CN106795203B - 用于抗体药物缀合物的稳定性调节接头 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了经稳定性调节的抗体‑药物缀合物，用于制备这些经稳定性调节的抗体‑药物缀合物的稳定性调节接头组分，使用经稳定性调节的抗体‑药物缀合物的治疗方法，以及制备稳定性调节接头和经稳定性调节的抗体‑药物缀合物的方法。

Description

用于抗体药物缀合物的稳定性调节接头
技术领域
本发明涉及与抗体-药物缀合物(ADC)关联使用的接头，所述接头能够上调和下调抗体-药物缀合物的细胞外和/或细胞内稳定性。本发明也涉及采用这样的临床上有利的经稳定性调节的抗体-药物缀合物的治疗用途和治疗方案。最后，本发明涉及制备稳定性调节接头和经稳定性调节的抗体-药物缀合物的方法。
对序列表的引用
本申请通过EFS-Web以电子方式提交，并包括.txt格式的以电子方式呈递的序列表。所述.txt文件含有于2015年8月14日创建且具有10KB的大小的标题为“PC72108A_SEQ_LISTING_ST25.txt”的序列表。在该.txt文件中所含的序列表是说明书的组成部分，且以其整体援引加入本文。
背景技术
抗体疗法在患有多种病症(诸如癌症和免疫学疾病)的患者中提供靶向治疗性处理，且因此已经在生物学研究中起重要作用。已经探究了靶向抗体疗法的不同方案，包括抗体-药物缀合物(ADC)。Chari,R.V.,Miller,M.L.,和Widdison,W.C.(2014)Antibody-drugconjugates:an emerging concept in cancer therapy.Angewandte Chemie 53,3796-827；Senter,P.D.,和Sievers,E.L.(2012)The discovery and development of
Figure BDA0001262491160000011
(brentuximab vedotin)for use in relapsed Hodgkin lymphoma andsystemic anaplastic large cell lymphoma.Nature biotechnology 30,631-7；Lambert,J.M.(2013)Drug-conjugated antibodies for the treatment ofcancer.British journal of clinical pharmacology 76,248-62。
在ADC(在某些上下文中也称为免疫缀合物)的情况下，将小分子“有效负载”(其通常是细胞毒性的小分子(药物基团))与抗体共价连接(缀合)，用于将药物基团向肿瘤靶向局部递送。用于ADC的常规缀合方法包括以下化学修饰：通过赖氨酸侧链胺，或通过还原链间二硫键而活化的半胱氨酸巯基。Brentuximab vedotin和
Figure BDA0001262491160000021
(ado-trastuzumab emtansine)是使用这些常规方法的ADC的2个实例。
还已经探究了使用转谷氨酰胺酶制备ADC的酶促方案。转谷氨酰胺酶属于催化酰基向伯胺加成的酶家族。使用转谷氨酰胺酶的缀合会提供高选择性、简化的反应操作以及温和的反应条件的优点。参见例如Strop等人,Chemistry&Biology,20:161-167(2013)；和Farias等人,Bioconj.Chem.25(2):240-250(2014)。US2013-0230543和US2013-0122020描述了转谷氨酰胺酶介导的抗体与小分子的位点特异性缀合。
常规ADC缀合方法产生在给定的生物系统中具有固有稳定性的ADC。有效负载在期望部位(通常是肿瘤)处的递送取决于有效负载的性质、共价接头、抗体和在其中引入ADC的生物系统。通常，从小于最佳稳定(less than optimally-stable)的ADC(例如在血浆中)过早地释放显著量的有效负载，且因而需要较高的ADC给药水平以便实现在肿瘤部位处对有效负载的期望暴露。在其它情况下，过度稳定的ADC的应用导致靶向肿瘤细胞内的小于最佳(less than optimal)有效负载释放活性。
自从在2002年对它们的介绍(Dubowchik,G.M.等人.Bioconjugate Chem.2002,13,855-869)以来，采用对氨基苄氧羰基(PABC)自杀单元(immolation element)的基于可溶蛋白性裂解的肽的连接已经被广泛地用在抗体-药物缀合物(ADC)研究中。这样的连接据称在内化进抗原靶向细胞中并将ADC暴露于在胞内体和溶酶体细胞器中发现的降解性蛋白水解环境后会经历裂解。这些二肽-PABC接头的半胱氨酸连接的变体已经获得专利(US 6,214,345 B2)，并且已经证实，这些和其它连接的含胺形式适合用于使用微生物转谷氨酰胺酶促进的酶促缀合与谷氨酰胺残基进行位点特异性缀合，以及使用该酶促缀合途径经历有效缀合的去糖基化抗体和工程化抗体变体的用途(WO2012/059882 A2)。
在本文中引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的以其整体援引加入本文，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利和专利申请如此援引加入的相同程度。在一篇或多篇援引加入的文献和类似材料与本申请(包括但不限于所限定的术语、术语用法、所描述的技术等)不同或矛盾的情况下，以本申请为准。
发明概述
本发明一般性地涉及通常通过采用转谷氨酰胺酶介导的缀合来制备的ADC，其具有稳定性性能，该性能是通过在ADC的接头上存在调节基团而改变的。发明人已经令人惊讶地发现，位于ADC接头的特定位置处的此类调节基团(更具体地，掺入这些调节基团中的某些化学特征)具有期望的增加或降低ADC的稳定性的能力，使得更大或更小比例的ADC有效负载在期望的作用部位处被释放。
因而，在本文中提供了在含胺缀合柄(conjugation handle)(所述缀合柄通常是赖氨酸的酰化衍生物)上的特异性取代，其可以对所得到的ADC的体外血浆稳定性和体内暴露具有深远影响。证实了可以通过改变存在于含胺缀合柄上的取代基的性质来调节缀合物稳定性，并且进一步地，可以选择取代基以优化各自独特缀合位点的稳定性。因此，本发明使得能够微调体内ADC稳定性，且因此使得能够调节影响体内效力和安全性的参数，且因此使得能够优化ADC的治疗指数。
附图说明
图1A至1I显示了在许多位点处与氨基-己酰基(C6)vcAur0101细胞毒性有效负载缀合的嵌合抗-Trop2抗体的体外细胞毒性研究。
图1J至1O显示了在位点LCQ04和L11B处与实施例2、3和5的接头-有效负载缀合的嵌合抗-Trop2抗体的体外细胞毒性研究。
图2显示了经由LCQ04位点连接在Trop2抗体上的以下化合物的体内稳定性：实施例12和14 ADC化合物(图2A)；实施例16和13 ADC化合物(图2B)；和实施例11、18和17 ADC化合物(图2C)。虚线代表有效负载浓度，实线代表抗体浓度。
图3提供了通过与小鼠敲除品系c56/bl6 ces1c-/-、杂合品系c56/bl6 ces1c±和野生型品系c56/bl6 ces1c+/+的对比来确证小鼠羧酸酯酶1C为在血浆中负责vc-pabc接头裂解的酶。
发明详述
本发明一般性地涉及具有设计的稳定性程度的抗体-药物缀合物(ADC)。具体地，本发明提供了式(I)的化合物：
Figure BDA0001262491160000041
其中：
M是稳定性调节剂；
P是包含一个或多个谷氨酰胺残基的肽序列；
Q是存在于P中的所述谷氨酰胺残基之一；
E各自独立地选自：-C(R1)2-、-O-C(R1)2-C(R1)2-(其中r至少是2)和-C(R1)2-C(R1)2-O-(其中s至少是1)；
R1各自独立地选自：H、C1-C6直链或支链烷基、C2-C6直链或支链烯基和C2-C6直链或支链炔基；
X各自独立地是氨基酸，其中各氨基酸X是相同的或者是不同的；
Y各自独立地是氨基酸，其中各氨基酸Y是相同的或者是不同的；
Z各自独立地是间隔单元，其中各间隔单元是相同的或者是不同的；
m是0-5，n是1-5，p是0-2，q是0-10，r是0-2，且s是0-2，其中q+r+s＝2或更大；且
D是细胞毒素剂或其它治疗剂，或D是成像剂。
本发明的实施方案还包括式(II)的化合物：
Figure BDA0001262491160000042
其中：
M是稳定性调节剂；
P是包含一个或多个谷氨酰胺残基的肽序列；
Q是存在于P中的所述谷氨酰胺残基之一；
E各自独立地选自：-C(R1)2-、-O-C(R1)2-C(R1)2-(其中r至少是2)和-C(R1)2-C(R1)2-O-(其中s至少是1)；
R1各自独立地选自：H、C1-C6直链或支链烷基、C2-C6直链或支链烯基和C2-C6直链或支链炔基；
X各自独立地是氨基酸，其中各氨基酸X是相同的或者是不同的；
Y各自独立地是氨基酸，其中各氨基酸Y是相同的或者是不同的；
Z各自独立地是间隔单元，其中各间隔单元是相同的或者是不同的；
m是0-5，n是1-5，p是0-2，q是0-10，r是0-2，且s是0-2，其中q+r+s＝2或更大；且
D是细胞毒素剂或其它治疗剂，或D是成像剂。
另外的实施方案包括用于制备抗体药物缀合物的式(III)的化合物：
Figure BDA0001262491160000051
其中：
M是稳定性调节剂；
E各自独立地选自：-C(R1)2-、-O-C(R1)2-C(R1)2-(其中r至少是2)和-C(R1)2-C(R1)2-O-(其中s至少是1)；
R1各自独立地选自：H、C1-C6直链或支链烷基、C2-C6直链或支链烯基和C2-C6直链或支链炔基；
X各自独立地是氨基酸，其中各氨基酸X是相同的或者是不同的；
Y各自独立地是氨基酸，其中各氨基酸Y是相同的或者是不同的；
Z各自独立地是间隔单元，其中各间隔单元是相同的或者是不同的；
m是0-5，n是1-5，p是0-2，q是0-10，r是0-2，且s是0-2，其中q+r+s＝2或更大；且
D是细胞毒素剂或其它治疗剂，或D是成像剂。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中M是-M1-M2，其中M1是-NR1-C(O)-、-NR1-S(O)2-或者不存在，且M2选自：被取代的甲基、-C2-C20烷基、-C1-C20杂烷基、-C2-C6烯基、-C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、羧基、-N(R1)2、-C6-C14芳基、-C6-C14杂芳基、-C1-C10杂环基和-C3-C10碳环基，且其中M2任选地被一个或多个选自以下的取代基进一步取代：-C1-C6烷基、-C1-C6烯基、-C1-C6炔基、卤素、C1-C6烷氧基、羟基、-N(R1)2、-C(O)N(R1)2、-NO2、-C6-C14芳基、-C6-C14杂芳基、-C1-C10杂环基、-C3-C10碳环基、羧基、-SH、-S(C1-C6烷基)、-S(C6-C14芳基)、-S(C6-C14杂芳基)、-S(C1-C10杂环基)、-S(C3-C10碳环基)、-C1-C8烷基-C(O)-C1-C8烷基、-C1-C8烷基-C(O)-H、-C1-C8烷基-C(O)-O-C1-C8烷基、-NR1-C(O)-N(R1)2、-C1-C8烷基-O-C(O)-N(R1)2、-C1-C8烷基-S(O)2-N(R1)2、-C1-C8烷基-S(O)2-OH、-C1-C8烷基-S(O)2-C1-C8烷基和-C1-C8烷基-S(O)-C1-C8烷基；条件是，当M1是-NH-C(O)-且-(C(R1)2)r-Eq-(C(R1)2)s-是直链C4-烷基时，M2不是未被取代的甲基。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中M是-M1-M2，其中M1是-NR1-C(O)-、-NR1-S(O)2-或不存在，且M2选自：-C2-C10烷基、-C1-C10杂烷基、-C6-C14芳基、-C6-C14杂芳基、-C1-C10杂环基和-C3-C10碳环基，且其中M2任选地被一个或多个选自以下的取代基进一步取代：-C1-C6烷基、卤素、-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基。
另外的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中M2选自：
Figure BDA0001262491160000071
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000072
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000081
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000082
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000083
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000084
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000085
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000086
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000087
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000091
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000092
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000093
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000094
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000095
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000096
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000097
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000101
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000102
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000103
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000104
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000105
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000106
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000111
在某些实施方案中，本发明的ADC包含具有经修饰的酰基调节基团的赖氨酸系接头系统，其中所述经修饰的酰基调节基团是：
Figure BDA0001262491160000112
在某些实施方案中，提供了一种调节ADC的体内稳定性的方法，所述方法包括下述步骤：选择能够调节所述化合物的细胞外稳定性的调节剂M；将所述调节剂M掺入所述缀合物中；和将所述缀合物给药至患者。
在某些实施方案中，调节稳定性，使得在靶细胞外释放的细胞毒素剂相对于在靶细胞内释放的细胞毒素剂的比率增加。
在某些实施方案中，调节稳定性，使得在靶细胞外释放的细胞毒素剂相对于在靶细胞内释放的细胞毒素剂的比率降低。
在某些实施方案中，调节稳定性，使得在靶细胞内释放的细胞毒素剂相对于在靶细胞外释放的细胞毒素剂的比率增加。
在某些实施方案中，调节稳定性，使得在靶细胞内释放的细胞毒素剂相对于在靶细胞外释放的细胞毒素剂的比率降低。
在某些实施方案中，本文提供的方法还包括纯化步骤，其中通过色谱法步骤纯化所述ADC。
在某些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶是微生物的、纯化的、或工程化的转谷氨酰胺酶。
在另一个方面，本发明提供了一种在有此需要的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的药物组合物，所述药物组合物包含如本文中所述的一种或多种ADC。
在另一个方面，本发明提供了一种在有此需要的个体中抑制肿瘤生长或进展的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的药物组合物，所述药物组合物包含如本文中所述的ADC。
在另一个方面，本发明提供了一种在疑似患有癌症的个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：a)在导致ADC与癌症相关蛋白结合的条件下使所述个体的样品与如本文中所述的ADC接触，和b)确定ADC与癌症相关蛋白的结合。
在某些实施方案中，如本文中所述的ADC中的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微抗体(minibody)、双抗体或抗体片段。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中所述细胞毒素剂D选自：蒽环类抗生素、耳他汀(auristatin)、spliceostatin、CBI/CPI二聚体(包括包含CBI和CPI组分二者的括“混合”二聚体，如在美国临时专利申请61/932,118中所述)、卡奇霉素、多卡米星、烯二炔(enediyne)、格尔德霉素、美坦辛、嘌呤霉素、紫杉烷、长春花生物碱、SN-38、tubulysin、哈米特林(hemiasterlin)、喜树碱、考布他汀、多拉司他汀、二氢吲哚并-苯二氮
Figure BDA0001262491160000121
(indolino-benzodiazepine)二聚体、吡咯并苯二氮
Figure BDA0001262491160000122
(pyrrolobenzodiazepine)二聚体和普拉地内酯(pladienolide)，及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。例如这样的实施方案，其中细胞毒素剂D是选自dolestatin、MMAD、MMAE、MMAF、PF-06380101、PF-06463377和PF-06456780的耳他汀。
本发明的另外的实施方案包括其中D是细胞毒素剂以外的物质(例如其中D是具有治疗性能的基团(即，治疗剂)且包括一种或多种肽、一种或多种蛋白质、一种或多种核酸、一种或多种生长因子、一种或多种抗病毒剂或一种或多种免疫学药剂，或者D是一种或多种荧光团或一种或多种其它成像剂)的实施方案。与其中D是细胞毒素剂的情况一样，本发明包括其中D是细胞毒素剂以外的物质的化合物的稳定性调节。
本发明的另外的实施方案包括这样的化合物，其中P是包含选自以下的氨基酸序列的肽：Q、LQG、LLQGG(SEQ ID NO:1)、LLQG(SEQ ID NO:2)、LSLSQG(SEQ ID NO:3)、GGGLLQGG(SEQ ID NO:4)、GLLQG(SEQ ID NO:5)、LLQ、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO:6)、GLLQGGG(SEQ ID NO:7)、GLLQGG(SEQ ID NO:8)、GLLQ(SEQ ID NO:9)、LLQLLQGA(SEQ ID NO:10)、LLQGA(SEQ ID NO:11)、LLQYQGA(SEQ ID NO:12)、LLQGSG(SEQ ID NO:13)、LLQYQG(SEQ IDNO:14)、LLQLLQG(SEQ ID NO:15)、SLLQG(SEQ ID NO:16)、LLQLQ(SEQ ID NO:17)、LLQLLQ(SEQ ID NO:18)、LLQGR(SEQ ID NO:19)、LLQGPP(SEQ ID NO:20)、LLQGPA(SEQ ID NO:21)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)、GGLLQGA(SEQ ID NO:23)、LLQGA(SEQ ID NO:24)、LLQGPGK(SEQID NO:25)、LLQGPG(SEQ ID NO:26)、LLQGP(SEQ ID NO:27)、LLQP(SEQ ID NO:28)、LLQPGK(SEQ ID NO:29)、LLQAPGK(SEQ ID NO:30)、LLQGAPG(SEQ ID NO:31)、LLQGAP(SEQ ID NO:32)、LLQGPA(SEQ ID NO:33)、LLQGPP(SEQ ID NO:34)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:35)和LLQLQG(SEQ ID NO:36)。
本发明的实施方案还包括如本文中所述的化合物，其中P是包含氨基酸序列XXQX(SEQ ID NO:37)的肽，其中X是任意氨基酸。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中与缺少所述调节剂M的对应化合物相比，所述化合物的稳定性降低了至少1倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍或100倍。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中与缺少所述调节剂M的对应化合物相比，所述化合物的稳定性增加了至少1倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍或100倍。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中X-Y选自：Gly、β-Ala、Val-Cit、Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ala-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Val-Ala和Ala-Ala-Asn。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中P选自：单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微抗体和抗体片段。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中所述抗体选自：曲妥珠单抗、曲妥珠单抗突变体(例如在本文中或在国际专利申请PCT/IB2012/056234中公开的曲妥珠单抗突变体)、奥戈伏单抗、依屈洛单抗、西妥昔单抗、针对玻连蛋白受体(αvβ3)的人源化单克隆抗体、阿仑珠单抗、抗-HLA-DR抗体(包括用于治疗非霍奇金淋巴瘤的人源化抗-HLA-DR抗体)、131I Lym-1、抗-HLA-Dr10抗体(包括用于治疗非霍奇金淋巴瘤的鼠抗-HLA-Dr10抗体)、抗-cd33抗体、抗-cd22抗体(包括用于治疗霍奇金病或非霍奇金淋巴瘤的人源化抗-CD22 mAb)、拉贝珠单抗、贝伐珠单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、帕木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、伊匹木单抗和吉妥珠单抗。
本发明的另外的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中Q各自独立地是肽序列P的内源性谷氨酰胺的残基，或者是在所述肽序列P上的工程化标签序列中提供的谷氨酰胺的残基(其中所述标签可以是含有谷氨酰胺的多氨基酸序列，或简单地是谷氨酰胺)。
在本发明的另一个方面，所述抗体充当具有或不具有靶向递送性质的大分子载体，从而通过经稳定性调节的可裂解接头促进有效负载D的控释。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中Q各自是所述肽序列P的内源性谷氨酰胺的残基。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中Q各自是在所述肽序列P上的工程化标签序列中提供的谷氨酰胺的残基(再次，其中所述标签可以是含有谷氨酰胺的多氨基酸序列，或简单地是谷氨酰胺)。
本发明的其它实施方案包括调节式(II)的抗体药物缀合物的体内稳定性的方法：
Figure BDA0001262491160000141
其中：
M是稳定性调节剂；
P是包含一个或多个谷氨酰胺残基的肽序列；
Q是存在于P中的所述谷氨酰胺残基之一；
E各自独立地选自：-C(R1)2-、-O-C(R1)2-C(R1)2-(其中r至少是2)和-C(R1)2-C(R1)2-O-(其中s至少是1)；
R1各自独立地选自：H、C1-C6直链或支链烷基、C2-C6直链或支链烯基和C2-C6直链或支链炔基；
X各自独立地是氨基酸，其中各氨基酸X是相同的或者是不同的；
Y各自独立地是氨基酸，其中各氨基酸Y是相同的或者是不同的；
Z各自独立地是间隔单元，其中各间隔单元是相同的或者是不同的；
m是0-5，n是1-5，p是0-2，q是0-10，r是0-2，且s是0-2，其中q+r+s＝2或更大；且
D是细胞毒素剂；
所述方法包括下述步骤：
选择能够调节所述化合物的细胞外稳定性的调节剂M；
将所述调节剂M掺入所述缀合物中；和
将所述缀合物给药至患者。
本发明的实施方案包括如本文中所述的治疗方法，其中在靶细胞外释放的细胞毒素剂相对于在靶细胞内释放的细胞毒素剂的比率增加。
本发明的实施方案包括如本文中所述的治疗方法，其中在靶细胞外释放的细胞毒素剂相对于在靶细胞内释放的细胞毒素剂的比率降低。
本发明的实施方案包括如本文中所述的治疗方法，其中在靶细胞内释放的细胞毒素剂相对于在靶细胞外释放的细胞毒素剂的比率增加。
本发明的实施方案包括如本文中所述的方法，其中在靶细胞内释放的细胞毒素剂相对于在靶细胞外释放的细胞毒素剂的比率降低。
本发明的其它实施方案包括合成式(II)的化合物的方法：
Figure BDA0001262491160000151
其中：
M是稳定性调节剂；
P是包含一个或多个谷氨酰胺残基的肽序列；
Q是存在于P中的所述谷氨酰胺残基之一；
E各自独立地选自：-C(R1)2-、-O-C(R1)2-C(R1)2-(其中r至少是2)和-C(R1)2-C(R1)2-O-(其中s至少是1)；
R1各自独立地选自：H、C1-C6直链或支链烷基、C2-C6直链或支链烯基和C2-C6直链或支链炔基；
X各自独立地是氨基酸，其中各氨基酸X是相同的或者是不同的；
Y各自独立地是氨基酸，其中各氨基酸Y是相同的或者是不同的；
Z各自独立地是间隔单元，其中各间隔单元是相同的或者是不同的；
m是0-5，n是1-5，p是0-2，q是0-10，r是0-2，且s是0-2，其中q+r+s＝2或更大；且
D是细胞毒素剂；
所述方法包括下述步骤：
提供一定量的具有以下结构的第一化合物
Figure BDA0001262491160000161
提供一定量的包含掺入谷氨酰胺的肽序列的第二化合物；和
在转谷氨酰胺酶的存在下使所述量的第一化合物和第二化合物反应。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中Z选自：PABC(对氨基苄基-氨甲酰基),PAB-OH(对氨基氨甲酰氧基),
Figure BDA0001262491160000171
其中T是O、NH或S。
本发明的实施方案包括如本文中所述的化合物，其中Z是Z1-Z2，其中：Z1选自对氨基苄基-氨甲酰基(PABC)、对氨基苄氧基、邻氨基苄基-氨甲酰基、邻氨基苄氧基、-NH-U-C(R1)2OCO-和-NH-U-C(R1)2O-；Z2不存在或选自-N(R1)2-(C1-C6-亚烷基)-OCO-、-N(R1)2-(C1-C6-亚烷基)-N(R1)2CO-、-N(R1)2-(C1-C6-亚烷基)-SCO-、-N(R1)2-(C3-C9-亚环烷基)-OCO-、-N(R1)2-(C3-C9-亚环烷基)-N(R1)2CO-和-N(R1)2-(C3-C9-亚烷基)-SCO-；其中U是任选地被至多5个选自以下的另外的取代基取代的C5-C20芳族环或杂芳族环：-C1-C6烷基、-C1-C6烯基、-C1-C6炔基、卤素、C1-C6烷氧基、羟基、-N(R1)2、-C(O)N(R1)2、-NO2、-C6-C14芳基、-C6-C14杂芳基、-C1-C10杂环基、-C3-C10碳环基、羧基、-SH、-S(C1-C6烷基)、-S(C6-C14芳基)、-S(C6-C14杂芳基)、-S(C1-C10杂环基)、-S(C3-C10碳环基)、-C1-C8烷基-C(O)-C1-C8烷基、-C1-C8烷基-C(O)-H、-C1-C8烷基-C(O)-O-C1-C8烷基、-NR1-C(O)-N(R1)2、-C1-C8烷基-O-C(O)-N(R1)2、-C1-C8烷基-S(O)2-N(R1)2、-C1-C8烷基-S(O)2-OH、-C1-C8烷基-S(O)2-C1-C8烷基和-C1-C8烷基-S(O)-C1-C8烷基。应当安排在U上的-NH-和-C(R1)2OCO-或-C(R1)2O-的取代模式，从而允许在Y-Z键的裂解后对Z2-D的有效消除。例如，参见US 7,754,681 B2和US 6214345 B2。
术语“烷基”(本身或作为另一个术语的组成部分)表示具有指定数目的碳原子的直链或支链饱和烃(例如，“C1-C8“烷基表示具有1-8个碳原子的烷基)。当没有指示碳原子的数目的时候，所述烷基具有1-8个碳原子。代表性的直链C1-C8烷基包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基；而支链C1-C8烷基包括但不限于：-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基和-2-甲基丁基；不饱和的C2-C8烷基包括但不限于：乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基、3-己基、乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基和3-甲基-1-丁炔基。
除非另有说明，术语“杂烷基”(本身或与另一个术语组合)是指稳定的直链或支链烃或它们的组合，其为完全饱和的或含有1-3不饱和度，由所述数目的碳原子和1-3个选自O、N、Si和S的杂原子组成，且其中所述氮和硫原子可以任选地被氧化，且所述氮杂原子可以任选地季铵化。可以将杂原子O、N和S放置在杂烷基的任何内部位置处。可以将杂原子Si放置在杂烷基的任何位置处，包括烷基与分子的其余部分连接的位置。至多2个杂原子可以是连贯的。
除非另有说明，术语“芳基”(本身或作为另一个术语的组成部分)是指具有6-20个、优选6-14个碳原子的被取代的或未被取代的单价碳环芳族烃基，其通过从母体芳族环系的单个碳原子除去一个氢原子而衍生出。典型的芳基包括但不限于从苯、取代的苯、萘、蒽、联苯等衍生出的残基。芳基可以被一个或多个、优选1-5个以下基团取代：C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中R'各自独立地选自-H、C1-C8烷基和未被取代的芳基。除非另有说明，术语“杂环基”(本身或作为另一个术语的组成部分)表示单价的被取代的或未被取代的芳族或非芳族的单环、二环或三环环系，其具有1-10个、优选3-8个碳原子(也被称作环成员)和1-4个独立地选自N、O、P或S的杂原子环成员，且通过从母体环系的环原子除去一个氢原子而衍生出。杂环基中的一个或多个N、C或S原子可以被氧化。包含杂原子的环可以是芳族的或非芳族的。除非另外指出，杂环基在任意杂原子或碳原子处与它的侧基连接，产生稳定的结构。C1-C10杂环基的代表性实例包括但不限于：四氢呋喃基、氧杂环丁基、吡喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、吲哚基、苯并吡唑基、吡咯基、噻吩基(噻吩)、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基(包括诸如1,2,3,4-四氢喹啉基的基团)、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基、四唑基、环氧化物、氧杂环丁烷和BODIPY(被取代的或未被取代的)。C1-C10杂环基可以被至多7个基团取代，所述基团包括但不限于：C1-C8烷基、C1-C8杂烷基、-OR'、芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(＝O)2R'、-S(O)R'、卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中R'各自独立地选自-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基。在某些实施方案中，取代的杂环基还可以包括以下中的一个或多个：-NHC(＝NH)NH2、-NHCONH2、-S(＝O)2R'和-SR'。
