CN104561334B - 一组区分谷子品种的ssr标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组区分谷子品种的SSR标记及其应用。本发明提供的区分谷子品种的SSR标记，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10组成。通过实验证明：经多次在我国不同地区来源的农家品种和育成品种中验证，本发明的成套引物可以准确有效的区分谷子品种。

Description

一组区分谷子品种的SSR标记及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一组区分谷子品种的SSR标记及其应用。
背景技术
谷子(Setaria italica(L.)Beauv.)又名小米、粟，属禾本科，狗尾草属，是我国北方地区主要的粮食作物，营养价值丰富。谷子是我国起源的古老作物，数千年来一直作为主栽培作物培育了我国北方文明，被誉为中华民族的哺育作物。谷子又因为抗旱性强，水分利用率高，被认为是应对未来日愈严重的水资源短缺的战略贮备作物，更在今天可持续生态农业建设中具有不可替代的作用。我国是谷子的起源国，拥有世界最丰富的品种类型和种质资源，这些品种资源是我国农业可持续发展的战略贮备和宝贵财富。建国65年来，谷子育种在全国各地开展，培育530多个通过国家或省级审(鉴)定的品种，我国谷子的育成品种的水平居国际领先或先进的水平，很多品种申请了品种权保护。近年来，随着谷子作为健康食品被越来越多的人认识，谷子生产有了新的发展，谷子品种的保护和鉴定就愈加重要。
长期以来，谷子不同基因型的鉴别主要依赖于对籽粒和田间形态性状，如粒色、籽粒大小、苗色、叶鞘色、花药颜色、种皮色、穗型、株型和叶型等有限数量的性状观察，并结合育种家的经验进行区分。由于形态学性状的表现与田间环境密切相关，通过传统的方法很难准确的区分不同谷子品种(基因型)间的差异情况，而且这些性状受到种植季节的限制，必须在田间种植的情况下才能观察到。这就造成了谷子品种鉴别困难性和不准确性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种区分谷子品种的成套引物。
本发明提供的成套引物由引物对(1)-(10)组成：
(1)为由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对1；
(2)为由SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物对2；
(3)为由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成的引物对3；
(4)为由SEQ ID No.7所示的单链DNA和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成的引物对4；
(5)为由SEQ ID No.9所示所示的单链DNA和SEQ ID No.10所示的单链DNA组成的引物对5；
(6)为由SEQ ID No.11所示的单链DNA和SEQ ID No.12所示的单链DNA组成的引物对6；
(7)为由SEQ ID No.13所示的单链DNA和SEQ ID No.14所示的单链DNA组成的引物对7；
(8)为由SEQ ID No.15所示所示的单链DNA和SEQ ID No.16所示的单链DNA组成的引物对8；
(9)为由SEQ ID No.17所示的单链DNA和SEQ ID No.18所示的单链DNA组成的引物对9；
(10)为由SEQ ID No.19所示的单链DNA和SEQ ID No.20所示的单链DNA组成的引物对10。
本发明的另一个目的是提供一种区分谷子品种的成套PCR试剂。
本发明提供的区分谷子品种的成套PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试5、PCR试剂6、PCR试剂7、PCR试剂8、PCR试剂9和PCR试剂10组成；
所述PCR试剂1包括上述成套引物中的引物对1；
所述PCR试剂2包括上述成套引物中的引物对2；
所述PCR试剂3包括上述成套引物中的引物对3；
所述PCR试剂4包括上述成套引物中的引物对4；
所述PCR试剂5包括上述成套引物中的引物对5；
所述PCR试剂6包括上述成套引物中的引物对6；
所述PCR试剂7包括上述成套引物中的引物对7；
所述PCR试剂8包括上述成套引物中的引物对8；
所述PCR试剂9包括上述成套引物中的引物对9；
所述PCR试剂10包括上述成套引物中的引物对10。
上述成套PCR试剂中，各个引物对独立包装，各条引物独立包装。
上述成套PCR试剂中，所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10的各条引物的物质的量相同。
含有上述成套引物或上述成套PCR试剂的试剂盒也属于本发明的保护范围。
上述的成套引物或上述的成套PCR试剂或上述的试剂盒在区分或辅助区分谷子品种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的最后一个目的是提供一种区分待测谷子a和待测谷子b是否为同一品种的方法。
