CN110791480A - 菜豆普通花叶病毒的单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents
菜豆普通花叶病毒的单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种菜豆普通花叶病毒的单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用。杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2019248，能够分泌菜豆普通花叶病毒的单克隆抗体。本发明还公开了相关的检测试剂盒及在检测菜豆普通花叶病毒中的用途。本发明可以实现BCMV的快速、现场和灵敏的检测。
Description
技术领域
本发明涉及菜豆普通花叶病毒的检测，尤其涉及一种菜豆普通花叶病毒的单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用。
背景技术
菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus，以下简称BCMV)，属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，它最早由Stewart和Reddick从美国纽约被侵染的菜豆植株上分离得到，会引起菜豆的嫩叶明脉，叶片失绿或皱缩等症状，是侵染豆科作物的主要病毒之一，广泛分布于全世界豆类种植区。据报道，迄今为止已知的34种自然侵染菜豆属病毒中，BCMV的发生最为广泛，且具有极大的破坏性。
目前常规检测BCMV的方法为PCR，需要专门的实验室场地，需要借助专门的仪器设备，并且对操作人员要求较高，需要有相当的专业知识、技能和操作经验，检测过程前处理复杂，所需时间很长。
以侧向流动为检测原理的金标卡检测方法已在很多领域中有过应用，包括食品安全检测、植物转基因检测等，但针对豆科作物病毒的检测较少。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种能够分泌菜豆普通花叶病毒的单抗的杂交瘤细胞株、该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体以及用途。
技术方案：本发明所述的杂交瘤细胞株名称为：杂交瘤细胞FL3011-14，保藏编号为：CCTCC NO：C2019248，保藏地址：中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年11月13日。
本发明还提供了一种菜豆普通花叶病毒的单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株所产生。
其中，所述单克隆抗体的抗体亚型为IgG1，轻链类型为κ。
本发明还提供了所述的杂交瘤细胞或所述的单克隆抗体在制备检测菜豆普通花叶病毒试剂或试剂盒中的应用。
本发明又提供了一种检测试剂盒，包括所述的杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体。
其中，所述的试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光检测试剂盒。
本发明将纯化的菜豆普通花叶病毒粒子免疫兔，获得多克隆抗体；将纯化的菜豆普通花叶病毒粒子免疫小鼠，然后通过细胞融合、克隆化筛选制备得到单克隆抗体细胞株，然后制备小鼠腹水，经过纯化得到鼠抗BCMV单克隆抗体；通过配对筛选，得到配对效果最佳的一对抗体(单克隆抗体和多克隆抗体)用于免疫金标速测卡。
因此，本发明特别提供了一种免疫金标速测卡，包括标记垫以及与标记垫搭接的层析膜，所述标记垫含有被胶体金标记的所述的单克隆抗体，所述层析膜上的检测线含菜豆普通花叶病毒多克隆抗体，控制线含羊抗鼠IgG二抗。
免疫金标速测卡应用双抗体夹心免疫层析的原理，检测植物样本中的菜豆普通花叶病毒(BCMV)。检测时，加入待检样本，如果样本中含有待检测物质，则样本中的抗原在侧向移动的过程中与位于标记垫上的胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，然后在层析膜检测线上与相应的特异性多克隆抗体结合，则该检测线(T线)显色，多余的金标单克隆抗体则与控制线上的二抗结合，控制线(C线)显色；如果样本中不含有待检测物质，则检测线(T线)不显色，多余的金标单克隆抗体则与控制线上的二抗结合，控制线(C线)显色。
其中，所述的菜豆普通花叶病毒多克隆抗体由菜豆普通花叶病毒免疫兔制备得到。
其中，所述标记垫上单克隆抗体的量为5ng-50ng，更优化的使用量30ng；层析膜上多克隆抗体的量为0.4μg-1.2μg，更优化的使用量0.6ug。
有益效果：
本发明筛选到一株杂交瘤细胞，能够分泌菜豆普通花叶病毒的单抗，该单抗的灵敏度高，特异性强，效价高，具有良好的稳定性。
本发明提供的免疫金标速测卡可以应用于BCMV进行快速、现场和灵敏的检测。本发明免疫金标速测卡主要应用于叶片样品的检测，样品前处理操作简单，100微升样品加样量即可，检测时间短(5-8min)、结果判定标准统一：阴性结果(仅出现1条C线)；阳性(+)：C/T线同时显色。
附图说明
图1 为金标检测卡的结构示意图；
