FI89983C

FI89983C - Biologiskt diagnostiskt analyseringssystem och foerfarande

Info

Publication number: FI89983C
Application number: FI884470A
Authority: FI
Inventors: Saul G Cohen; Shai Inbar
Original assignee: Pb Diagnostic Systems Inc
Priority date: 1987-05-21
Filing date: 1988-09-29
Publication date: 1993-12-10
Also published as: ES2032535T3; ZA882199B; US5102786A; WO1988009505A1; DE3870035D1; ATE75049T1; EP0293971B1; AU603206B2; JPH0692968B2; CA1309339C; AU1490688A; DK18589A; DK18589D0; FI884470A; JPH02501500A; FI884470A0; EP0293971A1; FI89983B

Description

89983

Biologinen diagnostinen analysointijärjestelmä ja menetelmä Tämä keksintö koskee analyysejä biologisesti aktii-5 visten aineosien määrittämiseksi biologisista nesteistä, kuten kokoverestä, plasmasta tai seerumista.

Monia analyysielementtejä biologisten nesteiden sisältämien analysoitavien aineosien määrittämiseksi nopeasti tunnetaan tällä alalla. Erityisen kiinnostavia ovat 10 sellaiset, joilla kyetään analysoimaan kokoverinäytteitä, koska ne tekevät tarpeettomaksi erottaa ensin verisolut plasmasta esimerkiksi sentrifugoimalla tai uuttamalla. Tunnetaan kuivia monikerroksisia analyysielementtejä, joihin näyte, esimerkiksi pisara kokoverta, laitetaan ja 15 joissa solut (punasolut, valkosolut) erotetaan plasmasta suodatinelementin avulla, ja plasma, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevan analysoitavan aineosan, kulkeutuu sitten reagenssikerrokseen tai -kerroksiin. Läsnä olevien analysoitavien aineosan ja reagenssin reagenssien vä-20 lisen vuorovaikutuksen tuloksena elementissä tapahtuu todettavissa oleva muutos, joka vastaa analysoitavan aineosan esiintymistä. Kyseinen, todettavissa oleva muutos voi olla värin muuttuminen, joka voidaan arvioida silmämääräisesti tai määrittää spektrofotometrisesti, esimerkiksi :.25 densitometrillä. Toisessa järjestelmässä, joka perustuu fluoresoivalla aineella leimattujen, biologisesti aktiivisten aineosien läsnäoloon, voidaan synnyttää fluoresens-siemissiosignaali ja lukea se spektrofluorofotometrillä.

Tarkkojen ja toistettavissa olevien tulosten saami-30 seksi analyysielementeillä yleensä, ja erityisesti sellaisilla, joissa käytetään kokoveri- tai plasmanäytettä, on olennaista, että kiinnostuksen kohteena olevat analysoitavat aineosat ja reagenssi(t) voidaan saada osallistumaan vuorovaikutukseen/vuorovaikutuksiin, joka/jotka saa(vat) 35 aikaan kyseisen todettavissa olevan muutoksen. Ikävä kyllä 2 Γ* !*> t-'' VS -y b j ö 3 väriaineet, kuten fluoreseiini, rodamiinit jne., ja erilaiset biologisesti aktiiviset yhdisteet, erityisesti lääkeaineet, jotka ovat "pieniä molekyylejä", joiden moolimassa on korkeintaan 2 000, esimerkiksi fenobarbitaali ja 5 fenytoiini, sekä hormonit, kuten tyroksiini (T4), sitoutuvat kuitenkin plasman proteiineihin. Näiden yhdisteiden affiniteetti plasman proteiineihin voi luonnollisesti vaikuttaa haitallisesti saatavien tulosten tarkkuuteen, erityisesti näytteen ollessa laimentamaton. Niinpä, kun ky-10 seisiä yhdisteitä esiintyy alusta alkaen kokoveri- tai plasmanäytteessä, ne ovat muodostaneet komplekseja plasman proteiinien kanssa ja on syrjäytettävä tai saatava disso-sioitumaan analyyttisesti merkittävässä määrin, niin että voidaan määrittää tuloksena oleva vapaiden, biologisesti 15 aktiivisten aineosien kokonaismäärä. Väriaineiden, väriainekon jugaattien ja muiden sellaisten yhdisteiden, joita käytetään reagensseina analysoinnissa, tapauksessa on välttämätöntä joko estää niitä sitoutumasta plasman proteiineihin, tai, jos ne ovat sitoutuneet, syrjäyttää tai 20 dissosioida ne.