本发明提供一种区分待测谷子a和待测谷子b是否为同一品种的方法包括如下步骤：
用上述的成套引物中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10分别对待测谷子a和待测谷子b进行PCR扩增，得到待测谷子a的10对引物对的PCR扩增产物和待测谷子b的10对引物对的PCR扩增产物；检测所述待测谷子a的10对引物对的PCR扩增产物和所述待测谷子b的10对引物对的PCR扩增产物的大小；
分别比较所述10对引物对中同一对引物对扩增得到的待测谷子a的PCR扩增产物大小和待测谷子b的PCR扩增产物大小；
若所述待测谷子a的10对引物对的PCR扩增产物大小与所述待测谷子b的对应引物对的扩增产物大小均一致，则所述待测谷子a和所述待测谷子b为或候选为同一品种；若所述待测谷子a的10对引物对的PCR扩增产物大小与所述待测谷子b的对应引物对的扩增产物大小不一致，则所述待测谷子a和所述待测谷子b不为或候选不为同一品种。
上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测谷子a或待测谷子b的基因组DNA。
上述方法中，所述引物对1进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物对2进行PCR扩增的退火温度为57℃；所述引物对3进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物对4进行PCR扩增的退火温度为51℃；所述引物对5进行PCR扩增的退火温度为57℃；所述引物对6进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物对7进行PCR扩增的退火温度为57℃；所述引物对8进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物对9进行PCR扩增的退火温度为57℃；所述引物对10进行PCR扩增的退火温度为55℃。
上述方法中，所述待测谷子a或b均为30个品种中任一种，所述30个品种分别为赤谷10号、冀谷18、豫谷7号、鲁谷10号、陇谷11号、公矮2号、沧谷4号、公谷60号、龙谷25、冀谷19、豫谷1号、谷丰1号、承谷12、公谷63号、九谷9、长农35、晋谷21、长生04、长生08、晋谷35号、延谷11号、长生07、龙谷31、豫谷2号、冀谷24、赤谷4号、峰谷12号、冀谷20、九谷16号、晋谷10号。
上述方法在区分或辅助区分谷子品种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种区分谷子品种的成套引物及其应用。通过实验证明：经多次在我国不同地区来源的农家品种和育成品种中验证，本发明的成套引物可以准确有效的区分谷子品种。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、区分谷子品种的成套引物及其方法
1、区分谷子品种的成套引物
本发明构建了一套含10个引物对的成套引物(如表1所示)，通过本发明的成套引物可快速区分不同谷子的品种。
表1、成套引物的序列和技术参数
2、成套引物区分谷子品种的方法
以我国谷子主产区代表性推广的30个品种(如表2所示)(来源于国家农作物种质资源保存中心)的基因组DNA为模板，使用实施例1中所述成套引物分别对每一品种进行PCR扩增；并用毛细管荧光电泳在ABI 3730XL测序仪上进行自动荧光检测，测序结果用GeneMapper(Version4.0)软件分析，得到10对引物对的扩增扩增条带大小。
PCR的反应体系：1μl的模板DNA(100ng/μl)、1μl的10×Taq buffer(含Mg2+)、1μl的dNTP mixture(10mM)、0.1μl的Taq polymerase(2.5U/μl)、1μl的正向引物(2μm/μl)、1μl的反向引物(2μm/μl)、5μl的ddH20。药品均购自于TaKaRa公司。
PCR的反应条件：94℃5min；94℃50s，X℃40s，72℃1min，30个循环；72℃30min。
结果表明：不同品种没有完全一样的片段，10对引物对可准确区分代表性推广的30个品种(各个引物对在不同品种中扩增条带大小统计如表2所示)，用成套引物中的10对引物对区分任意待测谷子a和待测谷子b是否为同一品种的具体方法如下：
用表1中的10对引物分别对待测谷子a和待测谷子b进行PCR扩增，分别得到待测谷子a和待测谷子b的10对引物对的PCR扩增产物；检测待测谷子a和待测谷子b的10对引物对的PCR扩增产物大小；
分别比较10对引物对中同一对引物对扩增得到的待测谷子a的PCR扩增产物大小和待测谷子b的PCR扩增产物大小；
若所述待测谷子a的10对引物对的PCR扩增产物大小均与所述待测谷子b的对应10对引物对的扩增产物大小一致，则待测谷子a和待测谷子b为或候选为同一品种；若所述待测谷子a的10对引物对的PCR扩增产物大小与所述待测谷子b的对应引物对的扩增产物大小不一致，则待测谷子a和待测谷子b不为或候选不为同一品种。