图2 为金标检测卡的内部结构示意图；
图3 BCMV速测卡灵敏度测试结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
实施例1 BCMV抗体的制备
一、BCMV病毒粒子的纯化制备
1、将100g具有明显症状的实验保存的侵染小豆的菜豆普通花叶病毒(BCMV)病叶匀浆，加入400mL预冷的Buffer A(0.5mol/L磷酸钾缓冲液，含0.1％2-巯基乙醇，0.01mol/LEDTA，pH 7.0)，用四层纱布过滤，经低速离心(5，000g)(BECKMAN J2-H5高速离心机，JA-14转子)15min进一步去除杂质；
2、将上清液合并，加1/4体积的CCl4(四氯化碳)剧烈搅拌5min，低速离心(5,000g)20min；
3、将上清转移至一新管，加入PEG6000、NaCl和Triton-X 100，分别至终浓度6％(W/V)、3％(W/V)和1％(V/V)，冰浴搅拌30min使PEG6000完全溶解，静置6h，使病毒沉淀完全；
4、离心(8,000g)30min，弃上清。将沉淀重新悬浮于15-20mL Buffer B(0.5mol/L尿素的Buffer A)。低速离心(8，000g)20min，将上清转至84mL超速离心管中，沉淀重新悬浮于15-20mL Buffer B，按相同的步骤重复2次，合并上清液于超速离心管中；
5、在超速离心管底部铺上Buffer C，即20％蔗糖垫，23,000g超速离心(HITACHI70P-72超速离心机，RP42-802转子)1.5h；
6、弃上清，沉淀用2.0mL PBS缓冲液悬浮，离心(10,000g)5min，取上清(即病毒粗提液)。
试剂：
二、BCMV多克隆抗体的制备
1、免疫原制备：将步骤(1)纯化的病毒粒子与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，以备免疫兔。
2、免疫策略：将病毒粒子免疫新西兰大白兔，皮下免疫3次，间隔4周，最后经ELISA检测，抗血清效价达到1∶243000以上。
3、抗体纯化
免疫兔血清离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％(体积)，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；5ml 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 3.0)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。
三、BCMV单克隆抗体的制备
1、免疫原制备：将步骤(1)纯化的病毒粒子与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，以备免疫小鼠。
2、免疫策略：将病毒粒子免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经ELISA检测，四只小鼠的抗血清效价如下：
3、细胞融合：最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫，三天后进行细胞融合。将小鼠断颈处死，70％质量分数乙醇浸泡30min消毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合，细胞融合为常规实验方法。
4、融合筛选：将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，三天后换液，改用HT培养液培养。10天后，取细胞培养上清进行检测。
5、克隆化与建株：使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，可建立阳性细胞株。最终获得阳性细胞株20株(表1)。
6、扩大培养：将建株的单克隆细胞扩大培养，并进行冻存。
7、验证筛选：将单抗进行配对筛选(表1)，其中14#单抗(FL3011-14)作为标记抗体，多抗作为包被抗体的配对检测病毒粒子和实际样本效果最好，将产生14#单抗的杂交瘤细胞进行保藏，该杂交瘤细胞名称为：杂交瘤细胞FL3011-14，保藏编号为：CCTCC NO：C2019248，保藏地址：中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年11月13日。
验证方法如下：
A、包被：将20株纯化后的鼠单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲液(包被液，下同)按照1∶100倍稀释，100μL/孔，4℃过夜
B、封闭：洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300μL，时间为1min，10％小牛血清封闭(用PH9.6的碳酸盐缓冲液按照1∶9倍稀释)，每孔150μL，恒温37℃封闭3小时。
C、加样：加入浓度梯度为1000、50、0ppb的BCMV病毒粒子(步骤1纯化的)以及实验室扩繁的BCMV侵染的小豆叶片(阳性样本)、健康的小豆叶片(阴性样本)提取液，100μL/孔，25℃，温育45min。
