JPH02183164A - 多標識抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明は免疫学的測定法において用いられる多標識抗体
に関する。

ｂ、従来技術及び発明が解決しようとする課題生体中に
存亡する微量な物質を測定する方法の一つとして、例え
ばエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）やラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）の免疫学的測定法は臨床検査におけ
る重要な位置を占めている。特にＥＩＡは特異性が高く
、放射性物質を使用せずに高感度で測定できるので近年
急速に発展している。高感度測定のために、ＥＩＡに用
いられる標識抗体の具備すべき要件としては、特異性、
ｌＩ相性が高く酵素活性が高いこと、さらに担体に対し
て非特異的吸着が少ないことがあげられる。なかでも酵
素活性は、高感度測定に最も直接的に関与する要件であ
り、高い酵素活性を得るためには標識抗体が、抗体一分
子当りの標識数が複数である多標識抗体であることが望
ましい。

かかる多標識抗体としては、従来、（１）グルタルアル
デヒド法、あるいは過ヨウ素該法（Ｊ、１ｓｔｏｃｈｅ
＋＋＋１ｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｎｉｓｔｒ
ｙ　　２２．　１０８４．　１９７４）によって得られ
る標識抗体、又（２）予め重合させた酵素で標識して得
られる標識抗体（特開昭８１−７３０６７号公報）が知
られている。しかしながら、（１）の多Ｗ識抗体の場合
には、重合物を含んだりして不均一な標識抗体であるた
め、前記標識抗体の要件の１つである非特異的吸着が大
きくなり、結果として高感度測定には不向きであった。

また（２）の多標識抗体の場合には、重合した酵素によ
って巨大分子が生成し、そのために（１）と同様に非特
異的吸着が大きくなり高感度測定に不向きであった。

一方、特開昭５８−１４９７００号公報には、抗体のＦ
ａｂ’フラグメント部分のＳＨ基とマレイミド基を介し
て酵素を標識して得られる。抗体：酵素の結合比が１＝
１の標識抗体の場合には標識抗体の重合体の生成が少く
、従って非特異的吸着が少く、高感度測定が可能である
旨の記載がなされている。

しかしながら、この標識抗体の場合でも、抗体当り１分
子の酵素しか結合していないため、高感度測定には実用
性の点で未だ十分なものとは言えなかった。

Ｃ１課題を解決するための手段 抗体のヒンジ部分には工ないし５本のジスルフィド結合
がありその数は動物の種や抗体のクラスやサブクラスに
より異なっている事が知られている。５ａＶａＳｔｉ　
ら（８ｉｏｃｈｅＩｉ、　Ｊ、、１２６．８３７．１９
７２　）はヒトＩ　ｇＧｘ　、Ｉ　ｇＧ２．Ｉ　ｇＧｓ
　、Ｉ　ｇＧｍではそれぞれ２，４，５．２ケのジスル
フィド結合があり、マウスＩ　ｇ　Ｇ！、　Ｉ　ｇ　Ｇ
ｚｌ、　Ｉ　ｇ　Ｇｌｂでは３．３．４ケのジスルフィ
ド結合があることを報告している０本発明者等はＦ　ａ
ｂ’フラグメントには２ケ以上のＳＨ基が存在すること
に着目し、鋭意研究した結果、Ｆａｂ’フラグメント−
分子当り標識物質が平均１．５分子以上標識されてなる
標識抗体が特異性、親和性に漬れ、高活性でかつ非特異
的吸着が少ないことを知見して本発明に到達した。

すなわち本発明は、抗体のＦａｂ’フラグメントの硫黄
原子を介して、￥Ｋｍ物質がＦａｂ’フラグメント−分
子当り平均１．５分子以上結合してなる（以下平均標識
量１，５という）多標識抗体、かがる多標識抗体の製造
法、かかる多標識抗体を用いる免疫学的測定方法、及び
かかる多標識抗体を標識抗体試薬として含む免疫学的測
定キットである。