Monenlaisia yhdisteitä on tuotu esiin käyttökelpoisina tähän tarkoitukseen immunologisissa määrityksissä. US-patenttijulkaisu 3 911 096 käsittelee erilaisia aineita, joiden mainitaan olevan käyttökelpoisia estävinä ai-25 neina T4:n tapauksessa ja joihin kuuluvat esimerkiksi 8-anilino-l-naftaleenisulfonihappo(ANS), naftaleenisulfo-nihappo, 2,4,6-trinitrobentseenisulfonihappo (TNBS) sekä muita. US-patenttijulkaisu 3 928 553 käsittelee erilaisia trijodityroniinin ja tyroksiinin sitoutumista estäviä ai-30 neita, kuten barbituurihappoa ja sen johdannaisia, salisy-laatteja sekä natriumdietyylimalonyyliureaa. US-patentti-julkaisu 4 622 293 käsittelee 2-hydroksi-4-metoksibentso-fenoni-5-sulfonihapon (HMS) käyttöä estävänä aineena jodi-tyraniinimäärityksissä.

3 O r\ O C 7 ; · y j 5

Tunnetut estävät aineet eivät ole kaikissa tapauksissa tyydyttäviä. Näillä aineilla tulisi mielellään olla monia erilaisia ominaisuuksia, jotta ne toimisivat tehokkaasti. Estävän tai syrjäyttävän aineen ei esimerkiksi 5 tulisi häiritä sitä sitoutumisparin spesifistä vuorovaikutusta, jota käytetään hyväksi todettavan signaalin aikaansaamisessa. Lisäksi määrityksissä, joissa analysoitava aine leimataan fluoresoivalla aineella ja synnytetään fluoresenssiemissiosignaali, estävä tai syrjäyttävä aine 10 ei saisi itse fluoresoida merkittävästi, tai, kun se on kompleksoitunut plasman proteiinien kanssa, samoissa eksi-taatio- ja emissiorajoissa kuin fluoresoiva leimausaine. Ne eivät lisäksi saisi tukehduttaa leimausaineen fluoresenssia. Niinpä kaivataan edelleen estäviä tai syrjäyttä-15 viä aineita, joita voidaan käyttää diagnostisissa analyyseissä niiden vaikuttamatta haitallisesti analyysien tarkkuuteen.

Tämä keksintö koskee diagnostista analysointijärjestelmää, jossa käytetään estävinä ja/tai syrjäyttävinä 20 aineina l-fenoksinaftaleeni-8-sulfonihappoa (PNS) ja sen suoloja. PNS vastaa kaavaa 0 o so3h 30

Keksinnön mukaiselle tuotteelle ja menetelmälle on 35 tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.

