1 ADC(分子2)的效能和高于双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)的活性(图5，表5)。但是，与分子2和分子3相比，分子1显示出90％的更好细胞杀死效力，杀死跨度分别为54％和75％。这些结果可能指示，在具有较低MUC1和EGFR表达水平的细胞上，双特异性ADC胜过单特异性ADC变体的协同活性。
图6和表6显示了使用小分子EGFR TKI进行的实验的结果。为了对比，还显示了分子1的结果。
表6.图6在最高试验浓度(n＝1-4)的几何平均IC50值[nM]和几何平均跨度(％效力)
Figure BDA0004113529250000341
/>
NC＝由于不完整稀释曲线而不可计算
所选的NSCLC细胞NCI-H292(EGFR wt)和NCI-H1975(EGFR L858R/T790M)对不同EGFR TKI的敏感性与在文献中描述的结果一致(图6，表4；参考文献：Hirano等人,In vitromodeling to determine mutation specificity ofEGFR tyrosine kinase inhibitorsagainst clinically relevant EGFR mutants in non-small-cell lung cancer,Oncotarget 2015,6,38789-38803)。与Hirano等人描述的结果一致，与其它TKI抑制剂(分子12、13、15)相比，阿法替尼(分子14)最有效地抑制野生型EGFR，而奥希替尼(分子15)(一种选择性靶向T790M耐药性突变的EGFR TKI)在NCI-H1975细胞中表现出最高的细胞杀死活性(图6，表6)。
总之，双特异性抗-MUC1/EGFR ADC(分子1)在亚纳摩尔范围内表现出对野生型和突变型EGFR细胞的效能，所述细胞特征在于MUC1和EGFR的不同表达水平。
实施例8.双特异性抗-MUC1/EGFR ADC在啮齿类动物中的药代动力学性能
在非荷瘤雌性CB17 SCID小鼠和Sprague-Dawley大鼠中评价了分子1的无房室药代动力学(PK)参数。
方法
在小鼠中，施用单次5mg/kg静脉内快速推注，在不同时间点取样，并从不同动物收集(非重复测量)。在大鼠中，通过留置颈静脉导管通过静脉内快速推注施用单个5mg/kg剂量，并使用重复测量设计在不同时间点收集血液样品。
结果
结果的总结呈现在表7中。
表7.分子1在啮齿类动物中的药代动力学参数
参数 单位 CB17 SCID 大鼠
剂量 mg/kg 5 5
研究持续时间 天 21 21
T1/2 天 12.1 9.5
C0 μg/mL 107 147
Cmax±SE μg/mL 104±5 144±3
AUC(0-all)±SEM 天*μg/mL 474±10 636±19
AUC(0-∞) 天*μg/mL 698 803
CL mL/天/kg 7.16 6.2
VSS mL/kg 126 82.1
由浓度-时间曲线的对数-直线图的回归分析确定消除半衰期(T1/2)。分子1包括T1/2、CL和Vss在内的PK参数在小鼠和大鼠中相当(图7)。此外，分子1表现出的啮齿动物PK概况看起来与其它FDA批准的单克隆IgG抗体的PK曲线相似。
实施例9.双特异性抗-MUC1/EGFR ADC在子宫颈癌(WISH)异种移植物模型中的剂 量应答效力研究
在WISH肿瘤中评价了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC分子1的剂量-应答关联，WISH肿瘤是一种人子宫颈细胞系(HeLa污染物)，其相对于所有其它试验细胞系表达最高内源性MUC1水平(+++)，并在两个独立研究中表达低内源性EGFR水平(+)。
方法
将已建立WISH肿瘤(～150mm3)的雌性无胸腺裸鼠用分子1的单次静脉内(IV)注射进行治疗，剂量范围为0.1mg/kg至1.5mg/kg(研究1)或1.25mg/kg至5mg/kg(研究2)。
结果
在两项研究中，治疗被良好耐受，没有毒性，并观察到正常体重增加(图8A和8B)。在图9A、9B和10中解释了治疗对WISH肿瘤生长的影响以及媒介物对照处理的肿瘤达到研究终点(>1,200mm3)当天的各个肿瘤大小。在研究1中，以0.1、0.3、0.75和1.5mg/kg施用的分子1表现出剂量依赖性的抗肿瘤活性。试验的最低剂量0.1和0.3mg/kg效力差，分别显示出0％和12％的肿瘤生长抑制(TGI)(图9A和9B)。基于在第21天的肿瘤大小的统计分析，与媒介物对照相比，用0.75mg/kg的分子1观察到中等活性(47％ TGI)，而1.5mg/kg在81％ TGI引发显著活性(p＝0.0009)(图8B)。分子1的最高剂量(1.5mg/kg)最初诱导肿瘤消退，并在治疗后约10天观察到再生长(图9A)。在研究2中，1.25、2.5和5mg/kg的分子1的单剂量表现出稳健且显著的效力，如在所有剂量下肿瘤消退的诱导所证明的(图10)。在研究结束时，在超过50％(7只中的4只)的用最低剂量治疗的动物中和100％(7只中的7只)的接受2.5和5mg/kg的分子1的动物中观察到完全应答。
综上所述，两项研究的结果独立地证明了分子1的有效抗肿瘤活性，在WISH肿瘤中产生显著的效力以及肿瘤消退。最小有效剂量(MED)，定义为诱导肿瘤体积从基线减小>20％的最低剂量(对于治疗开始后的任何时间点)，在两项研究中是一致的，并在WISH肿瘤模型中确定为大约1.5mg/kg的分子1。
实施例10.双特异性抗-MUC1/EGFRADC在卵巢癌(OVCAR-3)异种移植物模型中的剂 量应答效力研究
在OVCAR-3肿瘤中评价了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC分子1的剂量-应答关联，OVCAR-3肿瘤是一种表达低内源性水平的MUC1(++)和EGFR(+)的人卵巢腺癌。
方法
将已建立OVCAR-3肿瘤(～100mm3)的雌性CB17 SCID(严重联合免疫缺陷的，C.B-17-IcrHSD-Prkdcscid)小鼠用分子1的单次静脉内注射治疗，剂量范围为2.5mg/kg至10mg/kg。
