JP2005505243A - 血清アルブミンのキメラポリペプチド及びそれに関する使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、一つ以上の生物活性異種ペプチド配列を含有するように血清アルブミンタンパク質を変化させてあるキメラポリペプチドに関する。前記キメラポリペプチドは、血清アルブミンタンパク質フラグメントから得た向上した血清半減期と結び付けられた異種ペプチド配列に関係する治療的活性を呈するであろう。異種ペプチド配列は、血管新生抑制、抗腫瘍活性、及びアポトーシスの誘導を含め、何らかの生物学的効果を促進するように、選択してもよい。治療効果は、本キメラポリペプチドを直接投与して達成しても、又は、このようなキメラポリペプチドをコードする核酸を含有するベクタを細胞にトランスフェクトすることで達成してもよい。

Description

【０００１】
関連出願の参照
本出願は、その明細書全文を引用をもってここに援用する、２００１年１月１８日出願の米国出願第０９／７６４，９１８号、及び、２００１年１月２３日出願の米国出願第０９／７６８，１８３号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
組換えＤＮＡ技術における昨今の進歩により、多種の生物活性ペプチドが入手できるようになった。連結による遺伝子融合や部位指定突然変異誘発などにより、場合によっては、分子リモデリングは、このようなタンパク質に、至適活性と両立可能な性質をもたらしたが、多くの場合、これらの産物の効果的使用は送達系を通じて初めて可能となるのが実際である。
【０００３】
ポリペプチド治療薬は、数多くの疾患治療でのそれらの可能性にもかかわらず、ペプシン及びトリプシンなどの胃液及び腸内プロテアーゼにより容易に分解する。そのため、これらのポリペプチドを経口投与した場合では、それらはほとんど吸収されず、何ら効果的な薬理作用を生まない。所望の生物活性を得ようと、現在ではこれらのポリペプチドは通常、注射用剤形で調剤されている。しかしながら、注射という経路は不便であり、また患者にとって、特に投与を定期的かつ頻繁に行わねばならない場合、苦痛である。結果的に、このようなポリペプチドを投与するための代替的方法に、近年、研究の焦点が当てられている。
【０００４】
このような治療薬は通常、血中での半減期が短く、腎臓で急速に排出されるか、又は、細網内皮細胞系（RES）及び他の組織で取り込まれる。このような時期尚早な薬物の消失を補うために、治療の必要な区域に充分な量の薬物が集中するよう、大量の投薬量が必要である。しかしながら、これは費用がかさむだけでなく、毒性や、外来タンパク質に対する免疫応答までも惹起してしまうことがある。持続放出製剤（Putney, S.D. et al. Nature Biotechnology 1998, 16, 153-157)では一般に必要な投薬量が抑えられるが、それでも尚、注射や、より好ましくない形の送達に依拠している。体内での半減期が長い治療タンパク質であれば、持続放出製剤とほとんど同じ態様で、血中レベルをより安定に維持でき、しかし持続放出製剤を調製する際の面倒も伴わなず、分解が遅いために投薬量を少なくできるであろう。例えば、インターフェロン（IFN-ガンマ）及びインターロイキン-2（IL-2）などのサイトカインは、より効果的であり、毒性も低く、またそれらの血中での存在期間を延長できれば、より少量にして使用できるであろう。
【０００５】
発明の概要
本発明の局面の一つは、血清アルブミンタンパク質又はその相同体に挿入された生物活性異種ペプチドフラグメントを含んで成るキメラポリペプチドを提供するものである。前記異種ペプチドフラグメントは、選択的には、前記血清アルブミンタンパク質配列の一部を置換するものでもよい。前記血清アルブミンタンパク質配列の一部を置換するペプチドフラグメントは、置換する相手のフラグメントと同じ長さである必要はない。この局面に基づくキメラポリペプチドには、血清アルブミンタンパク質配列の一部を置換する二個以上の異種ペプチドフラグメントを含めてもよい。これら含められたフラグメント同士は、同一であっても、血清アルブミンタンパク質に無関係のタンパク質を由来とする別個の配列であっても、又は、無関係の起源の別個の配列であってもよい。
【０００６】
この局面に基づくキメラポリペプチドは、例えば構造A-B-Cを含んで成っていてもよく、但し式中Aは、一血清アルブミンタンパク質又はその相同体の第一フラグメントを表し、Bは生物活性異種ペプチド配列を表し、そしてCは一血清アルブミンタンパク質又はその相同体の別のフラグメントを表す。同様に、キメラポリペプチドは、構造A-B-C-D-Eを含んで成っていてもよく、但し式中、A、C、及びEは、一血清アルブミンタンパク質の数フラグメントを表し、そしてB及びDは、同一の生物活性異種ペプチド配列、血清アルブミンタンパク質に無関係の一タンパク質の二つの異なる生物活性配列、又は、血清アルブミンタンパク質に無関係の二つの異なるタンパク質の二つの異なる生物活性配列、を表す。同様に、キメラポリペプチドは構造A-B-C-D-E-F-Gを含んで成っていてもよく、但し式中、A、C、E、及びGは、一血清アルブミンタンパク質の数フラグメントを表し、そしてB、D、及びFは、同一の生物活性異種ペプチド配列、血清アルブミンタンパク質に無関係の一タンパク質の少なくとも二つの異なる生物活性配列、又は、血清アルブミンタンパク質に無関係の二つの異なるタンパク質の少なくとも二つの異なる生物活性配列、を表す。いくつかの実施態様では、血清アルブミンの一ペプチドフラグメント、又は、異種ペプチド配列は、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、又は少なくとも１８個のアミノ酸を含有するものである。
【０００７】
キメラポリペプチドは、例えば-HN-(A-B-C)_n-CO- 又は H₂N-(A-B-C)_n-CO₂Hなど、構造(A-B-C）_nを含んで成っていてもよく、但し式中、Aはそれぞれ個別に血清アルブミン（SA）の一フラグメントを表し、Bはそれぞれ個別に生物活性異種ペプチド配列を表し、Cはそれぞれ個別に第二生物活性異種ペプチド配列又は血清アルブミン（SA）の一フラグメントを表し、そしてnは0より大きい整数である。いくつかの実施態様では、血清アルブミンの一ペプチドフラグメント又は異種ペプチド配列は、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、又は少なくとも１８個のアミノ酸を含有するものである。
【０００８】
代替的には、このようなキメラポリペプチドは、一血清アルブミンタンパク質又はその相同体のＮ末端フラグメント、生物活性異種ペプチド配列、及び、一血清アルブミンタンパク質又はその相同体のＣ末端フラグメントを含んで成っていてもよい。
【０００９】
このように、一局面では、本発明は、生物活性異種ペプチド配列を中に挿入して有する血清アルブミンタンパク質(SA）を含んで成るキメラポリペプチドであって、前記異種ペプチド配列自体に比較して上昇した生物活性を示すキメラポリペプチドを提供するものである。
【００１０】
関連する局面では、本発明は構造A-B-Cを有するキメラポリペプチドを提供するものであり、但し式中、Aは、血清アルブミン(SA）の第一フラグメントを表し；Bは生物活性異種ペプチド配列を表し；そしてCはSAの第二ペプチドフラグメントを表し；この場合当該キメラペプチドは、前記異種ペプチド配列自体に比較して上昇した生物活性を示す。
【００１１】
別の関連する局面では、本発明は、血清アルブミン（SA）タンパク質のＮ末端フラグメントを含んで成る第一ペプチドフラグメントと；生物活性異種ペプチド配列を含んで成る第二ペプチドフラグメントと；SAのＣ末端フラグメントを含んで成る第三ペプチドフラグメントと、を含んで成るキメラポリペプチドを提供するものであり、但しこの場合、当該キメラペプチドは、前記異種ペプチド配列自体に比較して上昇した生物活性を示す。
【００１２】
前記異種ペプチド配列は、アンジオスタチン、エンドスタチン、又はこれらのペプチドフラグメントから選択することのできる、血管新生抑制タンパク質又はポリペプチドの一フラグメントを含んで成るものでもよい。
【００１３】
別の実施態様では、前記異種ペプチド配列は、細胞表面受容体タンパク質に結合することができる。このような受容体タンパク質の例には、Ｇタンパク質共役受容体、チロシンキナーゼ受容体、サイトカイン受容体、MIRR受容体、及びオーファン受容体、がある。
【００１４】
別の実施態様では、本キメラポリペプチドは、細胞外受容体又はイオンチャネルに結合することができる。本キメラポリペプチドは、細胞外受容体又はイオンチャネルのアゴニストであっても、又はアンタゴニストであってもよい。この実施態様のキメラポリペプチドは、例えばアポトーシスを誘導する、細胞増殖を調節する、又は細胞種の分化を調節する、などのものでもよい。
【００１５】
前記異種ペプチド配列は、約３乃至約５００残基長、又は、約４乃至約４００残基長でもよく、好ましくは約４乃至約２００残基、より好ましくは約４乃至１００残基、そして最も好ましくは約４乃至約２０残基である。
【００１６】
ある実施態様では、本キメラポリペプチドの三次構造は、天然SAの三次構造と同様である。
【００１７】
ある実施態様では、本キメラポリペプチドは、１０日間以上、好ましくは約１４日間以上、そして最も好ましくは、天然血清アルブミンタンパク質又はその相同体の半減期の５０％以上である、血中半減期を有する。
【００１８】
別の実施態様では、挿入されるペプチド配列は、天然SA配列の一部を置換する。挿入されるペプチド配列と、天然SA配列のうちの置換される部分の長さは等しくなくともよい。
【００１９】
別の実施態様では、本キメラポリペプチドは、生物活性異種ペプチド配列単独よりも、少なくとも１０倍、より好ましくは１００倍、そして最も好ましくは１０００倍又はそれ以上の活性を有する。
【００２０】
さらに本発明は、構造（A-B-C）_nを有するキメラポリペプチドを包含し、但し式中、Aは、それぞれ個別に、血清アルブミン（SA）の一フラグメントを表し；Bは、それぞれ個別に、生物活性異種ペプチド配列を表し；Cは、それぞれ個別に、第二生物活性異種ペプチド配列又は血清アルブミン(SA）の一フラグメントを表し；そしてnは0より大きい整数である。
【００２１】
ある実施態様では、B及びCは同一の配列を含んで成る。別の関連する実施態様では、B及びCはある一個のタンパク質の数フラグメントを含んで成る。さらに別の関連する実施態様では、B及びCは二つの異なるタンパク質の数フラグメントを含んで成る。
【００２２】
さらに本発明は、少なくとも二つの生物活性異種ペプチド配列を中に挿入して有する血清アルブミンタンパク質（SA）を含んで成るキメラポリペプチドも提供するものである。
【００２３】
ある実施態様では、前記異種ペプチド配列は同一である。別の関連する実施態様では、前記異種ペプチド配列は、一タンパク質のうちの別個の配列を含んで成る。さらに別の関連する実施態様では、前記異種ペプチド配列は、少なくとも二つの異なるタンパク質由来の配列を含んで成る。
【００２４】
ある実施態様では、前記生物活性異種ペプチド配列は、血清アルブミンタンパク質のシステイン・ループに挿入される。前記システイン・ループは、Cys⁵³-Cys⁶²、Cys⁷⁵-Cys⁹¹、Cys⁹⁰-Cys¹⁰¹、Cys²⁴⁵-Cys²⁵³、Cys²⁶⁶-Cys²⁷⁹、 Cys³⁶⁰-Cys³⁶⁹、Cys⁴⁶¹-Cys⁴⁷⁷、 Cys⁴⁷⁶-Cys⁴⁸⁷、及びCys⁵⁵⁸-Cys⁵⁶⁷から選択することができる。
【００２５】
ある実施態様では、前記生物活性異種ペプチド配列は、血清アルブミンタンパク質のシステイン・ループの一部を置換するものである。そしてこのシステイン・ループは、Cys⁵³-Cys⁶²、Cys⁷⁵-Cys⁹¹、Cys⁹⁰-Cys¹⁰¹、Cys²⁴⁵-Cys²⁵³、Cys²⁶⁶-Cys²⁷⁹、 Cys³⁶⁰-Cys³⁶⁹、Cys⁴⁶¹-Cys⁴⁷⁷、 Cys⁴⁷⁶-Cys⁴⁸⁷、及びCys⁵⁵⁸-Cys⁵⁶⁷から選択することができる。
【００２６】
ある実施態様では、前記生物活性異種ペプチドは、mycエピト-プ又はRGDペプチドである。
【００２７】
さらに本発明は、上述した通りのキメラポリペプチドをコードする核酸配列も包含する。
【００２８】
さらに本発明は、本キメラポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る、ウィルス又はレトロウィルスベクタなどの送達ベクタを包含するものである。適したベクタには、例えばアデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、又はワクシニアウィルスが含まれよう。
【００２９】
さらに本発明は、本発明の送達ベクタに暴露してある標的細胞も包含する。前記標的細胞は、血球、骨格筋細胞、幹細胞、皮膚細胞、肝細胞、分泌線細胞、造血細胞、又は骨髄細胞から選択することができる。
【００３０】
さらに本発明は、薬学的に許容可能な賦形剤及び上に記載した通りのキメラポリペプチドを含んで成る医薬組成物と、このような医薬組成物を生物に有効量を投与することにより、前記生物の疾患を治療する方法も包含する。
【００３１】
ある局面では、本発明は、生物の疾患を治療する方法を提供するものであり、前記方法は、（ｉ）本発明のキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を含んで成る送達ベクタを提供するステップと、（ｉｉ）標的細胞を誘導して前記ポリペプチドを発現させるのに充分な条件下で、前記ベクタを前記標的細胞にin vivoで導入するステップと、を含む。
【００３２】
別の局面では、本発明は、（ｉ）本発明のキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を含んで成る送達ベクタを提供するステップと、（ｉｉ）前記ベクタを標的細胞にex vivoで導入するステップと、（ｉｉｉ）前記標的細胞を誘導して前記ポリペプチドを発現させるのに充分な条件下で、導入されたベクタを含有する前記標的細胞を、生物に導入するステップと、を含む、前記生物の疾患を治療する方法を提供する。
【００３３】
ある実施態様では、前記標的細胞は、血球、骨格筋細胞、幹細胞、皮膚細胞、肝細胞、分泌線細胞、造血細胞、又は骨髄細胞から選択される。
【００３４】
現在好適な実施態様では、本発明に基づくキメラポリペプチドは、アンジオスタチン又はエンドスタチンなどの血管新生抑制タンパク質の一フラグメントを、異種ペプチド配列として含んで成り、血管新生を抑制することができる。例えば、血管新生を抑制し、当該ポリペプチドに導入してもよいペプチドフラグメントはRGD (Arg-Gly-Asp)であるか、又は、RGDを含有する配列（例えばVRGDF、配列番号 1)である。同様の方法は、細胞増殖、細胞分化、及び細胞死などの状態を調節するのに用いてもよい。
【００３５】
現在好適な実施態様では、本発明は、導入された遺伝物質が生物のトランスフェクトされた細胞で発現するよう、血清アルブミンタンパク質又はそのセグメントと、一種以上の治療タンパク質もしくはポリペプチド又はそのフラグメントとを含んで成るキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を、生物の細胞に導入することにより、生物の疾患を治療する方法を提供するものである。同様の方法は、細胞増殖、細胞分化、及び細胞死などの状態を調節するのに用いてもよい。
【００３６】
別の局面では、本発明は、遺伝物質を細胞内に導入するのに充分な条件下で、血清アルブミンタンパク質又はそのセグメントと、一種以上の治療タンパク質もしくはポリペプチド又はそのフラグメントとを含んで成るキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を、標的細胞にex vivoで導入して、前記タンパク質又はポリペプチドをコードする前記遺伝物質を前記細胞に発現させることにより、生物の疾患を治療する方法を提供するものである。次に、前記タンパク質又はポリペプチドをコードする導入された遺伝物質が生物の標的細胞で発現するよう、前記標的細胞を宿主生物に導入する。前記標的細胞は、血球、骨格筋細胞、平滑筋細胞、幹細胞、皮膚細胞、肝細胞、分泌線細胞、造血細胞、及び骨髄細胞からなる群より選択してよい。
【００３７】
本発明の別の局面は、本発明のキメラポリペプチドを医薬製剤として生物に投与するステップを含む、前記生物において細胞増殖、細胞分化、及び細胞死のうちの一つ以上を調節する方法を提供するものである。
【００３８】
