CN105063030B - 能够鉴定苏御糯的issr‑scar标记及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定太湖名贵糯稻——苏御糯的特异性分子标记，通过筛选能够在苏御糯中扩增出特异性条带的ISSR引物，并针对特异性条带设计序列特异性引物，最终将苏御糯和其它水稻品种区分开来，实现对太湖苏御糯的特异性鉴定，为水稻的品种鉴别和种质资源保护提供有力的技术支持。本发明提供的一种可以快速、准确地鉴定苏御糯的特异性分子标记及方法，对于开发水稻特异性品种鉴别体系及水稻种质资源保护具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于本发明属于分子标记鉴定领域，特别涉及一种鉴定太湖名贵糯稻——苏御糯的特异性分子标记及方法。
背景技术
稻（Oryza sativa L.）属禾本科（Gramineae）稻属（Oryza），为一年生水生草本，是亚热带地区广泛种植的重要谷物。《中国植物志》将其分为2个亚种，分别为籼稻（Oryzasativa L. subsp. indica Kato）和粳稻（Oryza sativa L. subsp. japonica Kato）。我国是亚洲栽培稻起源地之一，稻作历史悠久，稻种类型繁多，其数量之多列世界之最。据统计，截止2003年，我国共编目稻种资源已达77541份。由于水稻资源数量众多，水稻品种鉴别一直是农业生产和作物育种等环节面临的重要难题。
以往对水稻品种的鉴别，主要包括形态鉴定法、物理鉴定法和生物化学鉴定法等。但这些鉴定方法往往容易受到发育时期、环境条件等因素干扰，因此寻求一种快速、稳定、准确的水稻品种鉴定方法极其重要。由于DNA水平上的分子标记能从本质上反应个体差异，具有个体特异性，并且不受内外环境的影响，不存在组织、生长阶段或季节性的差异，近年来在水稻品种的鉴定方面得到应用。但目前报道的通过DNA分子标记对水稻品种的鉴别大多通过构建DNA指纹图谱对其进行区分，该方法操作繁琐、重复性差，并且不是可直接应用的专一性、特异性分子标记，因此不适合用于稳定、快速、准确的品种鉴别体系的开发。
苏御糯是太湖地区栽培历史悠久的名贵农家品种，在历史上曾作为贡品敬献给历代帝王享用，在国内享有盛名。该品种具有粒大饱满，色泽白净，糯性适中，甘口软浓郁等特点，素有“一家煮食满村香”的美誉。在1984年江苏省第一届优质稻米品尝鉴定会上，经专家们评定，其外观品质和蒸煮品质综合评分在特色稻米类型中居首位。但苏御糯从形态上与其他水稻品种仍然较难区分，因此开发鉴定苏御糯的专一性、特异性鉴别的分子标记具有重要的科学意义。
本发明是首次对太湖名贵糯稻品种——苏御糯进行特异性鉴别分子标记的开发，本发明提供的鉴定苏御糯的特异性标记方法具有操作简单、灵敏度高、重复性好等优点，能够实现对太湖苏御糯品种的特异性鉴定，对于我国水稻的品种鉴别和种质资源保护均具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定太湖名贵糯稻——苏御糯的特异性分子标记，通过筛选能够在苏御糯中扩增出特异性条带的ISSR引物，并针对特异性条带设计序列特异性引物，最终将苏御糯和其它水稻品种区分开来，实现对太湖苏御糯的特异性鉴定，为水稻的品种鉴别和种质资源保护提供有力的技术支持。
本发明采用的技术方案是：
能够在苏御糯中扩增得到的特异性片段，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所述。
一组能够鉴别苏御糯的SCAR引物，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3和SEQID NO: 4所述。
一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）采用32条ISSR引物对12个水稻品种进行扩增，得到1条苏御糯特异性片段；
（2）将步骤（1）中的特异性片段进行切胶回收并测序；
（3）针对步骤（2）中的序列设计序列特异性引物；
（4）用步骤（3）中的引物在所有水稻品种中进行单株验证；
（5）用步骤（3）中的引物在苏御糯和4个籼稻中进行扩增并测序；
（6）针对步骤（5）中的序列设计位点特异性引物；
（7）用步骤（6）中的引物在所有水稻品种中进行单株验证，得到仅在苏御糯中能扩增出特异性条带的引物。
优选的，所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，步骤（1）和步骤（5）中的PCR扩增的反应体系为20 µL，其组分及终浓度为：DNA模板（20 ng/µL）1.0 µL，2×Reaction Mix（含20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，400 µM的dNTPs，溴酚蓝）10.0µL，引物（10 mM）1.5 µL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/µl）0.4 µL，双蒸水补齐至20 µL；94℃，5min预变性；94℃变性1min， 53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，40个循环；最后72℃延伸10min；PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭（EB）染色，电压80 V，电泳1.5 h后，用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000作为DNA marker。
优选的，所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，步骤（1）中能在苏御糯中扩增出特异性条带的引物序列如SEQ ID NO: 1所述；步骤（2）中苏御糯中特异性片段的序列如SEQ ID NO: 2所述；步骤（3）中特异性引物的序列如SEQ ID NO: 3和SEQ IDNO: 4所述。