结果
治疗被良好耐受，未发现毒性或临床征象，并且在所有试验剂量下存在初始体重的3.10％至6.04％之间的显著(p≤0.05)平均体重增加(图11)。2.5、5和10mg/kg的分子1诱导肿瘤消退(>100％ TGI)并抑制生长直至治疗后大约第31天(图12A)。在第28天的肿瘤大小分析表明，与媒介物对照相比，分子1是显著(p<0.0001)有效的(图12B)。综上所述，分子1在OVCAR-3肿瘤中表现出强大效力。
实施例11.双特异性抗-MUC1/EGFR ADC在乳腺癌(MDA-MB-468)异种移植物模型中 的剂量应答效力研究
在MDA-MB-468肿瘤中评价了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC分子1的剂量-应答关联，MDA-MB-468肿瘤是一种相对于高EGFR水平(+++)表达更低水平的MUC1表达(+)的人乳腺转移性腺癌模型。
方法
将已建立MDA-MB-468肿瘤(～130mm3)的雌性SCID Beige小鼠用分子1的单次静脉内注射治疗，剂量范围为2.5mg/kg至10mg/kg。
结果
治疗被良好耐受，没有毒性且观察到正常体重增加(图12)。所有剂量的分子1(2.5、5和10mg/kg)诱导显著的抗肿瘤活性，在治疗后第63天研究结束之前实现完全肿瘤消退并抑制生长(图14)。综上所述，分子1在MDA-MB-468模型中表现出导致肿瘤消退的强效活性和延长的应答持续时间。
实施例12.双特异性抗-MUC1/EGFR ADC在非小细胞肺癌(NSCLC)患者衍生出的异 种移植物模型中的剂量应答效力研究
在NSCLC患者衍生出的异种移植物(PDX)模型LUX089中评价了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC分子1的剂量-应答关联。该PDX模型表达MUC1和EGFR两者。
方法
将已建立LUX089肿瘤(～150mm3)的雌性裸鼠(Nu/Nu,Vital River LaboratoryAnimal Technology Co.Ltd.,Beijing,China)用分子1的单次静脉内注射治疗，剂量范围为2mg/kg至10mg/kg。
结果
治疗被良好耐受，没有发现毒性或临床征象，也没有观察到体重减轻(图15B)。在第0天以2、5和10mg/kg施用一次的分子1显示出剂量依赖性的肿瘤生长抑制，在10mg/kg剂量组中完全消退(图15A)。10mg/kg剂量组中治疗的五只动物中的三只，直到第60天实验结束时没有检测到肿瘤。2和5mg/kg剂量在第38天分别引起69％和24％消退的TGI(p<0.001)，此时媒介物肿瘤达到1300mm3的平均体积。综上所述，分子1在PDX模型LUX089中表现出强大效力。
实施例13.在非小细胞肺癌(NSCLC)患者衍生出的异种移植物模型中双特异性抗- MUC1/EGFR ADC和单特异性ADC之间的对比
在三个不同NSCLC患者衍生出的异种移植物(PDX)模型中以相同剂量评价与单特异性抗-EGFR和抗-MUC1 ADC相比双特异性抗-MUC1/EGFR ADC分子1的效力。所有三个PDX模型表达MUC1和EGFR两者。
方法
将已建立LUX089、LUX019和LUX003肿瘤(～150mm3)的雌性裸(Nu/Nu,Vital RiverLaboratory Animal Technology Co.Ltd.,Beijing,China)小鼠用分子1的单次静脉内注射和5mg/kg剂量的单特异性ADC进行治疗。
结果
在所有三个PDX模型中，分子1显示出最强的肿瘤生长抑制，在模型LUX003和LUX019中完全消退。在FUX089中，治疗导致部分消退。第二最有效的治疗抗-EGFR ADC导致模型LUX019中的肿瘤停滞。抗-MUC1ADC在5mg/kg单次治疗在三个试验的PDX模型中没有引起肿瘤缩小(图16)。综上所述，分子1在三个试验的NSCLC PDX模型中显示出最强的抗肿瘤效力。
实施例14.双特异性抗-MUC1/EGFR ADC在患者衍生出的不同癌症适应症的异种移 植物模型中的效力
在来自不同癌症适应症的PDX模型中试验了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC分子1的效力。根据已知的MUC1和EGFR表达水平选择适应症。
方法
将具有来自NSCLC、胃癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌和间皮瘤的PDX模型的雌性裸(Nu/Nu)小鼠以8mg/kg的剂量用分子1的单次静脉内注射治疗。使用以下标准，在最佳应答当天(如果肿瘤应答延迟)/当媒介物组肿瘤体积(中位数)达到1000mm3时，将效力评估为进行性疾病(PD)、稳定疾病(SD)、部分消退(PR)或完全消退(CR)：>73％、<73％且>-66％、≤-66％的肿瘤体积变化对应于PD、SD、PR，并且不可测量的肿瘤对应于CR。
结果
在所有试验的适应症中均观察到强烈的抗肿瘤应答(部分的或完全的消退)。在表达不同水平的MUC1或EGFR的模型中看到应答。在表8中，将表达高EGFR和MUC1表达水平(基于使用haloscore软件的免疫组织化学评分>15)的NSCLC PDX模型用星号标记。将具有EGFR突变(LUPF049:EGFR19缺失(748-753)；LUPF104:EGFR19缺失(746-750)、T790M和C797S)的NSCLC PDX模型用井号标记。综上所述，分子1在表达不同水平的MUC1和EGFR的若干种癌症适应症中表现出广泛的适用性。
表8.来自不同适应症的PDX模型中的治疗应答
Figure BDA0004113529250000391
/>
Figure BDA0004113529250000401
/>
Figure BDA0004113529250000411
PD＝进行性疾病
SD＝稳定疾病
PR＝部分消退
CR＝完全消退