本発明の別の局面は、（ｉ）本発明のキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を含んで成る送達ベクタを提供するステップと、（ｉｉ）標的細胞を誘導して前記ポリペプチドを発現させるのに充分な条件下で、前記ベクタを前記標的細胞にin vivoで導入するステップと、を含む、生物において細胞増殖、細胞分化、及び細胞死のうちの一つ以上を調節する方法を提供するものである。
【００３９】
本発明の別の局面は、本発明のキメラタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸を含んで成る送達ベクタに暴露してある標的細胞を含んで成るトランスフェクトされた細胞を提供するものである。これらの細胞は、好ましくは、血球、骨格筋細胞、平滑筋細胞、幹細胞、皮膚細胞、肝細胞、分泌線細胞、造血細胞、及び骨髄細胞からなる群より選択される。
【００４０】
いくつかの実施態様では、生物活性ペプチド配列を含んで成る本発明のキメラポリペプチドは、例えば血清アルブミンタンパク質に融合させていないなどの当該生物活性ペプチド配列自体よりも効力がある。例えば、血清アルブミンタンパク質の一部に挿入する、又は、置換させる生物活性ペプチド配列は、例えば、１桁、２桁、さらには３桁分、活性が高いなど、当該の生物活性ペプチド配列単独よりも、１０倍、１００倍、又はさらには１０００倍、活性が高くてもよい。このように、当該生物活性ペプチド配列がある生物活性を抑制するような実施態様では、本キメラポリペプチドのIC₅₀は、当該生物活性ペプチド配列単独の場合のIC₅₀の１０分の１、１００分の１、又はさらには１，０００分の１であってもよく、そして当該生物活性ペプチド配列がある生物活性を誘導又は促進するような実施態様では、本キメラポリペプチドのEC₅₀は、当該生物活性ペプチド単独の場合のEC₅₀の１０分の１、１００分の１、又はさらには１，０００分の１であってもよい。当該生物活性ペプチド配列が核酸、ペプチド又は糖質などの生物学的分子に結合する実施態様では、本キメラポリペプチドと、それが結合する先の前記生物学的分子の間の解離定数K_dは、前記生物学的分子と、当該生物活性ペプチド単独の場合の間のK_dの１０分の１、１００分の１、又はさらには１０００分の１であってもよく、例えばこれらの二者の物質の結合の方が、それらの解離よりも次第に有利になるなどである。
【００４１】
発明を実施するための最適な様態
発明の詳細な説明
概観
ここに開示された系及び方法は、血清アルブミン（SA）のセグメントと生物活性異種ペプチド配列のセグメントとを含有するキメラポリペプチドを作製することにより、血流中の治療ポリペプチドの寿命を増加させることに関する。SAは循環系の主要なタンパク質構成成分であり、約三週間という血中半減期を有し(Rothschild, M.A. et al. Hepatology 1988, 8, 385-401)、大量（血清1L当たり40g）に存在する。さらに、正常な成人ヒト肝は、一日当たり約15グラムのヒト血清アルブミン（HSA）、又は、体重１キログラム当たり約200mg当たりを産生することも知られている。血清アルブミンは何の免疫学的活性又は酵素機能を有さず、多くの天然及び治療分子を輸送するのに用いられる天然の担体タンパク質である。治療ポリペプチドを血清アルブミンに共有結合させた融合タンパク質が、治療ペプチド自体の半減期よりも数倍長い血清半減期を有することが示されている (Syed, S. et al. Blood 1997, 89, 3243-3252; Yeh, P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 1904-1908)。引用した両方の文献において、この融合タンパク質の半減期は、治療ポリペプチド自体のそれの１４０倍を越え、融合させていない血清アルブミンの半減期に近かった。さらに、血清アルブミンのアミノ末端部分は、特に効率的な転位を起こして、この融合タンパク質の輸送しやすいことが真核細胞中で見出されている (PCT公報 WO 90/13653)。大まかに言ってこのことは、遊離治療ポリペプチド自体よりも、このようなタンパク質を製造する細胞の方が、より効率的にこのようなタンパク質を分泌することを意味する。
【００４２】
薬物送達の観点からは、血清アルブミンは全身の組織及び分泌物中に見られるため、血清アルブミンタンパク質のキメラポリペプチドには大きな可能性がある。例えば、血清アルブミンは、肝臓、腸管、腎臓及び脳などの臓器への、臓器−血流間の界面を横切った化合物の輸送を担っていることが公知である。このように、血清アルブミンのキメラタンパク質は、厄介な血液脳関門すら横切って、体内のどこであっても、その生物活性を発現するであろう。
【００４３】
SAの三次元構造及び化学的性質がよく研究されてきた(Carter, D.C. et al. Eur. J. Biochem. 1994, 226, 1049-1052; He, X.M. et al. Nature 1992, 358, 209-215; Carter, D.C. et al. Science 1989, 244, 1195-1198)。従って、上述のような単純な２成分による融合タンパク質に依拠するのではなく、SAタンパク質の数部分を、治療ポリペプチドに戦略的又はコンビナトリアル法的に置換してもよいだろう。例えば、ループの構造を変更しても、当該タンパク質全体の三次構造への影響は最小限だろうという予測に基づき、システインで拘束されたループを、置換対象に選択してもよい。図４A−Iは、マウス血清アルブミンタンパク質にある、いくつかのこのようなループの位置を示す。このようなループ内の効果的な置換及び挿入を下の例で解説する。本発明は、図４A−Iに示したループのいずれか一つ、又は、このようなループの何らかの組合せ、で行う挿入又は置換を考察している。いくつかの実施態様では、挿入又は置換対象に選択されるループは、分子間相互作用が容易に起きるよう、血清アルブミンタンパク質の表面にあるか、又は表面近傍に位置している。当業者であれば、これらの技術を、例えばウシ、ヒトなどの他の血清アルブミンタンパク質など、他の血清アルブミンタンパク質に、容易に応用できることであろう。
【００４４】
コンビナトリアル変異誘発を、構造を動機にしたグラフト法と組み合わせる技術を用いれば、生物活性ペプチドフラグメントを含有すると共に、三次構造が血清アルブミンと実質的に同様である数多くの関連ポリペプチドのライブラリをランダムに作製することができる。例えば、本発明のキメラポリペプチドに、ある生物活性異種ペプチド配列を、ある血清アルブミンタンパク質のペプチド配列に挿入した状態で含めてもよい。挿入される配列は、選択的に、前記血清アルブミン配列の一部を置換してもよく、この場合、この部分は同様な長さでも、又は異なる長さでもよい。場合によっては、所望の生物活性を得るのに、２箇所以上の挿入が必要かも知れない。代替的には、生物活性異種ペプチド配列を、ある血清アルブミン配列のうちの２つのフラグメントの間に配置して、このようなキメラポリペプチドを作製してもよい。選択に応じ、一つ以上の更なる生物活性ペプチド配列を、血清アルブミンタンパク質のフラグメント同士の間に配置してもよい。さらに本発明のキメラポリペプチドは、一方の側を血清アルブミンタンパク質のＮ末端フラグメントで、そして他方の側を血清アルブミンタンパク質のＣ末端フラグメントでフランクされた生物活性異種ペプチド配列である、と描写してもよい。
【００４５】
このようなキメラポリペプチドの長所は、血清アルブミンタンパク質に構造が似ているために、既知の融合タンパク質よりも効果的に、外来ペプチドを分解する生物学的機序からこれらのペプチドをカモフラージュするであろうという点である。その理由は、当該の外来ポリペプチドフラグメントは、生物に広汎に存在するタンパク質と実質的に同様なタンパク質上に載っているからである。このようなタンパク質は、血清アルブミンの有利な特徴（免疫原性のないこと、高レベルの発現、効率的な分泌、及び長い半減期）を留めている一方で、更なる所望の生物学的機能を支援するであろう。
【００４６】
このようなキメラポリペプチドの多くの治療上の用途は、当業者には明白であろう。例えば、細胞増殖を抑制するペプチドフラグメントを含めると、当業者に公知の、細胞増殖を特徴とする癌等の疾患の治療に役立つであろう。特定の細胞種への未成熟細胞の分化を調節するペプチドフラグメントを含めると、神経損傷及び神経変性疾患などの神経学的状態、膵臓組織の過形成性及び新形成性障害、並びに組織の望ましくない増殖及び分化を特徴とする他の状態、の治療に効果的であろうキメラポリペプチドを作製できるであろう。アポトーシスを誘導するペプチドフラグメントを含めると、癌等の望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患や、アポトーシス治療に適すると当業者に公知である他の状態を治療する上で効果的なポリペプチドを提供できるであろう。アンジオスタチン又はエンドスタチンのフラグメントなど、抗血管新生性ペプチドフラグメントを含めると、血管新生の結果生じる、又は、血管新生で可能となる癌等の状態の治療に有用なキメラポリペプチドを作製できるであろう。
【００４７】
定義
用語「ペプチド」とは、単量体がアミド結合で互いに結合されたアミノ酸（通常はアルファ-アミノ酸）であるオリゴマーを言う。ペプチドは二つ以上のアミノ酸単量体の長さであるが、５乃至１０アミノ酸単量体長であることが多く、さらに長く、即ち最長２０アミノ酸長又はそれ以上であることもあるが、２０個のアミノ酸長を越えるペプチドは「ポリペプチド」と呼ばれることが多い。用語「タンパク質」は当業で公知であり、通常、大変大型のポリペプチドを言うか、又は、何らかの生物学的機能を有する、一組の会合した同種又は異種のポリペプチドを言う。本発明の目的のためには、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、三種類すべてがまとめてペプチドと呼ばれるため、概ね交換可能である。
【００４８】
タンパク質及びポリペプチドを言うのにここで用いる交換可能な用語「融合」及び「キメラ」とは、二つの個々のポリペプチド又はその部分が融合されて一個のアミノ酸鎖を形成しているポリペプチド又はタンパク質に関する。このような融合は、組換えＤＮＡ技術により形成された一本の連続したコーディング配列を発現させることで、起こさせてもよい。このように、「融合」ポリペプチド及び「キメラ」ポリペプチドは、第一のポリペプチドのいずれのドメインにとっても外来であり、かつ実質的に相同でないポリペプチドドメインを規定する一つ以上のアミノ酸配列に、アミド結合を介して共有結合した第一のポリペプチドを含んで成る連続したポリペプチドを包含するものである。
【００４９】
融合タンパク質をコードする遺伝子コンストラクトも同様に、「キメラ遺伝子」又は「融合遺伝子」と呼ばれる。
【００５０】
「相同性」及び「同一性」はそれぞれ、二つのポリペプチド配列間の配列の類似性を言い、同一性がより厳密な比較である。相同性及び同一性はそれぞれ、比較を目的にアライメントし得る各配列中のある一つの位置を比較することで、決定できる。比較した配列中のある位置が、同じアミノ酸残基で占められていれば、それらポリペプチドはその位置において同一であると言うことができる。同等の部位が同じアミノ酸（例えば同一）か、又は、類似のアミノ酸（例えば立体及び／又は電子的性質が類似であるなど）で占められていれば、これら分子はその位置において相同であると言うことができる。配列間の相同性又は同一性のパーセンテージは、それら配列間に共通の対合する又は相同な位置の数の関数である。「無関係の」、「異種の」、又は「非相同の」配列は、比較する相手の配列に対し、同一性が４０パーセント未満であり、好ましくは同一性が２５パーセント未満である。このように、「異種のペプチド配列」とは、比較する相手の配列に対して実質的に類似でないペプチド配列である。
【００５１】
用語「血清アルブミン(SA)」には、生物の血清アルブミンタンパク質、好ましくは哺乳動物血清アルブミン、さらにより好ましくは、ヒト血清アルブミン（HSA）の公知又は未発見の多型及びそのバリアントが包含される（しかし必ずしも限定はされない）ものと、意図されている。例えば、ヒト血清アルブミンNaskapi はLys-372 をGlu-372の代わりに有し、アルブミンクライストチャーチは改変されたプロ配列を有する。用語「バリアント」には、配列中に小さな人工的変更を加えたSAタンパク質の相同体（例えば、１箇所又は２、３箇所の残基を欠失させた分子、残基の保存的置換もしくは小規模な挿入を有する分子、又は、アミノ酸構造の小規模な変更を有する分子など）も包含される（しかし必ずしも限定はされない）ものと、意図されている。このように、天然SAに対して80%、85%、90%、又は99% の相同性を有するポリペプチドは、「バリアント」と見なされる。さらに、このようなバリアントが、天然SAと共通の薬理学的実用性を少なくとも一つ有することも好適である。薬理学的な使用を意図した推定上のバリアントはいかなるものも、治療しようとする動物（特にヒト）にとって非免疫原性でなくてはならない。ヒト、ウシ、マウス、ブタ、ウマ、ヒツジ、及びニワトリ血清アルブミンを含め、数多くの考察された血清アルブミンタンパク質の配列は、GenBank（ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション）から得ることができる。
【００５２】
用語「天然」は、生物中で天然で生ずるタンパク質を記述するために用いられる。従って野生型タンパク質は天然タンパク質である。非天然であるタンパク質は、人工的な突然変異、組換えデザイン、又は他の研究室での改変により作製されたものであり、天然集団中では未知のものである。
【００５３】
「保存的置換」は、ポリペプチド化学の当業者が、当該ポリペプチドの少なくとも二次構造、そして好ましくは三次構造は実質的に変わらないままであろうと予測するような、一つ以上のアミノ酸の、同様の性質を有する他のものへの置換である。例えば、典型的なこのような置換には、アスパラギンのグルタミンへの置換、セリンのアスパラギンへの置換、そしてアルギニンのリシンへの置換、がある。用語「生理的に機能的な同等物」は、さらに、天然配列と、そのＮ末端の更なる配列とを含んで成る、より大型の分子（例えばプロ-HSA、プレ-プレ-HSA、及びmet-HSA）も包含する。
【００５４】
「三次構造」とは、タンパク質の三次元構造を言う。同様な三次構造を有するタンパク質は、たとえアミノ酸配列（「二次構造」）が同一でなくとも、同様な形状及び表面を有するであろう。三次構造は、アミノ酸鎖同士の折り畳み及びねじれの結果であり、例えば強酸もしくは強塩基などの化学的手段、又は、加熱などの物理的手段により破壊することができる。
【００５５】
用語「生物活性のある」とは、分子レベルで生物と何らかの態様で相互作用する実体を言う。生物活性のある実体は、受容体を活性化したり、免疫反応を惹起したり、膜又はイオンチャンネルと相互作用したり、又は、生物もしくは生物の何らかの部分の生物学的機能の変化を誘導するであろう。
【００５６】
用語「リガンド」とは、受容体などの特定のタンパク質が認識する分子を言う。あるタンパク質と結合する又は反応する物質は「リガンド」と呼ばれるため、この用語は酵素の基質や、触媒反応の反応物も包含する。用語「リガンド」は、問題となる物質がタンパク質と結合又は相互作用することができる以外には、何ら特定の分子サイズ又は構造上もしくは組成上の特徴を暗に意味するものではない。「リガンド」は、当該タンパク質が結合する天然リガンドか、又は、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用するであろう機能的類似体のいずれかとして、役に立つであろう。
【００５７】
用語「ベクタ」とは、宿主細胞内で複製が可能であり、遺伝子を挿入して組換えDNA分子を作製できるDNA分子を言う。ベクタの例には、プラスミド、ウィルスなどの感染性微生物、又は、リガンド-DNA結合体、リポソーム、もしくは脂質-DNA複合体などの非ウィルスベクタ、がある。
【００５８】
ここで用いる「細胞表面受容体」とは、細胞表面上に発生し、細胞外環境と相互作用し、そして（直接又は間接的に）この環境に関する情報を、細胞内セカンドメッセンジャの活性又は特定のプロモータの転写を調節できるような態様で、細胞内に輸送もしくは伝達することで、特定の遺伝子の転写を起こさせる分子を言う。
【００５９】
ここで用いる「細胞外シグナル」には、細胞外環境内の分子又は他の変化であって、当該シグナルと直接もしくは間接的に相互作用した細胞表面タンパク質を介して細胞内に伝達される分子又は他の変化が含まれる。細胞外シグナル又はエフェクタ分子には、細胞表面タンパク質の活性を何らかの態様で変えるあらゆる化合物又は物質が含まれる。このようなシグナルの例には、限定はしないが、細胞表面及び／又は細胞内受容体及びイオンチャネルに結合して、このような受容体及びチャネルの活性を調節する、アセチルコリン、成長因子及びホルモン、脂質、糖類及びヌクレオチドなどの分子がある。