本発明の多標識抗体において、抗体としてはポリクロー
ナル抗体又はモノクローナル抗体があげられるが、ヒン
ジ部分にジスルフィド結合が２ケ所以上ある抗体ならば
どの様な動物由来の物であっても構わない。

また本発明のＦａｂ’フラグメントは公知の方法。

例えばニソノフらの方法（＾ｒｃｈ、ａｉｏ、ｃｈｅｒ
ａ、８ｉ０１）ｈ’／Ｓ。

８９、２３０．１９６０）　、パームらの方法（Ｊ、Ｉ
ｎ＋１ｕｎｏｌ。

１３１　、２８９５．１９８３）によって抗体をペプシ
ン消化してＦ（ａｂ’）、フラグメントを得た後、メル
カプトエチルアミン等で還元処理することにより得る事
ができる。

本発明の標識物質としては酵素、螢光物質１発光物質な
どがあげられる。酵素としては、例えばリゾチーム、・
マレート・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォス
フェート・デヒドロゲナーゼ。

ペルオキシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ。

アルカリフォスファターゼ、ベータガラクトシダーゼな
ど：螢光物質としては、例えばフルオレセイン、ローダ
ミン、ウンベリフェロン、ランタニド・キレートなど；
発光物質としては例えばルミノール、アクリリジウム・
エステル、ルシフェリンなどがあげられる。なかでも好
ましくはアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ
などがあげられる。

標識物質のマレイミド化は公知の方法、例えばサクシン
イミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
カーボネー）　（ＳＭＣＣ）、スルホサクシンイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカミボネ
ート（スルホＳＭＣＣ）。

サクシンイミジルーメタマレイミドベンゾエート（ＭＢ
Ｓ）、ザクシンイミジル６−マレイミドヘキサノエート
（８ＭＣ３）など（石川栄治編「酵素免疫測定法」、医
学書院）により行うことができる。

本発明の多標識抗体は、前記抗体のＦａｂ”フラグメン
トとマレイミド化された標識物質とを反応させることに
よって製造される。

Ｆａｂ’　フラグメントとマレイミド化標識物質との反
応は一般に前記記載の方法（石川栄治絹「酵素免疫測定
法」、医学書院）２例えば反応温度４〜３０℃、Ｆａｂ
’　フラグメントとマレイミド化標識物質のモル比はｌ
：１１反応時間２０時間の条件に従うことができる。こ
の場合標識物質がＦａｂ’フラグメント−分子当り一分
子標識さたらの及び２分子以上標識された標識抗体の混
合物を得ることができる。かかる反応に際しては、反応
条件として反応温度２５℃以上とするか、あるいはＦａ
ｂ’フラグメントとマレイミド化１ｍ物質のモル比は１
：４以上、反応時間は２４時間以上で行うと収率よく多
標識抗体を得られるので好ましい、この様にして得られ
た多標識抗体は例えば、ゲルクロマトグラフィーを用い
て反応液より分離精製することができる０例えばゲルク
ロマトグラフィーの場合に用いられる担体としてはウル
トロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社）などがあげられるが、
ＴＳＫＧｅ　１Ｇ　−３０００３Ｗ　（東ソー）　、　
Ｄ　Ｉ′０Ｌ−２００（山村化学研究所）カラムなどを
用いたＨＰＬＣのほうが分離に優れているため好ましく
用いられる。この場合必ずしも一分子標識抗体と２分子
以上の多標識抗体とはきれいに分離することができない
場合もあるので、−分子標識抗体を少量含んだ抗体も本
発明の範囲である。

分離精製された該多標識抗体における標識物質の標識数
は、分子量の測定や吸光度、螢光強度、酵素活性などの
測定などにより求めることができる。たとえば、標識物
質がペルオキシダーゼの場合には、Ｆａｂ’フラグメン
トとペルオキシダーゼに由来する２８０ｎｉの吸光度と
、ペルオキシダーゼに由来する４０３ｎｍの吸光度を測
定することにより標識数を求めることができる。　　（
Ｅ、Ｉｓｈｉｋａｗａ　ｅｔａｔ、　Ｊ、Ｉｖ＋＋ｕｎ
ｏａｓｓａｙ、、　４　、２０９−３２７．（１９８３
）、　０２４３参照） 本発明の多標識抗体は平均標識量で１．５以上あれば、
本発明の測定の高感度化を達成できる。