实施例15.使用不同治疗计划双特异性抗-MUC1/EGFR ADC在患者衍生出的异种移 植物模型中的效力
使用不同计划在NSCLC PDX模型中试验了双特异性抗-MUC1/EGFR ADC分子1的效力。
方法
将已建立患者衍生出的NSCLC肿瘤(～150mm3)的雌性裸(Nu/Nu,Vital RiverLaboratory Animal Technology Co.Ltd.,Beijing,China)小鼠乳腺用以下治疗：单次静脉内注射8mg/kg的分子1，两次静脉内注射4mg/kg的分子1(间隔1周或2周)，或每周静脉内注射2mg/kg的分子1共四次。
结果
在所有计划中，使用8mg/kg的相同总剂量诱导强烈且持久的肿瘤生长抑制(图17A和17B)。综上所述，分子1在使用不同治疗方案下均显示出强大的抗肿瘤效力。
实施例16.双特异性抗-MUC1/EGFR ADC在来自NSCLC、食管癌以及头颈鳞状细胞癌 的患者衍生出的异种移植物模型中的效力
在来自NSCLC、食管癌以及头颈鳞状细胞癌的多种患者衍生出的异种移植物模型中试验了单次8mg/kg剂量的分子1的效力。如在图18A、18B和18C中所示，大部分来自NSCLC、食管癌以及头颈鳞状细胞癌的患者衍生出的异种移植物在单剂量后表现出完全缓解。肿瘤应答与靶表达相关。
实施例17.抗-MUC1抗体的表位作图
为了确定分子1的抗-MUC1臂的最小结合表位，针对人MUC1肽APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS(SEQ ID NO:22)(其翻译成直链15、12和10个氨基酸的肽，具有14、11和9个氨基酸的肽-肽重叠)以及针对15个氨基酸肽APDTRPAPGSTAPPA(SEQ ID NO:23)、PAPGSTAPPAHGVTS(SEQ ID NO:24)、TAPPAHGVTSAPDTR(SEQ ID NO:25)和HGVTSAPDTRPAPGS(SEQ ID NO:26)的序列截短体，进行人抗-MUC1抗体HT186-D11和H02的
Figure BDA0004113529250000421
表位作图。将得到的肽微阵列与浓度为1μg/ml的抗体样品一起在温育缓冲液中温育，随后用二抗和对照抗体染色，以及用LI-COR Odyssey成像系统读出结果。使用
Figure BDA0004113529250000422
分析仪完成斑点强度的量化和肽注释。
肽微阵列拷贝的预染色没有突出二抗或对照抗体与可能干扰主要测定的野生型肽的肽变体的任何背景相互作用。相比之下，与抗体样品一起温育会产生非常相似的且非常清晰的IgG应答概况。抗体HT186-D11显示出对具有最小共有基序TRPAP(SEQ ID NO:27)的肽的最强应答。相同的最小共有基序被抗体H02识别，尽管在中等斑点强度。还发现抗体H02与具有最小共有基序DTRPAP(SEQ ID NO:28)的肽相互作用时产生强烈应答。C-端脯氨酸或N-端苏氨酸的除去导致斑点强度的显著降低，并从而导致抗体结合。
实施例18.分子1针对人和食蟹猴EGFR的动力学相互作用分析
为了评估对EGFR的结合亲和力，将分子1(抗-MUC1/EGFR ADC；参见实施例3)和分子10(未缀合的抗-MUC1/EGFR；参见实施例2)固定化在生物传感器尖端上。将可溶性分析物(人EGFR或食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))EGFR；“食蟹猴EGFR”)的结合和解离测量为直接由蛋白与生物传感器尖端的结合引起的以nm为单位的干扰偏移。使用1:1相互作用模型和全局曲线拟合处理数据以得到k结合、k解离和KD值。
结果显示在表9A和9B中。分子1对人和食蟹猴EGFR的解离常数(KD)处于低个位数nM范围(1.5nM)。分子10的动力学结合常数非常相似，为大约1.4nM。
因而，分子1(抗-MUC1/EGFR ADC)以与未缀合的抗-MUC1/EGFR(分子10)类似的动力学结合EGFR。这些结果证实，缀合哈米特林衍生物制备分子1(参见实施例3)不影响与EGFR的结合。
表9A.分子1和分子10对人EGFR的结果，包括计算的KD、k结合和k解离值。
分析物:人EGFR
Figure BDA0004113529250000431
/>
表9B.分子1和分子10对食蟹猴EGFR的结果，包括计算的KD、k结合和k解离值。
分析物:食蟹猴EGFR-His
Figure BDA0004113529250000432
实施例19.分子1针对人和食蟹猴MUC1的动力学相互作用分析
为了评估对MUC1的结合亲和力，通过使用相应的胺偶联试剂盒与伯胺共价偶联，将分子1(抗-MUC1/EGFR ADC；参见实施例3)和分子10(未缀合的抗-MUC1/EGFR；参见实施例2)固定化在C1系列S传感器芯片上。每180秒测量1000nM分析物(食蟹猴(食蟹猕猴)MUC1肽和人MUC1肽VHH融合物)的结合和解离。
读出结果是直接由蛋白与传感器芯片的表面的结合所产生的测量应答。使用异质相互作用模型和全局曲线拟合处理数据以得到k结合、k解离和KD值。
结果显示在表10中。测得的针对人MUC1肽(作为与骆驼科VHH的N-端融合物)的解离常数(KD)对于分子1为21.5nM，且对于分子10为47.2nM。这些分子中的每一种的曲线形状指示异质结合模式。该第二相互作用似乎对于所有试验的分子来说都显著更弱。用食蟹猴MUC1肽没有测量到相互作用。
因而，分子1(抗-MUC1/EGFR ADC)以与未缀合的抗-MUC1/EGFR(分子10)类似的动力学结合人MUC1。这些结果证实，缀合哈米特林衍生物制备分子1(参见实施例3)不会显著影响与MUC1的结合。
与食蟹猴MUC1肽的结合的缺乏可能是由于氨基酸序列中的物种特异性差异。如在实施例17中所述，分子1的抗-MUC1结合臂被确定为具有包含氨基酸序列TRPAP(SEQ ID NO:27)的最小结合表位。不同物种的MUC1的序列比对表明，这种最小表位不存在于食蟹猴和啮齿动物MUC1中。
表10.分子1和分子10针对人MUC1的结果，包括计算的KD、k结合和k解离值.
