CN101358234B - 中药粉萆薢主要混淆基原叉蕊薯蓣鉴定ISSR-SCARs标记 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药粉萆薢主要混淆基原叉蕊薯蓣的分子鉴别方法，该方法在对叉蕊薯蓣和中药粉萆薢正宗基原粉背薯蓣在进行总DNA提取、PCR扩增、引物筛选、ISSR-SCARs扩增与检测、分析等过程的基础上，找到了鉴定叉蕊薯蓣的ISSR-SCARs标记及鉴别方法。使用本发明公开的引物进行PCR反应可以从叉蕊薯蓣中获得长度为960bp扩增片段，而在粉背薯蓣中无此片段。根据这个ISSR-PCR扩增片段的差异，设计出可鉴别中药粉萆薢不同基原植物的高特异性鉴别引物，并能成功进行叉蕊薯蓣的高特异性PCR鉴别。
Description
技术领域：
本发明属于分子标记技术及生药鉴定学领域，是一组鉴别中药粉萆薢基原及主要混淆基原植物的分子鉴别方法。
背景技术：
按照《中华人民共和国药典》(2005版)，中药粉萆薢(Rhizoma Dioscoreae Hypoglaucae)的基原主要是薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)根状茎组(Sect.Stenophora)粉背薯蓣(D.collettii var.hypoglauca Pei et C.T.Ting.)，粉背薯蓣原变种叉蕊薯蓣(D.collettii Hook.f.)在某些地方作粉萆薢的地方习用品使用，由于是变种关系，所以这2个种基原植物及药材无论是外部形态、组织结构还是淀粉粒形态都很相似，采用常规的方法，不易对其进行鉴别，它们的trnL-F、rcbL和matk序列比对差异也很小。
序列特异性扩增区域(Seqμence characterized amplified regions，SCARs)是从RAPD衍生而来的一种分子标记，是由Paran和Michelmore发展出的，这些标记是对感兴趣的PAPD片段进行克隆测序，通过序列分析，设计出一对互补到原来RAPD片段两端的20bp左右引物，用这对引物对原来的模板进行了PCR扩增，这样单一位点的特征扩增区域被特异性扩增。这些SCARs或维持原来RAPD片段的共显性分离的行为，或转换成共显性标记。SCARs克服了RAPD重复性差的缺点，使用专一性的引物和严格的PCR条件；另外，SCARs是限定的基因组区域的可重复扩增，更适用于有关种之间的同源性的研究，目前，又发展出了直接根据测序结果设计进行的序列特异性扩增及基于ISSR标记的SCARs技术，已广泛应用于植物、药材等的特异性鉴定。
目前，国内外尚无有关ISSR-SCARs标记鉴别中药粉萆薢基原植物粉背薯蓣和叉蕊薯蓣的报道，本发明填补了该领域的空白。
发明内容：
本发明的目的是提供鉴别叉蕊薯蓣的一组引物和一段DNA片段。
本发明的另外一个目的是提供鉴别叉蕊薯蓣的方法
本发明运用ISSR方法在叉蕊薯蓣基因组中扩增出一条特异性条带，通过克隆和测序获得一段长度为1170bp的DNA序列(SEQ-1)，并根据此序列设计了一组鉴别叉蕊薯蓣的引物。本发明提供了一对引物，其序列如SEQ-2(上游引物)和SEQ-3(下游引物)所示，它们分别对应于SEQ-1序列的51-71nt及990-1010nt位点，扩增出的片段长度为960bp。
本发明提供一种鉴别叉蕊薯蓣的方法，其特征在于根据样品的PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果鉴定样品的来源。该方法中PCR引物根据SEQ-1所示的序列设计合成。该方法中PCR产物的电泳结果中出现一段960bp条带的样品为叉蕊薯蓣，而相同部位没有出现条带的样品为粉背薯蓣。
反应体系为20μl，其组分及终浓度为：10×Buffer2.0μl，MgCl22.0μl，dNTP(10mm)0.6μl，引物各0.6μl(10mm)，模板DNA25ng/μl2μl，Tag聚合酶1μ，最后用水补齐20μl，PCR程序为95℃变性2.5min，95℃40s，58℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸5min。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
应用购自上海生物工程技术有限公司的64个ISSR引物，选取了其中扩增条带丰富、信号强的16个引物进行实验。其中引物ISSR-37(序列为5`-(AT)8CA-3`)、ISSR-59(序列为5`-(TG)8GC-3`)、ISSR-63(序列为5`-(AG)8TG-3`)、ISSR-810(序列为5`-(GA)8T-3`)在叉蕊薯蓣和粉背薯蓣中各扩增出了一条多态性条带，其中ISSR-63共扩增出了7个位点，在叉蕊薯蓣中扩增出的多态性条带大小约1.2kb，与其它带的距离较远，对此带进行切胶回收并构建载体进行序列测定，部分ISSR引物对叉蕊薯蓣和粉背薯蓣的扩增结果见图1。
将ISSR-63在叉蕊薯蓣中扩增出的多态性条带进行克隆、测序，序列如SEQ-1所示，片段长度为1170bp，将该序列在Genbank上进行序列比对，未发现与之同源的序列。
根据该序列设计出一对SCAR引物：SEQ-2：5′-ACTTGGAGGAGAGGGCATCAG-3′，SEQ-3：5′-TTCGGGATGTTACAGTTCTGG-3′，分别对应于SEQ-1序列的51-71nt及990-1010nt位点。
通过对4个叉蕊薯蓣居群和4个粉背薯蓣居群检验这对引物的有效性，结果表明，除叉蕊薯蓣中出现预期的长度为960bp的SCAR条带外，粉背薯蓣中没有出现SCAR条带(图2)。4个叉蕊薯蓣中3个居群均扩增出一条长1099bp的条带，云南蒙自样品呈现极淡的带谱。
综上所述，本发明提供了一段长度为1170bp的叉蕊薯蓣特异性的DNA序列，并根据该序列设计引物，可以用于叉蕊薯蓣的鉴别，检验结果证明了引物和PCR方法可以准确鉴别叉蕊薯蓣和粉背薯蓣。