１．５以下では酵素の結合量が少く活性が低いため、高
感度測定には向かない、好ましくは１．８以上である。

上限は特に限定しないが５までが好ましい。

反応を行う際の緩衝液としては反応を阻害しない限りど
の様なＭ′＃液でもよいが０．０１から０．５Ｍリン＠
緩衝液ＰＨ５，５〜８．０が好ましく用いられ、Ｆａｂ
’フラグメントの安定化のため１から１０ｍモル程度の
ＥＤＴＡを含めば更に良い。

本発明の多標識抗体はＦｃ部分を有してないため担体に
非特異的吸着が少なく、また標識物質を１．５分子以上
結合しているため高感度測定に有用である。またＦｃ部
分を有していないのでリュウマチ因子などの彰響も少な
いという性質を合わせ持つ免疫測定用の有用な試薬であ
る。

本発明の多標識抗体は標識抗体を用いる免疫測定法にお
いて広く用いることができる。そのような免疫学的測定
法としては例えば、ホルモン、ペプチド、その他生体成
分、例えばプラスミン・α２プラスミンインしビター複
合体、プロティンＣ１組織プラスミノーゲンアクチベー
ター・プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複
合体、トロンビン・アンチトロンビン■複合体、プロテ
ィンＳなどを測定対象物質とするものをあげることがで
きる。さらにエストロゲンレセプター、プロゲステロン
レセプターなどの組織染色など臨床検査１免疫測定法を
使う食品検査の領域で用いることができる。以下に参考
例と実施例により本発明を詳説する。

参考例１ 〈マウスモノクローナル抗体のＦａｂ’フラグメントの
作成〉 マウス抗ヒト組織ブラスミノーゲンアクチベーター抗体
（ＪＴＡ−１）の０．ＯＩＭ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液（ｌｓ
ｇ／ｍｌ）１０ｒａｌ（ＣＩＭ　　りｚンａ［ｌ１ｒｉ
（ｐＨ３，５）を少量ずつ加えてｐＨ３，７５とした。

この溶液にペプシンのクエン酸緩衝液溶液（１■／ｍｌ
）を０．２ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベーショ
ンした０反応液をｌＮＮａＯＨでＰＨ約６．０に調整し
たあと、限外ｒ過器（フィルトロンオメガセル：富士フ
ィルター社）にて約１ｍｌにまで濃縮し、ＨＰＬＯ（カ
ラムＴＳＫＧｅ　Ｉ　　Ｇ−３０００３Ｗ　（東ソー）
、溶１ＩＩＩ液りｎ＋ＭＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン緩＊
液ｐＨ６，０）により単離し、Ｆ　（ａｂ’）、　７ラ
グメント５．９　ａＪｒを得な。

このＦ（ａｈ’）２フラグメント５．９■を含有するリ
ン酸緩衝？ｌ！２．０１！１１に、０．１Ｍ２−メルカ
プトエチルアミンのリン酸ｕｉ街液溶液０．２ｍｌを加
え、３７℃で約９０分インキュベーションした。ＨＰＬ
Ｃ（上記粂件）によりＦａｂ’　フラグメントを５．３
■得た。

なおマウス抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター
抗体（ＪＴＡ−１）は、特願昭６３−８１３６７号（発
明の名称「プラスミノーゲンアクティベーターに対する
モノクローナル抗体」、出願日　昭和６３年４月４日）
に記載の方法で得られたものを用いた。具体的には、精
製したヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ｔ
ＰＡ）を抗原として、に６ｈｌｅｒとＨｉｌＳｔｅｉｎ
の方法により定法に従って得らなれ４種のモノクローナ
ル抗体のひとつであって、ｔＰＡのＨ鎖あるいはｔＰＡ
−プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡ
Ｉ）複合体を認識し、サブクラスＩ　ｇＧｌ　、にの性
質を有するものである。