4 ·, /*, ·\ λ *7 ' ✓ ij ο

On todettu, että PNS:a ja sen suoloja voi olla mukana analyyseissä pitoisuuksina, jotka ovat tehokkaita estämään määrityskomponenttien sitoutumista plasman proteiineihin ja/tai syrjäyttämään joko alunperin sitoutuneet 5 komponentit analyyttisesti merkittävässä määrin, tyypillisesti yli 50-%risesti ja edullisesti yli 75-%risesti, häiritsemättä samalla mitenkään merkittävästi määrityksen tarkkuutta. PNS on havaittu tehokkaaksi estämään plasman proteiinien sitoutumista sellaisiin komponentteihin tai 10 syrjäyttämään jo alunperin sitoutuneet proteiinit sellaisista komponenteista kuin väriaineet, joita käytetään analysoitavien aineosien leimausaineina, esimerkiksi fluore-seiinit, rodamiinit jne.; sellaisten väriaineiden ja biologisesti aktiivisten aineosien väliset konjugaatit; lää-15 keaineet, kuten fenobarbitaali ja fenytoiini; sekä hormonit, kuten tyroksiini (T4 ). Lisäksi PNSr11a ei pitoisuuksina, joita näiden tehtävien toteuttamiseksi vaaditaan, esiinny merkittävää fluoresenssia liuoksessa eikä se tukahduta merkittävässä määrin sellaisten väriaineiden fluo-20 resenssia liuoksessa. PNSr11a esiintyy hydroksietyylipi-peratsiinietyylisulfonaattipuskurissa (HEPES-puskurissa; pH 7,2) absorptiohuippu aallonpituudella 304 nm (E = 3,5 x 103). Samassa puskurissa PNS;11a esiintyy emissio-huippu aallonpituudella 414 nm (eksitaatio aallonpituudel-25 la 290 nm) ja sen fluoresenssikvanttituotto (Q£) on 0,54 etanolissa.

Vaadittava fenoksyylisubstituoitujen naftaleeniyh-disteiden ja niiden suolojen määrä eri määrityksissä vaih-telee ja on riippuvainen sellaisista seikoista kuin se ni-30 menomainen aineosa, joka on määrityksen kohteena, analysoitavan aineosan määrä näytteessä, muut määritysreaktioi-hin osallistuvat aineosat jne. Sen määrittämiseksi, mikä on tehokas määrä johonkin tiettyyn analyysiin, voidaan käyttää rutiininomaisia, liikkumarajojen selvittämiseen 35 tarkoitettuja testejä. Tyypillisesti fenoksyylisubstituoi- 5 89 9 83 tua naftaleeniyhdistettä vaaditaan noin 0,05 - 2 paino-% reagoivien aineiden kokonaismäärästä.

Fenoksyylisubstituoidut naftaleeniyhdisteet ja niiden suolat ovat vesiliukoisia vaadittavina pitoisuuksina 5 siinä pHrssa, jossa analyysit tehdään. Esimerkiksi hyvin alhaisessa pH:ssa, ts. arvoa 3 alemmassa pH:ssa, PNS pro-tonoituu ja saostuu liuoksesta. Immunologiset analyysit tehdään tyypillisesti arvoa 3 korkeammassa pH:ssa, edullisesti pH-alueella 6-8. Kiinnostuksen kohteena olevalla 10 pH-alueella PNS liukenee veteen vaadittavina pitoisuuksina.