优选的所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，步骤（4）中PCR验证体系为20 μL，其组分及终浓度为：DNA模板（20 ng/µl）1.0 µL，2×Reaction Mix（含20 mMTris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，400 µM的dNTPs，溴酚蓝）10.0 µL，引物（10 mM）各1.0µL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/µL）0.4 µL，最后用双蒸水补齐至20 µL；扩增程序为：94℃，5min预变性；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，电压80 V，电泳0.5 h后用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000作为DNA marker。
优选的，所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，所述苏御糯和其它4个籼稻品种的序列分别如SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9所述。
优选的，所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，步骤（6）中设计的位点特异性引物序列如SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所述。
优选的，所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，步骤（7）中PCR验证体系同步骤（1）相同，不同在于退火温度为60℃。
有益效果：本发明提供了一种可以快速、准确地鉴定苏御糯的特异性分子标记及方法，对于开发水稻特异性品种鉴别体系及水稻种质资源保护具有重要的意义。
附图说明
图1是苏御糯和11个其它水稻品种的ISSR引物（SEQ ID NO.1）扩增图谱。
泳道1-12从左至右依次为：太湖糯、浙糯5号、绍糯9714、镇糯19号、金陵香糯、镇稻2号、广陵香糯、鸭血糯、桂朝糯、扬辐糯4号、扬籼糯32-2、苏御糯，泳道M为DNA Marker。
图2是苏御糯和其它水稻品种各10个单株的ISSR-SCAR（SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4）检测图谱。
A：太湖糯；B：浙糯5号；C：绍糯9714；D：镇糯19号；E：金陵香糯；F：镇稻2号；G：广陵香糯；H：鸭血糯；I：桂朝糯；J：扬辐糯4号；K：扬籼糯32-2；L：苏御糯；M表示DNA marker；1-10为该品种的10个个体。
图3是苏御糯和其它水稻品种各10个单株的位点特异性引物（SEQ ID NO.10和SEQID NO.11）检测图谱。
A：太湖糯；B：浙糯5号；C：绍糯9714；D：镇糯19号；E：金陵香糯；F：镇稻2号；G：广陵香糯；H：鸭血糯；I：桂朝糯；J：扬辐糯4号；K：扬籼糯32-2；L：苏御糯；M表示DNA marker；1-10为该品种的10个个体。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。引物均由南京锐真生物技术有限公司合成；DNA提取试剂盒购自北京全式金公司，Taq酶和DL2000 DNA marker购自广州东胜生物科技有限公司，pMD19-T Vector和大肠杆菌DH5α感受态细胞为Takara公司产品；Tissue Lyser LT组织破碎仪为德国QIAGEN产品；核酸蛋白检测仪为美国eppendorf产品；PCR仪为BioMetra T1型。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
、植物基因组总DNA的提取
选择苏御糯及江浙地区通常栽培的11个水稻品种（表1），每个品种随机选取10个个体，分别提取其基因组DNA。具体为：待植株苗高10~15cm时剪取新鲜叶片100 mg，经Tissue Lyser LT组织破碎仪将样品进行破碎，利用Easy Pure Plant Genomic DNA Kit试剂盒，提取样品总DNA。DNA样品的浓度及纯度用核酸蛋白检测仪进行检测，调整每个样品的DNA浓度至20 ng/μl，于-20℃保存备用。
表1 实验材料表
2、ISSR引物的筛选
分别将12个水稻品种的10个单株DNA进行等量混合，以每个品种的DNA混合池为模板。PCR反应体系20 μL，包括：DNA模板（20 ng/µL）1.0 µL，2×Reaction Mix（含20 mMTris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，400 µM的dNTPs，溴酚蓝）10.0 µL，引物（10 mM）1.5 µL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/µL）0.4 µL，双蒸水补齐至20 µL。PCR条件为：94℃，5 min预变性；94℃变性1min，50℃~53℃（不同的引物退火温度有所差异）退火1 min，72℃延伸1.5 min，40个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭（EB）染色，电压80V，电泳1.5h后，用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000为DNA marker。
、ISSR-SCAR特异性条带的克隆及测序
通过筛选32对ISSR引物，其中序列为SEQ ID NO.1的引物能在苏御糯中扩增出的特异性条带（附图1）。利用上海捷瑞生物工程有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）对该特异性条带进行回收、纯化。连接反应参照pMD19-T Vector说明书，反应体系10 µL，包括以下组分：Vector 1.0 µL，Solution I 5. 0 µL，DNA 4.0 µL，4℃过夜连接。次日，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自Takara公司）。具体步骤为：取5.0 µL连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，42℃热激90 s，冰浴5 min，加500 µL液体SOC溶液，于37℃，180 rpm的摇床中培养1 h，涂平板，放在培养箱中过夜培养。次日，挑取单菌落，用通用引物M13和RV-M进行菌落 PCR 检验，将含有正确条带的克隆交由南京锐真生物技术有限公司进行测序。
、ISSR-SCAR标记的验证