表2、代表性谷子品种的10对引物对的PCR扩增产物大小

Claims (7)

1.一种区分谷子品种的成套引物，由引物对(1)-(10)组成：
(1)为由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对1；
(2)为由SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物对2；
(3)为由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成的引物对3；
(4)为由SEQ ID No.7所示的单链DNA和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成的引物对4；
(5)为由SEQ ID No.9所示所示的单链DNA和SEQ ID No.10所示的单链DNA组成的引物对5；
(6)为由SEQ ID No.11所示的单链DNA和SEQ ID No.12所示的单链DNA组成的引物对6；
(7)为由SEQ ID No.13所示的单链DNA和SEQ ID No.14所示的单链DNA组成的引物对7；
(8)为由SEQ ID No.15所示所示的单链DNA和SEQ ID No.16所示的单链DNA组成的引物对8；
(9)为由SEQ ID No.17所示的单链DNA和SEQ ID No.18所示的单链DNA组成的引物对9；
(10)为由SEQ ID No.19所示的单链DNA和SEQ ID No.20所示的单链DNA组成的引物对10。
2.一种区分谷子品种的成套PCR试剂，由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6、PCR试剂7、PCR试剂8、PCR试剂9和PCR试剂10组成；
所述PCR试剂1包括权利要求1所述成套引物中的引物对1；
所述PCR试剂2包括权利要求1所述成套引物中的引物对2；
所述PCR试剂3包括权利要求1所述成套引物中的引物对3；
所述PCR试剂4包括权利要求1所述成套引物中的引物对4；
所述PCR试剂5包括权利要求1所述成套引物中的引物对5；
所述PCR试剂6包括权利要求1所述成套引物中的引物对6；
所述PCR试剂7包括权利要求1所述成套引物中的引物对7；
所述PCR试剂8包括权利要求1所述成套引物中的引物对8；
所述PCR试剂9包括权利要求1所述成套引物中的引物对9；
所述PCR试剂10包括权利要求1所述成套引物中的引物对10。
3.根据权利要求2所述的成套PCR试剂，其特征在于：所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10的各条引物的物质的量相同。
4.权利要求1的成套引物或权利要求2或3所述的成套PCR试剂在区分或辅助区分谷子品种中的应用。
5.一种区分待测谷子a和待测谷子b是否为同一品种的方法，包括如下步骤：
用权利要求1所述的成套引物中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10分别对待测谷子a和待测谷子b进行PCR扩增，得到待测谷子a的10对引物对的PCR扩增产物和待测谷子b的10对引物对的PCR扩增产物；检测所述待测谷子a的10对引物对的PCR扩增产物和所述待测谷子b的10对引物对的PCR扩增产物的大小；
分别比较所述10对引物对中同一对引物对扩增得到的待测谷子a的PCR扩增产物大小和待测谷子b的PCR扩增产物大小；
若所述10对引物对中每对引物对扩增得到的待测谷子a的PCR扩增产物大小和待测谷子b的PCR扩增产物大小均相同，则所述待测谷子a和所述待测谷子b为或候选为同一品种；若所述10对引物对中至少一对引物对扩增得到的待测谷子a的PCR扩增产物大小和待测谷子b的PCR扩增产物大小不同，则所述待测谷子a和所述待测谷子b不为或候选不为同一品种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的模板为待测谷子a或待测谷子b的基因组DNA。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述引物对1进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物对2进行PCR扩增的退火温度为57℃；所述引物对3进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物对4进行PCR扩增的退火温度为51℃；所述引物对5进行PCR扩增的退火温度为57℃；所述引物对6进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物对7进行PCR扩增的退火温度为57℃；所述引物对8进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物对9进行PCR扩增的退火温度为57℃；所述引物对10进行PCR扩增的退火温度为55℃。
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