除非另有说明，术语“碳环基”(本身或作为另一个术语的组成部分)表示3-、4-、5-、6-、7-或8-元单价的被取代的或未被取代的饱和的或不饱和的非芳族单环或二环碳环，其通过从母体环系的环原子除去一个氢原子而衍生出。代表性的碳环基包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基、环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、环庚基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基、环辛基、环辛二烯基、二环(1.1.1.)戊烷和二环(2.2.2.)辛烷。碳环基可以是未被取代的或被至多7个基团取代，所述基团包括但不限于：C1-C8烷基、C1-C8杂烷基、-OR'、芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(＝O)2R'、-S(＝O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中R'各自如上所述。
除非另有说明，术语“烯基-”表示含有至少一个双键和优选2-10个碳原子的直链或支链不饱和烃。烯基的实例包括但不限于：乙烯、丙烯、1-丁烯、2-丁烯、异丁烯、仲丁烯、1-戊烯、2-戊烯、异戊烯、1-己烯、2-己烯、3-己烯、异己烯、1-庚烯、2-庚烯、3-庚烯、1-辛烯、2-辛烯、3-辛烯、4-辛烯、1-壬烯、2-壬烯、3-壬烯、4-壬烯、1-癸烯、2-癸烯、3-癸烯、4-癸烯和5-癸烯。烯基可以是未被取代的或被取代的。
术语“烷氧基-”表示基团烷基-O-，其中烷基在本文中定义。示例性的烷氧基基团包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基。烷氧基可以是未被取代的或被取代的。
术语“炔基-“表示含有至少一个三键和优选2-10个碳原子的直链或支链不饱和烃。炔基基团的实例包括但不限于：乙炔、丙炔、1-丁炔、2-丁炔、异丁炔、仲丁炔、1-戊炔、2-戊炔、异戊炔、1-己炔、2-己炔、3-己炔、异己炔、1-庚炔、2-庚炔、3-庚炔、1-辛炔、2-辛炔、3-辛炔、4-辛炔、1-壬炔、2-壬炔、3-壬炔、4-壬炔、1-癸炔、2-癸炔、3-癸炔、4-癸炔和5-癸炔。炔基可以是未被取代的或被取代的。
术语“杂芳基-”表示含有至少一个选自氧、硫和氮的杂原子和通常1-9个碳原子的5-10元单环和二环芳族基团。单环杂芳基基团的实例包括但不限于：噁嗪基、噻嗪基、二嗪基、三嗪基、噻二唑基、四嗪基、咪唑基、四唑基、异噁唑基、呋喃基、呋咱基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、吡唑基、三唑基、嘧啶基、N-吡啶基、2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基。二环杂芳基基团的实例包括但不限于：苯并咪唑基、吲哚基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、喹啉基、喹唑啉基、嘌呤基、苯并异噁唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并二唑基、苯并三唑基、异吲哚基和吲唑基。杂芳基可以是未被取代的或被取代的。
术语“羧基-”表示通过羧基(C(O)-O-)官能团的氧原子与母体结构连接的基团，通常是如本文中定义的烷基。羧基基团的实例包括乙酰氧基、丙酰氧基、丙基羧基和异戊基羧基。
除非另外指出，“取代的”(例如与化学基团连接的，诸如“取代的烷基”)是指其中一个或多个氢原子各自独立地被取代基替代的基团。典型的取代基包括但不限于：-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NRC(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO3 2-、PO3H2、-AsO2H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2或-C(＝NR)NR2，其中X各自独立地是卤素：-F、-C、-B或-I；且R各自独立地是-H、C1-C20烷基、C1-C20杂烷基、C6-C20芳基、C1-C10杂环基、保护基或前药基团。
还提供了在有此需要的个体中治疗癌症、抑制肿瘤生长或进展、抑制癌细胞或肿瘤的转移、或诱导肿瘤消退的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的包含如本文中所述的ADC的药物组合物。
一般技术和定义
除非在本文中另外定义，与本发明相关使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文描述的细胞和组织培养物、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白及核酸化学以及杂交结合使用的命名及其技术是本领域中众所周知且普遍使用的那些。
除非另外指出，本发明的方法和技术通常按照本技术领域中众所周知的以及如本说明书全文中所引用和讨论的各种一般性的和更具体的参考文献中所记载的常规方法进行。参见例如，Sambrook J.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow和Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；和Coligan等人,Short Protocols in ProteinScience,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。如本领域中通常实现的或如本文所述的，根据制造商的说明书进行酶反应和纯化技术。与本文描述的分子生物学、生物化学、免疫学、分析化学、合成有机化学和医学和药物化学结合使用的命名和实验室操作和技术是本领域中众所周知且普遍使用的那些。贯穿本说明书和权利要求书，词语“包括”或其变体如“包含”或“含有”应理解为暗示包括所述的整数或整数集合，但是不排除任何其它整数或整数集合。
本文中使用的术语“含有谷氨酰胺的标签”、“谷氨酰胺标签”、“含有Q的标签”、“Q-标签”或“转谷氨酰胺酶标签”表示含有一个或多个Gln残基的多肽或蛋白质，或可以表示单个谷氨酰胺或谷氨酰胺残基。
本文中使用的术语“位点特异性”、“位点特异性缀合”或“位点特异性交联”表示含胺基团与抗体经由含有谷氨酰胺的标签、内源性谷氨酰胺和/或通过抗体工程化或工程化转谷氨酰胺酶导致有反应性的内源性谷氨酰胺而在特定位点(例如，在表1中列出的各个位置处)处的特异性缀合或交联。可以通过各种技术测量位点特异性，所述技术包括但不限于质谱法(例如，基质辅助激光解吸-电离质谱法(MALDI-MS)、电喷射电离质谱法(ESI-MS)、串联质谱法(MS-MS)和飞行时间质谱法(TOF-MS)、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、定位诱变、荧光标记、尺寸排阻色谱法和X射线衍射晶体分析法。
术语“负载”或“药物负载”或“有效负载负载”代表或表示ADC分子中每个抗体的有效负载(“有效负载”在本文中与“药物”可互换使用)的平均数目。药物负载可以在每个抗体l-20个药物的范围内。这有时被称作DAR或药物-抗体比率。本发明的ADC的药物-抗体比率(DAR)是约1至约60。在某些实施方案中，所述DAR至少约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60中的任一个。可以通过常规方式诸如紫外/可见光光谱法、质谱法、ELISA测定和HPLC来表征每个抗体的平均药物数目或DAR值。还可以确定定量DAR值。在某些情况下，可以借助于诸如反相HPLC或电泳实现具有特定DAR值的均匀ADC的分离、纯化和表征。抗体上的连接位点的数目可以限制DAR。例如，在所述连接是谷氨酰胺的情况下，如在本发明中，抗体可能具有仅一个或几个合适的谷氨酰胺残基，通过所述谷氨酰胺残基可以连接接头单元。通常，在缀合反应过程中将少于理论最大值的药物基团缀合至抗体。
本文中使用的术语“导致有反应性的内源性谷氨酰胺(Q)”表示已经通过抗体工程化(例如，酶促去糖基化和/或氨基酸修饰)或通过工程化转谷氨酰胺酶而使得在转谷氨酰胺酶的存在下可接近含胺基团、暴露于含胺基团或与含胺基团反应的内源性谷氨酰胺。
本文中使用的术语“生物相容的聚合物”表示这样的聚合物(例如，重复的单体单元或结构单元)：其适合用于在受者(例如，人)中的治疗性或医学处理，而不会在受者中引起任何不希望的局部或全身效应。生物相容的聚合物(合成的、重组的或天然的)可以是水溶性的或不溶于水的聚合物。生物相容的聚合物还可以是线性或支化聚合物。
本文中使用的术语“抗体”是这样的免疫球蛋白分子：其能够通过位于所述免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点与靶标(诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)特异性结合。除非上下文另外指出，如本文中使用的该术语意图不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)和结构域抗体(包括鲨鱼和骆驼科抗体)，以及包含抗体部分的融合蛋白、多价抗体(例如，COVX-BODYTM)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物活性)和如本文中所述的抗体片段，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任意其它经修饰的构型。抗体包括任何种类的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其子类)，且抗体不需要属于任何特定种类。取决于其重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的种类。存在5大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与免疫球蛋白的不同种类对应的重链恒定域分别被称作α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。在一个方面，所述免疫球蛋白是人、鼠、猴或兔免疫球蛋白。
本文中使用的术语“含有Fab的多肽”表示包含Fab片段、Fab’片段或“(Fab’)2片段”的多肽。含有Fab的多肽可以包含野生型铰链序列的部分或全部(通常在多肽的Fab部分的羧基端)。含有Fab的多肽可以得自或源自任意合适的免疫球蛋白，诸如各种IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的至少一种，或者得自或源自IgA、IgE、IgD或IgM。含有Fab的多肽可以是含有Fab的融合多肽，其中一种或多种多肽连接至含有Fab的多肽。Fab融合将免疫球蛋白的Fab多肽与融合配偶体组合，所述融合配偶体通常可以是任意蛋白、多肽或小分子。基本上任何蛋白或小分子可以连接至Fab多肽以产生含有Fab的融合多肽。含有Fab的融合配偶体可以包括但不限于：受体、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或一些其它蛋白或蛋白结构域的靶标结合区。
“Fab片段”包含一个轻链和CH1和一个重链的可变区。Fab分子的重链不可与另一个重链分子形成二硫键。
“Fab’片段”包含一个轻链和一个重链的含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域的部分，使得可以在2个Fab’片段的2个重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有2个轻链和2个重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，使得在2个重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段因而由2个Fab’片段组成，所述Fab’片段通过2个重链之间的二硫键保持在一起。
本文中使用的“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选地保留当存在于完整抗体中时与该部分通常有关的功能的至少一种，优选地大部分或全部。
“多特异性抗体”是靶向超过一种抗原或表位的抗体。“二特异性的”、“双特异性的”或“双功能的”抗体是具有两个不同的抗原结合位点的杂交抗体。双特异性抗体是多特异性抗体的一种，且可以通过多种方法来生产，所述方法包括但不限于杂交瘤的融合、Fab'片段的连接、或在抗体铰链和CH3结构域处的突变。参见例如，Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)；和Strop等人,J.Mol.Biol.420(3):204-219(2012)。双特异性抗体的2个结合位点将结合2个不同的表位，所述表位可以位于相同的或不同的蛋白靶标上。
本文中使用的术语“单克隆抗体”表示从基本上均匀的抗体群体得到的抗体，即，除了可以以微量存在的、可能天然存在的突变以外，构成所述群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
在某些实施方案中，本文中的单克隆抗体可以特别包括“嵌合”抗体(其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源)，以及这样的抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有从非人免疫球蛋白衍生出的最小序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受者的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(诸如具有期望的特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。做出这些修饰以进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上所有，其中所有的或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有的或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。关于其它细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。也参见以下综述文章和其中引用的参考文献:Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
“人抗体”是这样的抗体：其具有与由人生产的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列，和/或已经使用如本文中公开的制备人抗体的技术中的任一种来制备。人抗体的该定义特别地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文中使用的“铰链区”、“铰链序列”及其变体包括本领域已知的含义，其例如由以下文献解释：Janeway等人,ImmunoBiology:the immune system in health anddisease,(Elsevier Science Ltd.,NY)(第4版,1999)；Bloom等人,Protein Science(1997),6:407-415；Humphreys等人,J.Immunol.Methods(1997),209:193-202。
本文中使用的术语“含有Fc的多肽”表示包含免疫球蛋白重链的羧基端多肽序列的多肽(例如，抗体或免疫粘附素)。含有Fc的多肽可以包含天然或变体Fc区(即，序列)。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定域：CH2结构域和CH3结构域，且任选地包含CH4结构域。含有Fc的多肽可以包含野生型铰链序列的部分或全部(通常是含有Fc的多肽的氨基端)。含有Fc的多肽还可以是二聚体。含有Fc的多肽可以得自或源自任意合适的免疫球蛋白，诸如各种IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的至少一种，或IgA、IgE、IgD或IgM。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，例如，人IgG重链Fc区通常被定义为从在位置Glu216处的氨基酸残基或从Ala231延伸至其羧基端。在Fc区中的残基的编号是如在Kabat中的EU索引的编号。Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。
含有Fc的多肽可以是含有Fc的融合多肽，其中一个或多个多肽连接至含有Fc的多肽。Fc融合将免疫球蛋白的Fc多肽与融合配偶体组合，所述融合配偶体通常可以是任意蛋白、多肽或小分子。基本上任何蛋白或小分子可以连接至Fc区以产生含有Fc的融合多肽。含有Fc的融合配偶体可以包括但不限于：受体的靶标结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或一些其它蛋白或蛋白结构域。
本文中使用的术语“免疫粘附素”是指抗体样或免疫球蛋白样分子，其将异源蛋白(“粘附素”，例如受体、配体或酶)的“结合区域”与免疫球蛋白恒定域(即，Fc结构域)的效应物组分组合。在结构上，免疫粘附素包含具有期望的结合特异性的粘附素氨基酸序列(其不是抗体的抗原识别和结合部位(抗原结合位点)(即是“异源的”))和免疫球蛋白恒定域序列的融合。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以得自任何免疫球蛋白，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换地用于表示任意长度的氨基酸链，优选地为相对短的氨基酸链(例如，10-100个氨基酸)。链可以是直链或支链，它可以包含修饰的氨基酸，和/或可以被非氨基酸中断。该术语也包括已经天然修饰的或通过插入而修饰的氨基酸链；所述修饰例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任意其它操作或修饰，诸如与标记组分缀合。在该定义内还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然的氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。应当理解，多肽可以作为单链或有关的链的形式存在。
本文中使用的术语“野生型氨基酸”、“野生型IgG”或“野生型mAb”表示在特定群体(例如，人、小鼠、大鼠、细胞等)内天然地存在的氨基酸或核酸的序列。
本文中使用的术语“缀合效率”或“交联效率”是如本文中所述的ADC的实验测定量除以最大预期ADC量的比率。可以通过本领域技术人员众所周知的各种技术诸如疏水相互作用色谱法来测量缀合效率或交联效率。还可以在不同的温度(诸如室温或37℃)下测量缀合效率。
术语“效应子功能”表示可归因于抗体的Fc区的生物活性。抗体效应子功能的实例包括但不限于：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、Fc受体结合、补体依赖性的细胞毒性(CDC)、吞噬作用、C1q结合和细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调。参见例如美国专利号6,737,056。这样的效应子功能通常需要Fc区与结合区域(例如，抗体可变结构域)组合，且可以使用本领域已知的用于评价这样的抗体效应子功能的各种测定来评估。效应子功能的一种示例性测量是通过Fcγ3和/或C1q结合。
本文中使用的“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”表示细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒性的细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合的抗体，并随后造成靶细胞的裂解。可以使用体外ADCC测定(诸如在美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的体外ADCC测定)评估目标分子的ADCC活性。用于这样的测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。或者，或另外地，可以在体内(例如在动物模型中，诸如在Clynes等人,1998,PNAS(USA),95:652-656所公开的动物模型中)评估目标分子的ADCC活性。
“补体依赖性的细胞毒性”或“CDC”表示在补体存在下的靶标裂解。补体激活途径由补体系统的第一组分(C1q)与与相关抗原复合的分子(例如抗体)的结合引发。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如如在Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所述。
本文中使用的“Fc受体”和“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcyRIV亚类的受体(包括这些受体的等位基因变体和交替剪接形式)的FcR。FcyRll受体包括具有与其细胞质结构域基本上不同的类似氨基酸序列的FcyRIIA(一种“活化受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)。FcR在以下文献中综述：Ravetch和Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92；Capel等人,1994,Immunomethods,4:25-34；de Haas等人,1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41；Nimmerjahn等人,2005,Immunity 23:2-4。“FcR”也包括新生儿受体FcRn，其负责母体IgG向胎儿的转移(Guyer等人,1976,J.Immunol.,117:587；和Kim等人,1994,J.Immunol.,24:249)。
术语“纯化”及其语法变体用于指从含有ADC和一种或多种杂质的混合物除去(无论完全地还是部分地)至少一种杂质，由此提高所述组合物中的ADC的纯度水平(即，通过减少所述组合物中的杂质的量(ppm))。
提及“约”，本文中的值或参数包括(且描述)指向该值或参数本身的实施方案。例如，关于“约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包括限定所述范围的数字。
“个体”或”受试者”是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物也包括但不限于家畜、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。
应当理解，每当在本文中用措辞“包含”描述实施方案时，也提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的方式描述的在其它方面类似的实施方案。
在以马库什群组或其它替代方案分组的方式描述本发明的方面或实施方案的情况下，本发明不仅包括作为整体列出的整个组，而且单独地包括所述组的每个成员和主组的所有可能的亚组，以及缺少一个或多个组成员的主组。本发明也包括在要求保护的发明中明确排除一个或多个任意组成员。
本申请中的残基命名基于恒定域的EU编号方案(Edelman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63(1):78-85(1969)。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。本文描述了示例性的方法和材料，但与本文描述的那些类似或等同的方法和材料也可以用在本发明的实践或试验中。在本文中提及的所有出版物和其它参考文献以其整体援引加入。如果出现矛盾，则以本说明书及其中的定义为准。尽管在本文中引用了许多文件，但该引用不会构成以下承认：这些文件中的任一篇形成本领域的常见一般知识的组成部分。贯穿本说明书和权利要求书，词语“包括”或变体诸如“包含”或“含有”应理解为暗示包括所述的整数或整数集合，但是不排除任意其它整数或整数集合。除非上下文有其它规定，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。所述材料、方法和实施例仅仅是示例性的，且无意成为限制性的。
转谷氨酰胺酶是蛋白-谷氨酰胺γ-谷氨酰基转移酶，其通常催化赖氨酸残基对谷氨酰胺残基的pH依赖性转酰胺基作用。在本文描述的发明中使用的转谷氨酰胺酶可以得自多种来源或从多种来源制备，或经工程化以催化一个或多个赖氨酸残基或其它含胺基团对一个或多个内源性谷氨酰胺残基的转酰胺基作用。在某些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶是钙依赖性转谷氨酰胺酶，其需要钙来诱导酶构象变化和允许酶活性。例如，转谷氨酰胺酶可以源自豚鼠肝脏和通过商业来源(例如，Sigma-Aldrich(St Louis,MO)和MPBiomedicals(Irvine,CA))得到。在某些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶是不依赖于钙的转谷氨酰胺酶，其不需要钙来诱导酶构象变化和允许酶活性。在某些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶是从微生物基因组衍生出的微生物转谷氨酰胺酶，诸如来自轮枝链霉菌属或链霉菌属的转谷氨酰胺酶(例如，Streptomyces mobarensis或Streptoverticilliummobarensis)。商购可得的不依赖于钙的转谷氨酰胺酶诸如ACTIVATM(Ajinomoto,日本)适用于本发明。在某些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶是哺乳动物蛋白(例如，人转谷氨酰胺酶)、细菌蛋白、植物蛋白、真菌蛋白(例如，卵菌纲(Oomycetes)和放线菌(Actinomicetes)转谷氨酰胺酶)或原核蛋白。在某些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶来自微球菌属(Micrococcus)、梭菌属(Clostridium)、Turolpsis、根霉菌属(Rhizopus)、红曲霉属(Monascus)或芽孢杆菌属(Bacillus)。
在某些实施方案中，在本文描述的发明中使用的转谷氨酰胺酶是工程化转谷氨酰胺酶，其催化一个或多个赖氨酸残基或其它含胺基团对抗体中的一个或多个内源性谷氨酰胺残基的转酰胺基作用。例如，可以删除天然存在的转谷氨酰胺酶中的一个或多个野生型氨基酸残基或用另一个氨基酸残基替换或取代以制备工程化转谷氨酰胺酶。
在某些实施方案中，在本文描述的发明中使用的转谷氨酰胺酶还可以是使用本领域技术人员已知的重组技术生产的重组蛋白。在某些实施方案中，在本文描述的发明中使用的转谷氨酰胺酶可以是纯化的蛋白。例如，纯化的转谷氨酰胺酶是至少约50％纯的。本文中使用的“纯的”或“纯化的”蛋白表示不含其它蛋白污染物的蛋白(例如，转谷氨酰胺酶)。在某些实施方案中，所述纯化的转谷氨酰胺酶至少约为55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-98％或99％纯中的任一种。在某些实施方案中，所述纯化的转谷氨酰胺酶至少约为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯中的任一种。
在某些实施方案中，本发明的ADC包含至少1个在转酰胺基反应中通过抗体工程化或被工程化转谷氨酰胺酶导致有反应性的内源性谷氨酰胺。在某些实施方案中，所述抗体工程化是抗体去糖基化(例如，酶促去糖基化)；或氨基酸修饰，包括抗体上的氨基酸缺失、插入、取代、突变或它们的任意组合。例如，在抗体中在位置297处的野生型氨基酸Asn(N)被氨基酸Ala(A)取代或替代，从而产生在位置297处的去糖基化和在位置295处的反应性内源性谷氨酰胺(Q)。在另一个实例中，抗体中的氨基酸修饰是在位置297处从N至Q的氨基酸取代，从而产生在位置297处的去糖基化、在位置295处的反应性的内源性Q、和在转谷氨酰胺酶的存在下在N297Q与Q295和在这两个位点处的一个或多个含胺基团之间的位点特异性缀合。
在某些实施方案中，本发明的ADC包含在至少一个或多个位置处工程化的含有谷氨酰胺的标签，所述位置包括但不限于，1)轻链、重链、或轻链和重链的羧基端；2)轻链、重链、或轻链和重链的氨基端；和3)S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和/或G385，其中含有谷氨酰胺的标签插入在抗体中或替换抗体中的一个或多个内源性氨基酸。
具体的含有谷氨酰胺的标签的实例和它们的对应的工程化位置提供在表1中，并描述在WO2012/059882和WO2015/015448中，其援引加入本文。
表1
Figure BDA0001262491160000311
Figure BDA0001262491160000321
在某些实施方案中，相对于在相同位置处的野生型抗体，ADC的抗体包含在位置222、340或370(EU编号)处的氨基酸修饰。在某些实施方案中，所述修饰是氨基酸缺失、插入、取代、突变或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述取代包括用另一种氨基酸(例如，非野生型氨基酸)替代野生型氨基酸。在某些实施方案中，所述其它(例如，非野生型)或插入的氨基酸是Arg(例如，K222R、K340R或K370R)。在某些实施方案中，所述插入包括插入一个或多个氨基酸(例如，插入1、2、3或更多个氨基酸)。在某些实施方案中，所述其它(例如，非野生型)氨基酸是Ala、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。
因此，在某些实施方案中，本发明的ADC包含a)在位置N297Q和K222R处的氨基酸取代，其中所述含胺基团位点特异性地缀合至在位置295处的内源性谷氨酰胺和在位置297处的取代的谷氨酰胺；和/或b)一个或多个含有谷氨酰胺的标签，其中所述含胺基团位点特异性地缀合至在抗体轻链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签。在某些实施方案中，所述药物-抗体比率(DAR)是约3-9。在某些实施方案中，在抗体轻链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签是GGLLQGA(SEQ ID NO:23)。
在某些实施方案中，本发明的ADC包含a)在位置N297Q和K222R处的氨基酸取代，其中所述含胺基团位点特异性地缀合至在位置295处的内源性谷氨酰胺和在位置297处的取代的谷氨酰胺；b)一个或多个含有谷氨酰胺的标签，其中所述含胺基团位点特异性地缀合至在抗体轻链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签；和/或c)一个或多个含有谷氨酰胺的标签，其中所述含胺基团进一步位点特异性地缀合至在一个或多个选自以下位置处的含有谷氨酰胺的标签：抗体中的S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和G385，其中所述含有谷氨酰胺的标签插入在抗体中或替代抗体中的一个或多个内源性氨基酸。在某些实施方案中，所述药物-抗体比率是至少约6。例如，在某些实施方案中，本发明的ADC也包含a)在位置N297Q和K222R处的氨基酸取代，其中所述含胺基团位点特异性地缀合至在位置295处的内源性谷氨酰胺和在位置297处的取代的谷氨酰胺；b)一个或多个含有谷氨酰胺的标签，其中所述含胺基团位点特异性地缀合至在抗体轻链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签；c)一个或多个谷氨酰胺标签，其中所述含胺基团进一步位点特异性地缀合至在抗体重链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签；且其中所述药物-抗体比率(DAR)是约6-9。在某些实施方案中，在抗体轻链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签是GGLLQGA(SEQ ID NO:23)；且在抗体重链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签是LLQGA(SEQ ID NO:11)。