根据本发明中苏御糯的特异性序列SEQ ID NO.2，设计一组特异性引物（SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4），对12个水稻品种的120个样品进行单株验证，反应体系为20 μL，其组分及终浓度为：DNA模板（20 ng/µl）1.0 µL，2×Reaction Mix（含20 mM Tris-HCl，100 mMKCl，3 mM MgCl2，400 µM的dNTPs，溴酚蓝）10.0 µL，引物（10 mM）各1.0 µL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/µL）0.4 µL，最后用双蒸水补齐至20 µL。扩增程序为：94℃，5 min预变性；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，电压80 V，电泳0.5 h后用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000为DNA marker（附图2）。
、特异性扩增苏御糯分子标记的设计
在步骤4中用SCAR引物对12个水稻品种进行验证时发现，苏御糯和其它4个籼稻品种（鸭血糯、桂朝糯、扬辐糯4号和扬籼糯32-2）中均扩增出1条清晰的、片段长度为908 bp的目的条带，而在其它7个粳稻品种的所有个体中均未扩增出该特异性条带。用步骤4中的SCAR引物对这5个籼稻品种进行PCR扩增并测序，获得的序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9。通过比对测序结果，发现苏御糯和其它4个品种的核苷酸序列在197-238 bp处有42 nt的缺失，针对该区域设计位点特异性引物，序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11。
苏御糯特异性分子标记的验证
用步骤5中设计的特异性引物对12个水稻品种的120个样品进行品种特异性单株验证，反应体系及反应条件同步骤4，不同之处在于退火温度为60℃。
Claims (6)
1.能够在苏御糯中扩增得到的特异性片段，其特征在于该片段的核苷酸序列如SEQ IDNO: 2 所述。
2.一组能够鉴别苏御糯的SCAR 引物，其特征在于该引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO: 3 和SEQ ID NO: 4 所述。
3.一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
（1）采用32 条ISSR 引物对12 个水稻品种进行扩增，得到1 条苏御糯特异性片段，能在苏御糯中扩增出特异性条带的引物序列如SEQ ID NO: 1 所述；
（2）将步骤（1）中的特异性片段进行切胶回收并测序，苏御糯中特异性片段的序列如SEQ ID NO: 2 所述；
（3）针对步骤（2）中的序列设计序列特异性引物，特异性引物的序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4 所述；
（4）用步骤（3）中的引物在所有水稻品种中进行单株验证；
（5）用步骤（3）中的引物在苏御糯和4 个籼稻中进行扩增并测序，苏御糯和其它4 个籼稻品种的序列分别如SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8 和SEQID NO: 9 所述；
（6）针对步骤（5）中的序列设计位点特异性引物，设计的位点特异性引物序列如SEQ IDNO: 10 和SEQ ID NO: 11 所述；
（7）用步骤（6）中的引物在所有水稻品种中进行单株验证，得到仅在苏御糯中能扩增出特异性条带的引物。
4.根据权利要求3 所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（5）中的PCR 扩增的反应体系为20 μL，其组分及终浓度为：DNA 模板（20ng/μL）1.0 μL，2×Reaction Mix（含20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，400 μM的dNTPs，溴酚蓝）10.0 μL，引物（10 mM）1.5 μL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/μl）0.4 μL，双蒸水补齐至20 μL ；94℃，5 min 预变性；94℃变性1min， 53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，40个循环；最后72℃延伸10 min ；PCR 产物经2% 琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭（EB）染色，电压80 V，电泳1.5 h 后，用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000 作为DNA marker。
5.根据权利要求3 所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中PCR 验证体系为20 μL，其组分及终浓度为：DNA 模板（20 ng/μl）1.0 μl，2×Reaction Mix（含20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，400 μM 的dNTPs，溴酚蓝）10.0 μL，引物（10 mM）各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/μL）0.4 μL，最后用双蒸水补齐至20 μL ；扩增程序为：94℃，5 min 预变性；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸5 min ；PCR 扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，电压80 V，电泳0.5 h 后用凝胶成像系统观察、拍照，以DL2000 作为DNA marker。
6.根据权利要求3 所述的一种鉴别苏御糯的特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤（7）中PCR 验证体系同步骤（1）相同，不同在于退火温度为60℃。
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