参考例２ くマレイミド化ペルオキシダーゼの作製〉ペルオキシダ
ーゼ（東洋紡）　４０■の０６１Ｍリン酸緩衝液ｐ　Ｈ
７，０６Ｉ１１１に、サクシンイミジル４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサンカーボネートのジメチル
ホルムアミド溶液（３３、４＋＋＋ｇ　／　ｍｌ　）０
．５ｍｌを加え、３０℃で１時間撹拌した０反応液を遠
心分離したあとセファデックスＧ−２５カラム（溶出液
０．１Ｍリン＃Ｍ緩ｆｉｉｐＨ７，０）にてゲル沢過を
行いマレイミド化ペルオキシダーゼ３９■を得た。

実施例１ ＜Ｆａｂ’　フラグメント／ペルオキシダーゼ１：２結
合酵素標識抗体の作成〉 参考例１で得られＦａｂ’　フラグメント（１，０■）
と参考例２で得られたマレイミド化ペルオキシダーゼ（
３，２Ｍ）を２５℃で２４時間反応させてＴＳＫＧｅ　
ｌ　　Ｇ−３０００ＳＷによるＨＰＬＣ（溶ＨＨＯ４Ｏ
ＩＭ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ　）にて分離精製しなところ、分子
量約１３万の標識抗体が０．３５■得られた。得られた
ｌｌ識抗体の２８Ｇｎｒａと４Ｇ３ｎＩｍの吸光度より
Ｆａｂ’７ラグメントとペルオキシダーゼの結合比は１
：２であった。以下Ｆａｂ’　　　（ＨＲＰ）２と略記
する。

このＩ！識抗体の経時的な反応収率は第１図に示すよう
であうな。

また第１表に記載したようにＦａｂ’フラグメントとマ
レイミド化ペルオキシダーゼのモル比１反応温度をかえ
、上記と同様に反応させたところ標識抗体収率は第１表
の通りであった。

実施例２ 以下、Ｆａｂ’　−ＨＲＰと略記する。

＜Ｆａｂ’フラグメント／ペルオキシダーゼ１　：　１
．５結合酵素標識抗体の作成〉実施例１と同条件でＦａ
ｂ’フラグメントとマレイミド化ペルオキシダーゼを反
応させた。ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社）カラム
（溶ＭＨＯＡＭリン酸［衝液にて分離したところ、得ら
れた標識抗体の２８０ｎｎ＋と４０３ｎｉの吸光度より
Ｆａｂ’　７ラグメントとペルオキシダーゼの結合比は
１．５であった。以下、Ｆａｂ’　−（ＨＲＰ）ｔ、ｓ
と略記する。

比較例１ Ｆａｂ“フラグメント／ペルオキシダーゼ１対１結合酵
素標識抗体の作製 参考例１で得られたＦａｂ’フラグメント（１，ＯＬｌ
ｇ）と参考例２で得られたマレイミド化ペルオキシダー
ゼ（０゜８■）を４℃で２４時間反応させたＨＰＬＣで
精製しなところＦａｂ“フラグメントとペルオキシダー
ゼが１対１結合した分子量約９万の標識抗体が０．６１
■（Ｆａｂ’として）得られた。

実施例３ 〈組織プラスミノーゲンアクチベーター・プラスミノー
ゲンアクチベーターインヒビター複合体測定系への応用
〉 ａ、固定抗体の作成 ポリスチレンビーズ（積水化学６．３５ｗφ＃８０）を
マウス抗ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ター抗体（ＪＴＩ−４）の濃度２０μｔ／ｍｌの０．１
Ｍリン１１１ＦＭＮＦ液（ｐＨ９，（１）の溶液にいれ
４℃で２０時間静置した。

ビーズを０．ＯｆＭ　　Ｐ　Ｂ　Ｓで３回洗浄したあと
、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中に室温で２時間静置後、再
度０．０１Ｍ　　Ｐ　Ｂ　Ｓで３回洗浄し固定抗体を得
た。