在一个变体中，本发明的ADC包含a)在位置N297Q和K222R处的氨基酸取代，其中所述含胺基团位点特异性地缀合至在位置295处的内源性谷氨酰胺和在位置297处的取代的谷氨酰胺；b)一个或多个含有谷氨酰胺的标签，其中所述含胺基团位点特异性地缀合至在抗体轻链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签；c)一个或多个含有谷氨酰胺的标签，其中所述含胺基团进一步位点特异性地缀合至插入在抗体重链中的氨基酸位置T135之后的含有谷氨酰胺的标签；且其中所述药物-抗体比率(DAR)是约6-9。在某些实施方案中，在抗体轻链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签是GGLLQGA(SEQ ID NO:23)；且插入在抗体重链中的T135之后的含有谷氨酰胺的标签是LLQG(SEQ ID NO:2)。
在另一个变体中，本发明的ADC包含a)在位置N297Q和K222R处的氨基酸取代，其中所述含胺基团位点特异性地缀合至在位置295处的内源性谷氨酰胺和在位置297处的取代的谷氨酰胺；b)一个或多个含有谷氨酰胺的标签，其中所述含胺基团位点特异性地缀合至在抗体轻链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签；c)一个或多个含有谷氨酰胺的标签，其中所述含胺基团进一步位点特异性地缀合至在抗体重链中在氨基酸位置G200-S202处的含有谷氨酰胺的标签；且其中所述药物-抗体比率(DAR)是约6-9。在某些实施方案中，在抗体轻链的羧基端处的含有谷氨酰胺的标签是GGLLQGA(SEQ ID NO:23)；且插入在抗体重链中的T135之后的含有谷氨酰胺的标签是LLQG(SEQ ID NO:2)。
在某些实施方案中，用于本文描述的ADC的含有谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列XXQX(SEQ ID NO:37)，其中X可以是如本文中所述的常规的或非常规的氨基酸。例如，在某些实施方案中，X是L(Leu)、A(Ala)、G(Gly)、S(Ser)、V(Val)、F(Phe)、Y(Tyr)、H(His)、R(Arg)、N(Asn)、E(Glu)、D(Asp)、C(Cys)、Q(Gln)、I(Ile)、M(Met)、P(Pro)、T(Thr)、K(Lys)或W(Trp)。
在某些实施方案中，所述含有谷氨酰胺的标签包含选自以下的氨基酸序列：Q、LQG、LLQGG(SEQ ID NO:1)、LLQG(SEQ ID NO:2)、LSLSQG(SEQ ID NO:3)、GGGLLQGG(SEQ IDNO:4)、GLLQG(SEQ ID NO:5)、LLQ、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO:6)、GLLQGGG(SEQ ID NO:7)、GLLQGG(SEQ ID NO:8)、GLLQ(SEQ ID NO:9)、LLQLLQGA(SEQ ID NO:10)、LLQGA(SEQ ID NO:11)、LLQYQGA(SEQ ID NO:12)、LLQGSG(SEQ ID NO:13)、LLQYQG(SEQ ID NO:14)、LLQLLQG(SEQ ID NO:15)、SLLQG(SEQ ID NO:16)、LLQLQ(SEQ ID NO:17)、LLQLLQ(SEQ ID NO:18)、LLQGR(SEQ ID NO:19)、LLQGPP(SEQ ID NO:20)、LLQGPA(SEQ ID NO:21)、GGLLQGPP(SEQ IDNO:22)、GGLLQGA(SEQ ID NO:23)、LLQGA(SEQ ID NO:24)、LLQGPGK(SEQ ID NO:25)、LLQGPG(SEQ ID NO:26)、LLQGP(SEQ ID NO:27)、LLQP(SEQ ID NO:28)、LLQPGK(SEQ ID NO:29)、LLQAPGK(SEQ ID NO:30)、LLQGAPG(SEQ ID NO:31)、LLQGAP(SEQ ID NO:32)、LLQGPA(SEQID NO:33)、LLQGPP(SEQ ID NO:34)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:35)和LLQLQG(SEQ ID NO:36)。
在某些实施方案中，所述含有谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列LLQGA(SEQ ID NO:24)、LQG、GGLLQGA(SEQ ID NO:23)、LLQGPA(SEQ ID NO:33)、LLQGPP(SEQ ID NO:34)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:35)、LLQGSG(SEQ ID NO:13)、LLQG(SEQ ID NO:2)、LLQYQG(SEQ IDNO:14)、LLQLLQG(SEQ ID NO:15)、LLQLQG(SEQ ID NO:36)、LLQLLQ(SEQ ID NO:18)、LLQLQ(SEQ ID NO:17)、LLQGR(SEQ ID NO:19)、LLQYQGA(SEQ ID NO:12)、SLLQG(SEQ ID NO:16)或LLQLLQGA(SEQ ID NO:10)。
在某些实施方案中，所述含有谷氨酰胺的标签不包含选自以下的氨基酸序列：LGGQGGG(SEQ ID NO:41)、GGGQGGL(SEQ ID NO:42)、GXGQGGG(SEQ ID NO:43)、GGXQGGG(SEQID NO:44)、GGGQXGG(SEQ ID NO:45)和GGGQGXG(SEQ ID NO:46)，其中X是G、A、S、L、V、F、Y、R、N或E)。其它示例性的标签也描述在例如US2013/0230543和US2013/0122020中。
在某些实施方案中，相对于在相同位置处的野生型抗体，如本文中所述的ADC的抗体包含在羧基端的最后一个氨基酸位置处的氨基酸修饰。在某些实施方案中，所述修饰是氨基酸缺失、插入、取代、突变或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述取代包括用另一个氨基酸(例如，非野生型氨基酸)替代野生型氨基酸。在某些实施方案中，所述插入包括插入一个或多个氨基酸(例如，插入1个、2个、3个或更多个氨基酸)。在某些实施方案中，其它(例如，非野生型)或插入的氨基酸是Arg。在某些实施方案中，其它(例如，非野生型)氨基酸是Ala、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。例如，在某些实施方案中，可以删除抗体的羧基端(例如，抗体的重链)的最后一个氨基酸，且被工程化成多肽的C-端的含有谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列LLQGA(SEQ ID NO:11)或GGLLQGA(SEQ ID NO:23)。
在某些实施方案中，相对于在相同位置处的野生型抗体，所述抗体包含在氨基端的第一个氨基酸位置处的氨基酸修饰。在某些实施方案中，所述修饰是氨基酸缺失、插入、取代、突变或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述取代包括用另一个(例如，非野生型)氨基酸替换野生型氨基酸。在某些实施方案中，所述插入包括插入氨基酸。在某些实施方案中，所述非野生型或插入的氨基酸是Arg。在某些实施方案中，所述其它(非野生型或插入的)氨基酸是Ala、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。
在某些实施方案中，本文描述的ADC包含全长抗体重链和抗体轻链。在某些实施方案中，本文描述的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微抗体、双抗体或抗体片段。在某些实施方案中，所述抗体是IgG。在某些实施方案中，所述IgG选自：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施方案中，所述抗体是IgA、IgE、IgD或IgM。在某些实施方案中，本文描述的ADC的效应子功能(例如，如通过Fcγ3和/或C1q结合所测量的)与野生型抗体相比下降不超过约1倍、2倍、3倍、4倍或5倍中的任一个。在某些实施方案中，ADC的抗体是IgG，其中所述IgG的效应子功能与野生型IgG相比下降不超过约2倍。在其它实施方案中，IgG的效应子功能与野生型IgG相比下降约2倍。在其它实施方案中，IgG的效应子功能与野生型IgG相比下降超过约2倍。在某些实施方案中，ADC的抗体是IgG，其中所述IgG的效应子功能与野生型IgG相比下降不超过约1倍。在其它实施方案中，IgG的效应子功能与野生型IgG相比下降约1倍。在某些实施方案中，IgG的效应子功能与野生型IgG相比下降超过约1倍、3倍、4倍或5倍中的任一个。
可以与抗体缀合的含胺基团物质的数目取决于1)与所述抗体连接/插入的含有谷氨酰胺的标签的数目，以及在含有谷氨酰胺的标签上的谷氨酰胺的数目；和/或2)抗体上的内源性谷氨酰胺(即，没有工程化的天然谷氨酰胺，诸如在可变结构域中的谷氨酰胺、CDR等)的数目，和/或3)通过如本文中所述的抗体工程或工程化转谷氨酰胺酶导致有反应性的内源性谷氨酰胺的数目。例如，两个含胺基团可以在两个轻链的羧基端处位点特异性地缀合至抗体，且四个含胺基团可以在位置Q295和N297Q处位点特异性地缀合至抗体。在某些实施方案中，所述含胺基团在各缀合位置处可以是相同的或不同的。
细胞毒素剂的实例包括但不限于：蒽环类抗生素、耳他汀(例如，dolestatin、MMAD、MMAE、MMAF、PF-06380101、PF-06463377和PF-06456780)、spliceostatin、CBI/CPI二聚体(包括包含CBI和CPI组分二者的“混合”二聚体，如在美国临时专利申请61/932、118中所述)、卡奇霉素、多卡米星、烯二炔、格尔德霉素、美坦辛、嘌呤霉素、紫杉烷、长春花生物碱、SN-38、tubulysin、哈米特林、喜树碱、考布他汀、多拉司他汀、二氢吲哚并-苯二氮
Figure BDA0001262491160000361
二聚体、吡咯并苯二氮
Figure BDA0001262491160000362
二聚体和普拉地内酯，及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。
蒽环类抗生素源自细菌链霉菌属(Strepomyces)，且已经用于治疗宽范围的癌症，诸如白血病、淋巴瘤、乳房癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌。示例性的蒽环类抗生素包括但不限于：柔红霉素、多柔比星(即，阿霉素)、表柔比星、伊达比星、戊柔比星和米托蒽醌。
多拉司他汀和它们的肽类似物和衍生物耳他汀是已经被证实具有抗癌和抗真菌活性的非常有效的抗有丝分裂剂。参见例如美国专利号5,663,149和Pettit等人,Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965,1998。示例性的多拉司他汀和耳他汀包括但不限于：多拉司他汀10、耳他汀E、耳他汀EB(AEB)、耳他汀EFP(AEFP)、MMAD(单甲基耳他汀D或单甲基多拉司他汀10)、MMAF(单甲基耳他汀F或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸(dolaisoleuine)-多拉脯氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸)、MMAE(单甲基耳他汀E或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-去甲麻黄碱)、5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)和其它新颖的耳他汀(诸如在美国公开号2013/0129753中描述的那些)。在某些实施方案中，所述耳他汀是具有以下结构的0101(2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
Figure BDA0001262491160000371
在某些实施方案中，所述耳他汀是具有以下结构的3377(N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
Figure BDA0001262491160000372
在其它实施方案中，所述耳他汀是具有以下结构的0131(2-甲基-L-丙基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
Figure BDA0001262491160000381
在其它实施方案中，所述耳他汀是具有以下结构的0121(2-甲基-L-丙基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
Figure BDA0001262491160000382
喜树碱是抑制酶拓扑异构酶I的细胞毒性的喹啉生物碱。喜树碱及其衍生物的实例包括但不限于：托泊替康和伊立替康和它们的代谢物，诸如SN-38。
考布他汀是在肿瘤中具有血管破坏性能的天然苯酚。示例性的考布他汀和它们的衍生物包括但不限于：考布他汀A-4(CA-4)和奥拉布林。
多卡米星和CC-1065是具有细胞毒性效能的DNA烷化剂。参见Boger和Johnson,PNAS 92:3642-3649(1995)。示例性的多拉司他汀和耳他汀包括但不限于：(+)-多卡米星A和(+)-多卡米星SA和(+)-CC-1065。
烯二炔是一类抗肿瘤的细菌产物，其特征在于9-和10-元环或缀合的三键-双键-三键的环状系统的存在。示例性的烯二炔包括但不限于：卡奇霉素、埃斯波霉素、uncialamicin、达内霉素和它们的衍生物。
哈米特林和它的类似物(例如，HTI-286)结合微管蛋白，破坏正常的微管动力学，并且在化学计量量下解聚微管。
格尔德霉素是结合Hsp90(热激蛋白90)且已经用作抗肿瘤药物的苯醌安沙霉素抗生素。示例性的格尔德霉素包括但不限于：17-AAG(17-N-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素)和17-DMAG(17-二甲基氨基乙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素)。
美坦辛或它们的衍生物美坦辛类通过抑制有丝分裂过程中的微管形成(通过抑制微管蛋白的聚合)来抑制细胞增殖。参见Remillard等人,Science 189:1002-1005(1975)。示例性的美坦辛和美坦辛类包括但不限于：美登素(DM1)及其衍生物以及安丝菌素。
吡咯并苯二氮
Figure BDA0001262491160000391
二聚体(PBD)和二氢吲哚并-苯二氮
Figure BDA0001262491160000392
二聚体(IGN)是含有一个或多个亚胺(immine)官能团或它们的等同物的抗肿瘤剂，其结合双链体DNA。PBD和IGN分子是基于天然产物阿奇霉素(athramycin)，并以序列选择性的方式与DNA相互作用，优选嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列。示例性的PBD和它们的类似物包括但不限于SJG-136。
Spliceostatin和普拉地内酯是抑制剪接并与剪接体SF3b相互作用的抗肿瘤化合物。Spliceostatin的实例包括但不限于：spliceostatin A、FR901464。普拉地内酯的实例包括但不限于：普拉地内酯B、普拉地内酯D和E7107。
紫杉烷是充当抗微管蛋白剂或有丝分裂抑制剂的二萜。示例性的紫杉烷包括但不限于紫杉醇(例如，
Figure BDA0001262491160000393
)和多西他赛
Figure BDA0001262491160000394
长春花生物碱也是抗微管蛋白剂。示例性的长春花生物碱包括但不限于长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨。
在某些实施方案中，所述药物基团是毒素多肽(或毒素蛋白)。毒素多肽的实例包括但不限于：白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、单端孢菌毒素、抑制剂胱氨酸结(ICK)肽(例如，ceratotoxin)和芋螺毒素(例如，KIIIA或SmIIIa)。
用于缀合ADC的方法
完成抗-Trop2抗体与本发明的接头-有效负载的缀合，其中在含有25mM Tris-HCl的缓冲液(pH 8.0-8.5)中将抗体的量调至5mg/mL。以相对于抗体5-50倍或5-500倍摩尔过量的量加入接头-有效负载，并通过加入2％(w/v)细菌转谷氨酰胺酶(Ajinomoto ActivaTI,日本)引发酶反应，并在轻轻摇动下在37℃温育16-24小时。通过调节反应混合物，使用Butyl SepharoseTMHigh Performance(Butyl HP,GE Healthcare Biosciences)纯化ADC，以得到含有0.75M硫酸铵、25mM磷酸钾、pH 7的缓冲液组合物(缓冲液A)。将所述物质应用于Butyl HP，用5CV缓冲液A洗涤，并用20CV线性梯度洗脱进25mM磷酸钾(pH 7)中。将含有ADC的流分合并，在PBS中透析，使用10kDa Amicon Ultra离心过滤器单元(MilliporeCorporation)浓缩，并通过0.2μm过滤器无菌过滤。或者，按照标准方案使用MabSelectProtein A树脂(GE Healthcare Biosciences)纯化ADC，并缓冲液更换进PBS中。缀合ADC的其它方法是已知的，包括在WO2012/059882中描述的那些方法。
使用本发明的抗体-药物缀合物的方法
本发明的ADC可用在不同的应用中，包括但不限于治疗性治疗方法和诊断性治疗方法。
在一个方面，本发明提供了一种治疗个体中的癌症的方法。因此，在某些实施方案中，提供了一种在有此需要的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的包含如本文中所述的ADC的组合物(例如，药物组合物)。本文中使用的癌症包括但不限于：实体癌(诸如膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、食管癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头和颈癌、肾癌、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和皮肤癌)；和液体癌(诸如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、T-细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、巨粒淋巴细胞白血病、成人T-细胞白血病和多发性骨髓瘤)。
在某些实施方案中，提供了一种在有此需要的个体中抑制肿瘤生长或进展的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的包含如本文中所述的ADC的组合物。在其它实施方案中，提供了一种在有此需要的个体中抑制癌细胞或肿瘤(例如，实体或液体肿瘤)的转移的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的包含如本文中所述的ADC的组合物。在其它实施方案中，提供了一种在有此需要的个体中诱导肿瘤消退的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的包含如本文中所述的ADC的组合物。
如本文中所述的ADC中的药物基团可以是可检测的基团诸如成像剂和酶-底物标记。如本文中所述的ADC还可以用于体内诊断测定，诸如体内成像(例如，PET或SPECT)，或染色试剂。
在某些实施方案中，本文所述的方法还包括用另外的治疗形式治疗个体的步骤。在某些实施方案中，所述另外的治疗形式是另外的抗癌疗法，包括但不限于化学疗法、放射、外科手术、激素疗法和/或另外的免疫疗法。
在某些实施方案中，所述另外的治疗形式包括给药除了如本文中所述的ADC以外的一种或多种治疗剂。所述治疗剂包括但不限于：另一种ADC(例如，常规ADC诸如Brentuximab vedotin
Figure BDA0001262491160000411
和ado-trastuzumab emtansine
Figure BDA0001262491160000412
)、抗体(例如，抗-VEGF抗体、抗-HER2抗体、抗-CD25抗体和/或抗-CD20抗体)、血管生成抑制剂、细胞毒素剂(例如，多西他赛、顺铂、多柔比星、丝裂霉素、他莫昔芬或氟尿嘧啶)和抗炎剂(例如，泼尼松和黄体酮)。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，其包含在药学上可接受的赋形剂或载体中的如本文中所述的ADC。所述ADC可以单独给药，或者与一种或多种本发明的其它ADC联合给药，或者与一种或多种其它药物(或以其任意组合的形式)联合给药。例如，本发明的ADC可以与常规ADC(即，不设计成具有稳定性调节性质)联合给药。本发明的方法和用途因而也包括如下详述的与其它活性剂的组合(共同给药)的实施方案。
本文中使用的术语“共同给药”、“共给药”或“与……联合”意图指且表示以下：(i)将本文中公开的ADC和治疗剂的组合向需要治疗的患者同时给药，当这样的组分一起配制成单一剂型时，其在基本上相同的时间向所述患者释放所述组分；(ii)将本文中公开的ADC和治疗剂的这种组合向需要治疗的患者的基本上同时给药，当这样的组分彼此分开地配制成单独剂型时，其在基本上相同的时间被所述患者摄入，由此所述组分在基本上相同的时间向所述患者释放；(iii)将本文中公开的ADC和治疗剂的这种组合向需要治疗的患者的相继给药，当这样的组分彼此分开地配制成单独剂型时，其在每次给药之间以显著的时间间隔被所述患者连续多次摄入，由此所述组分在基本上不同的时间释放给所述患者；和(iv)将本文中公开的ADC和治疗剂的这种组合向需要治疗的患者的相继给药，当这样的组分一起配制成单一剂型时，其以受控方式释放所述组分，由此它们并行地、连贯地和/或重叠地在相同和/或不同时间释放给所述患者，其中各部分可以通过相同的或不同的途径给药。
通常，本文中公开的ADC适合作为制剂与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给药。术语‘赋形剂’在本文中用于描述除了本发明的化合物以外的任何成分。赋形剂的选择在较大程度上取决于诸如特定给药模式、赋形剂对溶解度和稳定性的影响、和剂型的性质等因素。本文中使用的“药学上可接受的赋形剂”包括生理学上相容的任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的赋形剂的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。在某些实施方案中，在药物组合物中包括等渗剂，包括但不限于糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化钠。药学上可接受的物质的其它实例包括但不限于：润湿剂或小量辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或有效性。
在某些实施方案中，可以使用已知技术(诸如在例如PCT公开WO98/52976和WO00/34317中描述的那些)将本文描述的ADC去免疫以降低在给药至个体以后的免疫原性。
本发明的药物组合物和它们的制备方法是本领域技术人员容易明白的。用于它们的制备的此类组合物和方法可以参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第22版(Mack Publishing Company,2012)。优选地在GMP条件下制备药物组合物。
本发明的药物组合物可以散装、作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量制备、包装或销售。本文中使用的“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于欲给药至个体的活性成分的剂量或这样的剂量的方便分数，例如，这样的剂量的1/2或1/3。可以对本文中公开的工程化多肽缀合物适当地采用任何本领域接受的用于给药肽、蛋白或抗体的方法。
本发明的药物组合物通常适合用于胃肠外给药。药物组合物的胃肠外给药包括以个体的组织的物理突破为特征的任何给药途径和通过组织中的突破来给药药物组合物，因而通常导致向血流中、向肌肉中或向内部器官中的直接给药。例如，胃肠外给药包括但不限于：通过组合物的注射来给药药物组合物、通过外科手术切口来施用组合物、通过穿透组织的非外科手术创伤来施用组合物等。具体地，胃肠外给药包括但不限于：皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内注射或输注；和肾透析输注技术。在某些实施方案中，胃肠外给药是静脉内或皮下途径。
适合用于胃肠外给药的药物组合物的制剂典型地通常包含与药学上可接受的载体(诸如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。这样的制剂可以以适合用于推注给药或连续给药的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂型制备、包装或销售，诸如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于胃肠外给药的制剂包括但不限于：混悬剂、溶液剂、在油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂等。这样的制剂可以进一步包含一种或多种其它成分，包括但不限于助悬剂、稳定剂或分散剂。在用于胃肠外给药的制剂的一个实施方案中，以干燥的(即粉末或颗粒状)形式提供活性成分，以供用合适的媒介物(例如无菌的无热原的水)复原，然后将复原的组合物胃肠外给药。胃肠外制剂还包括水溶液剂，其可以含有赋形剂诸如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地达到3-9的pH)，但是，对于一些应用，它们可以更适当地配制为无菌的非水溶液剂或配制为要与合适的媒介物(诸如无菌的无热原的水)结合使用的干燥形式。示例性的胃肠外给药形式包括在无菌水溶液(例如，丙二醇或右旋糖水溶液)中的溶液剂或混悬剂。如果需要的话，可以适当地缓冲这样的剂型。有用的其它可胃肠外给药的制剂包括包含微晶形式的活性成分或在脂质体制品中的那些。可以将用于胃肠外给药的制剂配制成立即释放和/或改进释放。改进释放制剂包括控制释放制剂、延迟释放制剂、持续释放制剂、脉冲释放制剂、靶向释放制剂和程序化释放制剂。例如，在一个方面，可以如下制备无菌注射溶液：将所需量的工程化的含有Fc的多肽(例如，抗体-药物缀合物或双特异性抗体)与上文所列举的一种成分或成分的组合(根据需要)一起掺入适当的溶剂中，随后过滤除菌。通常，通过将所述活性化合物掺入无菌媒介物来制备分散体，所述媒介物含有基本分散介质和来自上文列举的那些的所需其它成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分+来自先前无菌过滤的其溶液的任何另外期望成分的粉末。可以维持溶液的适当流动性，例如，通过使用包衣诸如卵磷脂，通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)和通过使用表面活性剂。可以通过在组合物中包括延迟吸收的物质(例如，单硬脂酸盐和明胶)实现可注射组合物的延长吸收。
可以调节剂量方案以提供最适的期望应答。例如，可给药单次大剂量递送，可随时间给药几个分份剂量，或可根据治疗形势的急迫性所指示而按比例降低或提高所述剂量。为了易于给药和剂量一致，以剂量单位形式配制肠胃外组合物是特别有利的。本文中使用的剂量单位形式表示适合作为要治疗的患者/个体的单位剂量的物理上离散的单元；各单位含有与所需药用载体组合的经计算会产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规范通常取决于且直接地依赖于(a)药物基团(例如，小分子诸如细胞毒素剂)的独特特征和要实现的特定治疗或预防效果，和(b)配制这样的活性化合物以治疗个体的敏感性的技术上的固有限制。
因而，基于本文中提供的公开内容，技术人员会理解，根据治疗领域中众所周知的方法调节剂量和给药方案。也就是说，可以容易地确定最大耐受剂量，且也可以确定给患者提供可检测的治疗益处的有效量，还可以确定给药每种药剂以给患者提供可检测的治疗益处的时间要求。因此，尽管在本文中举例说明了某些剂量和给药方案，但这些实施例决不限制在实践本发明中可以提供给患者的剂量和给药方案。
应当指出，剂量值可以随要减轻的病症的类型和严重程度而变化，且可以包括单次或多次剂量。进一步应当理解，对于任何特定个体，应当根据个体需要以及管理或监督所述组合物的给药的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅仅是示例性的，且无意限制要求保护的组合物的范围或实践。进一步地，使用本发明的组合物的剂量方案可以基于多种因素，包括疾病的类型、患者的年龄、重量、性别、医学状况、病症的严重程度、给药途径、和采用的特定抗体。因而，剂量方案可以宽泛地变化，但是可以使用标准方法常规地确定。例如，可以基于药代动力学或药效动力学参数来调节剂量，所述参数可以包括临床效应诸如毒性效应和/或实验室值。因而，本发明包括由技术人员确定的患者内剂量增加。确定适当的剂量和方案是相关领域中众所周知的，且应当理解为被技术人员所掌握(一旦提供本文中公开的教导)。
对于给药至人类个体，本文中公开的ADC的总月剂量通常是在每位患者约0.01mg至约1200mg的范围内，当然取决于给药模式。例如，静脉内的月剂量可能需要约1至约1000mg/患者。所述总月剂量可以以单剂量或分份剂量给药，且可以根据医师的判定落在本文给出的典型范围之外。
本文中公开的ADC的治疗或预防有效量的一个示例性的非限制性范围是约0.01mg至约1000mg/患者/月。在某些实施方案中，可以以约1mg至约200mg或约1mg至约150mg/患者/月给药ADC。在某些实施方案中，所述患者是人。
药盒
本发明还提供了用于治疗上述病症的药盒(或制成品)。本发明的药盒包括一个或多个含有经纯化的ADC的容器和关于使用所述缀合物治疗疾病的说明书。例如，所述说明书包含给药ADC以治疗疾病诸如癌症(例如，实体或液体癌)的描述。所述药盒还可以包含基于鉴别个体是否具有疾病和所述疾病的阶段来选择适合治疗的个体的描述。
与ADC的应用有关的说明书通常包括关于剂量、给药计划和用于预期治疗的给药途径的信息。所述容器可以是单位剂量、散装(例如，多次剂量包装)或亚单位剂量。在本发明的药盒中供应的说明书通常是在标签或包装插页(例如，在药盒中包括的纸质片材)上的书面说明，但是机器可读的说明书(例如，在磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
本发明的药盒是在合适的包装中。合适的包装包括但不限于：管形瓶、瓶子、罐、柔性包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。也包括用于与特定装置(诸如吸入器、鼻给药装置(例如，雾化器)或输注装置诸如微型泵)联合使用的包装。药盒可以具有无菌的通入口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的瓶)。所述容器还可以具有无菌的访问口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的瓶)。组合物内的至少一种活性剂是如本文中所述的较高负载的ADC。所述容器可以进一步包含第二种药学活性剂。
药盒可以任选地提供另外的组分诸如缓冲液和解释信息。通常，药盒包含容器和在所述容器上或伴随所述容器的标签或包装插页。
实施例
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于例证目的，并且提示本领域技术人员可以以此为依据做出各种变型或改变，且所述变型或改变应当被包括在本申请的精神和范围内。