Tämän keksinnön piiriin kuuluu fenoksyylisubstitu-oitujen naftaleeniyhdisteiden ja niiden suolojen käyttö biologisissa diagnostisissa analyyseissä yleisesti. Eräs 15 edullinen suoritusmuoto koskee immunologisia analyysejä, joissa käytetään hyväksi näitä yhdisteitä ja niiden suoloja, ts. analyysejä, jotka perustuvat antigeenin ja vasta-aineen välisiin vuorovaikutuksiin. Sellaisia antigeenejä ovat antigeenit, joiden moolimassa on noin 100 - 2 000, 20 tyypillisemmin noin 125 - 1 000, esimerkiksi lääkeaineet, kuten alkaloidit, steroidit, bentsoheterosykliset yhdisteet, puriinit jne. Vasta-aineet voivat olla polyklonaali-sia tai monoklonaalisia vasta-aineita tai niiden fragmentteja. Määritykset voidaan tehdä tavanomaisella "märkätek-25 niikalla" tai "kuivaa" analyysielementtiä, joka voi olla monikerroksinen, käyttäen. Sellaiset kuivat analyysiele-mentit ovat tällä alalla tunnettuja ja siksi niitä ei ole tarpeen käsitellä tässä laajasti. Nämä analyysielementit voidaan valmistaa yhdestä ainoasta kerroksesta nestettä 30 läpäisevää matriksimateriaalia, kuten esimerkiksi huokoisuudeltaan suurin piirtein tasaisesta kalvosta, johon on ainakin osaan dispergoitu diagnoosireagenssikoostumusta. US-patenttijulkaisussa 3 607 093 on esitetty eräs tämän tyyppinen analyysielementti. Vaihtoehtoisesti sellaiset 35 analyysielementit voivat koostua useista kerroksista, eri - Ö9983 o kerroksilla ollessa yksi tai useampia tehtäviä. US-patent-tijulkaisussa 3 368 872 on esimerkiksi esitetty monikerroksinen analyysielementti, joka sisältää huokoisen nauhan näytteen vastaanottoa varten, biologisten nesteiden analy-5 sointiin. Tämä vastaanottava kerros on järjestetty testi-kerroksen päälle. Näyte, joka voi olla veripisara, asetetaan huokoiselle vastaanottonauhalle, jonka tehtävänä on levittää tai jakaa näyte tasaisesti yli reagenssikerrok-sen. US-patenttijulkaisussa 3 723 064 on myös esitetty mo-10 nikerroksinen analysointiväline, joka sisältää huokoisen kerroksen näytteen vastaanottoa varten. Huokoinen materiaali on huokoisuudeltaan tasainen, mikä mahdollistaa ka-pillaarisen kulkeutumisen tutkittavan nesteen aineosien tasaisen jakaantumisen saavuttamiseksi ennen niiden siir-15 tyrnistä seuraavana sijaitsevaan reagenssikerrokseen. Tämän keksinnön mukaiset monikerroksiset elementit sisältävät siis edullisesti kerroksen tai muun välineen, joka kykenee ottamaan vastaan tutkittavan nestepisaran ja saamaan aikaan tutkittavan nesteen aineosien tasaisen jakaantumisen 20 reagenssikerrokselle. Toisessa suoritusmuodossa analyysi- elementti voi sisältää suodatinelementin solujen (punasolujen, valkosolujen jne.) tai muiden häiritsevien aineosien poistamiseksi nesteestä.

Keksinnön mukaiset analyysielementit voivat sisäl-25 tää useita reagenssikerroksia, joista kukin sisältää jotakin reagenssia, joka ottaa osaa elementissä käytettävään signaalin synnytysjärjestelmään. Niihin saattaa myös olla sisällytetty erilaisia muita kerroksia, kuten esimerkiksi kerros, joka on mukautunut ottamaan vastaan diffundoitu-: 30 van, signaalin aikaansaavan aineosan, joka muodostuu tapahtuvien reaktioiden tai vuorovaikutusten tuloksena, tai nestettä läpäisevä, valolta suojaava kerros, joka on järjestetty elementtiin sopivalla tavalla elementissä syntyvän signaalin detektion helpottamiseksi. Fenoksyylisubsti-35 tuoitu naftaleeniyhdiste voidaan sisällyttää mihin tahansa 7 ΰ 9 9 S 3 sopivaan näiden analyysielementtien kerrokseen. Monikerroksisissa elementeissä, jotka sisältävät suodatinelemen-tin ja/tai kerroksen näytteen levittämiseksi tai jakamiseksi, yhdiste on edullista sisällyttää suodatinkerrokseen 5 tai näytteenlevityskerrokseen.