なお、マウス抗しトブラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター抗体（ＪＴＩ−４）は、特願昭６３−８１３
６６号（発明の名称「プラスミノーゲンアクティベータ
ーインヒビターに対するモノクローナル抗体」、出願日
　昭和６３年４月４日）に記載された方法で得られたも
ので、具体的には、Ｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ　Ｊ、＾、ら
の方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５９　。

１４９１４−１４９２１（１９８４）　）に準じて得ら
れなブラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（Ｐ
ＡＩ）を抗原として、定法に従い得られた４種の抗体の
１つであり、より具体的にはＱｕｉｅＳｃｅｎｔＰ　Ａ
　Ｉ　。

ＳＤＳ活性化ＰＡＩ、ｔＰＡ−ＰＡＩ複合体のいずれに
も結合し、サブクラスＩｇＧ１．にでＰＡＩ中和活性を
有しないという性質を有するものである。

ｂ、検量線の作成 ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・プラスミノ
ーゲンアクチベーターインヒビター複合体を０．２５％
スキムミルクを含む０．０１Ｍ　　リン酸−０，５Ｍ　
　ＮａＣ１１１！衝液（ｐＨ７，２）で希釈して、２５
゜１２．５．６．２５．３．１２５　、　ＯｎＱ／　ｍ
ｌのスタンダード溶液を作成した。スタンダード溶液０
．３ｍｌと固定ビーズを小試験官にいれ３７℃で２時間
インキュベーションした０次に０．ＯＩＭ　　Ｐ　Ｂ　
Ｓ　−０，０５％ツイーン２０　（Ｐ　Ｈ７，２）で３
回洗浄した。実施例１゜２と比歓例１で得られたペルオ
キシダーゼ標識抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベー
ターインヒビター抗体Ｆａｂ’フラグメントを、Ｆａｂ
’フラグメント濃度として０．６μｔ／ＩＩ＋１となる
ように０．０１Ｍ　　ＰＢＳ−０，０５％ツイーン２０
　（ｐ　Ｈ７，２）で調整し、その標識抗体液０．３ｍ
ｌ加え３７℃で３０分間インキュベーションした。　０
．ＯＩＭ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ−０，０５％ツイーン２０で３
回洗浄し０．３ｏ１のペルオキシダーゼ用基質液（２，
５ｉＭ　　Ｈ，Ｏ□−０，０２５％　３，３°。

５．５°テトラメチルベンチジンを含む）を加え３７℃
で３０分間発色させ、ＩＮ−硫酸で発色を停止し、４５
０ｎｉでの吸光度を測定した。

その結果得られた検量線を第２図に示す。

第２図から実施例１で得られたペルオキシダーゼ多標識
抗体は比較例１で得られたペルオキシダーゼ標識抗体よ
りも約４倍の活性があること、実施例２で得られた多標
識抗体の場合には約２倍の活性があることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｆａｂ’フラグメントとマレイミド化プベル
オキシダーゼをモル比１：４，２５℃で反応させたとき
の時間経過反応収率を示す。 第２図は、Ｆａｂ’−ＨＲＰ、Ｆａｂ’　−（ＨＲＰ）
１６．とＦａｂ’　＋　（ＨＲＰ）ｔを標識抗体として
用いた場合のヒト組織プラスミノーゲン・アクチベータ
ー・プラスミノーゲンアクチベーターインしビター（ｔ
ＰＡ−ＰＡＩ）複合体測定における検量線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗体のＦａｂ′フラグメントの硫黄原子を介して、
   該Ｆａｂ′フラグメント−分子当り標識物質が平均１．
   ５分子以上結合してなる多標識抗体。 ２、標識物質が酵素、螢光物質、発光物質である請求項
   １記載の多標識抗体。 ３、標識物質がペルオキシダーゼである請求項１記載の
   多標識抗体。 ４、抗体のＦａｂ′フラグメントとマレイミド化標識物
   質を反応させることを特徴とする請求項１記載の多標識
   抗体の製造法。 ５、請求項１記載の多標識抗体を用いる免疫学的測定法
   。 ６、請求項１記載の多標識抗体を標識抗体試薬として含
   む免疫学的測定キット。