【００６０】
ここで用いる「細胞外シグナル」には、さらに、細胞受容体の活性を調節することで、細胞内機能に影響を与えるような未同定の物質も含まれる。このような細胞外シグナルは、特定の細胞表面受容体の活性を調節することにより、特定の疾患を治療するのに使用できると思われる潜在的な薬理物質である。
【００６１】
「オーファン受容体」とは、具体的な天然リガンドが記述されたことがない、及び／又は、その機能が決定されていない受容体に与えられた名称である。
【００６２】
用語「標的細胞」とは、ここで用いる場合、外因性遺伝物質を導入したいin vivo又はex vivoのいずれかの細胞を意味する。標的細胞は、血球、骨格筋細胞、幹細胞、皮膚細胞、肝細胞、分泌線細胞、造血細胞、及び骨髄細胞を含め、いかなる種類の細胞であってもよい。
【００６３】
目的の治療法に関して言う、ある融合ポリペプチドの「有効量」とは、所望の投薬計画の一部として適用した場合に、臨床上許容可能な標準に従って障害を軽減又は治癒させるような血管新生の抑制をもたらす、製剤中の前記ポリペプチドの量を言う。
【００６４】
ここで用いる「血清半減期」とは、血流中のあるペプチドの半分の量が分解するのに必要な時間を言う。
【００６５】
文言「ある血清アルブミンタンパク質に挿入される生物活性ペプチド配列」中の文言「挿入される」は、第二の配列の二つのアミノ酸間に、第一の配列を挿入することと、第二の配列の一個以上のアミノ酸を、第一の配列のアミノ酸と置換すること（例えば第二の配列の一個以上のアミノ酸を、同じ又は異なる数のアミノ酸を有する第一のアミノ酸配列に置換するなど）の両方を含むのに用いられており、但し後者を明確に除外する場合は例外である。
【００６６】
用途の例
上述したように、本発明のキメラポリペプチドは、血清アルブミンの少なくとも一部に相同な配列と、一個以上の異種タンパク質の少なくとも一部分とを含有するキメラポリペプチドを、一個の連続したポリペプチド鎖として発現させることで、構築できる。本キメラポリペプチドを作製するには、血清アルブミン、異種タンパク質、及び選択に応じ、前記フラグメント同士の間を埋めるためのペプチドリンカ配列、のそれぞれ少なくとも一つの配列をコードするDNAを含んで成る融合遺伝子を構築する。２個以上の異種配列を本キメラポリペプチドに含める場合、これらは同一の配列でも、関係がある配列でも、又は無関係の配列でもよい。同一の配列を含めると、当該配列の有効濃度を高めることができるであろう。関係のある配列を含めると、由来となった元の天然タンパク質をより精確に模倣できるであろう。無関係の配列は、同じ応答を刺激するのに二つ以上の別個の受容体を活性化したり、又は、２種以上の別個の活性を本キメラポリペプチドに付与するために、有用であろう。例えば、本キメラポリペプチドに、抗血管新生活性を有する配列と、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する配列とを含めてもよいであろう。
【００６７】
このキメラポリペプチドを作製するには、あるタンパク質全体をクローンし、該タンパク質の一部として発現させるか、又は代替的に、生物活性部分を含有するその適したフラグメントを用いることもできる。翻訳産物が所望のキメラポリペプチドとなる、組換えDNA技術を用いて融合遺伝子を作製する方法は、当業で公知である。ある遺伝子のコーディング配列と、その調節領域の両方は、タンパク質産物の機能的性質、作製するタンパク質量、又は、タンパク質を産生させる細胞種、を変更するために、設計しなおすことができる。ある遺伝子のコーディング配列は、例えばその一部を異なる遺伝子のコーディング配列に融合して、ある融合タンパク質をコードする新規なハイブリッド遺伝子を作製するなどにより、広汎に変更することができる。融合タンパク質を作製する方法の例は、すべて引用をもってここに援用することとするPCT 出願PCT/US87/02968、PCT/US89/03587 及び PCT/US90/07335や、Traunecker et al. (1989) Nature 339:68に解説されている。
【００６８】
融合遺伝子を作製する技術は公知である。基本的には、様々なポリペプチド配列をコードする様々なDNA断片の接合は、平滑末端又は付着末端を連結に用いる、制限酵素消化により、適した末端にする、適宜付着末端を充填する、アルカリホスファターゼ処理を行って好ましくない接合を避ける、及び、酵素連結を行うといった従来技術に従って行われる。代替的には、自動DNA合成装置を含め、従来技術によっても、融合遺伝子を合成できる。別の方法では、遺伝子断片のPCR増幅を、二つの連続する遺伝子断片の間に相補的な突出末端を生じさせるアンカープライマを用いて行うことができ、その後これらの突出末端をアニールすれば、キメラ遺伝子配列を作製できる（例えば Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992を参照されたい)。
【００６９】
さらに本発明は、本キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、少なくとも一つの調節配列に作動上連結した状態で含んで成る発現ベクタも提供する。「作動上連結した」とは、当該ヌクレオチド配列が、調節配列に、当該ヌクレオチド配列の発現が可能な態様で連結していることを意味するものと、意図されている。調節配列は当業で公知であり、コードされたポリペプチドの発現を命令するよう、選択される。従って、調節配列という用語には、プロモータ、エンハンサ及び他の発現調節配列が含まれる。調節配列の例はGoeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に解説されている。例えば、発現制御配列、即ち、作動上連結した先のDNA配列の発現を制御するような多種の配列のいずれも、本発明のキメラポリペプチドをコードするDNA配列を発現させるために、これらのベクタで用いてよい。このような有用な発現制御配列には、例えば、SV40の初期及び後期プロモータ、アデノウィルス又はサイトメガロウィルス最初期プロモータ、lac系、trp系、TACもしくはTRC系、発現がT7 RNAポリメラーゼの命令を受けるT7プロモータ、ファージラムダの主要なオペレータ及びプロモータ領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素のプロモータ、Pho5など、酸ホスファターゼのプロモータ、酵母α接合因子のプロモータ、バキュロウィルス系のポリへドロンプロモータ、及び、原核もしくは真核細胞又はそれらのウィルスの遺伝子発現を制御することが公知の他の配列、並びにこれらの組合せ、がある。発現ベクタのデザインは、形質転換させようとする宿主細胞の選択、及び／又は、発現させたいタンパク質の種類などの因子に依存するであろうことは、理解されねばならない。さらに、ベクタのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び、抗生物質マーカなど、ベクタにコードされた何らかの他のタンパク質の発現も、考察しなければならない。
【００７０】
明白であろうが、当該遺伝子コンストラクトを用いると、本キメラポリペプチドを培養で増殖させた細胞で発現させて、例えば精製に向けて本キメラポリペプチドを産生させることができる。これは、研究用途、臨床用途及び製薬用途などのために、本ポリペプチドを大量に調製する方法となる。
【００７１】
いくつかの治療用途では、ex vivoで得たキメラポリペプチドを、一般的な治療に適した態様で利用する。このような治療法の場合、本発明のポリペプチドを、全身及び局所又は局部投与を含め、多種の投与形態に向けて調合することができる。このような実施態様では、本ポリペプチドを、無発熱源医薬品添加物などの薬学的に許容可能な医薬品添加物と配合してもよい。技術及び処方は概略的には Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PAに見られよう。全身投与の場合、筋肉内、静脈内、腹腔内、及び皮下注射を含め、注射が好ましく、本発明のポリペプチドは、液体の溶液、好ましくはハンクス溶液又はリンガー液などの生理的に適合性ある緩衝液中に調合できる。加えて、本ポリペプチドを固体形で調合し、使用直前に再溶解又は懸濁させてもよい。凍結乾燥型も含まれる。
【００７２】
さらに全身投与は、経粘膜又は経皮手段で行うことができ、又は本化合物を経口投与することもできる。経粘膜又は経皮投与の場合、透過させようとする障壁に適した浸透剤を調合物中に用いる。このような浸透剤は当業で広く公知であり、例えば、経粘膜投与には胆汁酸塩及びフシジン酸塩誘導体がこれに含まれる。さらに界面活性剤を用いて浸透を促してもよい。経粘膜投与は鼻孔用スプレーを介したり、又は座薬を用いてもよい。経口投与の場合、本ペプチドをカプセル、錠剤、及び強壮剤などの従来の経口投与型に調合する。局所投与の場合、特に美容用調合物の場合、本発明のオリゴマーを軟膏、軟膏剤、ゲル、又はクリームに、当業で広く公知のように調合する。
【００７３】
ペプチドを投与する代替的な手段が開発されてきた。持続放出製剤 (Putney, et al. Nature Biotechnology 1998, 16, 153-157) が有利であり、投与回数も少なくてすみ、またしばしば投薬量も少なくてすむ。ペプチドの経口送達のための技術がレビューされており (Fasano, A. Trends in Biotechnology 1998, 16, 152-157)、ペプチドを送達するいくつかの部位特異的手段も同様である (Pettit, D.K. et al. Trends in Biotechnology 1998, 16, 343-349)。ペプチドの治療に向けた投与のための更なる技術は当業者に公知である。
【００７４】
本発明の遺伝物質は、例えば、細胞で転写されたときに所望のキメラポリペプチドを産生する発現プラスミドとして、送達することができる。
【００７５】
別の実施態様では、細胞内で転写させて本キメラポリペプチドを産生させることができる「発現」コンストラクトを用いて、前記遺伝物質を提供する。このような発現コンストラクトは、例えば、キメラポリペプチドをコードする遺伝物質をex vivo又はin vivoのいずれかで細胞に効果的にトランスフェクトさせることのできる調合物又は組成物など、生物学的に効果的な何らかの担体に入れて投与してもよい。そのアプローチには、組換えレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、及び単純疱疹ウィルス−１を含むウィルスベクタや、又は組換え細菌もしくは真核プラスミドに、アンチセンス核酸を挿入する方法がある。ウィルスベクタを用いると細胞を直接トランスフェクトできる。プラスミドDNAは、例えば陽イオン性リポソーム（リポフェクチン）又は誘導体化（例えば抗体に結合させた）ポリリジン結合体、グラミシジンＳ、人工ウィルスエンベロープ又は他のこのような細胞内担体などの助けを得て送達したり、遺伝子コンストラクトを直接注射したり、又は、in vivoでリン酸カルシウム沈降を行わせることにより、送達することができる。適した標的細胞の形質導入は遺伝子治療において重要な最初のステップであるため、具体的な遺伝子送達系の選択は、目的の標的の表現型、及び、局所又は全身などの投与経路といった因子に依存するであろうことは理解されよう。
【００７６】
当該タンパク質の一つをコードする遺伝物質を細胞にin vivo導入する好適なアプローチは、前記遺伝物質を含有するウィルスベクタの使用による方法である。ウィルスベクタへの細胞の感染には、標的細胞の大部分が核酸を受け取ることができるという長所がある。その上、ウィルスベクタに含まれた核酸など、ウィルスベクタ中の遺伝物質にコードされたキメラポリペプチドは、ウィルスベクタ核酸を取り込んだ細胞によって効率的に発現される。このような戦略は、骨格筋細胞がベクタの標的である場合に特に効果的であろう (Fisher, K.J. et al. Nature Medicine 1997, 3, 306-312)。
【００７７】
レトロウィルスベクタ及びアデノ随伴ウィルスベクタは、一般に、外因性遺伝子の、特にヒトへのin vivoでの移入に選択される組換え遺伝子送達系であると理解されている。これらのベクタは細胞への効率的な遺伝子送達を提供し、移入した核酸は宿主の染色体DNAに安定に組み込まれる。レトロウィルスを用いる際の主要な必須条件は、それらの使用上の安全性、特に、細胞集団中に野生型ウィルスが広がる可能性に関する安全性を、確実にすることである。複製欠陥レトロウィルスしか生じない特化細胞株（「パッケージング細胞」と呼ばれる）が開発されたことで、レトロウィルスの遺伝子治療への実用性が増し、欠陥レトロウィルスは遺伝子治療を目的とした遺伝子移入での使用について、よく特徴付けされている (レビューはMiller, A.D. (1990) Blood 76:271を参照されたい）。このように、レトロウィルスコーディング配列の一部（gag、pol、env）が、アンチセンスE6APコンストラクトの一つをコードする核酸に置換されているために、そのレトロウィルスが複製欠陥になっている組換えレトロウィルスを構築することができる。次に、この複製欠陥レトロウィルスをビリオンにパッケージすると、このビリオンを用いて、標準的な技術により、ヘルパウィルスを用いて標的細胞を感染させることができる。組換えレトロウィルスを作製するプロトコルや、このようなウィルスに細胞をin vitro又はin vivoで感染させるプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14、及び他の標準的な研究室用マニュアルに見ることができる。適したレトロウィルスの例には、当業者に公知の pLJ、pZIP、pWE 及び pEMがある。環境栄養性及び両栄養性レトロウィルス系の両方を作製するのに適したパッケージングウィルス株の例には、ψCrip、ψCre、ψ2及びψAmがある。レトロウィルスは、多種の遺伝子を、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋原細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの様々な細胞種に、in vitro及び／又はin vivoで導入するのに用いられてきた（例えば Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; 米国特許第4,868,116号；米国特許第4,980,286号；PCT 出願 WO 89/07136； PCT 出願 WO 89/02468；PCT 出願 WO 89/05345; 及び PCT出願 WO 92/07573を参照されたい）。
【００７８】
本キメラポリペプチドをコードする遺伝物質の遺伝子送達系としてレトロウィルスベクタを選択する場合は、大半のレトロウィルスに標的細胞を成功裡に感染させること、ひいては、遺伝物質の安定な導入、にとって必須条件は、標的細胞が分裂性でなければならないということに注目することが重要である。概して、この必須条件は、レトロウィルスベクタの使用の障害とはならないであろう。実際、このような感染に関する制約は、標的細胞の周囲の組織（例えば非形質転換細胞）が広汎な細胞分裂を行わず、従ってレトロウィルスベクタによる感染に不応性である状況で、有利な場合がある。
【００７９】
さらに、ウィルス粒子の表面上にあるウィルスパッケージングタンパク質を改変すれば、レトロウィルスの感染スペクトルや、結果的にはレトロウィルスベースのベクタの感染スペクトルを制限することが可能であることが示されている（例えばPCT公報 WO93/25234、WO94/06920、及びWO94/11524を参照されたい）。例えば、レトロウィルスベクタの感染スペクトルを改変する戦略には、細胞表面抗原に特異的な抗体をウィルスenvタンパク質に連結する(Roux et al. (1989) PNAS 86:9079-9083; Julan et al. (1992) J. Gen Virol 73:3251-3255; 及び Goud et al. (1983) Virology 163:251-254)；又は、細胞表面リガンドをウィルスenvタンパク質に連結する (Neda et al. (1991) J Biol Chem 266:14143-14146)といった戦略がある。連結は、タンパク質もしくは他の多種（例えばラクトースに連結してenvタンパク質をアシアロ糖タンパク質に転化させるなど）との化学的架橋の形でも、キメラタンパク質（例えば一本鎖抗体／envキメラタンパク質）の作製の形でもよい。この技術は、特定の細胞種の感染を制限又は指向させるのに有用であるが、環境栄養性ベクタを両栄養性ベクタに変化させるためにも用いることができる。