Tämän keksinnön piiriin kuuluu jokainen biologinen diagnostinen määritysmenetelmä jonkin biologisen nesteen aineosan analysoimiseksi. Edullisia menetelmiä ovat antigeenin ja vasta-aineen välisiin vuorovaikutuksiin perustulo vat immunologiset määritykset, mm. kompetitiiviset analyy sit, sekä kaikentyyppiset immunometriset ja kerrosanalyy-sit. Näihin immunologisiin analyyseihin liittyy tyypillisesti leimattu reagenssi. Sellaisissa analyyseissä voidaan käyttää hyväksi mitä tahansa kemiallista vuorovaikutusta, 15 joka saa aikaan muutoksen joko leimatun reagenssin leimassa tai reagenssissa, joka reagoi leimausaineen kanssa aiheuttaen säteilyemission muuttumisen, todettavissa olevan signaalin aikaansaamiseksi. Voidaan esimerkiksi käyttää hyväksi mitä tahansa fluoresenssin, kemiluminenssin tai 20 värin muutosta tai muuta muutosta näkyvän alueen tai lähellä näkyvää aluetta olevan alueen säteilyssä. Sellaisissa immunologisissa analyyseissä hyväksi käytettävä leima voi siis olla suoraan tai epäsuorasti todettavissa. Leima voi olla fluorofori, kromofori, kemiluminofori, fosfori 25 tai entsyymi. Ollessaan entsyymi leimausaine voi olla sellainen, joka vaikuttaa substraattiin aiheuttaen absorption muutoksen, kun substraatti on kromogeeni; fluoresenssin muutoksen, kun substraatti on fluorofori; kemiluminenssin muutoksen, kun substraatti on jokin kerniluminesoiva esias-30 te; tai fosforesenssin muutoksen, kun substraatti on fosfori .

Keksintöä kuvataan nyt yksityiskohtaisemmin esimerkein, määrättyjä edullisia suoritusmuotoja käsitellen.

8 39983

Esimerkki I

Fenobarbitaalin syrjäytys plasman proteiineista Ihmisen plasmasta valmistettiin liuokset, jotka sisälsivät 0 (vertailuliuos), 0,02, 0,05, 0,2 ja 0,5 % 5 PNS:a, ja kuhunkin niistä lisättiin 0,1 % pinta-aktiivista ainetta, TweerP 20 (Rohm and Haas). Valmistettiin myös radioaktiivisella tritiumilla leimatun etyyli-5-fenyylibar-bituurihapon, 5-[‘3H(G)] (New England Nuclear), 50 mM HEPES-puskuriliuos.

10 Kuhunkin PNS-plasmaliuokseen lisättiin fenobarbi- taaliliuosta (10 μΐ), ja niitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti. Sen jälkeen liuokset suodatettiin sentri-fugoimalla (5 000 x g) Centricon PM 10 -suodattimen (Ami-con Corp.) läpi, joka päästää lävitseen ainoastaan mole-15 kyylit, joiden moolimassa on alle 10 000. Proteiineihin sitoutunut fenobarbitaali ei siten läpäise suodatinta. Kukin suodos (25 pl) laimennettiin 10 ml:11a BIOFLUOR-tui-kenestettä, ja radioaktiivisuus laskettiin Scinti Vers^' BIO-HP -laitteella (Fisher Scientific). Tulokset on esi-20 tetty taulukossa I.

Taulukko I

PNS-pitoisuus Fenobarbitaalimäärä (5) (±3 %) 25 (% plasmassa) (suodattimen läpäissyt) 0 55,5 0,02 62,7 0,05 71,1 0,2 93,0 30 0,5 97,0

Voidaan havaita, että noin 45 % fenobarbitaalin kokonaismäärästä oli sitoutunut plasman proteiineihin eikä läpäissyt suodatinta. Tulokset osoittavat, että PNS erotti 35 fenobarbitaalin tehokkaasti plasman proteiineista ja että optimidissosiaatio saavutettiin 0,5 %:lla PNS:a.

9 09983

Esimerkki II

Sulforodamiini 101:n syrjäytys ihmisen seerumin albumiinista (HSA)

Valmistettiin kaksi sarjaa vesiliuoksia, jotka si-5 söisivät 1,05 x 10*5 mol sulforodamiini 101:tä/litra HEPES-puskuria ja joissa HSA:n määrä vaihteli. Toinen sarja (vertailusarja) ei sisältänyt lainkaan PNS:a ja toinen sisälsi 0,2 % PNS:a. Liuokset suodatettiin sentrifugoimal-la (5 000 x g) Centricon 30 -suodattimen läpi, ja suodok-10 set tutkittiin aallonpituudella 586 nm Perkin Elmer ^9 -spektrofotometrillä. Suodosten sisältämät sulforodamiini 101 -määrät on esitetty taulukossa II.