用于分析的HPLC和LC-MS条件：
分析型HPLC条件：Phenomenex Luna C18(2),150x3.0mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：0％至100％B历时8.5分钟，然后100％B保持1.5分钟；流速：1.5mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：10μL；仪器：Agilent 1100HPLC。
分析LC-MS条件：Waters Acquity UPLC HSS T3,C18,2.1x50mm,1.7μm；流动相A：0.1％的甲酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.1％的甲酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：5％B历时0.1分钟，5％至95％B历时2.5分钟，95％B历时0.35分钟；流速：1.25mL/分钟。温度：60℃；检测：200-450nm；MS(+)范围100-2000道尔顿；进样量：5μL；仪器：Waters Acquity。
用于纯化的制备型HPLC条件：
方法A:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：5％至50％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法B:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：20％至80％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法C:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：5％至70％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法D:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：10％至70％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法E:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：30％至85％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法F:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：10％至90％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法G:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：10％至95％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法H:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：25％至65％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法I:Phenomenex Synergi Max C18,250x50mm,10um柱；流动相A：0.2％的甲酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：乙腈；梯度：33.0％至58％B在25分钟中，然后在2分钟中冲洗至100％B，保持5分钟；流速：80mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 220nm。
方法J:DIKMA Diamonsil(2)C18,200x20mm,5um柱；流动相A：0.225％的甲酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：乙腈；梯度：53％至73％B历时11分钟，然后在0.5分钟中冲洗至100％B，保持2分钟；流速：35mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 220nm。
方法K:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：20％至90％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法L:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：10％至80％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法M:Phenomenex Luna C18,150x21.2mm,5μm柱；流动相A：0.02％的乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：1％至100％B历时8.5分钟，然后保持在100％B历时2分钟；流速：27mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD 215nm,254nm；MS(+)范围150-2000道尔顿；进样量：直到5mL。仪器：305RP Waters FractionLynx LCMS。
方法N:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：50％至100％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法O:Phenomenex Luna C18,150x21.2mm,5μm柱；流动相A：0.02％的乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：35％至50％B历时8.5分钟，然后保持在100％B历时2分钟；流速：27mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD 215nm,254nm；MS(+)范围150-2000道尔顿；进样量：直到5mL。仪器：305RP Waters FractionLynx LCMS。
方法P:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：25％至100％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法Q:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：20％至100％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法R:Phenomenex Luna C18,150x21.2mm,5μm柱；流动相A：0.02％的乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：35％至50％B历时8.5分钟，然后保持在100％B历时2分钟；流速：27mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD 215nm,254nm；MS(+)范围150-2000道尔顿；进样量：直到5mL。仪器：305RP Waters FractionLynx LCMS。
方法S:Phenomenex Luna C18,100x30mm,5μm柱；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：20％至90％B历时20分钟；流速：20mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。仪器：Gilson 215。
方法T:Phenomenex Synergi Max C18,250x50mm,10um柱；流动相A：0.2％的甲酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：乙腈；梯度：在30分钟中35.0％至65％B，然后在2分钟中冲洗至100％B，保持5分钟；流速：30mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 220nm。
方法U:Isco MPLC,RediSep 43g C18柱Gold；流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：在20分钟中20-100％B；流速：40ml/min；温度：不控制；DAD 214,254nm。
方法V:Isco MPLC,RediSep 43g C18柱Gold；,流动相A：0.02％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.02％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；在20分钟中梯度10-80％B；流速：40ml/min；温度：不控制；DAD 214,254nm。
方法W:Phenomenex Synergi Max-RP 250x50mm,10μm柱；流动相A：0.1％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.1％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：24％至54％B历时30分钟；流速：30mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。
方法X:Luna C18 150x25,5μm柱；流动相A：0.2％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.2％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：30％至50％B历时11分钟；流速：35mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。
方法Y:Phenomenex Synergi Max-RP 250x50mm,100x30mm,10μm柱；流动相A：0.1％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.1％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：30％至60％B历时22分钟；流速：80mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。
方法Z:Phenomenex Synergi Max-RP 250x50mm,10μm柱；流动相A：0.1％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.1％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：30％至60％B历时21.5分钟；流速：80mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 210，254nm；进样量：直到5mL。
方法AA:Phenomenex Synergi Max-RP 250x80,10μm柱；流动相A：0.1％的三氟乙酸在水中的溶液(v/v)；流动相B：0.1％的三氟乙酸在乙腈中的溶液(v/v)；梯度：40％至70％B历时30分钟；流速：30mL/分钟。温度：不控制；检测：DAD 220nm；进样量：直到5mL。
实施例1：N～2～-苯甲酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(6)的制备
Figure BDA0001262491160000511
步骤1：N～2～-苯甲酰基-N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(2)的合成。向N～2～-苯甲酰基-N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(100mg,0.285mmol)和L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1,108mg,0.285mmol)在1mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,111mg,0.285mmol)，随后加入N,N-二异丙基乙胺(201ul,149mg,1.14mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌16小时。然后将反应物浓缩并通过反相HPLC(方法A)纯化。将含有产物的流分冻干以提供127mg(63％)期望产物。LC-MS m/z 712.4[M+H+]；710.4[M-H+]；保留时间＝1.30分钟。
步骤2：N～2～-苯甲酰基-N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(3)的合成。将N～2～-苯甲酰基-N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(2,125mg,0.352mmol)在1mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液用碳酸对硝基苯酯(107mg,0.352mmol)和三乙胺(101ul,73.4mg,0.704mmol)处理。将混合物在室温搅拌2小时，然后浓缩至接近干燥，并通过硅胶色谱法使用5％至20％的甲醇在二氯甲烷中的梯度洗脱进行纯化，以得到129mg(83.6％)期望产物。LC-MS m/z 877.4[M+H+]；899.3[M+Na+]；保留时间＝1.73分钟。
步骤3：N～2～-苯甲酰基-N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(5)的合成。向2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(4,20mg,0.027mmol)、N～2～-苯甲酰基-N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(3,28mg,0.032mmol)在0.2mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(5.8mg,0.032mmol)、N,N-二异丙基乙胺(9ul,7mg,0.054mmol)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt,4.4mg,0.032mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌16小时。然后将反应物浓缩并通过反相HPLC(方法B)纯化。将含有产物的流分冻干以提供30mg(75％)期望产物。LC-MS m/z 1481.8[M+H+]；1478.8[M-H+]；保留时间＝1.91分钟。
步骤4：N～2～-苯甲酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(6)的合成。向N～2～-苯甲酰基-N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(5,30mg,0.02mmol)在2.5mL二氯甲烷中的溶液中加入2.5mL 10％的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌2.25小时。然后将反应物浓缩并通过反相HPLC(方法C)纯化。将含有产物的流分冻干以提供22mg(74％)期望产物。LC-MS m/z 1381.7[M+H+]；保留时间＝1.54分钟。分析型HPLC保留时间＝6.00分钟。
实施例2：N～2～-(2,2-二甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(12)的制备
Figure BDA0001262491160000541
步骤1：N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(8)的合成。向2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(4,80mg,0.11mmol)和N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(7,76.7mg,0.119mmol)在0.5mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(46.3mg,0.432mmol)、N,N-二异丙基乙胺(67.7ul,56.4mg,0.432mmol)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt,17.7mg,0.130mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并使得能够在45℃搅拌16小时。然后将反应物浓缩并使用5％至20％的甲醇在二氯甲烷中的梯度洗脱通过硅胶色谱法纯化以提供90mg(67％)期望产物。LC-MS m/z 1248.7[M+H+]；保留时间＝1.84分钟。
步骤2：L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(9)的合成。向N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(8,91mg,0.072mmol)在5mL二氯甲烷中的溶液中加入2mL 20％的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌2.75小时。然后将反应物浓缩以提供91mg(100％)期望产物，将其不经纯化直接用在下一步中。LC-MS m/z 1148.7[M+H+]；保留时间＝1.43分钟。
步骤3：N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(10)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸(50.6mg,0.108mmol)在0.5mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,41.6mg,0.108mmol)，随后加入N,N-二异丙基乙胺(51ul,37.6mg,.288mmol)，并将混合物在室温搅拌15分钟。然后加入L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(9,91mg,0.072mmol)在1mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌2小时，然后缓慢地加入二乙胺(2ml,1.41g,19.3mmol)。将反应物搅拌16小时，然后通过加入三氟乙酸进行酸化，浓缩，并通过反相HPLC(方法D)纯化。将含有产物的流分冻干以提供99mg(92％)期望产物。LC-MS m/z 1376.8[M+H+]；1374.8[M-H+]；保留时间＝1.40分钟。
步骤4：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(2,2-二甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(11)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺三氟乙酸盐(10,21.5mg,0.015mmol)和戊醛酸酐(5.6mg,0.030mmol)在0.2mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(26ul,19.4mg,0.15mmol)，并将混合物在室温搅拌45分钟。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法E)纯化。将含有产物的流分冻干以提供21.9mg(100％)期望产物。LC-MS m/z 1460.7[M+H+]；1458.5[M-H+]；保留时间＝1.93分钟。
步骤5：N～2～-(2,2-二甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(12)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(2,2-二甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(11,21.9mg,0.015mmol)在1mL二氯甲烷中的溶液中加入0.33mL三氟乙酸。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌1小时。然后将反应物浓缩并通过反相HPLC(方法F)纯化。将含有产物的流分冻干以提供8mg(36％)期望产物。LC-MS m/z 1360.7[M+H+]；保留时间＝1.45分钟。分析型HPLC保留时间＝6.01分钟。
实施例3：N～2～-(苯基乙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(14)的制备
Figure BDA0001262491160000581
步骤1：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(苯基乙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(13)的合成。向苯乙酸(15mg,0.11mmol)在0.2mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,43.1mg,0.11mmol)，随后加入N,N-二异丙基乙胺(20ul,14.5mg,0.11mmol)，并将混合物在室温搅拌45分钟。加入N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺三氟乙酸盐(10,20mg,0.013mmol)在0.2mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液，并将混合物在室温搅拌16小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法G)纯化。将含有产物的流分冻干以提供10mg(52％)期望产物。LC-MS m/z1495.3[M+H+]；1493.1[M-H+]；保留时间＝1.93分钟。
步骤2：N～2～-(苯基乙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(14)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(苯基乙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(13,10mg,0.007mmol)在1mL二氯甲烷中的溶液中加入1mL 20％的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌2小时。然后将反应物浓缩并通过反相HPLC(方法G)纯化。将含有产物的流分冻干以提供10mg(100％)期望产物。LC-MS m/z 1394.7[M+H+]；保留时间＝1.52分钟。分析型HPLC保留时间＝5.39分钟。
实施例4：N～2～-(1H-咪唑-5-基羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(16)的制备
Figure BDA0001262491160000601
步骤1：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(1H-咪唑-5-基羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(15)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺三氟乙酸盐(10,20.5mg,0.014mmol)和1H-咪唑-5-甲酸(15.7mg,0.14mmol)在0.2mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(25ul,18.3mg,0.14mmol)，并将混合物在室温搅拌5分钟。加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,54.3mg,0.14mmol)并将混合物在室温搅拌另外1小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法G)纯化。将含有产物的流分冻干以提供13mg(59％)期望产物。LC-MS m/z 1471.6[M+H+]；1469.0[M-H+]；保留时间＝1.70分钟。
步骤2：N～2～-(1H-咪唑-5-基羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(16)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(1H-咪唑-5-基羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(15,13mg,0.008mmol)在5mL二氯甲烷中的溶液中加入2mL 20％的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌15分钟。然后将反应物浓缩并通过反相HPLC(方法D)纯化。将含有产物的流分冻干以提供6mg(50％)期望产物。LC-MS m/z 1370.7[M+H+]；1368.6[M-H+]；保留时间＝1.39分钟。分析型HPLC保留时间＝5.30分钟。
实施例5：N～2～-(1H-咪唑-5-基乙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(18)的制备
Figure BDA0001262491160000621
步骤1：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(1H-咪唑-5-基乙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(17)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺三氟乙酸盐(10,20mg,0.013mmol)和2-(1H-咪唑-5-基)乙酸(30.0mg,0.20mmol)在0.2mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(23ul,17mg,0.13mmol)，并将混合物在室温搅拌5分钟。加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,50.4mg,0.13mmol)，并将混合物在室温搅拌另外1小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法G)纯化。将含有产物的流分冻干以提供13.6mg(65％)期望产物。LC-MS m/z 1485.6[M+H+]；1483.5[M-H+]；保留时间＝1.44分钟。
步骤2：N～2～-(1H-咪唑-5-基乙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(18)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(1H-咪唑-5-基乙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(17,13.6mg,0.009mmol)在5mL二氯甲烷中的溶液中加入2mL 20％的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌15分钟。然后将反应物浓缩并通过反相HPLC(方法D)纯化。将含有产物的流分冻干以提供13mg(96％)期望产物。LC-MS m/z 1384.9[M+H+]；1382.8[M-H+]；保留时间＝1.26分钟。分析型HPLC保留时间＝5.21分钟。
实施例6：N～2～-(3-甲基丁酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(19)的制备
Figure BDA0001262491160000641
将3-甲基丁酸(10.2mg,0.100mmol)在0.4mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液用N,N-二异丙基乙胺(35ul,26.1mg,0.200mmol)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,77.6mg,0.200mmol)处理，并将混合物在室温搅拌5分钟。加入N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺三氟乙酸盐(10,30mg,0.020mmol)在0.4mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液，并将混合物在室温搅拌1小时。然后将溶液浓缩至接近干燥，然后溶解在2mL二氯甲烷中并用0.5mL三氟乙酸处理。在室温搅拌另外30分钟以后，将反应物浓缩并通过反相HPLC(方法H)纯化。将含有产物的流分冻干以提供13mg(44％)期望产物。LC-MS m/z 1360.8[M+H+]；1358.4[M-H+]；保留时间＝1.49分钟。分析型HPLC保留时间＝5.98分钟。
实施例7：N～2～-(2-甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(25)的制备
Figure BDA0001262491160000651
步骤1：N～2～-(叔丁氧羰基)-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(20)的合成。向L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1,6.5g,17.1mmol)和N～2～-(叔丁氧羰基)-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸(8.03g,17.1mmol)在200mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(3.32g,25.7mmol)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,7.8g,20.56mmol)。将反应混合物在室温搅拌12小时，然后浓缩，并使用5％至17％的甲醇在二氯甲烷中的溶液的梯度洗脱通过硅胶色谱法纯化，以得到4.00g(28.2％)作为白色固体的期望产物。
步骤2：N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(21)的合成。将N～2～-(叔丁氧羰基)-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(20,4.8g,5.78mmol)在96mL 4M盐酸水溶液中的混合物在室温搅拌12小时。通过缓慢地加入饱和K2CO3水溶液，将反应混合物调至pH 7.5，然后将得到的混悬液过滤。将固体收集并在真空中干燥以得到4.00g(94.9％)作为黄色固体的期望产物。
步骤3：N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-(2-甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(22)的合成。向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(21,500mg,0.685mmol)和1-[(2-甲基丙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(190mg,1.03mmol)在20mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N-N-二异丙基乙胺(221mg,1.7mmol)。在室温搅拌2小时以后，将混合物浓缩并通过反相HPLC(方法I)纯化以得到100mg(18.2％)作为白色固体的期望产物。