附图说明：
图1叉蕊薯蓣和粉背薯蓣部分ISSR引物扩增图谱
粉背薯蓣：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21；
叉蕊薯蓣：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22；
从左至右引物顺序：ISSR-4、ISSR-8、ISSR-9、ISSR-12、ISSR-17、ISSR-24、ISSR-43、ISSR-48、ISSR-59、ISSR-63、ISSR-74。
图2叉蕊薯蓣和粉背薯蓣验证结果，叉蕊薯蓣：1云南蒙自，3四川峨嵋，5广西田林，7云南景洪；粉背薯蓣：2浙江临安，4湖南永顺，6重庆南川，8湖南衡山。M：DNA分子量标记物
具体实施方式：
.DNA提取和ISSR-SCARs标记的获得
实验选取生长状况良好植株中部的健康嫩叶，去掉主脉，70％的酒精擦去叶片表面的灰尘，参照Paterson等的CTAB法提取总DNA。选择广西田林的叉蕊薯蓣和湖南衡山的粉背薯蓣作为ISSR-SCARs实验样品，其他3个居群(云南景洪、云南蒙自、四川峨嵋)的叉蕊薯蓣和3个居群(浙江临安、湖南永顺、重庆南川)的粉背薯蓣样品仅作验证。
ISSR引物的筛选的在PE-9700PCR仪上进行，反应体系为20μl。20μl的反应体系包括：1×Tag DNA酶缓冲液(10mmTris-HCl，50mmKCl，0.1％Trionx-100，PH8.4)，2.5mMMgCl2，1μTag酶，50ng模板，0.4μM引物，各0.4mM的dATP，dGTP，dCTP和dTTP。PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃保温7min，4℃保存。PCR产物在0.8％的琼脂糖胶中电泳1小时左右，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统进行拍照，记录实验结果。
经过筛选64条ISSR引物找到叉蕊薯蓣的特异性条带。利用上海生物工程技术有限公司生产的离心式凝胶回收试剂盒对该特异性条带进行回收，纯化。连接反应参照PGEM-T Easyvector Systems I说明书。连接反应的体系(10μl)：包括以下组分：DNA3μl，vector1μl，buffer5μl，T4ligase1μl，16摄氏度连接2小时(连接的DNA就是割胶纯化的产物，载体就是TA载体，购自promega公司)。
对连接产物进行纯化，取纯化好的连接产物2μl，把已经制好的大肠杆菌DH5a感受态拿出来，把2μl的连接产物加入感受态细胞中，轻轻搅动，使感受态细胞都融化，转入电转杯中，1500V电压电击，取出电转杯，加入500ml液体LB，于37℃，200rpm的摇床中培养1小时，涂平板，放在培养相中过夜培养。挑选菌落，做PCR检测。最后将PCR产物再次纯化，测序。
本发明中该特异序列为SEQ-1。根据该特异序列设计出一对长度皆为21个碱基的特异性引物用于SCAR反应，本发明中这对引物为SEQ-2和SEQ-3。
2.ISSR-SCARs标记的验证实验
以SEQ-2和SEQ-3这对引物为扩增引物，用4个居群的叉蕊薯蓣和4个居群的粉背薯蓣DNA模板进行PCR扩增。反应体系为20μl，其组分及终浓度为：10×Buffer2.0μl，MgCl22.0μl，dNTP(10mm)0.6μl，引物各0.6μl(10mm)，模板DNA25ng/μl2μl，Tag聚合酶1μ，最后用水补齐20μl，PCR程序为95℃变性2.5min，95℃40s，58℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸5min。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
序列表
<110>江苏省中国科学院植物研究所
<120>中药粉萆薢主要混淆基原叉蕊薯蓣鉴定ISSR-SCARs标记
<160>3
<210>1
<211>1170
<212>DNA
<213>来源于叉蕊薯蓣(D.collettii Hook.f.)
<400>1
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工引物
<400>2
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工引物
<400>3
Claims (4)
1.中药粉萆薢主要基源粉背薯蓣与混淆基原叉蕊薯蓣间DNA分子鉴别的特异性片段，其序列为SEQ ID NO：1。
2.粉背薯蓣与叉蕊薯蓣DNA分子鉴别的一组引物，序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
3.粉背薯蓣与叉蕊薯蓣DNA分子鉴别方法，其特征在于该方法是利用序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物，对待鉴别的粉背薯蓣或叉蕊薯蓣样品以PCR反应体系进行PCR反应，然后通过PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果鉴定样品，PCR产物电泳结果中出现一条960bp条带的样品为叉蕊薯蓣，而相同部位没有出现条带的样品则为粉背薯蓣。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于该PCR反应的程序为95℃变性2.5min，95℃40s，58℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸5min，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
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