【００８０】
さらに、レトロウィルス遺伝子送達の使用は、レトロウィルスベクタの遺伝物質の発現を制御する組織特異的もしくは細胞特異的転写調節配列を用いると、さらに向上させることができる。
【００８１】
本発明で有用なもう一つのウィルス遺伝子送達系は、アデノウィルス由来のベクタを利用するものである。アデノウィルスのゲノムを操作して、目的の遺伝子産物をコードはしているが、正常な溶解ウィルス生命周期でのその複製能という点で不活化されているようにすることができる（例えば Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; 及び Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155を参照されたい）。 アデノウィルス株Ad タイプ5 dl324 又は他のアデノウィルス株（例えば Ad2、Ad3、Ad7、等）を由来とする適したアデノウィルスベクタが当業者に公知である。組換えアデノウィルスは、いくつかの状況で有利な場合があり、それはこれらが非分裂性細胞に感染できるからであり、また気道上皮細胞(上に引用したRosenfeld et al. (1992) )、内皮細胞 (Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486)、肝細胞 (Herz and Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816) 及び筋細胞 (Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584)を含む多種の細胞種に感染させるのに使用できるからである。さらに、このウィルス粒子は比較的に安定であり、精製及び濃縮に適し、上述したように、感染スペクトルに影響を与えるよう、改変が可能である。さらに、導入されたアデノウィルスDNA（及びそこに含まれた外来のDNA）は宿主細胞のゲノムに組み込まれずに、エピソームのままで留まり、導入されたDNAが宿主ゲノム（例えばレトロウィルスDNA）に組み込まれて挿入的変異誘発が起きたときに発生しかねない問題を避けることができる。さらに、アデノウィルスゲノムが外来のDNAを運搬する能力は、他の遺伝子送達ベクタに比較して大きい（最高８キロベース）(Berkner et al., supra; Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol. 57:267)。現在用いられており、本発明でも好適な大半の複製欠陥アデノウィルスベクタは、ウィルスE1及びE3遺伝子の全部又は一部を欠失させつつ、しかしアデノウィルス遺伝物質の８０％をも残したものである（例えば Jones et al. (1979) Cell 16:683; Berkner et al., supra; and Graham et al. in Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7. pp. 109-127を参照されたい）。挿入された遺伝物質の発現は、例えばE1Aプロモータ、主要後期プロモータ（MLP）及び関連するリーダ配列や、E3プロモータ、又は外から加えたプロモータ配列などの制御下に置くことができる。
【００８２】
本キメラポリペプチドをコードする遺伝物質の送達に有用なさらに別のウィルスベクタ系は、アデノ随伴ウィルス（AAV）である。アデノ随伴ウィルスは、天然で生じる欠陥ウィルスであり、効率的な複製及び増殖能ある生命周期のためには、アデノウィルス又は疱疹ウィルスなどの別のウィルスをヘルパウィルスとして必要とする。（レビューは Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129を参照されたい）。さらに、これは非分裂性細胞にそのDNAを組み込ませ、安定な組み込みを高頻度で示す数少ないウィルスの一つでもある (例えばFlotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; 及び McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973を参照されたい）。300塩基対程度の数のAAVを含有するベクタをパッケージし、組み込ませることができる。外因性DNAのためのスペースは 約4.5kbに限られている。Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 に解説されたものなどのAAVベクタを用いて、DNAを細胞に導入することができる。多種の核酸が、様々な細胞種に、AAV ベクタを用いて導入されてきた（例えばHermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619; 及び Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790を参照されたい）。
【００８３】
遺伝子治療に用途があるであろう他のウィルスベクタ系が、疱疹ウィルス、ワクシニアウィルス、及びいくつかのRNAウィルスから得られてきた。
【００８４】
上述したものなどのウィルス移入法に加え、ウィルスに依らない法を用いても、本キメラポリペプチドをコードする遺伝物質を、動物の組織で発現させることができる。ウィルスに依らない遺伝子移入法の大半は、哺乳動物細胞が高分子を取り込み、細胞内輸送する正常な機序に依拠している。好適な実施態様では、遺伝子に依らない本発明の遺伝子送達系は、標的細胞が遺伝物質を取り込むエンドサイトーシス経路に依拠している。この種類の遺伝子送達系の例には、リポソーム由来系、ポリリジン結合体、及び人工ウィルスエンベロープがある。
【００８５】
代表的な実施態様では、表面に正の電荷を持ち（例えばリポフェクチン）、さらに選択に応じて標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグを付けたリポソームに遺伝物質を捕捉させることができる(Mizuno et al. (1992) No Shinkei Geka 20:547-551; PCT 公報WO91/06309；日本特許出願第1047381号；及びヨーロッパ特許公報 EP-A-43075)。例えば、乳頭腫感染細胞のリポフェクションは、PV関連抗原に対するモノクローナル抗体のタグを付けたリポソームを用いて、行うことができる（Viac et al. (1978) J Invest Dermatol 70:263-266を参照されたい；さらにMizuno et al. (1992) Neurol. Med. Chir. 32:873-876も参照されたい）。
【００８６】
さらに別の例示的実施態様では、本遺伝子送達系は、ポリリジンなどの遺伝子結合剤と架橋させた抗体又は細胞表面リガンドを含んで成る（例えばPCT 公報 WO93/04701、WO92/22635、WO92/20316、WO92/19749、及びWO92/06180を参照されたい）。例えば、本キメラポリペプチドをコードする遺伝物質を用いると、ポリリジンなどのポリカチオンに結合させたアシアロ糖タンパク質を含んで成る可溶性のポリヌクレオチド担体を用いて、肝細胞をin vivoでトランスフェクトすることができる（例えば米国特許第5,166,320号を参照されたい）。エンドサイトーシスを媒介とする本核酸コンストラクトの効果的な送達は、エンドソーム構造からの遺伝子の脱出を促進する作用物質を用いると向上させられることも、理解されよう。例えば、アデノウィルス全体か、又は、インフルエンザHA遺伝子産物の膜融合性ペプチドを、送達系の一部として用いると、DNA含有エンドソームの効率的な破壊を誘導することができる (Mulligan et al. (1993) Science 260-926; Wagner et al. (1992) PNAS 89:7934; 及びChristiano et al. (1993) PNAS 90:2122)。
【００８７】
臨床の場では、数多くある方法のいずれを用いても、本遺伝子送達系を患者に導入することができ、該方法はそれぞれ、当業で公知である。例えば、本遺伝子送達系の医薬製剤を、静脈注射などにより全身投与することができ、標的細胞の形質導入の特異性は、その遺伝子送達伝播体や、遺伝子発現を制御する転写調節配列を原因とする細胞種又は組織種発現、あるいはこれらの組合せによりもたらされるトランスフェクションの特異性から、主に起きることとなる。他の実施態様では、組換え遺伝子の最初の送達は、動物への導入が大変局所的なものであるために、より制限されている。例えば本遺伝子送達伝播体をカテーテル（米国特許第 5,328,470号）又は定位注射（例えば Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057)で導入することができる。
【００８８】
さらに、前記医薬製剤を、許容可能な希釈剤に入れた本遺伝子送達系から主に構成することができ、あるいは前記医薬製剤を、遺伝子送達伝播体が包埋された徐放マトリックスを含んで成るものとすることができる。代替的には、完全な遺伝子送達系をレトロウィルスパッケージなどの組換え細胞から、インタクトで作製できる場合、前記医薬製剤を、本遺伝子送達系を生じる一つ以上の細胞を含んで成るものとすることができる。後者の場合、ウィルスパッケージング細胞を導入する方法は、例えば再充填可能もしくは生分解性の器具に提供させてもよい。タンパク質様生体医薬を含む薬物の制御放出のために、様々な徐放ポリマー器具が近年、開発され、in vivoでテストされており、このような器具を、ポリマの組成及び形を操作することにより、ウィルス粒子の放出に適合させることができる。生分解性及び非分解性のポリマの両方を含め、多種の生体適合性ポリマ（ヒドロゲルを含む）を用いて、細胞によるウィルス粒子の持続的放出のために特定の標的部位に移植されるインプラントを形成することができる。本発明のこのような実施態様は、ポリマ器具に導入された外因性の精製済みウィルスの送達や、又は、ポリマ器具に封入された細胞が生じるウィルス粒子の送達に、用いることができる。
【００８９】
単量体の組成又は重合技術を選択することにより、水分量、多孔性及び結果的な透過性を制御することができる。形状、大きさ、ポリマの選択、及び移植方法は、治療しようとする障害や、個々の患者の応答に従って、個々に決定することができる。このようなインプラントの作製は当業で広く公知である。例えばConcise Encyclopedia of Medical & Dental Materials, ed. by David Williams (MIT Press: Cambridge, MA, 1990); 及び Sabel 氏らの米国特許第4,883,666号を参照されたい。インプラントの別の実施態様では、組換えウィルスを生じる細胞の供給源は、移植可能な中空のファイバーに封入されている。このようなファイバーを予め紡いだ後、ウィルス源を充填したり（Aebischer氏らの米国特許第4,892,538号；Aebischer氏らの米国特許第5,106,627号；Hoffman et al. (1990) Expt. Neurobiol. 110:39-44; Jaeger et al. (1990) Prog. Brain Res. 82:41-46; 及び Aebischer et al. (1991) J. Biomech. Eng. 113:178-183)、又は、ウィルスパッケージング細胞周囲のポリマー膜を形成する働きをするポリマーと同時に押し出し形成する(Lim 氏の米国特許第4,391,909号； Sefton 氏の米国特許第 4,353,888号；Sugamori et al. (1989) Trans. Am. Artif. Intern. Organs 35:791-799; Sefton et al. (1987) Biotechnol. Bioeng. 29:1135-1143; 及び Aebischer et al. (1991) Biomaterials 12:50-55）ことができる。やはり、ウィルス粒子を最適に放出するよう、このポリマを操作することができる。
【００９０】
本発明のキメラポリペプチドは、分子モデリングを用いてデザインすることができる。血清アルブミンのコンピュータ・モデルを、選択された異種配列を含むよう変更して、その結果得られる構造を、結果的なペプチドにどのような形状変化があるか、その変更がどれくらいのねじれを当該ポリペプチドに導入するか、当該異種配列が三次元ではどのように表示されるか、そして本キメラポリペプチドの結果的な構造に関連する他のデータ、を判断するようデザインされた計算に出してもよい。代替的には、含めようとする配列の性質を、受容体又は結合ポケットの知見に基づいて、計算により判断してもよいかも知れない。別の実施態様では、どのように所望の配列を挿入すれば血清アルブミンの骨格の三次構造を維持できるか、又は、どうやって挿入を適切な方向で表示できるか、を、これらの計算で最も良好に判断できるかも知れない。他の計算戦略は、当業者に公知であろう。これらなどの計算は、実際の合成及びスクリーニング技術を始める前に、本発明のキメラポリペプチドの合成を時間効率的かつ材料効率的な態様で方向付けるのに、有用であろう。
【００９１】
本発明のキメラポリペプチドをコンピュータ・モデリングを用いずにスクリーニングする方法は、当業で公知である。ペプチド・ライブラリの使用は、多数のポリペプチドを一度にスクリーニングする方法の一つである。あるスクリーニング検定では、候補ペプチドを細胞又はウィルス粒子の表面上にディスプレイさせ、特定の細胞又はウィルス粒子が、その遺伝子産物を介して受容体タンパク質などの標的分子へ結合する結合能を「パンニング検定」で検出する。例えば、この遺伝子ライブラリを、細菌細胞の表面膜タンパク質の遺伝子内にクローンして、その結果産生されるキメラポリペプチドをパンニングで検出することができる(Ladner et al., WO 88/06630; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1371; 及び Goward et al. (1992) TIBS 18:136-140)。
【００９２】
別の実施態様では、ペプチド・ライブラリをウィルス粒子の表面上にキメラポリペプチドとして発現させる。例えば、糸状ファージ系では、外来のペプチド配列を感染性ファージの表面上に発現させると、二つの有意な利点をもたらすことができる。第一に、これらのファージは大変高い濃度で親和性マトリックスに付着させることができるため、多数のファージを一度にスクリーニングすることができる。第二に、各感染性ファージはコンビナトリアル遺伝子産物をその表面上にディスプレイするため、特定のファージの親和性マトリックスからの回収率が低い場合、そのファージをもう一回感染させることで、増幅することができる。ほとんど同一のE. coli糸状ファージ M13、fd、及び f1 のグループがファージ・ディスプレイ・ライブラリでは最も頻繁に用いられているが、それは、このファージgIIIもしくは gVIIIコートタンパク質のいずれを用いても、ウィルス粒子の最終的なパッケージングを破壊せずにキメラポリペプチドを作製できるからである（Ladner 氏らの PCT 公報 WO 90/02809；Garrard氏らのPCT公報 WO 92/09690；Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; 及び Barbas et al. (1992) PNAS 89:4457-4461）。
【００９３】
コンビナトリアル・ペプチド・ライブラリの分野はレビューがなされており(Gallop et al. J. Med. Chem. 1994, 37, 1233-1251)、ペプチド・ライブラリを作製及びスクリーニングするための更なる技術が当業で公知である (Gustin, K. Virology 1993, 193, 653-660; Goeddel 氏らの米国特許第5,223,408号；Markland 氏らのPCT 公報WO92/15679; Bass et al. Proteins: Structure, Function and Genetics 1990, 8, 309-314;Cunningham, B.C. Science 1990, 247, 1461-1465; Lowman, H.B. Biochemistry 1991, 30, 10832-10838; Fowlkes 氏らの米国特許第5,789,184号；Houghton, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985, 82, 5131-5135)。