Taulukko II

15 HSA:n määrä Sulforodamiini 101:n määrä (%) (%) (suodattimen läpäissyt)

Vertailu 0,2 % PNS:a 0 100 100 20 0,032 83 99 0,064 50 94 0,13 32 88 0,16 23 83 0,32 10 68 25 0,48 6 61

Voidaan havaita, että PNS oli hyvin tehokas vapaan sulforodamiini 101:n aikaansaannissa.

Esimerkki III

30 Teofylliini-rodamiinikonjugaatin syrjäytys plasman proteiineista Tämä koe tehtiin konjugaatilla, joka vastaa kaavaa 10 8 9 9 63 0 «

HO,S(CH., ) -HNCCH, CH^CNH(CH ) 2S03H

3 i i ! £ \ * i. c. j cbeeo o

o 0 H

i, ° f \ Il /N~i^ n-ch3 (o) 10 ^ CH3

Koe tehtiin konjugaatilla (1,0 κ 10'5 M), joka oli liuotettu ihmisen plasman HEPES-puskuriliuoksiin. Toinen sarja (vertailusarja) ei sisältänyt lainkaan PNS:a ja toi-15 nen sisälsi 0,2 % PNS:a. Liuokset suodatettiin sentrifu-goimalla (5 000 x g) Centricon 30 -suodattimen läpi, ja suodokset tutkittiin Perkin Elmer λ9 -spektrofotometrillä aallonpituudella 500 - 600 nm. Vapaan konjugaatin määrät suodoksissa on esitetty taulukossa III.

20

Taulukko III

Plasman määrä (%) Konjugaatin määrä (%)

Vertailu 0,2% PNS

25 95 50 90 -- 86 85 57 75 -- 89 65 66 30 60 -- 87 45 70 40 -- 88 20 82 94 5 93 35 0 100 100 s 9 9 R 3 n

Voidaan havaita, että PNS oli hyvin tehokas vapaan konjugaatin aikaansaannissa. Lisäksi, koska plasma sisältää noin 4 % HSArta, on vertailuliuoksilla saatujen tulosten perusteella ilmeistä, että konjugaatti sitoutui plas-5 man muihin komponentteihin ja että PNS oli tehokas sellaisen sitoutumisen estämisessä ja/tai sitoutuneen konjugaatin syrjäyttämisessä.

Esimerkki IV

Fluoreseiinin ja fluoreseiini-teofylliinikonjugaa-10 tin syrjäytys HSA:sta

Kokeet tehtiin erikseen HEPES-puskuriin liuotetulla fluoreseiinilla ja fluoreseiini-teofylliinikonjugaatilla, liuosten sisältäessä erilaisia määriä HSA:ta. Toinen liuossarja (vertailusarja) ei sisältänyt lainkaan PNS:a ja 15 toinen sisälsi 0,2 % PNS:a. Liuokset suodatettiin sentri-fugoimalla (5 000 x g) Centricon 30 -suodattimen läpi, ja suodokset tutkittiin aallonpituudella 490 nm. Saadut tulokset on esitetty taulukossa IV.

20 Taulukko IV

HSA:n määrä Väriaine Konjugaatti (%) Vertailu 0,2 % PNS:a Vertailu 0,2 % PNS:a 0 100 100 100 100 - ' 25 0,075 83 99 72 93 0,15 69 97 61 87 0,3 52 98 44 87 0,5 40 — 38 0,6 35 93 32 82 30 0,9 -- 92 -- 76 1,0 24 -- 29 1,2 20 89 24 72 1,5 17 88 21 69 35 Voidaan havaita, että PNS oli tehokas vapaan väri aineen ja vapaan konjugaatin aikaansaannissa.