D、加检测抗体：用稀释液按1∶1000比例稀释步骤(二)制备的兔多抗，充分混匀，每孔100μl，25℃，温育45min。
E、加酶：用稀释液按1∶1000比例稀释羊抗兔酶标二抗(KPL货号074-1801)，充分混匀，每孔100μl，25℃，温育30min。
F、显色：洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300μL，时间为1min，每孔加TMB 100μL，25℃反应15min。
G、终止与检测：加入2M H2SO4，100μL/孔，450nm读取OD(吸光度)值。
验证结果参见表1。
表1杂交瘤细胞株的腹水阳性筛选结果
| 抗体编号 | 1ppm | 50ppb | 0 | 阳性样本 | 阴性样本 |
| FL3011-1 | 0.2473 | 0.2434 | 0.1943 | 0.2239 | 0.198 |
| FL3011-2 | 0.2822 | 0.2244 | 0.1835 | 0.1974 | 0.0952 |
| FL3011-3 | 0.2822 | 0.2244 | 0.1835 | 0.1974 | 0.0952 |
| FL3011-4 | 0.5019 | 0.2697 | 0.2326 | 0.3882 | 0.2587 |
| FL3011-5 | 0.3703 | 0.201 | 0.1547 | 0.2591 | 0.1844 |
| FL3011-6 | 0.4706 | 0.2124 | 0.1879 | 0.3158 | 0.2003 |
| FL3011-7 | 0.2398 | 0.1733 | 0.163 | 0.1905 | 0.1651 |
| FL3011-8 | 2.3086 | 1.0852 | 1.0622 | 1.6795 | 1.1311 |
| FL3011-9 | 2.902 | 1.0905 | 0.7164 | 1.8325 | 0.5183 |
| FL3011-10 | 1.8727 | 1.3504 | 1.3143 | 1.4108 | 1.4322 |
| FL3011-11 | 0.2545 | 0.192 | 0.1967 | 0.4619 | 0.2659 |
| FL3011-12 | 0.4229 | 0.2411 | 0.2341 | 0.3744 | 0.287 |
| FL3011-13 | 0.4532 | 0.2238 | 0.2331 | 0.2831 | 0.2812 |
| FL3011-14 | 3.3776 | 2.1931 | 0.1999 | 2.2582 | 0.2754 |
| FL3011-15 | 0.3606 | 0.2014 | 0.2023 | 0.2571 | 0.324 |
| FL3011-16 | 1.6581 | 0.4112 | 0.2208 | 0.5932 | 0.2769 |
| FL3011-17 | 1.9699 | 0.9743 | 0.2575 | 0.6944 | 0.3275 |
| FL3011-18 | 1.9947 | 1.5211 | 0.2354 | 0.7699 | 0.3466 |
| FL3011-19 | 0.4163 | 0.1831 | 0.2434 | 0.5954 | 0.2398 |
| FL3011-20 | 1.9426 | 0.8057 | 0.2288 | 0.5803 | 0.2771 |
四、BCMV单克隆抗体腹水的制备与纯化
1、取保藏编号为CCTCC NO：C2019248的BCMV单克隆抗体杂交瘤细胞株，在细胞培养瓶中扩大培养；
2、腹水制备：提前一周在小鼠腹腔注射矿物油，将5*10∧6个细胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水，4000rpm离心，得上清即为单克隆抗体腹水。
3、单克隆抗体纯化：腹水离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml0.4M PBS缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；5ml 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。
5、14#单抗的特性
(i)单抗的亚型鉴定
对14#单抗用抗体亚型检测试剂盒进行检测，单抗亚型鉴定为IgG1，轻链类型为κ。
(ii)抗体效价的测定
将14#杂交瘤细胞株的腹水梯度稀释后用间接ELISA检测方法测定效价。效价达到1∶106以上。
表2杂交瘤细胞株的腹水效价的检测结果
(iii)单抗腹水热稳定性实验
取步骤3的初纯的14号的腹水用灭菌的PBS 1∶1000稀释，置56℃水浴中4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时，然后用间接ELISA检测其OD450nm值的变化，14#杂交瘤细胞株的腹水经热稳定性试验结果见表3，结果表明14#杂交瘤细胞株的腹水具有很好的热稳定性。
表3杂交瘤细胞株的腹水热稳定性实验结果
(iv)单抗腹水酸碱稳定性实验