【００９４】
１９９８年１０月１９日に提出された米国特許出願09/174,943号は、生物活性ペプチドを単離する方法を開示している。そこに開示された技術を用いて、所定の受容体と相互作用する本発明のキメラポリペプチドを開発してもよい。
【００９５】
代表的な例では、この方法を用いて、一種以上の細胞種に対して抗増殖活性を有するポリペプチドを同定する。当業者であれば、下に概説した手法を改良して、所望の活性を持つポリペプチドを容易に発見できることであろう。前記例では、抗増殖性にしたい標的細胞に結合するポリペプチドを濃縮するために、ディスプレイ状態のキメラポリペプチド・ライブラリを、この細胞でパンニングすることができる。この段階で、コントロール細胞に結合するポリペプチドを除くために、一種以上のコントロール細胞株に対しても、このポリペプチド・ライブラリをパンニングすることもできる。このような方法により、後で分泌状態でテストすることになるポリペプチド・ライブラリを、（コントロール細胞に比較して）標的細胞に選択的に結合するポリペプチドについて、濃縮できる。従って、例えば、そのディスプレイ状態では、正常細胞に比較して腫瘍細胞に優先的に結合するポリペプチド、p53^＋細胞に比較してp53⁻細胞に優先的に結合するポリペプチド、他の上皮細胞に比較して毛嚢細胞に優先的に結合するポリペプチド、又は他の何らかの差示的結合特性を持つポリペプチド、について濃縮されたポリペプチド・ライブラリを作ることができる。
【００９６】
分泌状態では、当業で公知の数多くある技術のいずれかを用いて、標的細胞に対する抗増殖活性について、当該ポリペプチドをテストする。例えば、BrdU 又は他のヌクレオチド取り込みを、増殖の指標として測定することができる。上述したように、この分泌状態には、特異的抗増殖活性を持つポリペプチドを選抜するために、陰性コントロールを含めることができる。
【００９７】
同様な態様で、例えば細胞選択的な態様で、アポトーシス又は細胞溶解を誘導する能力に基づいて、ポリペプチドをライブラリから単離することができる。
【００９８】
さらに、この方法は、血管新生活性又は抗血管新生活性を持つポリペプチドを同定するためにも、使用できる。例えば、内皮細胞には結合するが線維芽細胞には結合しないポリペプチドについて、ポリペプチド・ライブラリを濃縮できる。その結果できるサブライブラリを、毛管内皮細胞の増殖及び／又は内皮細胞の遊走を抑制するポリペプチドについて、スクリーニングできるすることができる。これらの活性の一方又は両方について陽性と出たポリペプチドを、内皮細胞に対してのみ活性であるポリペプチドを選抜するために、平滑筋細胞又は線維芽細胞などの他の細胞種に対する活性についても、テストすることができる。
【００９９】
さらに、抗カビ剤又は抗菌剤として活性であるなど、抗感染性ポリペプチドを同定するためにも、この方法を使用できる。
【０１００】
加えて、この検定を、受容体タンパク質のエフェクター又はそれらの複合体を同定するために用いることができる。概略的には、この検定は、細胞外シグナルとの相互作用により、そのシグナル伝達活性が調節を受け、さらにそのシグナル伝達活性が検出可能なシグナルを産生できるような標的受容体又はイオンチャネルタンパク質を含有するテスト細胞を用いることを、特徴とする。
【０１０１】
一般にこのような検定は、試薬細胞内で検出可能なシグナルを伝達できる標的受容体タンパク質又はイオンチャネルを発現する細胞の混合物を使用することを特徴とする。前記受容体／チャネルタンパク質は、内因性又は異種のいずれであってもよい。前記試薬細胞の培養株を、開示した検出手段と組み合わせると、受容体機能のアゴニスト又はアンタゴニストを検出する手段となるであろう。
【０１０２】
特定のポリペプチドが、標的受容体又はチャネルのシグナル伝達活性を調節する能力は、検出シグナルの上方又は下方調節を検出することで、採点できる。例えば、セカンド・メッセンジャ生成（例えばGTPase活性、ホスホリピド加水分解、又はタンパク質のリン酸化パターン）を直接測定することができる。代替的には、指標遺伝子を用いると、便利な読み取り値を得ることができる。他の実施態様では、検出手段は指標遺伝子から成る。いずれの場合も、検出シグナルの統計上有意な変化を用いると、受容体又はイオンチャネル活性を調節する化合物の同定を容易に行うことができる。
【０１０３】
この方法により、特定の受容体又はチャネルからシグナル経路を誘導するポリペプチドを同定することができる。テストポリペプチドが受容体／チャネルタンパク質の活性を誘導しないように思われる場合、当該検定を上述したように繰り返し、試薬細胞を標的受容体／チャネルの既知の活性化物質と最初に接触させてシグナル伝達を誘導するステップを導入することで改良し、テストペプチドの活性化受容体／チャネルの抑制能を検定すれば、アンタゴニストなどを同定することができる。さらに他の実施態様では、受容体の既知の活性化物質に対する応答を増強するペプチドをスクリーニングすることができる。
【０１０４】
特に、前記検定は、機能的リガンド対受容体又はリガンド対イオンチャネルの相互作用を、細胞表面局在化受容体及びチャネルに関してテストするために、用いることができる。以下にさらに詳述するように、当該検定は、例えばＧタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体、及びイオンチャネルなどのエフェクターを同定するために、用いることができる。いくつかの実施態様では、ここで解説した方法を、そのリガンドが未知である「オーファン受容体」のリガンドを同定するために用いる。
【０１０５】
いくつかの例では、当該受容体は細胞表面受容体であり、例えばEPH受容体などの受容体チロシンキナーゼ；イオンチャネル；サイトカイン受容体；多サブユニット免疫認識受容体、ケモカイン受容体；成長因子受容体、又はＧタンパク質共役受容体、例えば走化性ペプチド受容体、ニューロペプチド受容体、光受容体、神経伝達物質受容体、又はポリペプチドホルモン受容体などである。
【０１０６】
好適なＧタンパク質共役受容体には、α1A-アドレナリン作動性受容体、α1B-アドレナリン作動性受容体、α2-アドレナリン作動性受容体、α2B-アドレナリン作動性受容体、1-アドレナリン作動性受容体、β2-アドレナリン作動性受容体、β3-アドレナリン作動性受容体、m1アセチルコリン受容体 (AChR)、m2 AChR、m3 AChR、m4 AChR、m5 AChR、D1 ドーパミン受容体、D2 ドーパミン受容体、D3 ドーパミン受容体、D4 ドーパミン受容体、D5 ドーパミン受容体、A1 アデノシン受容体、A2b アデノシン受容体、5-HT1a受容体、5-HT1b受容体、5HT1-様受容体、5-HT1d受容体、5HT1d-様受容体、5HT1d ベータ受容体、サブスタンスK (ニューロキニンA)受容体、fMLP受容体、fMLP-様受容体、アンギオテンシン II タイプ1受容体、エンドセリン ETA受容体、エンドセリン ETB受容体、トロンビン受容体、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)受容体、血管作動性腸管ペプチド受容体、オキシトシン受容体、ソマトスタチン SSTR1及びSSTR2、SSTR3、カンナビノイド受容体、卵胞刺激ホルモン(FSH)受容体、ロイトロピン（原語：leutropin） (LH/HCG)受容体、甲状腺刺激ホルモン (TSH)受容体、トロンボキサンA2受容体、血小板活性化因子(PAF)受容体、C5a アナフィラトキシン受容体、インターロイキン8 (IL-8) IL-8RA、IL-8RB、デルタオピオイド受容体、カッパオピオイド受容体、mip-1/RANTES受容体、ロドプシン、赤色オプシン、緑色オプシン、青色オプシン、代謝調節型グルタミン酸 mGluR1-6、ヒスタミンH2受容体、ATP受容体、ニューロペプチドY受容体、アミロイドタンパク質前駆体受容体、インシュリン様成長因子 II受容体、ブラジキニン受容体、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、コレシストキニン受容体、メラノサイト刺激ホルモン受容体、抗利尿ホルモン受容体、グルカゴン受容体、及び副腎皮質刺激ホルモン II受容体、がある。
【０１０７】
好適なEPH受容体には、 eph、elk、eck、sek、mek4、hek、hek2、eek、erk、tyro1、tyro4、tyro5、tyro6、tyro11、cek4、cek5、cek6、cek7、cek8、cek9、cek10、bsk、rtk1、rtk2、rtk3、myk1、myk2、ehk1、ehk2、pagliaccio、htk、erk 及びnuk受容体がある。
【０１０８】
Ａ．サイトカイン受容体
ある例では、前記標的受容体はサイトカイン受容体である。サイトカインは細胞間コミュニケーションの可溶性媒介物質の一ファミリーであり、インターロイキン、インターフェロン、及びコロニ刺激因子がこれに含まれる。サイトカインの特徴は、その機能的重複及び多面発現性である。別個のスーパーファミリを構成するサイトカイン受容体の大半は、固有のタンパク質チロシンキナーゼドメインを持たないが、通常、受容体が刺激を受けると、その受容体自体を含む細胞内タンパク質が急速にチロシンリン酸化する。サイトカイン受容体スーパーファミリのメンバーの多くは、Jakタンパク質チロシンキナーゼファミリーを活性化し、ひいてはSTAT転写活性化因子のリン酸化を引き起こす。IL-2、IL-7、IL-2及び インターフェロンγはすべて、Jakキナーゼを活性化することが示されている (Frank et al (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:7779-7783); Scharfe et al. (1995) Blood 86:2077-2085); (Bacon et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:7307-7311); 及び (Sakatsume et al (1995) J. Biol Chem 270:17528-17534)。Jakリン酸化の下流の事象も解明されている。例えば、Ｔリンパ球をIL-2に暴露すると、転写のシグナル伝達及び活性化因子であるタンパク質（STAT）のSTAT1α、STAT2β、及びSTAT3や、二つのSTAT関連タンパク質、p94 及びp95がリン酸化することが示されている。これらSTATタンパク質は、核へ移行して特異的DNA配列へ結合することが見出されており、こうしてIL-2が免疫細胞機能に関与する特異的遺伝子を活性化する機序らしいものが示唆された (上記のFrank et al. )。Jak3 は、IL-2、IL-4、及びIL-7 サイトカイン受容体のγ鎖と関連づけられている (Fujii et al. (1995) Proc Natl Acad Sci 92:5482-5486) 及び (Musso et al (1995) J Exp Med. 181:1425-1431)。Jakキナーゼもまた、サイトカイン受容体を介してシグナルを送る、成長ホルモン及びエリスロポエチン及びIL-6などの数多くのリガンドで活性化することが示されている(Kishimoto (1994) Stem cells Suppl 12:37-44)。
【０１０９】
セカンド・メッセンジャを直接検出することに加え、リン酸化の変化など、本検定で採点できると思われる検出手段には、STATタンパク質に応答する転写調節配列を含有するレポータ・コンストラクトもしくは指標遺伝子がある。下に説明する。
【０１１０】
Ｂ． 多サブユニット免疫認識受容体（ MIRR ）。
別の例では、前記受容体は多サブユニット受容体である。受容体は、サブユニットと呼ばれる複数のタンパク質から構成されていることがあり、多サブユニット受容体と呼ばれる種類の一つが、多サブユニット免疫認識受容体（MIRR）である。MIRRには、非共有結合的に結合した複数のサブユニットを有する受容体があり、srcファミリーのチロシンキナーゼと相互作用することができる。MIRRには、限定はしないが、Ｂ細胞抗原受容体、Ｔ細胞抗原受容体、Fc受容体及びCD22を含めることができる。MIRRの一例は、Ｂ細胞の表面上にある抗原受容体である。さらに解説すると、Ｂ細胞の表面上にあるこのMIRRは、抗原が結合したときにＢ細胞の機能を調節できる複合体を形成する、サブユニットIg-α及びIg-もしくはIg-γと結合した、膜結合免疫グロブリン（mIg）を含んで成る。抗原受容体は、増幅分子が遺伝子転写を調節できるような態様で、増幅分子に作動上連結することができる。
【０１１１】
srcファミリーのチロシンキナーゼは、標的分子のチロシン残基をリン酸化できる酵素である。典型的には、srcファミリーチロシンキナーゼは、一箇所以上の結合ドメインとキナーゼドメインを含有する。srcファミリーチロシンキナーゼの結合ドメインは、標的分子に結合することができ、キナーゼドメインは、このキナーゼに結合した標的分子をリン酸化することができる。srcファミリーのチロシンキナーゼのメンバーは、Ｎ末端の固有の領域と、それに続く、このファミリーの全てのメンバー間で相同性の程度が異なる三つの領域とを特徴とする。これらの三つの領域はsrcホモロジー領域1（SH1）、srcホモロジー領域2（SH2）及びsrcホモロジー領域3（SH3）と呼ばれる。SH2及びSH3ドメインは両者とも、シグナル伝達複合体の形成に重要なタンパク質会合機能を有すると考えられている。Ｎ末端の固有領域のアミノ酸配列は各srcファミリーチロシンキナーゼ間で様々である。Ｎ末端の固有領域は、ある一個のsrcファミリーチロシンキナーゼのＮ末端の最初の少なくとも４０個のアミノ酸残基であると考えられる。
【０１１２】
sykファミリーキナーゼは、標的分子のチロシン残基をリン酸化できる酵素である。典型的には、sykファミリーキナーゼは、一箇所以上の結合ドメインとキナーゼドメインを含有する。sykファミリーチロシンキナーゼの結合ドメインは、標的分子に結合することができ、キナーゼドメインはこのキナーゼに結合した標的分子をリン酸化することができる。sykファミリーのチロシンキナーゼのメンバーは、タンパク質結合機能のための二つのSH2ドメインと、チロシンキナーゼドメインとを特徴とする。
【０１１３】
一次標的分子は、セカンド・メッセンジャ分子を修飾することで、シグナル伝達経路をさらに延長することができる。一次標的分子には、限定はしないが、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI-3K）、p21^rasGAPase活性化タンパク質及び関連するp190 及び p62 タンパク質、PLCγ1及びPLC2などのホスホリパーゼ、MAPキナーゼ、Shc及びVAVを含めることができる。一次標的分子は、セカンド・メッセンジャ分子を生じることができ、このセカンド・メッセンジャ分子は、伝達されたシグナルをさらに増幅することができる。セカンド・メッセンジャ分子には、限定はしないが、ジアシルグリセロール及びイノシトール1,4,5-トリホスフェート（IP3)がある。セカンド・メッセンジャ分子は、遺伝子転写の変化につながる生理的事象を開始することができる。例えば、IP3 が生じると、細胞内カルシウムが放出され、ひいてはカルモジュリンキナーゼＩＩが活性化し、こうしてets-1プロト-オンコ-タンパク質と呼ばれるDNA結合タンパク質のセリンリン酸化が起きる。ジアシルグリセロールは、AP1 DNA結合タンパク質複合体の活性に影響するシグナル伝達タンパク質であるプロテインキナーゼＣを活性化することができる。シグナル伝達経路により、c-fos、egr-1、及びc-mycなどの遺伝子の転写活性化が可能である。
【０１１４】
Shcはアダプター分子と考えることができる。アダプター分子は、他の二つのタンパク質に複合体を形成できるようにするタンパク質を含んで成る（例えば三分子複合体）。Shcタンパク質は、Grb2及びSOSを含有する複合体の形成を可能にする。Shcは、Grb2のSH2ドメインと結合することのできるSH2ドメインを含んで成る。
【０１１５】
シグナル伝達経路の分子は、認識配列を用いて相互に結合することができる。認識配列により、二つの分子間の特異的結合が可能である。認識配列は、相互に結合しようとする分子の構造に応じて様々である。ある一個の分子が一個以上の認識配列を有しており、従って一個以上の異なる分子と結合する場合がある。
