CN107236821B - 一种用于西葫芦杂交种子纯度鉴定的ssr引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于西葫芦杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述引物包括引物SGSSR25的上游引物SGSSR25‑F和下游引物SGSSR25‑R，所述上游引物SGSSR25‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物SGSSR25‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。还公开了一种西葫芦杂交种子纯度的鉴定方法，该引物和方法可对西葫芦杂交种子及其母本、父本种子进行有效区分，快速、准确检测出杂交种子纯度，同时具有快速、准确、低成本、操作简单等优点。
Description
技术领域
本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及一种西葫芦杂交种子纯度的鉴定的SSR 引物及鉴定西葫芦杂交种子纯度的方法。
背景技术
西葫芦(Cucubita pepo L．)也叫美洲南瓜，是葫芦科南瓜属的一年生蔓性草本植物，西葫芦是人类晟早栽培的作物之一，其味道鲜美，营养丰富，也有药用价值的优点受到大众喜爱。在西葫芦的生产上，其适应性较强。种植周期较短，栽培相对容易，产品产量较高，供应周期很长，也比较容易贮存且适宜间作套种的好处，在我国有大范围的种植，现已成为我国瓜类蔬菜的主要栽品种之一，栽培面积次于黄瓜。利用杂种优势，培育一代杂交西葫芦品种是目前西葫芦育种的主要方法。由于在西葫芦杂交制种过程中，人工去雄不彻底或漏去雄等原因，常会出现假杂交种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大的经济损失，同时，一些不法分子或种子经营单位为追求高额利润，以劣充好，假冒伪劣种子进入市场并用于生产，造成西葫芦减产和品质降低，进而影响优良品种的市场销售信誉及其产业化发展。因此，优良一代杂交种种子真实性和／或品种纯度的快速、准确（简便、经济）鉴定成为西葫芦生产中最为迫切解决的问题之一。
传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。随着分子生物学的迅速发展，使从DNA 分子水平上对品种纯度进行基因鉴定和分析成为可能。采用分子标记技术进行种子纯度鉴定是一种快速、便捷、准确、有效的方法。微卫星序列即简单重复序列（Simplesequence repeat，SSR）分子标记，广泛存在于真核和原核生物基因组中。因其位点特异、复等位、呈共显性，在基因组序列中分布广泛等优点已经成为最为广泛的分子标记之一，也是目前作物品种鉴定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一。迄今为止，尚未见到利用SSR分子标记技术鉴定西葫芦杂交种子纯度的报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于西葫芦杂交种子纯度鉴定的SSR 引物，该引物能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强。
本发明的目的还在于提供一种西葫芦杂交种子纯度的鉴定方法，该方法利用上述SSR 引物，能快速、便捷、准确、有效的鉴定西葫芦杂交种子纯度。
为实现以上目的，采用以下技术方案：
一种用于西葫芦杂交种子纯度鉴定的SSR 引物，所述引物包括引物SGSSR25 的上游引物SGSSR25-F 和下游引物SGSSR25-R，所述上游引物SGSSR25-F 的核苷酸序列如SEQID NO.1 所示，所述下游引物SGSSR25-R 的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
引物SGSSR25 的上游引物SGSSR25-F 和下游引物SGSSR25-R 的具体核苷酸序列如下：
SGSSR25-F:5’- GGCATTTCCTCCCCATTTAT-3’(SEQ ID NO.1) ；SGSSR25-R:5’-AAATATGTGGCCAGCGACTC-3’(SEQ ID NO.2)。
一种西葫芦杂交种子纯度的鉴定方法，含以下步骤：
(1) 提取西葫芦亲本以及杂种后代基因组DNA ；
(2) 以西葫芦基因组DNA 为模板，使用上述SSR 引物引物SGSSR25 进行PCR 扩增；
(3) 对扩增产物进行凝胶电泳；
(4) 对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，引物SGSSR25 能产生256bp的父本特异性条带以及212bp 的母本特异性条带。
在上述各步骤中：
本发明步骤(2) 中PCR 扩增时采用的反应体系优选为：50 ng基因组DNA 1μL，0.2mmol·L-1 dNTP 1 μL，500 μ Taq DNA聚合酶0.3 μL，0.4 μmol·L-1的引物各1 μL，2.5 μL10×Buffer，加入灭菌的超纯水至25 μL。
本发明步骤(2) 中PCR 扩增时扩增程序优选为：94 ℃预变性3 min；然后进行35个循环，每个循环包括94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min；最后72 ℃延伸10 min，置于4℃保存。
本发明具有如下优点：
(1) 本发明中的SSR 引物SGSSR25 能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强；
(2) 本发明的方法可将西葫芦杂交种子与其父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；
(3) 本发明的检测方法在5h 之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、准确、低成本、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1 为筛选获得的1 对SSR 引物用于西葫芦杂交种及其双亲扩增产物的电泳分析图谱。其中，M ：Marker；P1：父本；P2：母本；F1：杂交种。
图2为12 株单株及其双亲扩增产物的电泳分析图谱。其中，M ：Marker；P1：父本；P2：母本；F1：杂交种；3：假杂种；1-2,4-12：抽样西葫芦杂交种。
图3 为11 株单株及其双亲扩增产物的电泳分析图谱。其中，M ：Marker；P1：父本；P2：母本；F1：杂交种；5：假杂种；1-4,6-11：抽样西葫芦杂交种。
具体实施方式
实施例1 杂交种西葫芦种子纯度检测方法的建立
1、筛选纯度鉴定的SSR 引物
根据西葫芦转录组测序结果设计的引物若干对在亲本及子代间进行筛选，选出共显性差异标记条带的引物SGSSR25，该标记带型清晰、重复性好，序列如下所示：