Q 9 p λ 12 ' y 3

Esimerkki V

Fenytoiinin syrjäytys plasman proteiineista

Kokeet tehtiin sarjalla HEPES-puskuriin tehtyjä plasmaliuoksia, jotka sisälsivät 14C:llä leimattua fenyto-5 iinia (9,3 x 10~5 M) ja vaihtelevia määriä PNS:a. Liuokset suodatettiin Centricon 30 -suodattimen läpi sentrifugoi-malla (5 000 x g), ja suodoksille suoritettiin tuikelas-kenta (100 μΐ suodosta, 10 ml skintillaationestettä) käyttäen standardina fenytoiinia HEPES-puskurissa. Tulokset on 10 esitetty taulukossa V.

Taulukko V

PNS-pitoisuus Suodattimen läpäissyt fenytoiinin 15 (%) määrä (%) (± 3 %) 0 11,9 0,1 97,5 0,2 98,6 0,3 98,7 20 0,4 98,6 0,5 96,7

On selvää, että PNS oli erittäin tehokas vapaan fenytoiinin aikaansaannissa.

25 Esimerkki VI

Tutkittiin B- ja R-fykoerytriinin fluoresenssiemis-sio PNS:n ja 8-anilino-l-naftaleenisulfonihapon (ANS) funktiona.

Kokeet tehtiin fykoerytriinin (1,7 x 10"10 M) HEPES-30 puskuriliuoksilla, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä PNS:a ja ANS:a. Fykoerytriinit viritettiin aallonpituudella 560 nm, ja niiden emissiot mitattiin aallonpituudella 575 nm. Tulokset on esitetty taulukossa VI.

13 G 9 8 3

Taulukko VI

PNS- tai B-fykoerytriinin suht. R-fykoerytriinin suht.

ANS-pit. fluoresenssi-intensi- fluoresenssi-intensi- 5 (%) teetti, kun mukana on teetti, kun mukana on

PNS ANS PNS ANS

0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,125 1,0 0,61 1,0 0,72 0,25 1,0 0,43 0,99 0,54 10 0,375 1,0 0,33 0,99 0,40 0,50 1,0 0,25 0,98 0,29

Voidaan havaita, että PNS ei vaikuta fykoerytrii-nien fluoresenssiemissioihin liuoksessa, kun taas ANS hil-15 litsee hyvin voimakkaasti kummankin fykoerytriinin emissiota .

Vaikka keksintöä on kuvattu määrättyjä edullisia suoritusmuotoja käsitellen, tarkoituksena ei ole rajoittaa keksintöä niihin, vaan päinvastoin alan ammatti-ihmiset 20 tietävät, että niihin voidaan tehdä vaihdoksia ja muutoksia, jotka ovat keksinnön hengen mukaisia ja kuuluvat oheisten patenttivaatimusten piiriin.

Claims

1. Menetelmä jonkin aineosan määrittämiseksi biologisesta nesteestä, tunnettu siitä, että biolo- 5 ginen neste saatetaan kosketuksiin ainakin ensimmäisen reagenssin kanssa määrityskomponenttien sitoutumista plas-maproteiineihin estävän ja/tai alunperin sitoutuneita komponentteja syrjäyttävän yhdisteen, jolla on kaava o so3h 15 ^ I x | 20 tai sen suolan ollessa läsnä todettavissa olevan muutoksen, joka on mainitun biologisen nesteen aineosan funktio, aikaansaamiseksi ja mainittu muutos detektoidaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologinen neste on kokove- 25 ri, plasma tai seerumi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen reagenssi on määritettävän aineosan sitoutumisosapuoli.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että se toteutetaan toisen reagenssin läsnä ollessa.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen reagenssi on konju-gaatti, joka koostuu määritettävästä aineosasta tai sen 35 analogista, joka on liittynyt leimauskomponenttiin. 39983

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leimauskomponentti on fluoresoiva ryhmä.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että toinen reagenssi on konju-gaatti, joka koostuu määritettävän komponentin sitoutu-misosapuolesta, joka on liittynyt leimauskomponenttiin.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leimauskomponentti on ent- 10 syymi ja että menetelmään kuuluu entsyymin reaktio substraatin kanssa.