【０１１６】
MIRR複合体のためのシグナル伝達経路は、細胞の生物学的機能を調節することができる。このような機能には、限定はしないが、細胞の成長能、分化能、及び細胞産物の分泌能を含めることができる。MIRRが誘導するシグナル伝達経路は、免疫応答、炎症性応答及びアレルギー性応答など、動物による特定の応答に関与する特定の種類の細胞の生物学的機能を調節することができる。免疫応答に関与する細胞には、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、及びプラズマ細胞を含めることができる。炎症性応答に関与する細胞には、例えば、好塩基球、マスト細胞、好酸球、好中球及びマクロファージを含めることができる。アレルギー性応答に関与する細胞には、例えば、マスト細胞、好酸球、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びマクロファージを含めることができる。
【０１１７】
いくつかの例では、検出シグナルは、例えば血清応答配列(SRE)、12-O-テトラデカノイル-ホルボール-13-アセテート応答配列、サイクリックAMP応答配列、c-fos プロモータ、又はCREB応答配列などの転写調節配列を含有するレポータ・コンストラクト又は指標遺伝子を含む、リン酸化src様タンパク質などのセカンド・メッセンジャである。
【０１１８】
Ｃ． 受容体チロシンキナーゼ
さらに別の例では、前記標的受容体は受容体チロシンキナーゼである。受容体チロシンキナーゼは、それらの細胞外ドメインの構造上の類似性と、それらの細胞質ドメインのチロシンキナーゼ触媒領域の機構とに基づき、５つのサブグループに分類することができる。サブグループＩ（上皮成長因子（EGF）受容体様）、ＩＩ（インシュリン受容体様）及びeph/eck ファミリーは、システイン・リッチな配列を含有する(Hirai et al., (1987) Science 238:1717-1720 及びLindberg and Hunter, (1990) Mol. Cell. Biol. 10:6316-6324)。これら３つのクラスの受容体チロシンキナーゼのキナーゼ領域の機能ドメインは、一個の連続した配列としてコードされている ( Hanks et al. (1988) Science 241:42-52)。サブグループＩＩＩ（血小板由来成長因子(PDGF)受容体様) 及びIV (線維芽細胞成長因子(FGF)受容体) は、免疫グロブリン(Ig)-様の折り畳みをそれらの細胞外ドメインに有することや、またそれらのキナーゼドメインが、無関係のアミノ酸が様々な長さ延びた部分により二つの部分に分割されていることを、特徴とする(上記のYanden and Ullrich (1988) 及び上記のHanks et al. (1988))。
【０１１９】
遙かに最も多くの数の既知のメンバーを有するファミリーはEPHファミリーである。原型の記述以来、EPH受容体 (Hirai et al. (1987) Science 238:1717-1720)の配列が、２種以上の種で見られる、明らかに直系の受容体は計数せずに、このファミリーの少なくとも１０種のメンバーについて、報告されている。部分的な配列が更に加えられていることや、新しいメンバーが報告されている速度から考えると、このファミリーはさらに大きいことが分かる(Maisonpierre et al. (1993) Oncogene 8:3277-3288; Andres et al. (1994) Oncogene 9:1461-1467; Henkemeyer et al. (1994) Oncogene 9:1001-1014; Ruiz et al. (1994) Mech Dev 46:87-100; Xu et al. (1994) Development 120:287-299; Zhou et al. (1994) J Neurosci Res 37:129-143; 及びTuzi and Gullick (1994) Br J Cancer 69:417-421の参考文献)。驚くべきことに、このようにEPHファミリーには多数のメンバーがありながら、これらの分子はすべて、リガンドが判明していないオーファン受容体として同定された。
【０１２０】
EPHファミリー受容体のいくつかで判明した発現パターンは、これらの分子が脊椎動物の発生初期に重要な役割を果たしていることを示唆した。具体的には、原腸胚形成及び初期器官形成の段階のsek、mek4及び他の受容体のいくつかの発現のタイミング及びパターンをもとに、この段階の胚パターニングに関与する重要な細胞間相互作用におけるこれらの受容体の機能が示唆された (Gilardi-Hebenstreit et al. (1992) Oncogene 7:2499-2506; Nieto et al. (1992) Development 116:1137-1150; 上記のHenkemeyer et al.; 上記のRuiz et al.；及び上記のXu et al.)。例えばsekは、マウス胚で目に見える体節形成を示す二つの箇所、即ち中胚葉の体節と、菱脳の神経小片とで、著しい初期発現を示す。従って、この名称sekは、体節発現キナーゼを表す (上記のGilardi-Hebenstreit et al., 上記のNieto et al., supra)。ショウジョウバエの場合と同様、哺乳動物胚のこれらの体節構造は、ボディプランの確立に重要な要素であると示唆されている。Sekの発現は形態上の体節の出現よりも前に起きるという観察は、これらの体節構造の形成、又は、細胞系譜の区画決定など、体節特異的細胞の性質を決定する上でsekが重要な役割を果たしていることを示唆している (上記のNieto et al. )。さらに、EPH受容体は、それらの発現パターンに基づき、胚及び成体のほぼすべての組織の発生及び維持に関与していることが示唆されている。例えばEPH受容体は神経系、精巣、骨格の軟骨モデル、歯の原基、脳下垂体の漏斗部、多様な上皮組織、肺、膵臓、肝臓及び腎臓組織にわたって検出されてきた。このような観察は、発生及び生理においてEPHファミリーキナーゼが果たす重要かつ固有の役割を示すものであったが、それらの作用を理解する上でのこれ以上の進展には、それらのリガンドに関する情報が不足しているために、大きな限界があった。
【０１２１】
ここで用いる用語「EPH受容体」又は「EPH型受容体」とは、例えば異なる種の相同体など、このクラス内にはより多くのオーソログが存在するが、少なくとも１１個のパラログ遺伝子を包含する、受容体チロシンキナーゼの一クラスを言う。一般にEPH受容体は、相同性で関連づけられ、容易に認識可能である独立した一個のグループの受容体であり、例えば、これらは、Ｎ末端近傍のシステイン残基による特徴的な間隔と、二つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ反復配列とを含有する細胞外ドメインが典型的な特徴である（Hirai et al. (1987) Science 238:1717-1720; Lindberg et al. (1990) Mol Cell Biol 10:6316-6324; Chan et al. (1991) Oncogene 6:1057-1061; Maisonpierre et al. (1993) Oncogene 8:3277-3288; Andres et al. (1994) Oncogene 9:1461-1467; Henkemeyer et al. (1994) Oncogene 9:1001-1014; Ruiz et al. (1994) Mech Dev 46:87-100; Xu et al. (1994) Development 120:287-299; Zhou et al. (1994) J Neurosci Res 37:129-143; 及びTuzi and Gullick (1994) Br J Cancer 69:417-421の参考文献)。EPH受容体の例には、eph、elk、eck、sek、mek4、hek、hek2、eek、erk、tyro1、tyro4、tyro5、tyro6、tyro11、cek4、cek5、cek6、cek7、cek8、cek9、cek10、bsk、rtk1、rtk2、rtk3、myk1、myk2、ehk1、ehk2、pagliaccio、htk、erk 及びnuk受容体がある。用語「EPH受容体」とは、膜型のこの受容体タンパク質や、本発明のリガンドへの結合能を保持した可溶性細胞外フラグメントを言う。
【０１２２】
いくつかの例では、前記検出シグナルは、MEKK、MEK又はMapキナーゼなどの細胞内タンパク質のリン酸化を検出したり、あるいは、c-fos及び／又はc-junに応答する転写調節配列を含有するレポータ・コンストラクト又は指標遺伝子を用いて、提供される。下に解説する。
【０１２３】
Ｄ． Ｇタンパク質共役受容体
真核細胞で見られるシグナル伝達カスケードのファミリーの一つは、ヘテロ三量体型の「Ｇタンパク質」を利用するものである。多くの様々なＧタンパク質が受容体と相互作用することが知られている。Ｇタンパク質シグナリング系には三つの構成成分、即ち受容体自体と、GTP結合タンパク質（Ｇタンパク質）と、細胞内標的タンパク質とが含まれる。
【０１２４】
細胞膜は交換機として働く。異なる受容体を通じて到着したメッセージでも、当該受容体が同じ種類のＧタンパク質に対して作用する場合は、単一の効果を生むことがある。他方で、単一の受容体を活性化するシグナルでも、 当該受容体が様々なＧタンパク質に作用する場合、又は、当該Ｇタンパク質が様々なエフェクターに作用する場合には、２種類以上の効果を生む。
【０１２５】
アルファ（α）、ベータ（β）及びガンマ（γ）サブユニットから成るＧタンパク質は、休止状態のときはヌクレオチドグアノシン二リン酸（GDP）と複合体を形成して受容体と接触した状態にある。ホルモン又は他のファースト・メッセンジャが受容体に結合すると、その受容体はコンホメーションを変化させるが、これがＧタンパク質とのその相互作用も変化させる。これにより、そのαサブユニットが惹起されてGDPを遊離させ、より豊富にあるヌクレオチドグアノシン三リン酸（GTP）がそれに置換し、Ｇタンパク質を活性化する。次にこのＧタンパク質は解離して、まだ複合体を形成しているベータ及びガンマサブユニットからαサブユニットを分離させる。経路に応じ、このＧαサブユニットか、又はＧβγ複合体のいずれかが、エフェクターと相互作用する。こうして（しばしば酵素である）このエフェクターが、不活性な前駆体分子を活性の「セカンド・メッセンジャ」に変換し、このセカンド・メッセンジャが細胞質に拡散して、代謝カスケードを惹起する。数秒後、ＧαがGTPをGDPに変換して自らを不活性化する。不活性化したＧαはこうしてＧβγ複合体と再度結合する。
【０１２６】
数千種でないとしても数百種の受容体が、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を通じてメッセージを運搬するが、このヘテロ三量体Ｇタンパク質のうち少なくとも１７種の異なる形が単離されている。αサブユニットには最も大きな多様性が見られてきたが、β及びγ構造ではいくつか異なる構造が報告されただけである。さらにＧタンパク質依存的エフェクターもいくつか異なるものがある。
【０１２７】
大半のＧタンパク質共役受容体は、細胞膜を７回貫通する一本のタンパク質鎖から成る。このような受容体はしばしば、７回膜貫通受容体（STR）と呼ばれる。１００種を越す異なるSTRが見つかっており、その中には同じリガンドに結合する数多くの別個の受容体もあり、発見に至らないSTRもまだ多くあると考えられる。
【０１２８】
加えて、その天然リガンドが不明なSTRが同定されてきた。これらの受容体は、上述したように「オーファン」Ｇタンパク質共役受容体と呼ばれる。例には、Neote et al. (1993) Cell 72, 415; Kouba et al. FEBS Lett. (1993) 321, 173; Birkenbach et al.(1993) J. Virol. 67, 2209がクローンした受容体がある。
【０１２９】
この例の「外因性受容体」は、本発明の目的のために遺伝子操作しようとする細胞にとって外因性である何らかのＧタンパク質共役受容体であろう。この受容体は、植物もしくは動物細胞受容体であってよい。植物細胞受容体への結合についてのスクリーニングは、除草剤などの開発に有用であろう。動物受容体の場合、それは無脊椎動物由来でも、又は脊椎動物由来でもよい。無脊椎動物受容体の場合、昆虫受容体が好ましく、殺虫剤の開発に便利であろう。また当該受容体は脊椎動物受容体でもよいが、より好適には哺乳動物、さらにより好適にはヒト受容体であるとよい。前記外因性受容体は、さらに、７回膜貫通部分受容体であると好ましい。
【０１３０】
Ｇタンパク質共役受容体の公知のリガンドには：プリン及びヌクレオチド、例えばアデノシン、cAMP、ATP、UTP、ADP、メラトニン等；生体アミン（及び関連する天然リガンド）、例えば5-ヒドロキシトリプトアミン、アセチルコリン、ドーパミン、アドレナリン、アドレナリン、アドレナリン、ヒスタミン、ノルアドレナリン、ノルアドレナリン、ノルアドレナリン、チラミン／オクトパミン及び他の関連する化合物；ペプチド、例えば副腎皮質刺激ホルモン (acth)、メラニン細胞刺激ホルモン (msh)、メラノコルチン、ニューロテンシン(nt)、ボンベシン及び関連するペプチド、エンドセリン、コレシストキニン、ガストリン、ニューロキニンb (nk3)、無脊椎動物タキキニン様ペプチド、サブスタンスk (nk2)、サブスタンスp (nk1)、ニューロペプチド y (npy)、甲状腺刺激ホルモン放出因子(trf)、ブラジキニン、アンギオテンシン ii、ベータ-エンドルフィン、c5aアナファラトキシン（原語：anaphalatoxin）、カルシトニン、ケモカイン（インタークリンとも呼ばれる）、副腎皮質ホルモン放出因子 (crf)、ダイノルフィン、エンドルフィン、fmlp 及び他のホルミル化ペプチド、卵胞刺激ホルモン(fsh)、真菌接合フェレモン（原語：pheremones）、ガラニン、胃抑制ポリペプチド受容体 (gip)、グルカゴン様ペプチド(glps)、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン (gnrh)、成長ホルモン 放出ホルモン(ghrh)、昆虫利尿ホルモン、インターロイキン-8、ロイトロピン(lh/hcg)、met-エンケファリン、オピオイドペプチド、オキシトシン、副甲状腺ホルモン (pth) 及び pthrp、下垂体アデニリルシクラーゼ活性化ペプチド(pacap)、セクレチン、ソマトスタチン、トロンビン、甲状腺刺激ホルモン(tsh)、血管作動性腸管ペプチド(vip)、バソプレッシン、バソトシン；エイコサノイド、例えばip-プロスタサイクリン、pg-プロスタグランジン、tx-トロンボキサン；レチナール・ベースの化合物、例えば脊椎動物11-cis レチナール、無脊椎動物11-cis レチナール、及び他の関連する化合物；脂質及び脂質ベースの化合物、例えばカンナビノイド、アナンダミド、リゾホスファチド酸、血小板活性化因子、ロイコトリエン等；興奮性アミノ酸及びイオン、例えばカルシウムイオン及びグルタミン酸、がある。
【０１３１】
Ｇタンパク質共役受容体の適した例には、限定はしないが、ドーパミン作動性、ムスカリン性コリン作動性、a-アドレナリン作動性、b-アドレナリン作動性、オピオイド（デルタ及びミューを含む）、カンナビノイド、セロトニン作動性、及びGABA作動性受容体がある。好適な受容体には、5HTファミリーの受容体、ドーパミン受容体、C5a受容体及びFPRL-1受容体、シクロ-ヒスチジル-プロリン-ジケトプルペラジン（原語：diketoplperazine）受容体、メラニン細胞刺激ホルモン放出抑制因子受容体、及び、ニューロテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、カルシトニン、コレシトキニン-Ａ、ニューロキニン-２、ヒスタミン-３、カンナビノイド、メラノコルチン、又は、アドレノモジュリン、ニューロペプチドY1又はガラニンの受容体がある。他の適した受容体は当業で公知である。ここで用いる用語「受容体」は、天然型及び変異型の両方の受容体を包含するものである。
【０１３２】