酸稳定性试验：将步骤3的初纯的14号的腹水用pH值2.2的盐酸溶液1∶10倍稀释，于4℃保存4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时，再用pH值7.2的PBS稀释到1∶1000，ELISA检测其OD450nm值变化。
碱稳定性试验：用pH值9.6的碳酸盐缓冲液1∶10倍稀释腹水，按上述方法进行碱稳定性试验。14#杂交瘤细胞株的腹水经酸碱稳定性试验结果见表4，结果表明14#杂交瘤细胞株的腹水具有较好的酸碱稳定性。
表4杂交瘤细胞株的腹水酸碱稳定性实验结果
(v)单抗特异性分析
以BCMV、TMV、PVY、CMV、TSWV、CGMMV包被酶标版，以间接法对14#单克隆抗体进行效价检测，从ELISA结果可以看出，所制备的单抗的效价较高，且特异性很高，与一些常见植物病毒，如TMV、PVY、CMV、TSWV、CGMMV等均不发生反应(表5)。
表5杂交瘤细胞株的腹水特异性交叉实验结果
实施例2
一、BCMV速测卡的制作
按以下结构制备免疫金标速测卡：
除抗体外，速测卡的结构为现有技术，如图1、图2，速测卡的结构一般包括壳体8，壳体8内封装有底板1以及设于底板1上的试纸条，试纸条包括样品垫5、标记垫4、层析膜2和吸收垫3，样品垫为玻璃纤维膜，大小为3mm×15mm；标记垫大小为3mm×4rnm；层析膜为NC膜，大小为3mm×28mm；吸收垫为吸水纸，大小为3mm×19mm。
标记垫4处于样品垫5前端的下方，标记垫4与样品垫5的重合部位长度为1mm-1.5mm。标记垫4的前端搭在NC膜2后端上方，标记垫4与NC膜2重合部分的长度为1mm-2mm。吸收垫3的后端搭在NC膜2前端上方。
上述的前端和后端是指沿样品液行进方向区分前端和后端，以加样孔作为试纸条的上方。
沿样品前进方向，NC膜2设有T线(BMCV线)6和C线(控制线)7，T线由BMCV多克隆抗体固定形成，C线由二抗固定形成。标记垫4固定BMCV单克隆抗体。壳体8在对应样品垫5的部位开设有加样孔9，加样孔大小为3mm×7mm，壳体8在对应NC膜T线和C线的部位设有观察孔10，观察孔大小为3mm×18mm。
组装时，在底板上按照上述结构将试纸条固定，固定的时候可采用粘结的方式，注意避免影响样品液流经路径，最后封装在壳体内。
使用时，将速测卡水平放置，于加样孔中加入100μL样品溶液。样品溶液会沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的标记垫，并与NC膜上的特异性抗体形成双抗体夹心结构。8-10min后，于结果观察孔中观察颜色变化，作出判断。结果判断：阴性结果(出现1条C线)；阳性(+)：C/T线同时显色。
1)、包被
选取PALL170的硝酸纤维素膜(NC膜)用划膜喷金机将浓度为2.0mg/mL的BCMV包被抗体溶液(即实施例1制备纯化的多克隆抗体)以1.0μL/cm划T线，作为检测线；浓度为1mg/mL的羊抗鼠二抗(羊抗鼠IgG)以1.0μL/cm划C线，作为质控线；37℃烘干24小时，待用；得到包被抗体的硝酸纤维素膜。
2)胶体金制备
a)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中(重铬酸钾∶浓硫酸∶超纯水＝120g∶200ml∶1000ml)浸泡24小时。取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用。
b)烧金溶液A的配置。用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末(购于sigma)于棕色瓶中，加入99ml超纯水充分溶解，4℃避光保存。
c)烧金溶液B的配置。称取1g柠檬酸三钠(购自sigma)溶解于99ml超纯水中，混匀。
d)胶体金的制备：量取99ml超纯水于烧杯中，加入1ml烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2ml新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮7-10min，自然冷却至室温，加超纯水定容至100ml。倒入棕色瓶，4℃避光保存；得到胶体金(粒径为25nm)。
3)抗体标记
a)抗体的标记：取1.5ml上述1)制取好的胶体金，用0.1M的K2CO3调节pH值，分别加入BCMV标记抗体20ug(即实施例1制备纯化的14#单抗)，混合均匀，室温反应40min。加入10％的BSA终止，静置30min。
b)标记抗体纯化：先用低速(1500r/min)离心，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀。然后用高速(8500r/min)离心30分钟。仔细吸去上清，沉淀物用含1％BSA的0.1M PBS 50μl(PH7.4)复溶，4℃保存；得到标记胶体金抗体溶液。
4)喷金
将上述3)制备的标记好的标记胶体金抗体溶液稀释到0.1mg/ml，以1ul/cm喷于预处理过的金标垫，烘干待用，得到固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的标记垫。
5)大板组装
将各个组成按图2组装固定在底板(PVC带胶底板)上，然后置于37℃真空干燥30min。
6)切条组装
在上层的塑料卡壳(即壳体)上有两个孔，加样孔和观察孔，加样孔大小为3mm×7mm，观察孔大小为3mm×18mm。
将组装好的大板切成3mm宽的条子，装入塑料卡壳中。