步骤4：N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-(2-甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(23)的合成。向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-(2-甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(22,100mg,0.125mmol)和碳酸对硝基苯酯(42mg,0.138mmol)在5mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(32mg,0.25mmol)，并将混合物在室温搅拌12小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法J)纯化以得到110mg(91.7％)作为白色固体的期望产物。HRMS m/z forC50H60N8O12:987.4036(M+Na)+.1H NMR(400MHz,DMSO):δ10.12(s,1H),8.30(m,2H),8.18(m,1H),7.88(m,3H),7.64(m,6H),7.27(m,6H),6.00(s,1H),5.44(s,2H),5.23(s,2H),4.21(m,6H),2.95(m,5H),1.99(m,1H),1.24(m,12H),0.99(d,6H),0.85(d,6H)；
步骤4：N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-(2-甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(24)的合成。向2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(4,27.5mg,0.032mmol)和N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-(2-甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(23,36.7mg,0.038mmol)在1mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(13.7mg,0.128mmol)、N,N-二异丙基乙胺(23ul,16.7mg,0.128mmol)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt,5.2mg,0.038mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌16小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法K)纯化。将含有产物的流分冻干以提供30mg(60％)期望产物。
步骤5：N～2～-(2-甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(25)的合成。将N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-(2-甲基丙酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(24,30mg,0.019mmol)在1mL二氯甲烷中的溶液用1mL二乙胺处理。将溶液在室温搅拌5小时，然后浓缩并通过反相HPLC(方法K)纯化。将含有产物的流分冻干以提供6.0mg(21％)期望产物。LC-MS m/z 1346.9[M+H+]；保留时间＝1.47分钟。分析型HPLC保留时间＝5.87分钟。
实施例8-18和49-71的操作：位点特异性抗-Trop2ADC的缀合、纯化
为了使抗-Trop2抗体与实施例1-7的接头-有效负载(LP)缀合，将指定量的抗体在含有25mM Tris-HCl的缓冲液(pH 8.0-8.5)中调至5mg/mL。将指定量的LP以相对于抗体5-50倍摩尔过量加入，并通过加入2％(w/v)细菌转谷氨酰胺酶(Ajinomoto Activa TI,日本)引发酶反应，并在37℃在轻轻摇动下温育16-24小时。通过调节反应混合物以得到0.75M硫酸铵、25mM磷酸钾、pH 7的缓冲液组合物(缓冲液A)，使用Butyl SepharoseTMHighPerformance(Butyl HP,GE Healthcare Biosciences)纯化ADC。将所述物质应用于ButylHP，用5CV缓冲液A洗涤，并用20CV线性梯度洗脱进25mM磷酸钾(pH 7)中。将含有ADC的流分合并，在PBS中透析，使用10kDa Amicon Ultra离心过滤器单元(Millipore Corporation)浓缩，并穿过0.2μm过滤器无菌过滤。或者，按照标准方案使用MabSelect Protein A树脂(GE Healthcare Biosciences)纯化ADC，并缓冲液更换进PBS中。
使用上述技术制备下述ADC(在Trop2抗体上的不同位置和不同标签连接，如在表2-7上所示)(带括号的部分指示谷氨酰胺残基，波浪线显示与抗-Trop2抗体的剩余部分的连接点)：
比较例8:C6vcMMAD：
Figure BDA0001262491160000681
比较例9:AcLys-vcMMAD：
Figure BDA0001262491160000691
比较例10:C6vc0101：
Figure BDA0001262491160000692
比较例11:AcLys-vc0101：
Figure BDA0001262491160000693
实施例12：
Figure BDA0001262491160000694
实施例13：
Figure BDA0001262491160000701
实施例14：
Figure BDA0001262491160000702
实施例15：
Figure BDA0001262491160000703
实施例16：
Figure BDA0001262491160000704
实施例17：
Figure BDA0001262491160000711
实施例18：
Figure BDA0001262491160000712
实施例19：体内稳定性测定-小鼠
在单次9mg/kg剂量的ADC以后1-10天范围内的时间点，从小鼠得到血浆样品。将样品用等体积的1x PBS稀释，并使用标准方案使用MabSelect珠或与CNBr-活化的Sepharose(GE Healthcare)偶联的Trop2抗原分离ADC。使用HIC方法和质谱法在体内暴露之前和之后评估药物-抗体比率。
实施例20：体内稳定性测定–大鼠
在单次9mg/kg剂量的ADC以后1-10天范围内的时间点，从大鼠得到血浆样品。将样品用等体积的1x PBS稀释，并使用标准方案使用与CNBr-活化的Sepharose(GEHealthcare)偶联的Trop2抗原分离ADC。使用HIC方法和质谱法在体内暴露之前和之后评估药物-抗体比率。
实施例21A：体外稳定性测定-小鼠血浆
将100-200ug ADC在补充了1x PBS的小鼠血浆(由Bioreclamation提供)中温育至0.125mg/mL的最终ADC浓度。温育3-7天以后，将样品用等体积的1x PBS稀释，并使用标准方案使用与CNBr-活化的Sepharose(GE Healthcare)偶联的Trop2抗原分离ADC。使用HIC方法和质谱法评估体外暴露之前和之后的药物-抗体比率。
实施例21B：负责接头裂解的小鼠血浆酶的鉴别
为了将小鼠血浆酶分类，使用抗-Trop2L11B C6 vc0101缀合物作为底物，在有各种蛋白酶抑制剂存在下进行体外稳定性测定。结果表明，小鼠血浆酶可能是被1mMPefabloc(Roche)和100uM BNPP(Sigma)抑制的丝氨酸水解酶。为了鉴别该酶，我们通过使用一系列步骤将Balb/c小鼠血清分级，富集了抗-Trop2 L11B C6 vc0101接头水解活性。首先，使用商购可得的MabSelect Protein A和Protein G树脂(GE Healthcare)，然后用Qproteome Murine Albumin Depletion Kit(Qiagen)，将Balb/c血清(BioreclamationIVT)除去IgG和白蛋白。然后将耗竭的血清用硫酸铵进行连续沉淀。然后使用含有氯化钠的不连续梯度洗脱，将具有最高接头水解酶活性的流分施加到阳离子交换HiTrap SP柱(GE Healthcare)。此后，使用含有氯化钠的不连续梯度洗脱将具有最高活性的SP流分施加到阴离子交换HiTrap Q柱(GE Healthcare)。然后将具有最高水解酶活性的流分合并，并使用Superdex 200柱(GE Healthcare)进行尺寸分级。合并的具有最高活性的Superdex 200流分的蛋白组学分析揭示了羧酸酯酶1C，其能够水解酰胺键且可以被Pefabloc和BNPP抑制。为了验证小鼠羧酸酯酶1C作为负责接头裂解的血浆酶的正确鉴别，将重组蛋白在Expi 293细胞中表达，并按照标准方案使用HIS标签纯化。证实了纯化的蛋白以相同的相对活性裂解具有VC系接头的多种缀合物，如对于小鼠血浆所证实的。
实施例22：体外稳定性测定-大鼠血浆
将100-200ug ADC在补充了1x PBS的大鼠血浆(由Bioreclamation提供)中温育至0.125mg/mL的最终ADC浓度。温育3-7天以后，将样品用等体积的1x PBS稀释，并使用标准方案使用与CNBr-活化的Sepharose(GE Healthcare)偶联的Trop2抗原分离ADC。使用HIC方法和质谱法评估体外暴露之前和之后的药物-抗体比率。
实施例23:体外稳定性测定-食蟹猴血浆
将100-200ug ADC在补充了1x PBS的食蟹猴血浆(由Bioreclamation提供)中温育至0.125mg/mL的最终ADC浓度。温育3-7天以后，将样品用等体积的1x PBS稀释，并使用标准方案使用与CNBr-活化的Sepharose(GE Healthcare)偶联的Trop2抗原分离ADC。使用HIC方法和质谱法评估体外暴露之前和之后的药物-抗体比率。
实施例24:体外细胞毒性测定
如在图1(A至I)中所示，用表达靶标的BxPC3细胞进行在许多位点处与氨基己酰基(C6)vc Aur0101细胞毒性有效负载缀合的嵌合抗-Trop2抗体的体外细胞毒性研究。将未经处理的化合物(实线)和在小鼠血浆中处理4.5天以后分离的它们的代谢物(虚线)并行地试验以确定细胞毒性的任何变化。BxPc3是具有高靶标表达水平(Trop-2+++)的癌细胞系。在处理之前将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上24小时。将细胞用4倍系列稀释的抗体-药物缀合物一式三份地处理。在处理后96小时通过
Figure BDA0001262491160000731
LuminescentCell Viability Assay 96(Promega,Madison,WI)确定细胞生存力。将相对细胞生存力确定为未经处理的对照的百分比。
也如在图1(J至O)中所示，用表达靶标的BxPC3细胞进行在LCQ04或L11B位点处与3个接头-有效负载(实施例2、3和5的接头有效负载)之一缀合的嵌合抗-Trop2抗体的体外细胞毒性研究。将未经处理的化合物(实线)和在小鼠血浆中处理4.5天以后分离的它们的代谢物(虚线)并行地试验以确定细胞毒性的任何变化。BxPc3是具有高靶标表达水平(Trop-2+++)的癌细胞系。在处理之前将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上24小时。将细胞用4倍系列稀释的抗体-药物缀合物一式三份地处理。在处理后96小时通过
Figure BDA0001262491160000732
Luminescent Cell Viability Assay 96(Promega,Madison,WI)确定细胞生存力。将相对细胞生存力确定为未经处理的对照的百分比。
实施例25：N～2～-(羟基乙酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(30)的制备
Figure BDA0001262491160000741
步骤1：N～2～-(叔丁氧羰基)-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(26)的合成。向N～2～-(叔丁氧羰基)-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(20,998mg,1.20mmol)和碳酸对硝基苯酯(748mg,2.41mmol))在7mL N,N-二甲基甲酰胺中和在7mL二氯甲烷中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(452uL 0.328g,2.41mmol)，并将混合物在室温搅拌3小时。将残余物用乙酸乙酯和乙醚稀释，并将得到的浆搅拌30分钟。将固体通过过滤进行分离并用乙醚洗涤数次，并在风干以后得到作为黄色固体的期望产物(1319mg)，将其不经进一步纯化原样使用。LC-MS m/z 995.5[M+H+]；保留时间＝1.02分钟。分析型HPLC保留时间＝8.181分钟。
步骤2：N～2～-(叔丁氧羰基)-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(27)的合成。向2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(4,371mg,0.499mmol)和N～2～-(叔丁氧羰基)-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(26,802mg,0.64mmol)在2.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(216uL,200mg,1.9mmol,)、N,N-二异丙基乙胺(326uL,240mg,1.9mmol)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt,17.7mg,0.130mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并使得能够在50℃搅拌90分钟，然后在室温搅拌16小时。然后将反应物通过反相色谱法(方法U)纯化以在冻干法以后提供339mg(42％,2步骤)作为白色固体的期望产物。LC-MS m/z 1599.9[M+H+]；保留时间＝1.09分钟。分析型HPLC保留时间＝8.163分钟。
步骤3：N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28)的合成。向N～2～-(叔丁氧羰基)-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(27,439mg,0.275mmol)在2mL二氯甲烷中的混悬液中加入1mL三氟乙酸。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌20分钟。然后将反应物浓缩并通过反相色谱法(方法V)纯化以在冻干法以后提供410mg(96％)。LC-MS m/z 1499.8[M+H+]；保留时间＝0.86分钟。分析型HPLC保留时间＝6.778分钟。
步骤4：N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-(羟基乙酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(29)的合成。向羟基乙酸(14.7mg,0.193mmol)在0.3mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI,7.99mg,0.0417mmol)、乙基(肟基)氰基乙酸酯(Oxyma,20mg,0.14mmol)和N-甲基吗啉(40uL,37mg,0.36mmol)。将得到的黄色溶液搅拌20分钟，然后加入N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,50mg,0.032mmol)在0.5mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌1小时，然后浓缩并通过反相HPLC(方法F)纯化。将含有产物的流分冻干以在冻干法以后提供12.2mg(24％)。LC-MS m/z 1557.8[M+H+]；保留时间＝0.98分钟。分析型HPLC保留时间＝7.371分钟。
步骤5：N～2～-(羟基乙酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(30)的合成。向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-(羟基乙酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(29,12.2mg,0.00784mmol)在0.3mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入哌啶(0.1mL,90mg,1mmol)，并将混合物在室温搅拌1小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法E)纯化。将含有产物的流分冻干以提供8mg(70％)期望产物。LC-MS m/z 1334.8[M+H+]；保留时间＝0.76分钟。分析型HPLC保留时间＝5.788分钟。
实施例26：N～2～-(甲基氨甲酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(33)的制备
Figure BDA0001262491160000781
步骤1：N-甲基-1H-咪唑-1-甲酰胺(31)的合成。将1,1’-羰基二咪唑(1.76g,10.7mmol)和盐酸甲胺(661mg,9.7mmol)的混合物溶解在1.8mL N,N-二甲基甲酰胺和5.5mL乙腈中。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌3.25小时。然后将反应物浓缩并使用0％至10％的甲醇在二氯甲烷中的溶液的梯度洗脱通过硅胶色谱法纯化以提供696mg(57％)期望产物。LC-MS m/z 126.0[M+H+]；保留时间＝0.17分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.22(s,1H),7.65(s,1H),7.03(s,1H),2.83(d,J＝4.3Hz,3H)。
步骤2：N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-(甲基氨甲酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(32)的合成。向N-甲基-1H-咪唑-1-甲酰胺(40.1mg,0.321mmol)和N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,50mg,0.032mmol)在0.5mL N,N-二甲基甲酰胺中的混合物中加入三乙胺(44.7uL,32.5mg,0.321mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌1.5小时，然后用二甲基亚砜稀释并通过反相HPLC(方法L)纯化以在冻干法以后提供8.8mg(18％)期望产物。LC-MS m/z 1556.8[M+H+]；保留时间＝0.99分钟。分析型HPLC保留时间＝7.521分钟。
步骤3：N～2～-(甲基氨甲酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(33)的合成。向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-(甲基氨甲酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(32,8.8mg,0.0057mmol)在0.3mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入哌啶(0.1mL,90mg,1mmol)，并将混合物在室温搅拌1.5小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法E，然后方法M)纯化。将含有产物的流分冻干以提供4.6mg(58％)期望产物。LC-MS m/z 1333.7[M+H+]；保留时间＝0.76分钟。分析型HPLC保留时间＝5.825分钟。
实施例27：N-甲基甘氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(34)的制备
Figure BDA0001262491160000801
向2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基甘氨酸酯(11.9mg,0.0416mmol)在0.1mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,50mg,0.032mmol)和N,N-二异丙基乙胺(17uL,13mg,0.096mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌1小时(LC-MS m/z 1670.7 1[M+H+]；保留时间＝1.03分钟)。将混合物在强氮气流下浓缩并将残余物溶解回甲醇中并穿过SCX柱(用2柱体积的甲醇预洗涤)。将筒用1柱体积的甲醇洗涤，并将产物在柱上静置过夜。将柱用7M的氨在甲醇中的溶液冲洗，浓缩以后，将残余物通过反相HPLC(方法L)纯化。将含有产物的流分冻干以提供4.2mg(8％)期望产物。LC-MS m/z 1347.51[M+H+]；保留时间＝0.68分钟。分析型HPLC保留时间＝5.486分钟。
实施例28：N,N-二甲基甘氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(35)的制备
Figure BDA0001262491160000811
向N,N-二甲基甘氨酸(4.5mg,0.044mmol)在0.1mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入0.1mL N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI,79.9mg,0.417mmol)、乙基(肟基)氰基乙酸酯(Oxyma,10mg,0.07mmol)和N-甲基吗啉(10uL,9mg,0.09mmol)在1mLN,N-二甲基甲酰胺中的储备溶液。将得到的黄色溶液搅拌15分钟，然后加入N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,50mg,0.032mmol)在0.5mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并使得能够在室温和更多的N-甲基吗啉(50uL,45mg,0.45mmol)中搅拌40分钟。将混合物搅拌16小时，浓缩并通过反相HPLC(方法L)纯化。将含有产物的流分冻干以提供5.4mg(11％)期望产物。LC-MS m/z 1361.8[M+H+]；保留时间＝0.71分钟。分析型HPLC保留时间＝5.481分钟。
实施例29：甘氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(37)的制备
Figure BDA0001262491160000821
步骤1：N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(36)的合成。向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,65.0mg,0.043mmol))在0.650mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酸酯(68.4mg,0.173mmol)和N,N-二异丙基乙胺(23.1mg,0.173mmol,30.8uL)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌2小时并通过反相HPLC(方法N)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供22.3mg(29％)期望产物。LC-MS m/z 1777.2[M+H+]；保留时间＝1.10分钟。分析型HPLC保留时间＝8.544分钟。
步骤2：甘氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(37)的合成。向N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(36,20mg,0.011mmol)在0.6mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入哌啶(0.3mL,270mg,3mmol)，并将混合物在室温搅拌15分钟。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法L，然后方法M)纯化。将含有产物的流分冻干以提供14.4mg(90％)期望产物。LC-MS m/z 1333.8[M+H+]；保留时间＝0.70分钟。分析型HPLC保留时间＝5.825分钟。
实施例30：N～2～-[(3-甲基氧杂环丁烷-3-基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(39)的制备
Figure BDA0001262491160000841
步骤1：N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-[(3-甲基氧杂环丁烷-3-基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(38)的合成。在冰水浴中，向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,50.0mg,0.031mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入3-甲基氧杂环丁烷-3-甲酸(22mg,0.19mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,65mg,0.17mmol)和N,N-二异丙基乙胺(35uL,26mg,0.20mmol)。将混合物在冰水浴中搅拌另外40分钟。然后将溶液通过反相HPLC(方法P)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供37.4mg(55％)期望产物。LC-MS m/z 1597.8[M+H+]；保留时间＝1.00分钟。分析型HPLC保留时间＝7.567分钟。
步骤2：N～2～-[(3-甲基氧杂环丁烷-3-基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(39)的合成。向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N～2～-[(3-甲基氧杂环丁烷-3-基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(38,27.4mg,0.0172mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入氢氧化锂的水溶液(411uL,41.1mg,0.0343mmol)，并将混合物在室温搅拌1小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法L)纯化。将含有产物的流分冻干以提供9.3mg(36％)期望产物。LC-MS m/z 1374.4[M+H+]；保留时间＝0.77分钟。分析型HPLC保留时间＝5.841分钟。
实施例31：2-甲基丙氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(41)的制备
Figure BDA0001262491160000861
步骤1：N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(40)的合成。在冰水浴中，向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,50.0mg,0.031mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酸(17.5mg,0.0538mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,25.9mg,0.0681mmol)和N,N-二异丙基乙胺(25uL,19mg,0.14mmol)。将混合物在冰水浴中搅拌另外40分钟。然后将溶液通过反相HPLC(方法Q)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供56mg(100％)期望产物。LC-MS m/z 1806.9[M+H+]；保留时间＝1.12分钟。分析型HPLC保留时间＝8.817分钟。
步骤2：2-甲基丙氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(40)的合成。向N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(40,56mg,0.031mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入氢氧化锂水溶液(100uL,10mg,0.4mmol)，并将混合物在室温搅拌1小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法L)纯化。将含有产物的流分冻干以提供7.6mg(15％)期望产物。LC-MS m/z 1384.2[M+Na+]；保留时间＝0.71分钟。分析型HPLC保留时间＝5.467分钟。
实施例32：N～2～-(甲氧基羰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(43)的制备
Figure BDA0001262491160000881
步骤1：N-(甲氧基羰基)-2-甲基丙氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(42)的合成。向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,30.0mg,0.019mmol))在0.3mL N,N-二甲基乙酰胺和0.2mL二氯甲烷中的溶液中加入氯甲酸甲酯(29uL,35.2mg,0.372mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌2小时。2h以后，加入N,N-二异丙基乙胺(10.0uL,7.5mg,0.056mmol)并将混合物搅拌另外16小时。LC-MS仍然显示反应是不完全的，所以加入氯甲酸甲酯(60uL,73mg,0.78mmol)，随后加入N,N-二异丙基乙胺(10uL,7.5mg,0.056mmol)。在室温搅拌另外4小时以后，将混合物通过反相HPLC(方法Q)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供6.4mg(22％)期望产物。LC-MS m/z 1557.9[M+H+]；保留时间＝1.05分钟。分析型HPLC保留时间＝7.709分钟。
步骤2：N～2～-(甲氧基羰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(43)的合成。向N-(甲氧基羰基)-2-甲基丙氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(42,6.4mg,0.0041mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入二乙胺(0.3mL,200mg,3mmol)，并将混合物在室温搅拌3小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法L)纯化。将含有产物的流分冻干以提供2.6mg(44％)期望产物。LC-MS m/z 1334.8[M+H+]；保留时间＝0.83分钟。分析型HPLC保留时间＝5.908分钟。