これらＧタンパク質共役受容体の多くは、酵母ａ−及びα-因子受容体と同様、細胞膜内に存在すると予測される７箇所の疎水性アミノ酸リッチな領域を含有する。その遺伝子が単離されており、そして発現ベクタを構築できると思われる特異ヒトＧタンパク質共役STRには、ここに挙げたものや、当業で公知の他のものがある。このように、操作しようとする細胞内で機能的なプロモータと、やはり当該細胞内で機能するシグナル配列とに、この遺伝子を作動上、連結することになるであろう。例えば酵母の場合では、適したプロモータにはSte2、Ste3 及び gal10がある。適したシグナル配列には、Ste2、Ste3のものや、 酵母細胞により分泌されるタンパク質をコードする他の遺伝子のものがある。酵母細胞を用いる場合、好ましくは、遺伝子のコドンを、酵母での発現に最適化するとよいであろう。Hoekema et al., (1987) Mol. Cell. Biol., 7:2914-24; Sharp, et al., (1986)14:5125-43を参照されたい。
【０１３３】
STRの相同性は、Dohlman et al., Ann. Rev. Biochem., (1991) 60:653-88に論じられている。STRを比較すると、相同性に顕著な空間的パターンがあることが分かる。膜貫通ドメインはしばしば最も類似性が高く、他方、Ｎ末端及びＣ末端領域と、膜貫通セグメントＶ及びＶＩをつなぐ細胞質側のループはより多様である。
【０１３４】
様々なSTR領域の機能上の意味が、点変異（置換及び欠失の両方を含む）を導入したり、異なる、しかし関係のあるSTRのキメラを構築することで、研究されてきた。個々のセグメントに相当する合成ペプチドも、活性についてテストされてきた。親和標識を用いてリガンド結合部位も同定されている。
【０１３５】
宿主細胞が酵母細胞である場合、外来の受容体は、酵母細胞膜と機能的に一体化できず、ひいては内因性酵母Ｇタンパク質と相互作用できないことが考えられる。おそらく、受容体を改変（例えばそのＶ−ＶＩループを酵母STE2又はSTE3受容体のものと置換するなどにより）しなければならないか、和合性のＧタンパク質を提供せねばならないであろう。
【０１３６】
野生型外因性Ｇタンパク質共役受容体を酵母内で機能的にできない場合、それをこの目的のために変異させてもよい。外因性受容体のアミノ酸配列と、酵母受容体のそれとを比較し、相同性の高い領域と低い領域を明らかにしてもよいであろう。次に、試験的変異を起こさせて、リガンドもしくはＧタンパク質結合に関与する領域を、膜への機能的一体化にとって必要なものから、区別してもよいであろう。こうして、機能的一体化が達成されるまで、外因性受容体を後者の領域で変異させて、酵母受容体により似たものになるようにしてもよいだろう。これでは機能性を達成するには不充分である場合、Ｇタンパク質結合に関与する領域に変異を起こさせてもよいだろう。リガンド結合に関与する領域で変異を起こさせるのは最終的な手段としてだけであり、その後で、可能な場合には保存的置換を行うことで、リガンド結合を維持するよう、努めるとよいであろう。
【０１３７】
好ましくは、酵母ゲノムを改変して、外因性受容体に相同な酵母受容体は機能的な形では生じないよう、酵母ゲノムを改変する。他の方法では、あるペプチドが、目的の受容体ではなく、内因性Ｇタンパク質共役受容体の活性化する能力を、正の検定の得点に反映させられるかも知れない。
【０１３８】
（ｉ）走化性受容体
N-ホルミルペプチド受容体は、哺乳動物免疫系の好中球及び他の食細胞が発現するカルシウム動員Ｇタンパク質共役受容体の伝統的な一例である(Snyderman et al. (1988) In Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, pp. 309-323)。細菌由来のN-ホルミルペプチドはこの受容体に結合し、複合体活性化プログラムを働かせて、指向性のある細胞移動や、炎症性顆粒内包物の放出、及び、分子酸素の代謝産物の生成にとって重要な潜性NADPHオキシダーゼの活性化を引き起こす。受容体対リガンドの相互作用により開始するこの経路は、化膿性感染からの宿主防御において重要である。同様なシグナル伝達が、炎症性ペプチドC5a及びIL-8に対する応答で起きる。
【０１３９】
他にも２種類のホルミルペプチド受容体様（FPRL）遺伝子が、NFPR cDNAコーディング配列の一断片へのそれらのハイブリダイゼーション能に基づき、クローンされている。これらは FPRL1 (Murphy et al. (1992) J. Biol Chem. 267:7637-7643) 及び FPRL2 (Ye et al. (1992) Biochem Biophys Res. Comm. 184:582-589)と名付けられた。FPRL2は、この遺伝子をトランスフェクトした上でホルミルペプチドに暴露したマウス線維芽細胞で、カルシウム動員を媒介することが見出されている。対照的に、FPRL1はNFPRに対してアミノ酸配列上は６９％同一であることが判明しているが、それを異種の細胞種で発現させたとき、原型であるN-ホルミルペプチドリガンドを結合させなかった。このことから、FPRL1オーファン受容体には未知のリガンドが存在するという仮説が導かれる(上記のMurphy et al. )。
【０１４０】
（ｉｉ）Ｇタンパク質
外因性Ｇタンパク質共役受容体の場合、酵母細胞は、当該外因性受容体により活性化すると共に酵母エフェクターを活性化できるＧタンパク質を産生できなければならない。当業では、内因性酵母Ｇαサブユニット（例えばGPA）は、しばしば、外因性受容体と天然で関係のある「コグネイト」Ｇαサブユニットに対しては、共役を起こさせるのに充分相同な場合があると示唆されている。おそらくは、当該外因性受容体と適切に相互作用することができる外来Ｇαサブユニットを生じるよう、酵母細胞を遺伝子操作する必要があるであろう。例えば、酵母Ｇタンパク質のＧαサブユニットを、当該外因性受容体と天然で関係のあるＧαサブユニットに置換してもよい。
【０１４１】
Dietzel and Kurjan, (1987) Cell, 50:1001) は、ラットＧαが酵母Ｇβγ複合体と機能的に共役したことを示した。しかしながら、ラットＧαi2は実質的に過剰発現したときにだけ、補足したが、Ｇαは全く補足しなかった。Kang, et al., Mol. Cell. Biol., (1990)10:2582)。結論的には、いくつかの外来Ｇαサブユニットでは、酵母Ｇαを単純に置換することはできないのである。
【０１４２】
外因性Ｇタンパク質共役受容体が、この受容体に天然で関連するＧαサブユニットによっては、酵母Ｇβγに充分には共役しない場合、このＧαサブユニットを改変して共役を向上させてもよい。これらの改変はしばしば、当該Ｇαサブユニットを酵母Ｇαにより似たものとしながら、当該受容体に関連したＧαへのその類似性を低下させる変異の形をとるであろう。例えば、一個の残基を、相当する酵母Ｇα残基に同一になるように、あるいは、この残基の同じ交換基に少なくとも属するように、変更してもよい。改変後、改変されたＧαサブユニットは、当該の外来及び／又は酵母Ｇαサブユニットに「実質的に相同」であっても、なくてもよいであろう。
【０１４３】
この改変は、好ましくは、Gβγ結合に関与すると思われるＧα領域に集中させるとよい。いくつかの例では、前記改変は、当該の受容体関連Ｇαの一箇所以上のセグメントを、相当する酵母Ｇαセグメントに置換して、キメラＧαサブユニットを形成するという形を採るであろう。（付属の請求項の目的のためには、用語「セグメント」とは、３個以上の連続したアミノ酸を言う。）他の例では、点変異で充分かもしれない。
【０１４４】
このキメラＧαサブユニットは、外因性受容体及び酵母Ｇβγ複合体と相互作用することで、シグナル伝達を可能とするであろう。内因性酵母Ｇβγの使用が好適であるが、外来又はキメラＧβγがシグナルを酵母エフェクタに伝達できれば、代わりにそれを用いてもよい。
【０１４５】
上で説明した技術の多くは、特定の生物学的経路で活性のある受容体の具体的な知識が必要であるが、当業者であれば、本発明のキメラポリペプチドのライブラリをスクリーニングするには、このような知識は必要ではないことは認識するところであろう。逆に、所定の表現型の細胞を用いて、表現型での特定の変化を誘導するキメラポリペプチドをスクリーニングすることのできる、細胞ベースの検定が当業で公知である。この方法で、分子レベルでは理解されていない所望の生物学的機能を有するキメラポリペプチドを発見することができる。
【０１４６】
実施例
以上、本発明を概略的に解説したところで、以下の実施例を参照すれば、より容易に理解されよう。但し、以下の実施例は、単に本発明の特定の局面及び実施態様の説明を目的として含まれたのであり、本発明を限定することは意図していない。
【０１４７】
血清アルブミンループ領域。 ヒト血清アルブミン（HSA）の空間充填モデルを図１に示す。HSAの三次構造から、ジスルフィド結合したシステインの対で各々拘束された、１０個の隣接螺旋領域又はループが存在することが分かる。この空間充填モデルを用いて、このタンパク質の表面に露出したループ領域を予測した。表面露出領域を表すために二つのアミノ酸セグメントを選び（ループ53-62及びループ360-369）、そして、タンパク質内に埋もれていると予測される領域を表すために３番目（ループ450-463）を選んだ。これら及び他の候補ループ（Cys⁵³-Cys⁶²、Cys⁷⁵-Cys⁹¹、Cys⁹⁰-Cys¹⁰¹、Cys²⁴⁵-Cys²⁵³、Cys²⁶⁶-Cys²⁷⁹、Cys³⁶⁰-Cys³⁶⁹、Cys⁴⁶¹-Cys⁴⁷⁷、Cys⁴⁷⁶-Cys⁴⁸⁷、及びCys⁵⁵⁸-Cys⁵⁶⁷)を図４Ａ−Ｉに示す。
【０１４８】
MSAループ領域におけるMycエピト-プのディスプレイ。 予測されたループが実際にこのアルブミン分子の表面に露出しているかを調べるために、マウス血清アルブミン（MSA）を改変してmyc エピト-プ、EQKLISEEDL (配列番号2)を含有させた。このmyc エピト-プは、ループ53-62のアミノ酸57-58位間、ループ360-369のアミノ酸364-365位間、及び、ループ450-467のアミノ酸467-468位間、という、三つのアミノ酸セグメントのそれぞれの中央に挿入された。COS7細胞に、野生型MSAか、又は、MSAコンストラクトを含有する多種のmycのいずれかをトランスフェクトした。まず培地中のこのタンパク質の存在を、MSA及びmycエピト-プに特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロット解析で調べた。図２の左側半分に見られるように、MSA又はMSA-Mycをトランスフェクトした細胞の培地から採った試料中にのみ、当該アルブミンタンパク質の存在が見られる。その上、MSA-Mycをトランスフェクトした細胞の培地から採った試料のみが、mycエピト-プについて陽性である。試料はすべて、SDS-PAGE系で変性しているため、この分析では、表面上に露出しているであろうmycエピト-プと、このタンパク質内に埋もれたものとの、区別はできない。この分析には、myc特異抗体を用いた免疫沈降法を利用した。この実験では、調製培地を前記抗体（Ｎ、天然）と直接混合するか、又は、まず 0.1% SDS、1mMのβ-メルカプトエタノールの存在下で変性させ、加熱（１００℃で１０分間）した後、抗体を加えた（Ｄ、変性）。免疫沈降後、myc抗体で沈降できた当該タンパク質の存在が、MSA特異抗体を用いたウェスタンブロット分析で明らかになった。図２の右側パネルは、予想通り、ループ53-62及び360-369にmycを挿入したアルブミンタンパク質が、このタンパク質がその天然型又は変性型であるかに関係なく、myc抗体に結合したことを示す。他方、mycを、予測上の埋もれた領域であるループ450-463に挿入した場合、このタンパク質は、それを最初に変性させたときにだけ、前記抗体に結合した。この実験は、ループ53-62及び360-369はMSAタンパク質の表面上に露出しており、従ってディスプレイに良好であることを明白に実証している。さらに、450-463ループは埋もれている。
【０１４９】
ウシ毛管内皮細胞（BCE）MSA-RGDの抑制。 この実験の目標は、RGDペプチド（VRGDF、配列番号1）をそのタンパク質表面上のループ53-58領域 (MSA-myc-RGD)にディスプレイしたMSAの機能を調べることだった。RGDを選択したのは、このペプチドが、内皮細胞上のαvβ3インテグリン受容体に効率的に結合してそれらの増殖を抑制できるからである。COS7細胞の三重式ウェルに、以下の構築物をトランスフェクトした：MSA-myc (myc エピト-プを、この回はMSAのＣ末端の尾に加えた）； MSA-myc-RGD；又はpAM7-スタッファ（原語：stuffer）、である。これらのCOS7細胞をトランスウェル（R)組織培養プレートの下側チャンバで成長させ、上側チャンバにはBCE細胞を入れた。BCE細胞の成長を刺激するためにFGFを下側チャンバに加えたが、FGFなしのコントロールの場合には加えずに、細胞を７２時間、成長させた。pAM7-スタッファを入れた一組のウェルには、6.25μMのc-RGDペプチドも加えた。細胞成長はカルセイン結合蛍光検定で調べた。図３の左側のパネルは、それぞれの光学密度（OD）のグラフである。このデータから、FGFを添加すると、BCE細胞の成長が２倍に刺激されることが分かる。この成長はc-RGDペプチドにより抑制され、また分泌されたMSA-myc-RGD タンパク質によっても抑制された。右側パネルは同じデータを別の方法で見たものである。この場合、成長の抑制の程度をそれぞれについてグラフにしている。このデータでは、MSA-Myc-RGDタンパク質が、BCE細胞の成長を53%抑制したことと、この抑制の程度は、RGDペプチドを添加した場合と同等であることが分かる。MSA分子の表面上にディスプレイされたRGDペプチドは、内因的に加えられた遊離RGDペプチドと同程度に効率的にBCE細胞成長を抑制したことから、このペプチドが、当該ループ方向でその活性を留めていることが実証された。
【０１５０】
血清アルブミン-EC結合ペプチドの融合によるBCE及びHUVEC増殖の抑制。 この実験は、内皮細胞結合（EC）ペプチドをディスプレイした精製マウス血清アルブミン（MSA）タンパク質によるBCE及びHUVEC細胞の増殖の抑制を実証するよう、デザインされた。このMSA-ペプチド融合においては、当該ペプチド配列を、システインで拘束されたループ内のアミノ酸53位及び62位の間に挿入した。このタンパク質は、この特定の組換えタンパク質の合成及び分泌を命令する発現プラスミドをトランスフェクトしたCOS-7細胞により、産生された。図５に示すように、MSA-9G5、MSA-11B3 及びMSA-RGD コンストラクトでは、挿入されたペプチドにより、MSAのCys⁵³-Cys⁶²間の天然型残基が置換された。MSA-1H5 及びMSA-myc コンストラクト（陰性コントロール）では、当該ペプチドを、前記ループのアミノ酸Glu⁵⁷位に挿入した。図６及び７は、FGFで刺激したBCE及びHUVEC細胞の増殖に及ぼす、当該精製タンパク質の抑制作用を示す。
【０１５１】
EC増殖実験の実験デザイン
タンパク質の作製及び濃縮
COS7-L 細胞に、以下：
１． 完全長マウス血清アルブミンMSA、（陰性コントロール）；
２． RGD配列（VRGDF、配列番号1）でMSA配列のCys⁵³-Cys⁶²間を置換したMSA-RGD；
３． 11-B3ペプチド配列（PSTLRAQ、配列番号3）でMSA配列のCys⁵³ - Cys⁶²を置換したMSA-11B3；
４． 1-H5ペプチド配列（HTKQIPRHIYSA、配列番号4）をMSAの Cys⁵³ - Cys⁶² ループのGlu⁵⁷ 及び Ser⁵⁸ 間に挿入した MSA-1H5；
５． 9-G5ペプチド配列（DSHKRLK、配列番号 5) でMSA配列のCys⁵³ - Cys⁶²間を置換したMSA-9G5；
６． Myc エピト-プペプチド配列(EQKLISEEDL、配列番号 2)をMSAの Cys⁵³ - Cys⁶² ループ内のGlu⁵⁷ 及び Ser⁵⁸ 間に挿入したMSA-myc（陰性コントロール）；
を発現するタンパク質発現コンストラクトをトランスフェクトした。
【０１５２】
トランスフェクト後のCOS7-L細胞を規定の無血清培地（VP-SFM)で培養した。５日間毎日、その調製培地を細胞から採集し、遠心分離して死んだ細胞及び他の細胞破壊片を取り除いた後、凍結した。５日経った培地をプールし、分子量カットオフ値を50（MSA、MSA-RGD、MSA-9G5用）又は分子量カットオフ値を30（MSA-myc、MSA-11B3、MSA-1H5用）にしたセンチプレップ-80を用いて５００倍に濃縮した。当該アルブミンタンパク質の濃度を、ウサギ抗MSA抗体を用い、そして既知の濃度の精製MSAを用いた各プレパラートのウェスタンブロット解析で決定して、標準曲線を作製した。ブロットを現像し、フィルムに露出させた後に、ゲル・ドック1000画像分析システム及びモラキュラー・アナリストソフトウェア（バイオラド社製）を用いて、そのオートラジオグラフを分析した。