分析物：人MUC1-VHH融合物
Figure BDA0004113529250000441
实施例20.与MUC1的结合模式
为了进一步了解H02-scFv的结合模式，解析了分子1的MUC1-结合臂，即在H02-scFv与人MUC1免疫优势核心肽(APDTRPAPGSTAPPA；SEQ ID NO:23)的片段之间的复合物的晶体结构。
在结晶之前，将H02-scFv与10倍摩尔过量的MUC1肽一起在冰上温育30分钟，并随后在25mM HEPES、150mM NaCl、pH 7.4缓冲液中浓缩至22mg/ml。通过将1.0μl蛋白溶液与1.0μl储备溶液(0.1M Tris,0.2M MgCl2,28％w/v PEG4000,pH 8.5)混合，使用悬滴蒸汽扩散技术在277K生长晶体。复合物的整体结构如图19A所示。
在晶体结构内，MUC1肽链在电子密度图(2Fo-Fc)中从Asp 3至Ala 15明确定义，如在图19A中所示。Arg 5[MUC1]的侧链胍盐与Glu 99[H02-scFv]的羧酸酯基团形成双齿盐桥，而Arg 5[MUC1]的主链氮与Asp 103[H02-scFv]的主链羰基氧形成氢键。观察到另外两个氢键：1)在Gly 9[MUC1]的主链氮与Asp 52[H02-scFv]的羧酸酯之间，和2)在Thr 11Oγ[MUC1]与Asp 52[H02-scFv]之间。MUC1肽和H02-scFv之间的相互作用通过范德华接触进一步稳定，特别是通过Pro 8[MUC1]结合到由H02-scFv的CDR1 Thr 30-His32碎片和由H02-scFv的CDR2 Asp 52-Val54碎片形成的腔体中。MUC1肽和H02-scFv之间的其余接触由水分子介导。
等同方案
本文提及的每篇专利文献和科学文章的整个公开内容通过引用并入用于所有目的。
在不脱离本公开内容的精神或基本特征的情况下，本公开内容可以以其它具体形式体现。因此，前述实施方案在所有方面都被认为是示例性的，而不是限制本文描述的公开内容。不同实施方案的各种结构元件和各个公开的方法步骤可以以各种组合和排列使用，并且所有这样的变体都将被认为是本公开内容的形式。因此，本公开内容的范围由所附权利要求而不是由前述描述指示，并且在权利要求的等同方案的含义和范围内的所有变化意图被包括在其中。
序列
SEQ ID NO:1(抗-MUC1 scFvFc(AG SEED))
MQMQLVQSEAELKKPGASVKVSCKASGYSFTSHFMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPVTGGTKYAQNFQGWVTMTRDTSIRTAYLELSRLRSDDTAMYYCAREARADRGQFDKWGQGTLVTVASGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPALVIYYGSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDWVFGGGTKLTVLKPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTTTFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISLSPGK
SEQ ID NO:2(抗-EGFR Fab(重)Fc(GA SEED))
MEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLTNYGVHWMRQAPGQGLEWIGVIWSGGNTDYNTPFTSRVTITSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDGSFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDRSPGK
SEQ ID NO:3(抗-EGFR Fab(轻链))
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGTNIHWYQQKPGKAPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQNNNWPTTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:4(HT186-D11和1993系列抗体的CDRH1基序)
GYX1FX2X3X4X5MH
其中
X1是S(丝氨酸)或P(脯氨酸)，
X2是T(苏氨酸)或N(天冬酰胺)，
X3是G(甘氨酸)、D(天冬氨酸)或S(丝氨酸)，
X4是H(组氨酸)或N(天冬酰胺)，且
X5是Y(酪氨酸)或F(苯丙氨酸)。
SEQ ID NO:5(HT186-D11和1993系列抗体的CDRH2基序)
WIDPVTGX1TX2YAQX3FQG
其中
X1是G(甘氨酸)或E(谷氨酸)，
X2是K(赖氨酸)或R(精氨酸)，且
X3是N(天冬酰胺)或D(天冬氨酸)。
SEQ ID NO:6(HT186-D11和1993系列抗体的CDRH3基序)
EX1X2X3X4RGQFDK
其中
X1是V(缬氨酸)或A(丙氨酸)，
X2是T(苏氨酸)或R(精氨酸)，
X3是G(甘氨酸)或A(丙氨酸)，且
X4是D(天冬氨酸)或S(丝氨酸)。
SEQ ID NO:7(HT186-D11和1993系列抗体的CDRL1)
GGNNIGSKSVH
SEQ ID NO:8(HT186-D11和1993系列抗体的CDRL2)
YGSNRPS
SEQ ID NO:9(HT186-D11和1993系列抗体的CDRL3)
QVWDSSSDWV
SEQ ID NO:10(MUC1的VNTR肽)
APDTRPAPGSTAPPAC
SEQ ID NO:11(抗-MUC1 scFvFc(AG SEED)，其在用*指示的位点处具有引入的非天然氨基酸(例如，pAMF))
MQMQLVQSEAELKKPGASVKVSCKASGYSFTSHFMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPVTGGTKYAQNFQGWVTMTRDTSIRTAYLELSRLRSDDTAMYYCAREARADRGQFDKWGQGTLVTVASGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPALVIYYGSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDWVFGGGTKLTVLKPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSV*LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTTT*AVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISLSPGK
SEQ ID NO:12((抗-EGFR Fab(重)Fc(GA SEED)，其在用*指示的位点处具有引入的非天然氨基酸(例如，pAMF))
MEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLTNYGVHWMRQAPGQGLEWIGVIWSGGNTDYNTPFTSRVTITSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL*SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV*LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDGSFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDRSPGK
SEQ ID NO:13(hC225的CDRH1)
GFSLTNYG
SEQ ID NO:14(hC225的CDRH2)
IWSGGNT
SEQ ID NO:15(hC225的CDRH3)
ARALTYYDYEFAY
SEQ ID NO:16(hC225的CDRL1)
QSIGTN
SEQ ID NO:17(hC225的CDRL2)
YASE
SEQ ID NO:18(hC225的CDRL3)
QQNNNWPTT
SEQ ID NO:19(在hC225重链内的CH1)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
SEQ ID NO:20(在hC225重链内的CH1，其在用*指示的位点处具有引入的非天然氨基酸(例如，pAMF))
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL*SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
SEQ ID NO:21(在hC225轻链内的CL1)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:22(来自人MUC1的肽)
APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS
SEQ ID NO:23(人MUC1截短肽)
APDTRPAPGSTAPPA
SEQ ID NO:24(人MUC1截短肽)
PAPGSTAPPAHGVTS
SEQ ID NO:25(人MUC1截短肽)
TAPPAHGVTSAPDTR
SEQ ID NO:26(人MUC1截短肽)
HGVTSAPDTRPAPGS
SEQ ID NO:27(人MUC1最小共有基序)
TRPAP
SEQ ID NO:28(人MUC1最小共有基序)
DTRPAP
SEQ ID NO:29(HT186-D11的CDRH1-Kabat)
GHYMH
SEQ ID NO:30(HT186-D11的CDRH2-Kabat)
WIDPVTGGTKYAQNFQG
SEQ ID NO:31(HT186-D11的CDRH3-Kabat)
EVTGDRGQFDK
SEQ ID NO:32(HT186-D11的CDRH1-Chothia)
GYSFTGH
SEQ ID NO:33(HT186-D11的CDRH2-Chothia)
DPVTGG
SEQ ID NO:34(HT186-D11的CDRH3-Chothia)
EVTGDRGQFDK
SEQ ID NO:35(1993-H02的CDRH1-Kabat)
SHFMH
SEQ ID NO:36(1993-H02的CDRH2-Kabat)
WIDPVTGGTKYAQNFQG
SEQ ID NO:37(1993-H02的CDRH3-Kabat)
EARADRGQFDK
SEQ ID NO:38(1993-H02的CDRH1-Chothia)
GYSFTSH
SEQ ID NO:39(1993-H02的CDRH2-Chothia)
DPVTGG
SEQ ID NO:40(1993-H02的CDRH3-Chothia)
EARADRGQFDK
SEQ ID NO:41(HT186-D11的VH)