实施例33：L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(44)的制备
Figure BDA0001262491160000901
向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,20.0mg,0.012mmol))在0.2mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入哌啶(0.1mL,90mg,1mmol)，并将混合物在室温搅拌4小时。然后将溶液通过反相HPLC(方法L，然后方法R)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供7.6mg(44％)期望产物。LC-MS m/z 1276.7[M+H+]；保留时间＝0.70分钟。分析型HPLC保留时间＝5.516分钟。
实施例34：L-丙氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(46)的制备
Figure BDA0001262491160000911
步骤1：N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(45)的合成。在冰水浴中，向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,8.7mg,0.0054mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸酯((8.81mg,0.0216mmol)和N,N-二异丙基乙胺(10.0uL,7.5mg,0.056mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌16小时并通过反相HPLC(方法S)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供5.3mg(55％)期望产物。LC-MS m/z 1791.7[M+H+]；保留时间＝1.11分钟。分析型HPLC保留时间＝8.655分钟。
步骤2：L-丙氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(46)的合成。向N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(45,5.3mg,0.0030mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入氢氧化锂水溶液(210uL,20mg,0.9mmol)，并将混合物在室温搅拌1小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法L)纯化。将含有产物的流分冻干以提供3.4mg(73％)期望产物。LC-MS m/z 1347.7[M+H]+；保留时间＝0.69分钟。分析型HPLC保留时间＝5.487分钟。
实施例35：D-丙氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(48)的制备
Figure BDA0001262491160000931
步骤1：N-(叔丁氧羰基)-D-丙氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(47)的合成。在冰水浴中，向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,50mg,0.03mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(叔丁氧羰基)-D-丙氨酸酯(15.7mg,0.0548mmol)和N,N-二异丙基乙胺(22.0uL,16mg,0.12mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌16小时并通过反相HPLC(方法S)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供20.0mg(40％)期望产物。LC-MS m/z1791.7[M+H+]；保留时间＝1.08分钟。分析型HPLC保留时间＝8.024分钟。
步骤2：D-丙氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(48)的合成。向N-(叔丁氧羰基)-D-丙氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(47,20.0mg,0.012mmol)在1mL乙腈中的溶液中加入0.5mL三氟乙酸。将混合物在室温搅拌15分钟然后浓缩。将残余物溶解在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中并用冰水浴冷却。向其加入氢氧化锂水溶液(50.3uL,5.3mg,0.12mmol)，并将混合物在室温搅拌30分钟。然后将溶液通过反相HPLC(方法L)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供8.9mg(47％)期望产物。LC-MS m/z1347.9[M+H]+；保留时间＝0.77分钟。分析型HPLC保留时间＝5.429分钟。
实施例36：L-α-天冬氨酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(50)的制备
Figure BDA0001262491160000951
步骤1：(6S,9S,12S,15S)-1-氨基-6-({4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}氨甲酰基)-15-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-12-(4-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁基)-1,8,11,14-四氧代-9-(丙烷-2-基)-2,7,10,13-四氮杂十七烷-17-酸叔丁酯(49)的合成。在冰水浴中，向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,50mg,0.03mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入(2S)-4-叔-丁氧基-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸(20.9mg,0.0722mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,28.0mg,0.074mmol)和N,N-二异丙基乙胺(22.0uL,16mg,0.12mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并使得能够搅拌1小时，并通过反相HPLC(方法Q)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供41mg(70％)期望产物。LC-MS m/z 1771.2[M+H+]；保留时间＝1.16分钟。分析型HPLC保留时间＝8.591分钟。
步骤2：L-α-天冬氨酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(50)的合成。向(6S,9S,12S,15S)-1-氨基-6-({4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}氨甲酰基)-15-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-12-(4-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁基)-1,8,11,14-四氧代-9-(丙烷-2-基)-2,7,10,13-四氮杂十七烷-17-酸叔丁酯(49,41.0mg,0.023mmol)在1mL乙腈中的溶液中加入0.5mL三氟乙酸。将混合物在室温搅拌25分钟(LC-MSm/z 1671.0[M+H]+；保留时间＝0.93分钟)然后浓缩。将残余物溶解在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中并用冰水浴冷却。向其加入氢氧化锂水溶液(50.3uL,5.3mg,0.12mmol)，并将混合物在室温搅拌20分钟。然后将溶液通过反相HPLC(方法Q)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供1.1mg(3％)期望产物。LC-MS m/z 1392.1[M+H]+；保留时间＝0.80分钟。分析型HPLC保留时间＝5.309分钟。
实施例37：N-乙酰基甘氨酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(52)的制备
Figure BDA0001262491160000971
步骤1：N-乙酰基甘氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(51)的合成。在冰水浴中，向N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(28,30mg,0.02mmol)在0.3mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-乙酰基甘氨酸酯(13.7mg,0.0640mmol)和N,N-二异丙基乙胺(22uL,16mg,0.12mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌16小时并通过反相HPLC(方法Q)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供17.4mg(60％)期望产物。LC-MS m/z 1598.9[M+H+]；保留时间＝1.04分钟。分析型HPLC保留时间＝7.326分钟。
步骤2：N-乙酰基甘氨酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(52)的合成。向N-乙酰基甘氨酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(51,17.4mg,0.0109mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入氢氧化锂水溶液(100uL,10mg,0.2mmol)，并将混合物在室温搅拌20分钟。然后将溶液通过反相HPLC(方法B)直接纯化。将含有产物的流分冻干以提供9.4mg(58％)期望产物。LC-MS m/z 1398.1[M+Na+]；保留时间＝0.84分钟。分析型HPLC保留时间＝5.715分钟。
实施例38：L-丝氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(57)的制备
Figure BDA0001262491160000991
步骤1：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(53)的合成。在冰水浴中，向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸(1090mg,2.32mmol)在15mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,882mg,2.32mmol)。40分钟以后，加入L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1,800mg,2.11mmol)，随后加入N,N-二异丙基乙胺(1.114ml,817mg,6.32mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌2小时。然后将反应物倒入甲基叔丁基醚(150mL)中，搅拌15分钟，然后过滤。将得到的固体用二氯甲烷:甲基叔丁基醚:甲醇(10:10:2)混合物洗涤以得到作为灰色固体的粗产物(1.3g)。将该固体通过反相HPLC(方法T)纯化。将含有产物的流分冻干以提供570mg(33％)期望产物。分析型HPLC保留时间＝4.55分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝9.97(br.s.,1H),8.14(d,J＝6.5Hz,1H),7.90(d,J＝7.5Hz,2H),7.73(br.s.,3H),7.54(d,J＝8.5Hz,3H),7.42(t,J＝7.3Hz,2H),7.33(t,J＝7.3Hz,2H),7.23(d,J＝8.0Hz,2H),6.78(br.s.,1H),5.98(br.s.,1H),5.43(br.s.,2H),5.11(br.s.,1H),4.45-4.34(m,3H),4.34-4.15(m,4H),4.02(br.s.,1H),3.02(d,J＝5.5Hz,1H),2.89(br.s.,3H),1.98(d,J＝6.5Hz,1H),1.61(br.s.,3H),1.52(br.s.,1H),1.42-1.30(m,13H),1.24(br.s.,2H),0.83(d,J＝12.0Hz,3H),0.85(d,J＝11.5Hz,3H)。
步骤2：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(54)的合成。在冰水浴中，向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(53,570mg,0.687mmol)和碳酸对硝基苯酯(418mg,1.37mmol)在10mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(257uL,178mg,1.37mmol)，并将混合物在室温搅拌6小时。然后将反应物倒入甲基叔丁基醚(150mL)中，搅拌15分钟，然后过滤。将得到的固体在二氯甲烷(20mL)中分散20分钟，然后过滤以提供400mg(58％)期望产物。LC-MS m/z 996.0[M+H+]；保留时间＝4.829分钟。分析型HPLC保留时间＝5.43分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.14(s,1H),8.36-8.29(m,2H),8.18(d,J＝7.5Hz,1H),7.90(d,J＝7.5Hz,2H),7.74(d,J＝7.0Hz,2H),7.66(d,J＝8.0Hz,2H),7.62-7.50(m,2H),7.42(d,J＝7.0Hz,3H),7.38-7.11(m,3H),6.78(br.s.,1H),6.00(br.s.,1H),5.44(br.s.,2H),5.26(s,2H),4.39(br.s.,1H),4.35-4.16(m,4H),4.04(br.s.,1H),3.05(d,J＝7.0Hz,1H),2.90(br.s.,3H),2.74(s,1H),2.34(br.s.,1H),2.10(s,1H),1.99(d,J＝6.0Hz,1H),1.68(br.s.,1H),1.62(br.s.,2H),1.53(br.s.,2H),1.38(s,11H),1.42-1.20(m,1H),1.42-1.20(m,1H),0.85(d,J＝12.5Hz,3H),0.86(d,J＝12.5Hz,3H)。
步骤3：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(55)的合成。向2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(4,440mg,0.59mmol)和N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(54,658.0mg,0.661mmol)在1.3mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(137uL,130mg,1.2mmol)、N,N-二异丙基乙胺(207.0uL,160mg,1.2mmol)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt,92.1mg,0.677mmol)。将混合物通过LC-MS监测，并使得能够在50℃搅拌2.5小时，然后在室温搅拌16小时。然后将反应物通过反相色谱法(方法U)纯化以在冻干法以后提供630mg(67％)作为白色固体的期望产物。LC-MS m/z 1600.6[M+H+]；保留时间＝1.07分钟。分析型HPLC保留时间＝8.213分钟。
步骤4:N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(56)的合成。在冰水浴中，向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(55,630mg,0.394mmol)在5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入氢氧化锂(29.4mg,1.23mmol)在0.5mL水中的溶液，并将混合物在室温搅拌30分钟，此后加入氢氧化锂(40.4mg,1.69mmol)。共3小时以后，将溶液在冰浴水中冷却，然后用乙酸(0.2mL)淬灭并通过反相HPLC(方法2)纯化。将含有产物的流分冻干以提供350mg(60％)期望产物。LC-MS m/z1377.6[M+H+]；保留时间＝0.77分钟。分析型HPLC保留时间＝6.181分钟。
步骤5：L-丝氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(57)的合成。在冰水浴中，向N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(56,50.0mg,0.0335mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入N-(叔丁氧羰基)-L-丝氨酸(6.88mg,0.0335mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,15.3mg,0.0402mmol mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺和N,N-二异丙基乙胺(l7.9uL,13.4mg,0.101mmol)中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌45分钟，然后在强氮气流下浓缩以得到粗制物(LC-MS m/z 1565.6[M+H+],保留时间＝0.96分钟)。将黄色残余物溶解在1.2mL甲醇中并均匀地加载到2个用3柱体积的甲醇预洗脱的SCX筒上。将柱用3柱体积的甲醇洗涤(根据LC-MS，在洗液中没有痕量产物)。将产物在柱上静置过夜。将期望产物用2柱体积的1N的三乙胺在甲醇中的溶液洗脱。在减压下浓缩以后，然后将残余物通过反相色谱法(方法V)纯化以在冻干法以后提供8.3mg(16％)期望产物。LC-MS m/z 1364.5[M+H+],保留时间＝0.68分钟。分析型HPLC保留时间＝5.464分钟。
实施例39：D-丝氨酰基-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(58)的制备
Figure BDA0001262491160001031
在冰水浴中，向N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(56,50.0mg,0.0335mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入N-(叔丁氧羰基)-D-丝氨酸(6.88mg,0.0335mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,15.3mg,0.0402mmol mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺和N,N-二异丙基乙胺(l7.9uL,13.4mg,0.101mmol)中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌45分钟，然后在强氮气流下浓缩以得到粗制物(LC-MS m/z 1565.6[M+H+],保留时间＝0.96分钟)。将黄色残余物溶解在1.2mL甲醇中并均匀地加载到2个用3柱体积的甲醇预洗脱的SCX筒上。将柱用3柱体积的甲醇洗涤(根据LC-MS，在洗液中没有痕量产物)。将产物在柱上静置过夜。将期望产物用2柱体积的1N的三乙胺在甲醇中的溶液洗脱。在减压下浓缩以后，然后将残余物通过反相色谱法(方法V)纯化以在冻干法以后提供10.4mg(19％)期望产物。LC-MS m/z 1364.5[M+H+],保留时间＝0.67分钟。分析型HPLC保留时间＝5.424分钟。
实施例40：N～2～-[(2S)-2-羟基丙酰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(59)的制备
Figure BDA0001262491160001041
在冰水浴中，向N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(56,50.0mg,0.0335mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入(2S)-2-羟基丙酸(3.02mg,0.0335mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,15.3mg,0.0402mmol mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺和N,N-二异丙基乙胺(l7.9uL,13.4mg,0.101mmol)中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌45分钟，然后在强氮气流下浓缩以得到粗制物(LC-MS m/z 1449.5[M+H+],保留时间＝0.91分钟)。将黄色残余物溶解在1.2mL甲醇中并均匀地加载到2个用3柱体积的甲醇预洗脱的SCX筒上。将柱用3柱体积的甲醇洗涤(根据LC-MS，在洗液中没有痕量产物)。将产物在柱上静置过夜。将期望产物用2柱体积的1N的三乙胺在甲醇中的溶液洗脱。在减压下浓缩以后，然后将残余物通过反相色谱法(方法V)纯化以在冻干法以后提供12.9mg(26％)期望产物。LC-MS m/z 1349.4[M+H+],保留时间＝0.74分钟。分析型HPLC保留时间＝5.813分钟。
实施例41：N～2～-[(2R)-2-羟基丙酰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(60)的制备
Figure BDA0001262491160001051
在冰水浴中，向N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(56,50.0mg,0.0335mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入(2R)-2-羟基丙酸(3.01mg,0.0334mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,15.3mg,0.0402mmol mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺和N,N-二异丙基乙胺(l7.9uL,13.4mg,0.101mmol)中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌45分钟，然后在强氮气流下浓缩以得到粗制物(LC-MS m/z 1449.4[M+H+],保留时间＝0.90分钟)。然后将残余物通过反相色谱法(方法V)纯化以在冻干法以后提供29.6mg(60％)期望产物。LC-MS m/z 1349.4[M+H+],保留时间＝0.75分钟。分析型HPLC保留时间＝5.740分钟。
实施例42：N～2～-[(2S)-2,3-二羟基丙酰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(62)的制备
Figure BDA0001262491160001061
步骤1：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-[(2S)-2,3-二羟基丙酰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(61)的合成。在冰水浴中，向N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(56,50.0mg,0.0335mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入(2S)-2,3-二羟基丙酸y(4.02mg,0.0379mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,15.3mg,0.0402mmol mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺和N,N-二异丙基乙胺(l7.9uL,13.4mg,0.101mmol)中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌45分钟，然后在强氮气流下浓缩。然后将黄色残余物通过反相色谱法(方法U)纯化以在冻干法以后提供10.8mg(22％)期望产物。LC-MS m/z 1465.5[M+H+],保留时间＝0.89分钟。分析型HPLC保留时间＝6.607分钟。
步骤2：N～2～-[(2S)-2,3-二羟基丙酰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(62)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-[(2S)-2,3-二羟基丙酰基]-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(61,10.8mg,0.0074mmol)在1mL二氯甲烷中的混悬液中加入0.5mL三氟乙酸。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌20分钟。然后将反应物浓缩并通过反相色谱法(方法V)纯化以在冻干法以后提供3.6mg(33％)。LC-MS m/z 1365.4[M+H+]；保留时间＝0.74分钟。分析型HPLC保留时间＝5.749分钟。
实施例43：N～2～-(3-羟基丙酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(64)的制备
Figure BDA0001262491160001081
步骤1：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(3-羟基丙酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(63)的合成。在冰水浴中，向N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(56,50.0mg,0.0335mmol)在0.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入3-羟基丙酸(4.01mg,0.0445mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,15.3mg,0.0402mmol mmol)在0.1mL N,N-二甲基乙酰胺和N,N-二异丙基乙胺(l7.9uL,13.4mg,0.101mmol)中的溶液。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌45分钟，然后在强氮气流下浓缩。然后将黄色残余物通过反相色谱法(方法U)纯化以在冻干法以后提供13.9mg(29％)期望产物。LC-MS m/z 1449.6[M+H+],保留时间＝0.91分钟。分析型HPLC保留时间＝6.721分钟。
步骤2：N～2～-(3-羟基丙酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(64)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(3-羟基丙酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(63,13.9mg,0.0096mmol)在1mL二氯甲烷中的混悬液中加入0.5mL三氟乙酸。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌20分钟。然后将反应物浓缩并通过反相色谱法(方法V)纯化以在冻干法以后提供4.1mg(29％)。LC-MS m/z 1349.4[M+H+]；保留时间＝0.75分钟。分析型HPLC保留时间＝5.758分钟。
实施例44：N～2～-(甲基磺酰基)赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺,三氟乙酸盐(70)的制备
Figure BDA0001262491160001101
步骤1：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(甲基磺酰基)-L-赖氨酸甲酯(65)的合成。向冰冷的N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸甲酯(2.0g,6.73mmol)在四氢呋喃:水(1:1,20mL)中的溶液中加入碳酸钾(4.6g,33.7mmol)，随后逐滴加入甲磺酰氯(0.62mL,8.08mmol)。将混合物在室温搅拌3小时，并然后将混合物过滤。将滤液用乙酸乙酯萃取3次。将合并的萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物使用0％至2％的甲醇在二氯甲烷中的溶液的梯度洗脱通过硅胶色谱法纯化以提供2.0g(87％)作为无色油的期望产物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝5.23(d,J＝9.0Hz,1H),4.62(br.s.,1H),4.10(dt,J＝5.0,8.5Hz,1H),3.78(s,3H),3.16-3.04(m,2H),2.95(s,3H),1.88-1.78(m,2H),1.77-1.64(m,1H),1.59-1.47(m,3H),1.45(s,9H)。
步骤2：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(甲基磺酰基)-L-赖氨酸(66)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(甲基磺酰基)-L-赖氨酸甲酯(65,2.0g,5.90mmol)在四氢呋喃:水:甲醇(1:1:1,30mL)中的搅拌溶液中加入氢氧化锂一水合物(496mg,11.8mmol)。将混合物在室温搅拌3小时。将混合物在减压下浓缩。将剩余的水层用乙酸乙酯萃取2次。将水层用1N盐酸水溶液酸化至pH 3，并然后用异丙醇:乙酸乙酯(1:5)萃取2次。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩以提供1.3g(68％)作为白色固体的期望产物。MS m/z 323.1[M-H+]；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝6.40(br.s.,1H),5.81-5.66(m,1H),4.79(br.s.,1H),3.23-3.06(m,2H),2.99(s,3H),1.96-1.71(m,2H),1.55-1.39(m,13H)。