二、BCMV速测卡检测病毒粒子效果评价
①加样孔中加入100μL空白样品液(pH 7.4，0.01mol/L PBS：8g氯化钠、3.35g十二水合磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，双蒸水溶解定容至1L)，在室温条件下反应8分钟后在结果观察孔中观察显色结果。结果表明，观察孔中呈现明显的酒红色的控制线C线，T线不显色，参见图3中对应的数字1。
②加样孔中加入100μL1μg/ml的BCMV病毒粒子溶液(采用pH 7.4，0.01mol/L PBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T线显色。参见图3中对应的数字2。
③加样孔中加入100μL0.5μg/ml的BCMV病毒粒子溶液(采用pH 7.4，0.01mol/LPBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T线显色。参见图3中对应的数字3。
④加样孔中加入100μL0.2μg/ml的BCMV病毒粒子溶液(采用pH 7.4，0.01mol/LPBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T线显色。参见图3中对应的数字4。
⑤加样孔中加入100μL0.1μg/ml的BCMV病毒粒子溶液(采用pH 7.4，0.01mol/LPBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线显色、检测线T线颜色很浅。参见图3中对应的数字5。
⑥加样孔中加入100μL0.05μg/ml的BCMV病毒粒子溶液(采用pH 7.4，0.01mol/LPBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线显色，检测线T线不显色。参见图3中对应的数字6。
综上，从图3结果可以判定该速测卡对病毒粒子的检测灵敏度可以达到0.1μg/ml。
三、BCMV速测卡检测叶片样本效果评价
叶片样本处理方法：将小豆叶片组织置于一次性组织提取管的盖子与管身之间，迅速盖住盖子，重复2次，得到2片圆形叶片组织；用杵将叶片置于提取管的底部；将杵插入管中，旋转杵或枪头碾搅碎叶片，持续按压20～30秒。加入1mL(约40滴)提取缓冲液(0.01mol/L PBS缓冲液)；重复碾碎步骤使样品与缓冲液充分接触混合；静置沉淀或者离心得到上清液，即为叶片样本提取液。
①加样孔中加入100mL未侵染BCMV的健康叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中呈现明显的酒红色的控制线C线，检测线T线不显色。
②加样孔中加入100mL实验室扩繁的BCMV阳性的小豆叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T线显色。
Claims (9)
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：C2019248。
2.一种菜豆普通花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生。
3.根据权利要求2所述的菜豆普通花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体亚型为IgG1，轻链类型为κ。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2~3任一项所述的单克隆抗体在制备检测菜豆普通花叶病毒试剂或试剂盒中的应用。
5.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2~3任一项所述的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光检测试剂盒。
7.一种免疫金标速测卡，包括标记垫以及与标记垫搭接的层析膜，其特征在于，所述标记垫含有被胶体金标记的权利要求2~3任一项所述的单克隆抗体，所述层析膜上的检测线含菜豆普通花叶病毒多克隆抗体，控制线含羊抗鼠IgG二抗。
8.根据权利要求7所述的免疫金标速测卡，其特征在于，所述的菜豆普通花叶病毒多克隆抗体由菜豆普通花叶病毒免疫兔制备得到。
9.根据权利要求7所述的免疫金标速测卡，其特征在于，所述标记垫上单克隆抗体的量为5 ng-50 ng，层析膜上多克隆抗体的量为0.4μg-1.2μg。
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| CN105671001A (zh) * | 2016-02-22 | 2016-06-15 | 浙江大学 | 分泌抗南方菜豆花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
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| 张成良等: "生物素抗生胸素酶联法检测植物病毒的研究", 《植物检疫》 * |
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