QMQLVQSEAELKKPGASVKVSCKASGYSFTGHYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPVTGGTKYAQNFQGWVTMTRDTSIRTAYLELSRLRSDDTAMYYCAREVTGDRGQFDKWGQGTLVTVAS
SEQ ID NO:42(1993-H02的VH)
QMQLVQSEAELKKPGASVKVSCKASGYSFTSHFMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPVTGGTKYAQNFQGWVTMTRDTSIRTAYLELSRLRSDDTAMYYCAREARADRGQFDKWGQGTLVTVAS
SEQ ID NO:43(HT186-D11和1993-H02的VL)
QSVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPALVIYYGSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:44(1993-E03的VH)
QMQLVQSEAELKKPGASVKVSCKASGYSFNDHFMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPVTGGTKYAQNFQGWVTMTRDTSIRTAYLELSRLRSDDTAMYYCAREARADRGQFDKWGQGTLVTVAS
SEQ ID NO:45(1993-H08的VH)
QMQLVQSEAELKKPGASVKVSCKASGYSFTGHYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPVTGETKYAQNFQGWVTMTRDTSIRTAYLELSRLRSDDTAMYYCAREARADRGQFDKWGQGTLVTVAS
SEQ ID NO:46(1993-G09的VH)
QMQLVQSEAELKKPGASVKVSCKASGYSFTDHYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPVTGETKYAQDFQGWVTMTRDTSIRTAYLELSRLRSDDTAMYYCAREARADRGQFDKWGQGTLVTVAS
SEQ ID NO:47(1993-E04的VH)
QMQLVQSEAELKKPGASVKVSCKASGYSFTGNYMHWVRQAPGQGPEWMGWIDPVTGETKYAQNFQGWVTMTRDTSIRTAYLELSRLRSDDTAMYYCAREARASRGQFDKWGQGTLVTVAS
SEQ ID NO:48(1993-D01的VH)
QMQLVQSEAELKKPGASVKVSCKASGYPFTGHYMHWVRQAPGQGPEWMGWIDPVTGETRYAQNFQGWVTMTRDTSIRTAYLELSRLRSDDTAMYYCAREARADRGQFDKWGQGTLVTVAS
序列表
<110> 默克专利股份公司
<120> 靶向EGFR和MUC1的双特异性抗体-药物缀合物及其用途
<130> EMD-016
<150> 63/034,296
<151> 2020-06-03
<160> 48
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗-MUC1 scFvFc (AG SEED)
<400> 1
Met Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser
20 25 30
His Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn
50 55 60
Phe Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly
145 150 155 160
Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Ala Leu Val Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu Lys Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
325 330 335
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
340 345 350
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
355 360 365
Gly Gln Pro Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Ser Arg Glu
370 375 380
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Lys Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr
420 425 430
Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
435 440 445
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
450 455 460
Asn His Tyr Thr Gln Lys Thr Ile Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 2
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗-EGFR Fab(重)Fc (GA SEED)
<400> 2
Met Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn
20 25 30
Tyr Gly Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe
50 55 60
Thr Ser Arg Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp
385 390 395 400
Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ile Leu
405 410 415
Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Asp
435 440 445
Arg Ser Pro Gly Lys
450
<210> 3
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗-EGFR Fab(轻链)
<400> 3
Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr
20 25 30
Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro
85 90 95
Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11和1993系列抗体的CDRH1基序
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Ser或Pro
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Thr或Asn
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Gly, Asp,或Ser
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是His或Asn
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<400> 4
Gly Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Met His
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11和1993系列抗体的CDRH2基序
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Gly或Glu
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是Lys或Arg
<220>
<221> 变体
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是Asn或Asp
<400> 5
Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Gln Xaa Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11和1993系列抗体的CDRH3基序
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Val或Ala
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Thr或Arg
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Gly或Ala
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Asp或Ser
<400> 6
Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Gln Phe Asp Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11和1993系列抗体的CDRL1
<400> 7
Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11和1993系列抗体的CDRL2
<400> 8
Tyr Gly Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11和1993系列抗体的CDRL3
<400> 9
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Trp Val
1 5 10
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> MUC1的VNTR肽
<400> 10
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala Cys
1 5 10 15
<210> 11
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 在Xaa位点处具有引入的非天然氨基酸(例如，pAMF)的抗-MUC1 scFvFc(AGSEED)
<220>
<221> 诱变剂
<222> (269)..(269)
<223> 非天然氨基酸，例如，对叠氮基甲基L-苯丙氨酸(pAMF)
<220>