步骤3：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(甲基磺酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]鸟氨酰胺(67)的合成。向冰冷的N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(甲基磺酰基)-L-赖氨酸(66,1.0g,3.09mmol)和L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1,1.28g,3.40mmol)在20mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(600uL,438mg,3.40mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(649mg,3.40mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(459mg,3.40mmol)。将混合物温热至室温并搅拌16小时。然后将混合物逐滴加入到150mL叔丁基甲基醚中。将固体通过反相HPLC纯化。将含有产物的流分冻干以提供580mg(28％)作为白色固体的期望产物。
步骤4：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(甲基磺酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]鸟氨酰胺(68)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(甲基磺酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]鸟氨酰胺(67,580mg,0.85mmol)和碳酸对硝基苯酯(770mg,2.56mmol)在10mL N,N-二甲基甲酰胺中的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(451ul,330mg,2.56mmol)。将混合物在室温搅拌16小时。将混合物逐滴加入到150mL叔丁基甲基醚中。将固体通过反相HPLC(方法XXX)纯化。将含有产物的流分冻干以提供200mg(28％)作为白色固体的期望产物。MS m/z 851.4[M+H+].1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.16(s,1H),8.32(d,J＝9.5Hz,2H),8.26(d,J＝6.5Hz,1H),7.95(t,J＝7.4Hz,1H),7.65(d,J＝8.5Hz,2H),7.58(t,J＝5.9Hz,2H),7.45(d,J＝9.0Hz,1H),7.42(d,J＝8.5Hz,2H),6.79(t,J＝5.5Hz,1H),6.00(t,J＝5.8Hz,1H),5.45(s,2H),4.40(d,J＝5.0Hz,1H),4.33-4.06(m,1H),3.84(d,J＝4.5Hz,1H),3.30(br.s.,1H),3.09-2.99(m,1H),2.98-2.93(m,1H),2.93-2.86(m,2H),2.83(s,3H),2.01(d,J＝6.5Hz,1H),1.59(br.s.,3H),1.47(d,J＝13.1Hz,2H),1.38(s,13H),0.89(d,J＝7.0Hz,3H),0.85(d,J＝7.0Hz,3H)。
步骤5：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(甲基磺酰基)-D-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(69)的合成。向2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(4,52.0mg,0.070mmol)和N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(甲基磺酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]鸟氨酰胺(68,60.6mg,0.0710mmol)在2mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(31uL,28.3mg,0.264mmol)、N,N-二异丙基乙胺(46uL,34.1mg,0.264mmol)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(9mg,0.066mmol)。将混合物在45℃搅拌16小时。然后将反应物通过反相HPLC(方法S)纯化以在冻干法以后提供70mg(69％)作为白色固体的期望产物。LC-MS m/z1455.09[M+H+],1453.77[M-H+]；保留时间＝1.80分钟。
步骤6：N～2～-(甲基磺酰基)赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺,三氟乙酸盐(70)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(甲基磺酰基)-D-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(69,30mg,0.021mmol)在0.8mL二氯甲烷中的溶液中加入0.2mL三氟乙酸。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌30分钟。然后将溶液通过反相HPLC(方法B)直接纯化。将含有产物的流分冻干以在冻干法以后提供15mg(48％)。LC-MS m/z 1355.4[M+H+],1353.3[M-H+]；保留时间＝1.42分钟。
实施例45：N～2～-(苯磺酰基)赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺,三氟乙酸盐(75)的制备
Figure BDA0001262491160001141
步骤1：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(苯磺酰基)-L-赖氨酸(71)的合成。向冰冷的N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(3.0g,12.2mmol)在四氢呋喃:水(1:1,100mL)中的溶液中加入碳酸钾(8.4g,61.0mmol)，随后逐滴加入苯磺酰氯(1.86mL,14.6mmol)。将混合物在室温搅拌3小时，并然后将混合物过滤。将滤液用乙酸乙酯:异丙醇10:1萃取3次。将合并的萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。向残余物中加入100mL叔丁基甲基醚，并将混合物搅拌30分钟。将固体通过过滤收集并通过反相HPLC纯化。将含有产物的流分冻干以提供538mg(11％)作为白色固体的期望产物。MS m/z 408.9[M+Na+].1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.63-7.50(m,3H),3.61-3.53(m,1H),2.82-2.73(m,2H),1.61-1.40(m,2H),1.35(s,9H),1.28-1.06(m,4H)。
步骤2：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(苯磺酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]鸟氨酰胺(72)的合成。向冰冷的N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(苯磺酰基)-L-赖氨酸(71,1.2g,3.10mmol)和L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1,(1.30g,3.41mmol)在20mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(600uL,438mg,3.40mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(650mg,3.41mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(460mg,3.41mmol)。将混合物温热至室温并搅拌16小时。将混合物逐滴加入到150mL叔丁基甲基醚中。将固体通过过滤分离，并然后通过反相HPLC纯化。将含有产物的流分冻干以提供850mg(37％)作为白色固体的期望产物。
步骤3：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(苯磺酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]鸟氨酰胺(73)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(苯磺酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]鸟氨酰胺(72,850mg,1.14mmol)和碳酸对硝基苯酯(853mg,2.85mmol)在15mL N,N-二甲基甲酰胺中的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(501ul,365mg,2.85mmol)。将混合物在室温搅拌16小时。将混合物逐滴加入到150mL叔丁基甲基醚中。将固体通过反相HPLC纯化。将含有产物的流分冻干以提供450mg(43％)作为白色固体的期望产物。MS m/z 935.1[M+Na+]；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.11(s,1H),8.35-8.27(m,2H),8.10(d,J＝7.0Hz,1H),7.94(d,J＝8.5Hz,1H),7.83(d,J＝8.5Hz,1H),7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.63(d,J＝8.5Hz,2H),7.60-7.48(m,5H),7.40(t,J＝5.8Hz,2H),6.70(s,J＝5.6,5.6Hz,1H),6.01-5.93(m,1H),5.43(s,2H),4.36(d,J＝6.0Hz,1H),4.01(t,J＝7.5Hz,1H),3.78(d,J＝5.0Hz,1H),3.01(d,J＝6.0Hz,1H),2.97-2.88(m,1H),2.76(q,J＝6.5Hz,2H),1.86(d,J＝6.5Hz,1H),1.44(d,J＝5.5Hz,4H),1.41-1.40(m,1H),1.36(s,9H),1.31-1.13(m,3H),1.05(br.s.,1H),0.75(d,J＝7.0Hz,3H),0.73(d,J＝7.0Hz,3H)。
步骤4：N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(苯磺酰基)赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(74)的合成。向2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(4,52.0mg,0.070mmol)和N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(苯磺酰基)-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]鸟氨酰胺(73,60.4mg,0.066mmol)在2mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(31uL,28.3mg,0.264mmol)、N,N-二异丙基乙胺(46uL,34.1mg,0.264mmol)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(9mg,0.066mmol)。将混合物在45℃搅拌16小时。然后将反应物通过反相HPLC(方法S)纯化以在冻干法以后提供85mg(85％)作为白色固体的期望产物。LC-MS m/z1518.4[M+H+],1516.3[M-H+]；保留时间＝1.93分钟。
步骤5：N～2～-(苯磺酰基)赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺，三氟乙酸盐(75)的合成。向N～6～-(叔丁氧羰基)-N～2～-(苯磺酰基)赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(75,82mg,0.054mmol)在0.8mL二氯甲烷中的溶液中加入0.2mL三氟乙酸。将混合物通过LC-MS监测，并在室温搅拌30分钟。然后将溶液通过反相HPLC(方法B)直接纯化。将含有产物的流分冻干以在冻干法以后提供35mg(42％)。LC-MS m/z 1416.87[M+H+]；保留时间＝1.35分钟。
实施例46：N-乙酰基-O-(2-氨基乙基)-D-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺,三氟乙酸盐(83)的制备
Figure BDA0001262491160001171
步骤1：N-乙酰基-O-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)-L-丝氨酸甲酯(78)的合成。在-30℃向9H-芴-9-基甲基(2-羟基乙基)氨基甲酸酯(1000mg,3.53mmol)和(2S)-1-乙酰基氮杂环丙烷-2-甲酸甲酯(US 20110021482,758mg,5.29mmol)在20mL二氯甲烷中的混悬液中逐滴加入三氟化硼二乙基乙醚络合物(532uL,601mg,4.24mmol)。将混合物在该温度搅拌2小时，然后温热至室温。另外1小时以后，向反应物中加入饱和的碳酸氢钠水溶液并用二氯甲烷(80mL)稀释。将有机相分离，并用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过反相HPLC(方法W)纯化。将适当的流分合并，并将有机溶剂在减压下除去。将剩余的水性混合物用乙酸乙酯(2x100mL)萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物与二氯甲烷(50mL)一起共蒸发一次，得到作为浅黄色胶质的标题化合物160mg(11％)。MS m/z 448.9[M+Na+]；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.78(d,J＝7.5Hz,2H),7.60(d,J＝7.5Hz,2H),7.42(t,J＝7.5Hz,2H),7.37-7.31(m,2H),6.66(br.s.,1H),5.07(br.s.,1H),4.89-4.72(m,1H),4.45(d,J＝6.5Hz,2H),4.23(d,J＝6.5Hz,1H),3.88(d,J＝6.5Hz,1H),3.72(br.s.,4H),3.54(br.s.,2H),3.36(br.s.,2H),2.09(s,3H)。
步骤2：N-乙酰基-O-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)-L-丝氨酸(79)的合成。向N-乙酰基-O-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)-L-丝氨酸酯(78,160mg,0.375mmol)在异丙醇:水(7:3,10mL)中的溶液中加入氯化钙(833g,7.5mmol)。一旦混合物变澄清，加入氢氧化钠(18mg,0.450mmol)。将得到的混合物在室温搅拌3小时。然后将混合物用3M盐酸水溶液酸化至pH～1-2并用水(10mL)稀释。将混合物用乙酸乙酯(20mL)萃取，并将有机物分离和在减压下浓缩以除去大部分异丙醇。将水相用乙酸乙酯(2x100mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩以提供107mg(96％)作为蓝色固体的期望化合物，将其不经进一步纯化原样用在下一步中。MS m/z 434.8[M+Na+]；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.48(d,J＝9.0Hz,1H),7.78(d,J＝7.5Hz,2H),7.56(d,J＝7.5Hz,2H),7.47-7.37(m,2H),7.35-7.29(m,2H),7.15(t,J＝6.1Hz,1H),5.03(d,J＝9.0Hz,1H),4.51(dd,J＝6.8,10.8Hz,1H),4.41(dd,J＝7.0,10.5Hz,2H),4.30-4.23(m,1H),4.32-4.21(m,1H),4.21-4.09(m,1H),3.57(t,J＝8.3Hz,3H),3.53-3.45(m,2H),3.40(br.s.,1H),3.31(d,J＝9.0Hz,1H),2.00(s,3H)。
步骤3：N-乙酰基-O-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)-L-丝氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(80)的合成。向N-乙酰基-O-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)-L-丝氨酸(79,105mg,0.255mmol)和L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1,96.6mg,0.255mmol)在3mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)N,N,N′,N′四甲基脲鎓六氟磷酸盐(106mg,0.280mmol)，随后加入N,N二异丙基乙胺(98.7mg,0.764mmol)。将黄色澄清混合物在室温搅拌2小时。将混合物用叔丁基甲基醚(60mL)稀释并搅拌30分钟。将固体通过过滤分离，然后通过反相HPLC(方法X)纯化。将含有产物的流分冻干以提供84mg(43％)作为白色固体的期望产物。MS m/z 774.2[M+H+]。
步骤4：N-乙酰基-O-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)丝氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(81)的合成。向N-乙酰基-O-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)-L-丝氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(80,200mg,0.258mmol)和碳酸对硝基苯酯(853mg,2.85mmol)在5mL N,N-二甲基甲酰胺中的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(100.8ul,73.5mg,0.569mmol)。将混合物在室温搅拌3小时，然后加入更多的碳酸对硝基苯酯(78.6mg,0.258mmol)。另外1小时以后，将混合物逐滴加入到100mL叔丁基甲基醚中。将固体通过过滤分离，用一些叔丁基甲基醚洗涤以在风干以后提供180mg(74％)作为黄色固体的期望产物。MS m/z 939.2[M+H+]961.1[M+Na+]。
步骤5：N-乙酰基-O-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)-D-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(82)的合成。向2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(4,60.0mg,0.081mmol)和N-乙酰基-O-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)丝氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(81,121mg,0.188mmol)在2.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(37.4uL,34.6mg,0.323mmol)、N,N-二异丙基乙胺(42.2uL,31.3mg,0.242mmol)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(11.0mg,0.081mmol)。将混合物在45℃搅拌6小时。然后将反应物通过反相HPLC(方法G)纯化以在冻干法以后提供62mg(50％)作为白色固体的期望产物。LC-MS m/z 1543.3[M+H+]；保留时间＝2.25分钟。分析型HPLC保留时间＝7.435分钟。
步骤6：N-乙酰基-O-(2-氨基乙基)-D-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺，三氟乙酸盐(83)的合成。向N-乙酰基-O-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)-D-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(82,42mg,0.027mmol)在2.5mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入氢氧化锂水溶液(3.26mg,0.136mmol)，并将混合物在室温搅拌1小时。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法L)纯化。将含有产物的流分冻干以提供29mg(74％)期望产物。LC-MS m/z 1321.2[M+H+]；保留时间＝1.30分钟。分析型HPLC保留时间＝5.804分钟。
实施例47:N-乙酰基-O-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺,三氟乙酸盐(90)的制备
Figure BDA0001262491160001211
步骤1：N-乙酰基-O-[2-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]-L-丝氨酸甲酯(85)的合成。向9H-芴-9-基甲基[2-(2-羟基乙氧基)乙基]氨基甲酸酯(84,7.55g,23.1mmol)和(2S)-1-乙酰基氮杂环丙烷-2-甲酸甲酯(758mg,5.29mmol)在130mL二氯甲烷中的溶液中逐滴加入三氟化硼二乙基乙醚络合物(3.94mL,4.46g,31.4mmol)。1小时以后，向反应物中加入饱和的碳酸氢钠水溶液。将有机相分离，并用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过反相HPLC(方法Y)纯化。将适当的流分合并，并将有机溶剂在减压下除去。将剩余的水性混合物用二氯甲烷(2x100mL)萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩，得到作为无色油的标题化合物3.8g(26％)。MS m/z493.0[M+Na+]；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.77(d,J＝7.5Hz,2H),7.62(d,J＝7.0Hz,2H),7.44-7.37(m,2H),7.35-7.29(m,2H),6.69(d,J＝6.5Hz,1H),5.49(br.s.,1H),4.78(d,J＝8.0Hz,1H),4.42(d,J＝6.5Hz,2H),4.25(d,J＝7.0Hz,1H),3.95(d,J＝10.0Hz,1H),3.75(s,3H),3.66-3.50(m,6H),3.41(br.s.,2H),2.04(s,3H)。
步骤2：N-乙酰基-O-[2-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]-L-丝氨酸(86)的合成。向N-乙酰基-O-[2-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]-L-丝氨酸甲酯(85,3200mg,6.8mmol)在90mL异丙醇和40mL水中的溶液中加入氯化钙(15.1g,136mmol)。一旦混合物变澄清，加入氢氧化钠(326mg,8.16mmol)。2小时以后，然后将混合物用3M盐酸水溶液酸化至pH～1-2并用水(300mL)稀释。将混合物用乙酸乙酯(3x250mL)萃取，并将有机物分离和在减压下浓缩以提供3000mg(97％)作为白色固体的期望化合物，将其不经进一步纯化原样用在下一步中。MS m/z 456.9[M+H+]；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.77(d,J＝7.5Hz,2H),7.63-7.53(m,2H),7.44-7.38(m,2H),7.36-7.30(m,2H),6.65(d,J＝6.0Hz,1H),4.77(br.s.,1H),4.51(br.s.,1H),4.43(d,J＝6.5Hz,1H),4.26(d,J＝6.0Hz,1H),3.95(br.s.,1H),3.76(br.s.,1H),3.70-3.57(m,3H),3.54(d,J＝7.5Hz,2H),3.41(d,J＝13.1Hz,2H),3.29(br.s.,1H),2.05(br.s.,3H)。
步骤3：N-乙酰基-O-[2-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]-L-丝氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(87)的合成。向N-乙酰基-O-[2-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]-L-丝氨酸(86,3000mg,6.57mmol)在45mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)N,N,N′,N′四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,3000mg,7.89mmol)。20分钟以后，加入L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1,2490mg,6.57mmol)，随后加入N,N-二异丙基乙胺(2550mg,19.7mmol)。3小时以后，将混合物倒入叔丁基甲基醚(500mL)和石油醚(200mL)的混合物中并搅拌20分钟。将固体通过过滤分离，然后使用1％至20％的甲醇在二氯甲烷中的溶液的梯度洗脱通过硅胶色谱法纯化，以提供3100mg(58％)作为白色固体的期望产物。MS m/z 818.1[M+H+]。
步骤4：N-乙酰基-O-[2-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]-L-丝氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(88)的合成。向冰冷的N-乙酰基-O-[2-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]-L-丝氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(87,500mg,0.611mmol)和碳酸对硝基苯酯(279mg,0.917mmol)在6mL N,N-二甲基甲酰胺中的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(216.7ul,158mg,1.22mmol)。将混合物在室温搅拌5小时，然后再加入碳酸对硝基苯酯(100mg,0.538mmol)。另外12小时以后，将混合物倒入叔丁基甲基醚(60mL)和石油醚(20mL)的混合物中并搅拌15分钟。将固体通过过滤分离，然后使用1％至10％的甲醇在二氯甲烷中的溶液的梯度洗脱通过硅胶色谱法纯化，以提供300mg(50％)作为白色固体的期望产物。MS m/z 983.5[M+H+]。
步骤5：N-乙酰基-O-[2-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(89)的合成。向2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(4,60.0mg,0.081mmol)和N-乙酰基-O-[2-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]-L-丝氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(88,75.4mg,0.077mmol)在2.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(37.4uL,34.6mg,0.323mmol)、N,N-二异丙基乙胺(42.2uL,31.3mg,0.242mmol)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt,11.0mg,0.081mmol)。将混合物在45℃搅拌16小时。然后将反应物通过反相HPLC(方法G)纯化以在冻干法以后提供76mg(58％)作为白色固体的期望产物。LC-MS m/z 1587.3[M+H+]；保留时间＝2.26分钟。分析型HPLC保留时间＝7.459分钟。
步骤6：N-乙酰基-O-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺，三氟乙酸盐(90)的合成。向N-乙酰基-O-[2-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(89,40mg,0.025mmol)在2.5mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入氢氧化锂水溶液(3.02mg,0.126mmol)，并将混合物在室温搅拌30分钟。然后将溶液通过反相HPLC(方法D)纯化。将含有产物的流分冻干以提供27mg(72％)期望产物。LC-MSm/z 1365.2[M+H+]；保留时间＝1.26分钟。分析型HPLC保留时间＝5.768分钟。
实施例48：N～2～-(3-羟基丙酰基)-L-赖氨酰基缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺,三氟乙酸盐(97)的制备
Figure BDA0001262491160001251
步骤1：N-乙酰基-O-[1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19-六氧杂-4-氮杂二十一烷-21-基]-L-丝氨酸甲酯(92)的合成。向9H-芴-9-基甲基(17-羟基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基)氨基甲酸酯(91,7600mg,15.09mmol)和(2S)-1-乙酰基氮杂环丙烷-2-甲酸甲酯(4320mg,30.2mmol)在150mL二氯甲烷中的溶液中逐滴加入三氟化硼二乙基乙醚络合物(2.84mL,3210mg,22.6mmol)。2.5小时以后，将反应物用饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过反相HPLC(方法Z)纯化。将适当的流分合并，并将有机溶剂在减压下除去。将剩余的水性混合物用乙酸乙酯(2x100mL)萃取。将合并的萃取物经硫酸钠干燥并浓缩以得到作为油的标题化合物5g(51％)。MS m/z 647.1[M+H+]；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.61(d,J＝7.5Hz,2H),7.40(t,J＝7.5Hz,2H),7.31(t,J＝7.4Hz,2H),6.72(d,J＝7.5Hz,1H),5.47(br.s.,1H),4.73(td,J＝3.5,8.0Hz,1H),4.41(d,J＝7.0Hz,2H),4.26-4.19(m,1H),3.94(dd,J＝3.5,10.0Hz,1H),3.75(s,3H),3.70(dd,J＝3.5,10.0Hz,1H),3.67-3.56(m,22H),3.40(q,J＝5.2Hz,2H),2.07(s,3H)。