【０１５３】
BCE 増殖検定
０日目に、１１回継代培養したウシ毛管内皮細胞（BCE）を、ペニシリン／ストレプトマイシン（PS）を加えた100mlの5%仔ウシ血清（CS）／DMEMを入れた９６ウェル組織培養プレートに、ウェル一つ当たり2×10³個の密度になるように、プレートした。次にこれらの細胞を、10%のCO₂、３７℃の雰囲気内で一晩、インキュベートした。
【０１５４】
１日目に、この培地を150mlの2% CS/DMEM/PSに変えた。当該アルブミンタンパク質を一番目のウェルに、150ml の 2% CS/DMEM/PSを更に含有する8.75mlとして加えた。次に150mlをこのウェルから取り出し、次のウェルに加えて、このタンパク質を 1:2 の希釈度とした。このプロセスをそれぞれ三重にして合計６回、繰り返した。次に50ml の 4ng/ml FGF (最終濃度：1ng/ml FGF) を各ウェルに加え、これらプレートを上述した通りに７２時間、インキュベートした。濃度4.1mMのサイクリックRGD(c-RGD）の合成ペプチドを含めて、増殖の抑制に関する陽性コントロールとして役立てた。タンパク質を加えずに、FGFを加えた細胞及びFGFを加えなかった細胞を、更なるコントロールとして各プレートに含めた。
【０１５５】
７２時間のインキュベーション後、培地を取り除き、プレートをPBSで２回洗浄し、−８０℃で凍結させた。BCE細胞の増殖を、メーカの推奨に従ってCyQUANT(R)細胞増殖検定キットを用いて評価した。
【０１５６】
：
結論
EC結合ペプチドをMSAに挿入すると、それらの抑制活性がほぼ１０００倍に上昇した。このMSA-EC結合ペプチド融合により、BCE及びHUVECの増殖が、ナノモル（nM）範囲で抑制されたが、前記合成ペプチドはマイクロモル（μM）範囲では活性であった。コントロールMSA及びMSA-mycタンパク質は、標的内皮細胞の増殖に有意な影響を与えなかった。
【０１５７】
MSA-RGD融合による腫瘍細胞アポトーシスの誘導。 RGD (Arg-Gly-Asp) モチーフを含有するペプチドは、プロ-カスパーゼ3自己開裂及び活性化を促進することで、カスパーゼ3依存的にアポトーシスを誘導することが示されている (Buckley et al., 1999)。従って、MSA-RGD融合によっても、アポトーシスを誘導できるかを調べることにも関心が持たれた。この仮説を検証するために、ヒト非小細胞肺癌細胞 (NCI 1869)をトランスウェル・インサートのメンブレンにプレートした。これらの細胞をインキュベートして付着させた。COS7細胞に、各融合タンパク質を発現及び分泌させるために（pcDNA MSA-RGD/53)をコードするcDNAを含有するプラスミドをトランスフェクトした。空のベクタ(pcDNA3)も陰性コントロールとして並行してトランスフェクトした。２４時間後、このNCI-1869細胞を持つトランスウェル・インサートを、COS7/MSA-RGDトランスフェクタントを含有するプレートに移した。これら細胞をさらに２４時間、同時インキュベートした。次にNCI-1869細胞を回収し、蛍光カスパーゼ3基質であるDEVD-AFCを含有するPBS/Mg^＋＋中でインキュベートした。この蛍光発生性テトラペプチド基質が、カスパーゼ3により開裂すると蛍光シグナルが生じるが、このシグナルを、アポトーシスの誘導の測定値として蛍光プレートリーダで読み取る。
【０１５８】
図８に示すその結果（それぞれの棒線は、３個の個別の試料の平均である）は、COS7細胞によってMSA-RGDが分泌されると、NCI-1869細胞中にベクタコントロールがある場合に比較して、アポトーシスが4.9倍、誘導されることを実証している。これらの細胞を精製RGDペプチドと一緒にインキュベートしても、顕微鏡分析による評価では、アポトーシスが誘導される。
【０１５９】
当業者であれば、ここに開示した本発明の等価物を数多く、認識されようが、その等価物のすべては、本発明の範囲内にあると意図されている。上に引用したすべての記事、特許、及び出願を、引用をもってここに援用することとする。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１は、ヒト血清アルブミン（HSA）の三次構造を示す。
【図２】図２は、マウス血清アルブミン（MSA）-Myc融合コンストラクトによる細胞のトランスフェクションや、この融合タンパク質の発現の成功、並びに、MSAタンパク質中の異種配列の位置に依存した、MSA-Myc融合タンパク質へのMSA及びMyc抗体の結合を示す。
【図３】図３は、ウシ毛管内皮細胞のFGF誘導性増殖に対する、RGDペプチド及びMSA-myc-RGD融合タンパク質による抑制を示す。
【図４】図４A乃至Iは、以下に解説するディスプレイ治療ポリペプチド配列と置換してもよい血清アルブミンのループを強調した図である。
【図５】図５は、マウス血清アルブミンのCys⁵³-Cys⁶²ループ中の治療ポリペプチド配列のディスプレイのためのアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、FGFで刺激されたウシ毛管内皮（BCE）細胞に対し、図５で示したマウス血清アルブミンタンパク質が及ぼす抑制効果を示す。
【図７】図７は、FGFで刺激されたヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）に対し、図５で示したマウス血清アルブミンタンパク質が及ぼす抑制効果を示す。
【図８】図８は、NCI 1869ヒト非小細胞肺癌細胞株においてMSA-RGD融合タンパク質が誘導するアポトーシスの誘導を示す。

Claims (53)

1. 生物活性異種ペプチド配列を内部に挿入して有する血清アルブミンタンパク質（SA）を含んで成るキメラポリペプチドであって、前記ペプチドが、前記異種ペプチド配列自体に比較して上昇した生物活性を示す、キメラポリペプチド。
2. 構造A-B-Cを有するキメラポリペプチドであって、
   但し式中、Aは血清アルブミン（SA）の第一フラグメントを表し、
   Bは生物活性異種ペプチド配列を表し、そして
   CはSAの第二ペプチドフラグメントを表し、
   前記異種ペプチド配列自体に比較して上昇した生物活性を示す、キメラポリペプチド。
3. 血清アルブミン(SA）タンパク質のＮ末端フラグメントを含んで成る第一ペプチドフラグメントと、
   生物活性異種ペプチド配列を含んで成る第二ペプチドフラグメントと、
   SAのＣ末端フラグメントを含んで成る第三ペプチドフラグメントと
   を含んで成り、前記ペプチドが、前記異種ペプチド配列自体に比較して上昇した生物活性を示す、キメラポリペプチド。
4. 前記異種ペプチド配列が、血管新生抑制タンパク質又はポリペプチドの一フラグメントを含んで成る、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
5. 前記血管新生抑制タンパク質又はポリペプチドが、アンジオスタチン、エンドスタチン、又はこれらのペプチドフラグメントから選択される、請求項４に記載のキメラポリペプチド。
6. 前記異種ペプチド配列が細胞表面受容体タンパク質に結合する、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
7. 前記受容体タンパク質がＧタンパク質共役受容体である、請求項６に記載のキメラポリペプチド。
8. 前記受容体タンパク質がチロシンキナーゼ受容体である、請求項６に記載のキメラポリペプチド。
9. 前記受容体タンパク質がサイトカイン受容体である、請求項６に記載のキメラポリペプチド。
10. 前記受容体タンパク質がMIRR受容体である、請求項６に記載のキメラポリペプチド。
11. 前記受容体タンパク質がオーファン受容体である、請求項６に記載のキメラポリペプチド。
12. 細胞外受容体又はイオンチャネルに結合する、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
13. 前記受容体又はイオンチャネルのアゴニストである、請求項１２に記載のキメラポリペプチド。
14. 前記受容体又はイオンチャネルのアンタゴニストである、請求項１２に記載のキメラポリペプチド。
15. アポトーシスを誘導する、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
16. 細胞増殖を調節する、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
17. 細胞種の分化を調節する、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
18. 前記異種ペプチド配列が４乃至４００個の間の残基を含んで成る、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
19. 前記異種ペプチド配列が４乃至２００個の間の残基を含んで成る、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
20. 前記異種ペプチド配列が４乃至１００個の間の残基を含んで成る、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
21. 前記異種ペプチド配列が４乃至２０個の間の残基を含んで成る、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
22. 前記キメラポリペプチドの三次構造が、天然SAの三次構造に類似である、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
23. 前記挿入されるペプチド配列が天然SA配列の一部を置換する、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
24. 前記挿入されるペプチド配列と、天然SAの置換される部分が、等しくない長さのものである、請求項２３に記載のキメラポリペプチド。
25. 前記生物活性異種ペプチド配列単独よりも少なくとも１０倍、活性である、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
26. 前記生物活性異種ペプチド配列単独よりも少なくとも１００倍、活性である、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
27. 前記生物活性異種ペプチド配列単独よりも少なくとも１,０００倍、活性である、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
28. 請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする核酸。
29. 請求項２８に記載の核酸を含んで成る送達ベクタ。
30. ウィルス又はレトロウィルスを含んで成る、請求項２９に記載の送達ベクタ。
31. 前記ウィルス又はレトロウィルスが、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、又はワクシニアウィルスから選択される、請求項３０に記載の送達ベクタ。
32. 請求項２９に記載の送達ベクタに暴露してある標的細胞を含んで成るトランスフェクトされた細胞。
33. 前記細胞が血球、骨格筋細胞、幹細胞、皮膚細胞、肝細胞、分泌線細胞、造血細胞、又は骨髄細胞から選択される、請求項３２に記載のトランスフェクトされた細胞。
34. 薬学的に許容可能な医薬品添加物と、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチドとを含んで成る医薬製剤。
35. 請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチドを医薬製剤として生物に投与するステップを含む、生物の疾患を治療する方法。
36. （ｉ）請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を含んで成る送達ベクタを提供するステップと、
    （ｉｉ）標的細胞を誘導して前記ポリペプチドを発現させるのに充分な条件下で、前記ベクタを前記標的細胞にin vivoで導入するステップと
    を含む、前記生物の疾患を治療する方法。
37. （ｉ）請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を含んで成る送達ベクタを提供するステップと、
    （ｉｉ）前記ベクタを標的細胞にex vivoで導入するステップと、
    （ｉｉｉ）前記標的細胞を誘導して前記ポリペプチドを発現させるのに充分な条件下で、導入されたベクタを含有する前記標的細胞を、生物に導入するステップと
    を含む、前記生物の疾患を治療する方法。
38. 前記標的細胞が、血球、骨格筋細胞、幹細胞、皮膚細胞、肝細胞、分泌線細胞、造血細胞、又は骨髄細胞から選択される、請求項３６又は３７に記載の方法。
39. 構造(A-B-C）_nを有するキメラポリペプチドであって、
    但し式中、Aはそれぞれ個別に血清アルブミン（SA）の一フラグメントを表し、
    Bはそれぞれ個別に生物活性異種ペプチド配列を表し、
    Cはそれぞれ個別に第二生物活性異種ペプチド配列又は血清アルブミン（SA）の一フラグメントを表し、そして
    nは0より大きい整数である、キメラポリペプチド。
40. B及びCが同一の配列を含んで成る、請求項３９に記載のポリペプチド。
41. B及びCが単一のタンパク質の数フラグメントを含んで成る、請求項３９に記載のポリペプチド。
42. B及びCが二つの異なるタンパク質の数フラグメントを含んで成る、請求項３９に記載のポリペプチド。
43. 少なくとも二つの生物活性異種ペプチド配列を内部に挿入して有する血清アルブミンタンパク質（SA）を含んで成るキメラポリペプチド。
44. 前記異種ペプチド配列が同一である、請求項４３に記載のポリペプチド。
45. 前記異種ペプチド配列が、一タンパク質の別個の配列を含んで成る、請求項４３に記載のポリペプチド。
46. 前記異種ペプチド配列が、少なくとも二つの異なるタンパク質のうちの数配列を含んで成る、請求項４３に記載のポリペプチド。
47. 請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチドを医薬製剤として生物に投与するステップを含む、前記生物において細胞増殖、細胞分化、及び細胞死のうちの一つ以上を調節する方法。
48. （ｉ）請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を含んで成る送達ベクタを提供するステップと、
    （ｉｉ）標的細胞を誘導して前記ポリペプチドを発現させるのに充分な条件下で、前記ベクタを前記標的細胞にin vivoで導入するステップと
    を含む、前記生物において細胞増殖、細胞分化、及び細胞死のうちの一つ以上を調節する方法。
49. 前記生物活性異種ペプチド配列が、前記血清アルブミンタンパク質のシステインループに挿入される、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
50. 前記システインループが、Cys⁵³-Cys⁶²、Cys⁷⁵-Cys⁹¹、Cys⁹⁰-Cys¹⁰¹、Cys²⁴⁵-Cys²⁵³、Cys²⁶⁶-Cys²⁷⁹、Cys³⁶⁰-Cys³⁶⁹、Cys⁴⁶¹-Cys⁴⁷⁷、Cys⁴⁷⁶-Cys⁴⁸⁷、及びCys⁵⁵⁸-Cys⁵⁶⁷から選択される、請求項４９に記載のキメラポリペプチド。
51. 前記生物活性異種ペプチド配列が、前記血清アルブミンタンパク質のシステインループの一部を置換する、請求項２３に記載のキメラポリペプチド。
52. 前記システインループが、Cys⁵³-Cys⁶²、Cys⁷⁵-Cys⁹¹、Cys⁹⁰-Cys¹⁰¹、Cys²⁴⁵-Cys²⁵³、Cys²⁶⁶-Cys²⁷⁹、Cys³⁶⁰-Cys³⁶⁹、Cys⁴⁶¹-Cys⁴⁷⁷、Cys⁴⁷⁶-Cys⁴⁸⁷、及びCys⁵⁵⁸-Cys⁵⁶⁷から選択される、請求項５１に記載のキメラポリペプチド。
53. 前記生物活性異種ペプチドがmycエピト-プ又はRGDペプチドである、請求項１、２、又は３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。

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