<221> 诱变剂
<222> (435)..(435)
<223> 非天然氨基酸，例如，对叠氮基甲基L-苯丙氨酸(pAMF)
<400> 11
Met Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser
20 25 30
His Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn
50 55 60
Phe Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly
145 150 155 160
Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Ala Leu Val Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu Lys Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Xaa Leu Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
325 330 335
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
340 345 350
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
355 360 365
Gly Gln Pro Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Ser Arg Glu
370 375 380
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Lys Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr
420 425 430
Thr Thr Xaa Ala Val Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
435 440 445
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
450 455 460
Asn His Tyr Thr Gln Lys Thr Ile Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 12
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 在Xaa位点处具有引入的非天然氨基酸(例如，pAMF)的抗-EGFR Fab(重)Fc(GA SEED)
<220>
<221> 诱变剂
<222> (183)..(183)
<223> Xaa是非天然氨基酸，例如，对叠氮基甲基L-苯丙氨酸(pAMF)
<220>
<221> 诱变剂
<222> (244)..(244)
<223> Xaa是非天然氨基酸，例如，对叠氮基甲基L-苯丙氨酸(pAMF)
<400> 12
Met Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn
20 25 30
Tyr Gly Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe
50 55 60
Thr Ser Arg Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Xaa Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Xaa Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp
385 390 395 400
Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ile Leu
405 410 415
Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Asp
435 440 445
Arg Ser Pro Gly Lys
450
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hC225的CDRH1
<400> 13
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hC225的CDRH2
<400> 14
Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hC225的CDRH3
<400> 15
Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hC225的CDRL1
<400> 16
Gln Ser Ile Gly Thr Asn
1 5
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hC225的CDRL2
<400> 17
Tyr Ala Ser Glu
1
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hC225的CDRL3
<400> 18
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr
1 5
<210> 19
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 在hC225重链内的CH1
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 20
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 在hC225重链内的CH1，在Xaa处具有引入的非天然氨基酸(例如，pAMF)
<220>
<221> 诱变剂
<222> (63)..(63)
<223> Xaa是非天然氨基酸，例如，对叠氮基甲基L-苯丙氨酸(pAMF)
<400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Xaa Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 在hC225轻链内的CL1
<400> 21
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 22
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 来自人MUC1的肽
<400> 22
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
1 5 10 15
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
20 25 30
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
35 40
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人MUC1截短肽
<400> 23
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人MUC1截短肽
<400> 24
Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人MUC1截短肽
<400> 25
Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人MUC1截短肽
<400> 26
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人MUC1最小共有基序
<400> 27
Thr Arg Pro Ala Pro
1 5
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人MUC1最小共有基序
<400> 28
Asp Thr Arg Pro Ala Pro
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11的CDRH1 - Kabat
<400> 29
Gly His Tyr Met His
1 5
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11的CDRH2 - Kabat
<400> 30
Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11的CDRH3 - Kabat
<400> 31
Glu Val Thr Gly Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11的CDRH1 - Chothia
<400> 32
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
1 5
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11的CDRH2 - Chothia
<400> 33
Asp Pro Val Thr Gly Gly
1 5
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11的CDRH3 - Chothia
<400> 34
Glu Val Thr Gly Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys
1 5 10
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-H02的CDRH1 - Kabat
<400> 35
Ser His Phe Met His
1 5
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-H02的CDRH2 - Kabat
<400> 36
Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-H02的CDRH3 - Kabat
<400> 37
Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-H02的CDRH1 - Chothia
<400> 38
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser His
1 5
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-H02的CDRH2 - Chothia
<400> 39
Asp Pro Val Thr Gly Gly
1 5
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-H02的CDRH3 - Chothia