步骤2：N-乙酰基-O-[1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19-六氧杂-4-氮杂二十一烷-21-基]-L-丝氨酸(93)的合成。向N-乙酰基-O-[1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19-六氧杂-4-氮杂二十一烷-21-基]-L-丝氨酸甲酯(92,4200mg,6.49mmol)在异丙醇:水(7:3,170mL)中的溶液中加入氯化钙(14.4g,130mmol)。一旦混合物变澄清，加入氢氧化钠(312mg,7.79mmol)。将得到的混合物在室温搅拌3小时。然后将混合物用3M盐酸水溶液酸化至pH～1-2并用水(100mL)稀释。将混合物用乙酸乙酯(100mL)萃取，并将有机物分离和在减压下浓缩以除去大部分异丙醇。将水相用乙酸乙酯(2x100mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。然后将残余物使用0％至15％的甲醇在二氯甲烷中的溶液的梯度洗脱通过硅胶色谱法纯化以提供3.4g(83％)作为黄色油的期望化合物。MS m/z 633.1[M+H+]。
步骤3：N-乙酰基-O-[1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19-六氧杂-4-氮杂二十一烷-21-基]-L-丝氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(94)的合成。向冰冷的N-乙酰基-O-[1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19-六氧杂-4-氮杂二十一烷-21-基]-L-丝氨酸(93,1.20g,1.90mmol)和L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1,720mg,1.90mmol)在15mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入O-(7氮杂苯并三唑-1-基)N,N,N′,N′四甲基脲鎓六氟磷酸盐(794mg,2.09mmol)，随后加入N,N二异丙基乙胺(736mg,5.69mmol)。将黄色澄清混合物在室温搅拌2小时。将混合物用乙酸乙酯(3x30mL)稀释，用水(60mL)洗涤，并经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。然后将残余物使用0％至15％的甲醇在二氯甲烷中的溶液的梯度洗脱通过硅胶色谱法纯化以提供1.5g(80％)作为无色玻璃的期望产物。MS m/z 994.8[M+H+]。
步骤4：N-乙酰基-O-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(95)的合成。在冰浴中，向N-乙酰基-O-[1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19-六氧杂-4-氮杂二十一烷-21-基]-L-丝氨酰基缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(94,1.5g,1.5mmol)和碳酸对硝基苯酯(918mg,3.02mmol)在15mL N,N-二甲基甲酰胺中的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(402ul,293mg,2.26mmol)。将混合物在室温搅拌16小时，然后加入更多的碳酸对硝基苯酯(918mg,3.02mmol)。另外3小时以后，将混合物用乙酸乙酯(30mL)稀释，用水(40mL)洗涤。将水相用乙酸乙酯(30mL)萃取。将合并的有机层在减压下浓缩，然后使用0％至15％的甲醇在二氯甲烷中的溶液的梯度洗脱通过硅胶色谱法纯化，然后通过反相HPLC(方法AA)纯化，以在冻干法以后提供944mg(54％)作为白色固体的期望产物。MS m/z 1159.8[M+H+]。
步骤5：N-乙酰基-O-[1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19-六氧杂-4-氮杂二十一烷-21-基]-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(96)的合成。向2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(4,55.0mg,0.074mmol)和N-乙酰基-O-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(95,85.8mg,0.074mmol)在2.5mL N,N-二甲基乙酰胺中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(34.3uL,31.7mg,0.296mmol)、N,N-二异丙基乙胺(38.7uL,28.7mg,0.222mmol)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(10.1mg,0.074mmol)。将混合物在45℃搅拌6小时。然后将反应物通过反相HPLC(方法G)纯化以在冻干法以后提供90mg(69％)作为白色固体的期望产物。LC-MS m/z 1764.4[M+H+]；保留时间＝1.99分钟。分析型HPLC保留时间＝7.476分钟。
步骤6：N-乙酰基-O-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基)-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺，三氟乙酸盐(97)的合成。向N-乙酰基-O-[1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19-六氧杂-4-氮杂二十一烷-21-基]-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-丁-2-基]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5,5,10-三甲基-3,6,9-三氧代-8-(丙烷-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]苯基}-N～5～-氨甲酰基鸟氨酰胺(96,46mg,0.026mmol)在2.5mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入氢氧化锂水溶液(3.1mg,0.130mmol)，并将混合物在室温搅拌20分钟。然后将溶液浓缩并通过反相HPLC(方法D，然后方法H)纯化。将含有产物的流分冻干以提供15mg(35％)期望产物。LC-MS m/z 1542.2[M+H+]；保留时间＝1.41分钟。分析型HPLC保留时间＝5.836分钟。
使用上述缀合技术制备下述另外的ADC(连接在Trop2抗体的不同位置和不同标签上，如表2-7上所指示的)(带括号的部分指示谷氨酰胺残基，波浪线显示与抗-Trop2抗体的剩余部分的连接点)：
实施例49：
Figure BDA0001262491160001291
实施例50：
Figure BDA0001262491160001292
实施例51：
Figure BDA0001262491160001293
实施例52：
Figure BDA0001262491160001294
实施例53：
Figure BDA0001262491160001301
实施例54：
Figure BDA0001262491160001302
实施例55：
Figure BDA0001262491160001303
实施例56：
Figure BDA0001262491160001304
实施例57：
Figure BDA0001262491160001311
实施例58：
Figure BDA0001262491160001312
实施例59：
Figure BDA0001262491160001313
实施例60：
Figure BDA0001262491160001314
实施例61：
Figure BDA0001262491160001321
实施例62：
Figure BDA0001262491160001322
实施例63：
Figure BDA0001262491160001323
实施例64：
Figure BDA0001262491160001324
实施例65：
Figure BDA0001262491160001331
实施例66：
Figure BDA0001262491160001332
实施例67：
Figure BDA0001262491160001333
实施例68：
Figure BDA0001262491160001334
实施例69：
Figure BDA0001262491160001341
实施例70：
Figure BDA0001262491160001342
实施例71：
Figure BDA0001262491160001343
实施例72.小鼠羧酸酯酶1C作为负责血浆中的VC-PABC接头裂解的酶的证实
使用来自小鼠敲除品系C56/BL6 Ces1C-/-、杂合品系C56/BL6 Ces1C±和野生型品系C56/BL6 Ces1C+/+的血浆样品试验抗-Trop2 L11B-C6-VC-PABC-Aur0101缀合物的稳定性。将56ug ADC在补充了1x PBS的35％血浆中温育至0.125mg/mL的最终ADC浓度。温育18小时以后，使用标准方案使用与CNBr-活化的Sepharose(GE Healthcare)偶联的M1S1抗原分离ADC。使用HIC分析评估温育之前和之后的DAR值。将缀合物稳定性(％)计算为温育以后剩余的DAR的百分比。参见图3。
生物学数据
在实施例8-18中描述的操作中产生的稳定性数据总结在表2-7中。
表2–在小鼠中的体内缀合物稳定性
Figure BDA0001262491160001351
Figure BDA0001262491160001361
在小鼠中的体内缀合物稳定性。将从给药9mg/kg的动物纯化的缀合物的DAR值与体内暴露之前的DAR值进行对比。将以上稳定性值表示为给定的暴露时段(显示在括号中)以后剩余的DAR的百分比。
表3-在大鼠中的体内缀合物稳定性
Figure BDA0001262491160001362
Figure BDA0001262491160001371
在大鼠中的体内缀合物稳定性。将从给药9mg/kg的动物纯化的缀合物的DAR值与体内暴露之前的DAR值进行对比。将以上稳定性值表示为给定的暴露时段(显示在括号中)以后剩余的DAR的百分比。
表4-在小鼠血浆中的体外缀合物稳定性
Figure BDA0001262491160001372
Figure BDA0001262491160001381
Figure BDA0001262491160001391
Figure BDA0001262491160001401
在小鼠血浆中的体外缀合物稳定性。将血浆温育后纯化的缀合物的DAR值与血浆处理之前的DAR值进行对比。将以上稳定性值表示为给定的温育时段(显示在括号中)以后剩余的DAR的百分比。
表5-在大鼠血浆中的体外缀合物稳定性
Figure BDA0001262491160001402
Figure BDA0001262491160001411
在大鼠血浆中的体外缀合物稳定性。将血浆温育后纯化的缀合物的DAR值与血浆处理之前的DAR值进行对比。将以上稳定性值表示为给定的温育时段(显示在括号中)以后剩余的DAR的百分比。
表6–在食蟹猴血浆中的体外缀合物稳定性
Figure BDA0001262491160001412
Figure BDA0001262491160001421
在食蟹猴血浆中的体外缀合物稳定性。将血浆温育后纯化的缀合物的DAR值与血浆处理之前的DAR值进行对比。将以上稳定性值表示为给定的温育时段(显示在括号中)以后剩余的DAR的百分比。
表7A–具有计算的％稳定性的实验DAR值
通过使用HIC或质谱法分析评估与抗体连接的药物的数目，从而确定所有DAR值。将缀合物稳定性计算为在血浆中温育3天或4.5天以后剩余的DAR的百分比。
Figure BDA0001262491160001431
表7B–具有计算的％稳定性的另外的实验DAR值
通过使用HIC或质谱法分析评估与抗体连接的药物的数目，从而确定所有DAR值。将缀合物稳定性计算为在血浆中温育3天或4.5天以后剩余的DAR的百分比.
Figure BDA0001262491160001441
*如在WO2012/059882和WO2015/015448中所述生产。
表8–具有计算的％稳定性的另外的实验DAR值，与具有LCQ05含有谷氨酰胺的标签的Combo_Rd4_0.6nM_C29抗体缀合的接头-有效负载
缀合方法如本文中关于抗-Trop2抗体所述。Combo_Rd4_0.6nM_C29抗体是在美国临时专利申请号62/146,843中所述的抗-BCMA抗体。在SCID小鼠血浆中温育以后，根据标准方法使用MabSelect Protein A树脂(GE Healthcare)纯化化合物。通过使用HIC分析评估与抗体连接的药物的数目，从而确定所有DAR值。将缀合物稳定性计算为在SCID小鼠血浆中温育4.5天以后的剩余的DAR的百分比。
Figure BDA0001262491160001451
尽管已经参考各种应用、方法和组合物描述了公开的教导，但应当理解，可以在不背离本文中的教导和要求保护的发明的情况下做出多种变化和修改。提供了前述实施例来更好地举例说明公开的教导，且无意限制本文中呈现的教导的范围。尽管已经以这些示例性实施方案的方式描述了本教导，但技术人员会容易地明白，可以无需过多实验而进行这些示例性实施方案的众多变化和修改。所有这样的变化和修改是在本教导的范围内。
在本文中引用的所有参考文献(包括专利、专利申请、论文、教科书等)和其中引用的参考文献以其整体援引加入本文。在一篇或多篇援引加入的文献和类似的材料与本申请(包括但不限于限定的术语、术语用法、描述的技术等)不同或矛盾的情况下，以本申请为准。
之前的描述和实施例详述了本发明的某些具体实施方案，并描述了发明人考虑到的最佳模式。但是，应当明白，不论从文章可以看出多么详细的前述内容，本发明可以以许多方式实践，且本发明应当根据所附权利要求及其任何等同方案来解释。
序列表
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瑞纳神经科学公司
R·G·杜申
P·施特罗普
M·G·多里沃尔斯科
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<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 1
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1 5
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1
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<220>
<223> Synthetic Construct
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1 5
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1 5
<210> 5
<211> 5
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Gly Ser Pro Leu Ala Gln Ser His Gly Gly
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Gly Leu Leu Gln Gly Gly Gly
1 5
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1
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Leu Leu Gln Gly Ala
1 5
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1 5
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1 5
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Ser Leu Leu Gln Gly
1 5
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Leu Leu Gln Leu Gln
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<212> PRT
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<220>
<223> Synthetic Construct
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Leu Leu Gln Leu Leu Gln
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Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro
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Leu Leu Gln Gly Ala
1 5
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1 5
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Leu Leu Gln Pro
1
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<211> 6
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<223> Synthetic Construct
<400> 29
Leu Leu Gln Pro Gly Lys
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 30
Leu Leu Gln Ala Pro Gly Lys
1 5
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Construct
<400> 31
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1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 32
Leu Leu Gln Gly Ala Pro
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 33
Leu Leu Gln Gly Pro Ala
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 34
Leu Leu Gln Gly Pro Pro
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 35
Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 36
Leu Leu Gln Leu Gln Gly
1 5
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Leu, Ala, Gly, Ser, Val, Phe, Tyr, His, Arg, Asn, Glu,Asp,
Cys, Gln, Ile, Met, Pro, Thr, Lys, or Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Leu, Ala, Gly, Ser, Val, Phe, Tyr, His, Arg, Asn, Glu,Asp,
Cys, Gln, Ile, Met, Pro, Thr, Lys, or Trp
<400> 37
Xaa Xaa Gln Xaa
1

Claims (17)

1.式(I)的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure FDA0002751600380000011
其中：
M是稳定性调节剂，其中M是-M1-M2；
其中M1是-NR1-C(O)-、-NR1-S(O)2-或不存在；并且
M2选自：
Figure FDA0002751600380000021
P是包含一个或多个谷氨酰胺残基的肽序列；
Q是存在于P中的谷氨酰胺残基；
E各自独立地选自：-C(R1)2-、-O-C(R1)2-C(R1)2-和-C(R1)2-C(R1)2-O-，其中当E是-O-C(R1)2-C(R1)2-时，r至少是2；其中当E是-C(R1)2-C(R1)2-O-时，s至少是1；
R1各自独立地选自：H和C1-C6直链或支链烷基；
其中-Xm-Yn-是-X-Y-，并且其中X-Y选自Gly、β-Ala、Val-Cit、Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ala-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Val-Ala和Ala-Ala-Asn；
Z是PABC(对氨基苄基-氨甲酰基)；
p是0-2，q是0-10，r是0-2，且s是0-2，其中q+r+s＝2或更大；且
D是细胞毒素剂。
2.式(II)的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure FDA0002751600380000031
其中：
M是稳定性调节剂，其中M是-M1-M2；
其中M1是-NR1-C(O)-、-NR1-S(O)2-或不存在；并且
M2选自：
Figure FDA0002751600380000041
P是包含一个或多个谷氨酰胺残基的肽序列；
Q是存在于P中的所述谷氨酰胺残基之一；
E各自独立地选自：-C(R1)2-、-O-C(R1)2-C(R1)2-和-C(R1)2-C(R1)2-O-，其中当E是-O-C(R1)2-C(R1)2-时，r至少是2；其中当E是-C(R1)2-C(R1)2-O-时，s至少是1；
R1各自独立地选自：H和C1-C6直链或支链烷基；
其中-Xm-Yn-是-X-Y-，并且其中X-Y选自Gly、β-Ala、Val-Cit、Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ala-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Val-Ala和Ala-Ala-Asn；
Z是PABC(对氨基苄基-氨甲酰基)；
p是0-2，q是0-10，r是0-2，且s是0-2，其中q+r+s＝2或更大；且
D是细胞毒素剂。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中P是包含选自以下的氨基酸序列的肽：Q、LQG、LLQGG(SEQ ID NO:1)、LLQG(SEQ ID NO:2)、LSLSQG(SEQ ID NO:3)、GGGLLQGG(SEQ ID NO:4)、GLLQG(SEQ ID NO:5)、LLQ、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO:6)、GLLQGGG(SEQ IDNO:7)、GLLQGG(SEQ ID NO:8)、GLLQ(SEQ ID NO:9)、LLQLLQGA(SEQ ID NO:10)、LLQGA(SEQID NO:11)、LLQYQGA(SEQ ID NO:12)、LLQGSG(SEQ ID NO:13)、LLQYQG(SEQ ID NO:14)、LLQLLQG(SEQ ID NO:15)、SLLQG(SEQ ID NO:16)、LLQLQ(SEQ ID NO:17)、LLQLLQ(SEQ IDNO:18)、LLQGR(SEQ ID NO:19)、LLQGPP(SEQ ID NO:20)、LLQGPA(SEQ ID NO:21)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)、GGLLQGA(SEQ ID NO:23)、LLQGA(SEQ ID NO:24)、LLQGPGK(SEQ ID NO:25)、LLQGPG(SEQ ID NO:26)、LLQGP(SEQ ID NO:27)、LLQP(SEQ ID NO:28)、LLQPGK(SEQ IDNO:29)、LLQAPGK(SEQ ID NO:30)、LLQGAPG(SEQ ID NO:31)、LLQGAP(SEQ ID NO:32)、LLQGPA(SEQ ID NO:33)、LLQGPP(SEQ ID NO:34)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:35)、LLQLQG(SEQID NO:36)和XXQX(SEQ ID NO:37)，其中X是任意氨基酸。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中与缺少所述调节剂M的对应化合物相比，所述化合物的稳定性降低了5-50％。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中与缺少所述调节剂M的对应化合物相比，所述化合物的稳定性增加了5-50％。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中P选自：单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微抗体和抗体片段。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中所述抗体选自：曲妥珠单抗、曲妥珠单抗突变体、奥戈伏单抗、依屈洛单抗、西妥昔单抗、针对玻连蛋白受体(αvβ3)的人源化单克隆抗体、阿仑珠单抗、抗-HLA-DR抗体、131I Lym-1、抗-HLA-Dr10抗体、抗-cd33抗体、抗-cd22抗体、拉贝珠单抗、贝伐珠单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、帕木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、伊匹木单抗和吉妥珠单抗。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中Q各自独立地是所述肽序列P的内源性谷氨酰胺的残基，或者是在所述肽序列P上的工程化标签序列中提供的谷氨酰胺的残基。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中一个或多个Q是所述肽序列P的内源性谷氨酰胺的残基。
10.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中一个或多个Q是在所述肽序列P上的工程化标签序列中提供的谷氨酰胺的残基。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中一个或多个标签是单一的氨基酸谷氨酰胺。
12.式(III)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure FDA0002751600380000071
其中：
M是稳定性调节剂，其中M是-M1-M2；
其中M1是-NR1-C(O)-、-NR1-S(O)2-或不存在；并且
M2选自：
Figure FDA0002751600380000081
E各自独立地选自：-C(R1)2-、-O-C(R1)2-C(R1)2-和-C(R1)2-C(R1)2-O-，其中当E是-O-C(R1)2-C(R1)2-时，r至少是2；其中当E是-C(R1)2-C(R1)2-O-时，s至少是1；
R1各自选自：H和C1-C6直链或支链烷基；
其中-Xm-Yn-是-X-Y-，并且其中X-Y选自Gly、β-Ala、Val-Cit、Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ala-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Val-Ala和Ala-Ala-Asn；
Z是PABC(对氨基苄基-氨甲酰基)；
p是0-2，q是0-10，r是0-2，且s是0-2，其中q+r+s＝2或更大；且
D是细胞毒素剂。
13.根据权利要求1、2或12所述的化合物，其中所述细胞毒素剂D选自：蒽环类抗生素、耳他汀、spliceostatin、CBI/CPI二聚体、卡奇霉素、多卡米星、烯二炔、格尔德霉素、美坦辛、嘌呤霉素、紫杉烷、长春花生物碱、SN-38、tubulysin、哈米特林、喜树碱、考布他汀、多拉司他汀、二氢吲哚并-苯二氮
Figure FDA0002751600380000092
二聚体、吡咯并苯二氮
Figure FDA0002751600380000093
二聚体和普拉地内酯。
14.根据权利要求1、2或12所述的化合物，其中所述细胞毒素剂D是选自dolestatin、MMAD、MMAE、MMAF、PF-06380101、PF-06463377和PF-06456780的耳他汀。
15.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure FDA0002751600380000091
Figure FDA0002751600380000101
Figure FDA0002751600380000111
Figure FDA0002751600380000121
Figure FDA0002751600380000131
Figure FDA0002751600380000141
16.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure FDA0002751600380000142
Figure FDA0002751600380000151
Figure FDA0002751600380000161
Figure FDA0002751600380000171
Figure FDA0002751600380000181
Figure FDA0002751600380000191
Figure FDA0002751600380000201
其中所述化合物的带括号的部分代表肽序列内的谷氨酰胺残基。
17.合成式(II)的化合物的方法：
Figure FDA0002751600380000211
其中：
M是稳定性调节剂，其中M是-M1-M2；
其中M1是-NR1-C(O)-、-NR1-S(O)2-或不存在；并且
M2选自：
Figure FDA0002751600380000221
P是包含一个或多个谷氨酰胺残基的肽序列；
Q是存在于P中的所述谷氨酰胺残基之一；
E各自独立地选自：-C(R1)2-、-O-C(R1)2-C(R1)2-和-C(R1)2-C(R1)2-O-，其中当E是-O-C(R1)2-C(R1)2-时，r至少是2；其中当E是-C(R1)2-C(R1)2-O-时，s至少是1；
R1各自独立地选自：H和C1-C6直链或支链烷基；
其中-Xm-Yn-是-X-Y-，并且其中X-Y选自Gly、β-Ala、Val-Cit、Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ala-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Val-Ala和Ala-Ala-Asn；
Z是PABC(对氨基苄基-氨甲酰基)；
p是0-2，q是0-10，r是0-2，且s是0-2，其中q+r+s＝2或更大；且
D是细胞毒素剂；
所述方法包括下述步骤：
提供一定量的具有以下结构的第一化合物
Figure FDA0002751600380000231
提供一定量的包含掺入谷氨酰胺的肽序列的第二化合物；和，
在转谷氨酰胺酶的存在下使所述量的第一化合物和第二化合物反应。
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