9. Immunologinen analysointimenetelmä jonkin analysoitavan aineosan määrittämiseksi nestenäytteestä, tunnettu siitä, että muodostetaan analysoitavan 15 aineosan ja sen sitoutumisosapuolen välinen binaarinen kompleksi määrityskomponenttien sitoutumista plasmaprote-iineihin estävän ja/tai alunperin sitoutuneita komponentteja syrjäyttävän yhdisteen, jolla on kaava 20 ^ I V . o so3h Λ4 30 tai sen suolan ollessa läsnä saattamalla näyte kosketuksiin sitoutumisosapuolen kanssa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analysoitava aine on antigeeni ja kontaktivaihe toteutetaan konjugaatin läsnä ol- 35 lessa, joka koostuu antigeenistä tai sen analogista, joka on liittynyt leimauskomponenttiin. Γ> Ο Λ 7 .> y J t 5

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leimauskomponentti on fluoresoiva .

12. Immunologinen analysointimenetelmä jonkin ana- 5 lysoitavan aineosan määrittämiseksi nestenäytteestä, tunnettu siitä, että muodostetaan analysoitavan aineosan, ensimmäisen sitoutumis- ja toisen sitoutumisosa-puolen, joka sitoutuu analysoitavaan aineosaan eri kohtaan kuin ensimmäinen sitoutumisosapuoli, välinen ternaarinen 10 kompleksi määrityskomponenttien sitoutumista plasmaprote- iineihin estävän ja/tai alunperin sitoutuneita komponentteja syrjäyttävän yhdisteen, jolla on kaava Q o so3h 20 tai sen suolan ollessa läsnä saattamalla näyte kosketuksiin ensimmäisen ja toisen sitoutumisosapuolen kanssa. .25

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen sitoutumisosapuoli on liittynyt leimauskomponenttiin.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analysoitava aineosa on an- 30 tigeeni ja leimauskomponentti on entsyymi.

15. Biologisen nesteen aineosan analysointiin tarkoitettu elementti, tunnettu siitä, että se käsittää ainakin yhden reagenssikerroksen ja sisältää määrityskomponenttien sitoutumista plasmaproteiineihin estävää 35 ja/tai alunperin sitoutuneita komponentteja syrjäyttävää yhdistettä, jolla on kaava η ΰ 9 S 8 3 V 0 so3 KtS tai sen suolaa.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen elementti, 10 tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi kantajan.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen elementti, tunnettu siitä, että siinä on kaksi reagenssiker-rosta ja se sisältää reagenssikerrosten väliin järjestet- 15 tynä valon läpäisyn estävän kerroksen.

18. Patenttivaatimuksen 15 mukainen elementti, tunnettu siitä, että reagenssikerros sisältää kyseisen biologisen nesteen aineosan sitoutumisosapuolta.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen elementti, 20 tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi konju- gaattia, joka koostuu analysoitavasta aineosasta tai sen analogista, joka on liittynyt leimauskomponenttiin.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen elementti, tunnettu siitä, että leimauskomponentti on fluo- : - 25 resoiva.

21. Patenttivaatimuksen 15 mukainen elementti, tunnettu siitä, että se sisältää analysoitavan aineosan ensimmäistä sitoutumisosapuolta ja analysoitavan aineosan toista sitoutumisosapuolta, joista kumpikin si- • 30 toutumisosapuoli sitoutuu aineosan eri kohtiin.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen elementti, tunnettu siitä, että toinen sitoutumisosapuoli on liittynyt leimauskomponenttiin.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen elementti, 35 tunnettu siitä, että leimauskomponentti on entsyymi . f. Q Q g 3 18 - · ' ° J