<400> 40
Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys
1 5 10
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11的VH
<400> 41
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser
115 120
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-H02的VH
<400> 42
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser His
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser
115 120
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HT186-D11和1993-H02的VL
<400> 43
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ala Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Trp
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 44
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-E03的VH
<400> 44
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Asn Asp His
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser
115 120
<210> 45
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-H08的VH
<400> 45
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser
115 120
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-G09的VH
<400> 46
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp His
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Gln Asp Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser
115 120
<210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-E04的VH
<400> 47
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Asn
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Arg Ala Ser Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser
115 120
<210> 48
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1993-D01的VH
<400> 48
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Gly His
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser
115 120

Claims (83)

1.一种免疫缀合物，其包含：
(a)结合EGFR和MUC1的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
(i)第一多肽，其包含第一工程化Fc结构域和单链Fv(scFv)，其中所述scFv结合MUC1，
(ii)第二多肽，其包含第二工程化Fc结构域和Fab片段的重链，和
(iii)第三多肽，其包含Fab片段的轻链；
其中所述第二和第三多肽链一起限定结合EGFR的Fab片段，
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过在所述第一工程化Fc结构域和所述第二工程化Fc结构域之间形成的一个或多个二硫键共价地连接；
其中所述第二多肽和所述第三多肽通过在所述第二多肽的重链和所述第三多肽的轻链之间形成的一个或多个二硫键共价地连接；且
其中所述第一多肽和所述第二多肽各自包含至少一个非天然氨基酸残基；和
(b)多个哈米特林部分，其中每个哈米特林部分独立地通过接头缀合至所述第一多肽或所述第二多肽的非天然氨基酸残基之一。
2.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述多个哈米特林部分包含四个哈米特林部分。
3.根据权利要求1或2所述的免疫缀合物，其中所述第一工程化Fc结构域不同于所述第二工程化Fc结构域。
4.根据权利要求3所述的免疫缀合物，其中所述第一和第二工程化Fc结构域各自包含链交换工程化结构域。
5.根据权利要求4所述的免疫缀合物，其中每个链交换工程化结构域包含人IgA和IgG恒定重链-3(CH3)序列的交替区段。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述第一工程化Fc结构域包含两个非天然氨基酸残基。
7.根据权利要求6所述的免疫缀合物，其中所述第一工程化Fc结构域包含不超过两个非天然氨基酸残基。
8.根据权利要求6或7所述的免疫缀合物，其中所述第一工程化Fc结构域在根据EU索引的重链位置F241和F404处包含非天然氨基酸残基。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述第二工程化Fc结构域包含一个非天然氨基酸残基。
10.根据权利要求9所述的免疫缀合物，其中所述第二工程化Fc结构域包含不超过一个非天然氨基酸残基。
11.根据权利要求9或10所述的免疫缀合物，其中所述第二工程化Fc结构域在根据EU索引的重链位置F241处包含一个非天然氨基酸残基。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述Fab片段包含非天然氨基酸残基。
13.根据权利要求12所述的免疫缀合物，其中在所述第二多肽内的Fab片段的重链包含非天然氨基酸残基。
14.根据权利要求12或13所述的免疫缀合物，其中所述Fab片段包含不超过一个非天然氨基酸残基。
15.根据权利要求12、13或14所述的免疫缀合物，其中所述Fab片段在根据EU索引的重链位置Y180处包含一个非天然氨基酸残基。
16.根据权利要求1-15中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述至少一个非天然氨基酸残基中的每一个选自：对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、氟代苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对丙炔氧基苯丙氨酸和对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸。
17.根据权利要求16所述的免疫缀合物，其中所述至少一个非天然氨基酸残基中的每一个是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)。
18.根据权利要求1-17中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述双特异性抗体被去糖基化。
19.根据权利要求1-18中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述第一多肽包含互补性决定区(CDR)：
CDR-L1，其包含在SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列；
CDR-L2，其包含在SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列；和
CDR-L3，其包含在SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求19所述的免疫缀合物，其中所述第一多肽包含互补性决定区(CDR)：
CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，
CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，和
CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。
21.根据权利要求19所述的免疫缀合物，其中所述第一多肽包含互补性决定区(CDR)：
(a)(i)CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列；或
(b)(i)CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的免疫缀合物，其中所述第一多肽包含：
(a)重链可变(VH)区域，其包含在SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列；和
(b)轻链可变(VL)区域，其包含在SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。
23.根据权利要求19所述的免疫缀合物，其中所述第一多肽包含互补性决定区(CDR)：
(a)(i)CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列；或
(b)(i)CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求23所述的免疫缀合物，其中所述第一多肽包含：
(a)重链可变(VH)区域，其包含在SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列；和
(b)轻链可变(VL)区域，其包含在SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。
25.根据权利要求1-24中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述第二多肽包含互补性决定区(CDR)：
CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，
CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列，和
CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。
26.根据权利要求1-25中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述第三多肽包含互补性决定区(CDR)：
CDR-L1，其包含在SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列，
CDR-L2，其包含在SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，和
CDR-L3，其包含在SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
27.根据权利要求1-26中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述第一多肽的氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少99％同一性。
28.根据权利要求27所述的免疫缀合物，其中所述第一多肽具有在SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求1-28中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述第二多肽的氨基酸序列与在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少99％同一性。
30.根据权利要求29所述的免疫缀合物，其中所述第二多肽具有在SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。
31.根据权利要求1-30中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述第三多肽的氨基酸序列与在SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少99％同一性。
32.根据权利要求31所述的免疫缀合物，其中所述第三多肽具有在SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。
33.根据权利要求1-32中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述接头是可切割的接头。
34.根据权利要求33所述的免疫缀合物，其中所述可切割接头是缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲醇(PABA)。
35.根据权利要求1-34中的任一项所述的免疫缀合物，其中所述哈米特林部分是哈米特林衍生物。
36.根据权利要求35所述的免疫缀合物，其中所述哈米特林衍生物是3-氨基苯基-哈米特林。
37.根据权利要求36所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含以下结构：
Figure FDA0004113529240000051
/>
其中n是4。
38.一种免疫缀合物，其包含：
(a)结合EGFR和MUC1的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
(i)第一多肽，其包含第一工程化Fc结构域和单链Fv片段(scFv)，其中所述scFv结合MUC1，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，其在根据EU索引的重链位置F241和F404处包含非天然氨基酸残基，
(ii)第二多肽，其包含第二工程化Fc结构域和Fab片段的重链，所述第二多肽包含SEQID NO:12的氨基酸序列，其在根据EU索引的位置Y180和F241处包含非天然氨基酸残基，和
(iii)第三多肽，其包含Fab片段的轻链，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
其中所述第二和第三多肽链一起限定结合EGFR的Fab片段，
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过在所述第一工程化Fc结构域和所述第二工程化Fc结构域之间形成的一个或多个二硫键共价地连接，且
其中所述第二多肽和所述第三多肽通过在所述第二多肽的重链和所述第三多肽的轻链之间形成的一个或多个二硫键共价地连接；和
(b)多个3-氨基苯基哈米特林部分，各自独立地通过可切割的缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲醇接头缀合至所述非天然氨基酸残基之一。
39.根据权利要求38所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含四个3-氨基苯基哈米特林部分。
40.根据权利要求39或40所述的免疫缀合物，其中每个非天然氨基酸是对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)。
41.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-40中的任一项所述的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
42.一种在有此需要的哺乳动物受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括下述步骤：
给所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-40中的任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求41所述的药物组合物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述哺乳动物受试者被诊断为患有癌症。
45.根据权利要求42-44中的任一项所述的方法，其中所述癌症包含实体瘤。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、食管癌、头颈癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌和间皮瘤。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
49.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述NSCLC包含腺癌。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述NSCLC包含鳞状细胞癌。
53.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症是食管癌。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述食管癌是鳞状食管癌。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述癌症是头颈癌。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述头颈癌是头颈鳞状细胞癌。
57.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症是子宫颈癌。
58.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
59.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症是胃癌。
60.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症是间皮瘤。
61.根据权利要求42-44中的任一项所述的方法，其中所述癌症包含非实体瘤。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
63.根据权利要求42-62中的任一项所述的方法，其中所述癌症包含EGFR野生型的细胞。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述癌症主要包含EGFR野生型的细胞。
65.根据权利要求42-63中的任一项所述的方法，其中所述癌症包含含有EGFR的突变形式的细胞。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述癌症主要包含含有EGFR的突变形式的细胞。
67.根据权利要求42-66中的任一项所述的方法，其中所述癌症包含表达高水平的EGFR的细胞。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述癌症主要包含表达高水平的EGFR的细胞。
69.根据权利要求42-67中的任一项所述的方法，其中所述癌症包含表达低或中水平的EGFR的细胞。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述癌症主要包含表达低或中水平的EGFR的细胞。
71.根据权利要求42-70中的任一项所述的方法，其中所述癌症包含表达高水平的MUC1的细胞。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述癌症主要包含表达高水平的MUC1的细胞。
73.根据权利要求42-71中的任一项所述的方法，其中所述癌症包含表达低或中水平的MUC1的细胞。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述癌症主要包含表达低或中水平的MUC1的细胞。
75.根据权利要求42-74中的任一项所述的方法，其中所述施用步骤包含通过全身途径施用。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述全身途径是静脉内途径。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述全身途径是皮下途径。
78.根据权利要求42-77中的任一项所述的方法，其中在将所述免疫缀合物施用给所述哺乳动物受试者之后，肿瘤生长相对于参照水平减少。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述参照水平是在给所述哺乳动物受试者施用所述免疫缀合物的步骤之前的肿瘤生长水平。
80.根据权利要求78或79所述的方法，其中在给所述哺乳动物受试者施用所述免疫缀合物之后，肿瘤生长消退。
81.根据权利要求80所述的方法，其中在给所述哺乳动物受试者施用所述免疫缀合物之后，肿瘤生长完全消退。
82.根据权利要求42-81中的任一项所述的方法，其中所述施用步骤包含施用至少两剂，其中所述至少两剂共同构成治疗有效量。
83.根据权利要求42-81中的任一项所述的方法，其中施用所述免疫缀合物的步骤包含施用构成治疗有效量的单剂量。
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