SGSSR25-F:5’- GGCATTTCCTCCCCATTTAT -3’(SEQ ID NO.1) ；SGSSR25-R:5’-AAATATGTGGCCAGCGACTC -3’(SEQ ID NO.2)。
以西葫芦基因组DNA 为模板，使用上述SSR 引物SGSSR25 进行PCR 扩增，对扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果显示，SSR 引物SGSSR25 能产生256bp 的父本特异性条带以及212bp 的母本特异性条带。
2、利用上述特异性引物对杂交西葫芦种子进行纯度鉴定
2.1 西葫芦DNA 的提取
（1）用酒精擦拭所选取的长势良好，形态完整的西葫芦幼嫩叶片，之后快速剪取0.3g 嫩叶放入研钵中，加入液氮和0.1 g的PVPP快速充分研磨至粉末状，之后将粉末放入1.5 mL的离心管中；
（2）向离心管中加入600 μL预热至65℃的2%CTAB 提取缓冲液和7 μL β-琉基乙醇，充分混匀后，放入65℃水浴锅中1 h，期间多次摇匀；
（3）从水浴锅中取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻缓颠倒混匀，静置10 min，后于4℃下12000 rpm离心10 min；
（4）用移液枪取离心管中的上清液加入另一新的1.5 mL离心管中，随后加入100 μL 3mol/L NaAc和300 μL的氯仿/异戊醇充分混匀，在4℃下12000 rpm离心10 min；
（5）再次用移液枪吸取上清液至新的1.5 mL离心管中，并加入0.6倍体积异丙醇，轻轻颠倒混匀至能看到白色絮状物，后于4℃冰箱静置30~60 min，之后于4℃下12000 rpm离心10 min；
（6）用75％的乙醇洗涤DNA 2-3次，随后放于超净工作台上。将风干后的DNA溶于100 μL TE溶液，再加入2.5 μL RNase A去除RNA，并存于37℃的水浴锅中20 min-30 min保存备用；
（7）吸取4 μL DNA溶液与2 μL溴酚蓝混合，在1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA纯度，保存于4℃或-20℃备用。
2.2 SSR-PCR 扩增
PCR 扩增时采用的反应体系为：50 ng基因组DNA 1μL，0.2 mmol·L-1 dNTP 1 μL，500 u Taq DNA聚合酶0.3 μL，0.4 umol·L-1的引物各1 μL，2.5 μL 10×Buffer，加入灭菌的超纯水至25 μL。
PCR 扩增时扩增程序为：94 ℃预变性3 min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min；最后72 ℃延伸10 min，置于4℃保存。
PCR扩增产物经电泳后观察拍照。
2.3 EST-SSR 结果分析
供试品种杂交种带型为母本1 条与父本相异于母本的1条，这2条特征谱带的集合，也就是共显性的互补带型(见图1)。
实施例2
采用实施例1 的方法对从福建省农业科学院蔬菜基地的种子纯度鉴定田间取的12株西葫芦，对其单株编号，提取单株DNA 进行检测（见图2），检测结果：杂交种子11株，父本1 株，种子纯度为91.67％，与田间检测结果一致。
实施例3
采用实施例1 的方法对从蔬菜中心基地的种子纯度鉴定田间取的11株西葫芦，对其单株编号，提取单株DNA 进行检测（见图3），检测结果：杂交种子10株，母本1株，种子纯度为90.9％，与田间检测结果一致。
以上实施例表明，本发明的方法可将西葫芦杂交种子与其父母本种子进行有效区分，快速、准确检测出种子纯度。
以上列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院作物研究所
<120> 一种用于西葫芦杂交种子纯度鉴定的SSR 引物及方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcatttcct ccccatttat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaatatgtgg ccagcgactc 20
Claims (4)
1.一种用于西葫芦杂交种子纯度鉴定的SSR 引物，其特征在于：所述引物包括引物SGSSR25 的上游引物SGSSR25-F 和下游引物SGSSR25-R，其序列如下所示：
SGSSR25-F:5’- GGCATTTCCTCCCCATTTAT-3’；
SGSSR25-R:5’- AAATATGTGGCCAGCGACTC-3’。
2.一种西葫芦杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于：含以下步骤：
（1）提取西葫芦亲本以及杂种后代基因组DNA；
（2） 以西葫芦基因组DNA 为模板，使用权利要求1 中所述的引物SGSSR25进行PCR 扩增；
（3）对扩增产物进行凝胶电泳；
（4）对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，引物SGSSR25 能产生256 bp 的父本特异性条带以及212bp 的母本特异性条带。
3.根据权利要求2所述的西葫芦杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于：PCR 扩增的反应总体积为25μL：50 ng基因组DNA 1μL，0.2 mmol·L-1 dNTP 1 μL，500 μ Taq DNA聚合酶0.3 μL，0.4 μmol·L-1的引物各1 μL，2.5 μL 10×Buffer，加入灭菌的超纯水至25 μL。
4.根据权利要求2所述的西葫芦杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于：步骤（2）中PCR扩增时扩增程序为：94 ℃预变性3 min；然后进行35个循环，每个循环包括94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min；最后72 ℃延伸10 min，置于4℃保存。
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Patent Citations (3)
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| SSR 标记技术在种子纯度鉴定中的研究进展;李巧英;《中国种业》;20091115(第11期);第22-23页 * |
| 利用SSR进行品种纯度鉴定的研究进展;乔军等;《天津农业科学》;20110825;第17卷(第4期);第45-51页 * |
| 南瓜属EST-SSR标记的开发及在杂种纯度鉴定中的应用;张国裕等;《华北农学报》;20111128;第26卷(第6期);第98页左栏第3段、"2结果与分析"、"3．2南瓜属EST-SSR在杂种纯度鉴定中的应用"、表3 * |
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Application publication date: 20171010 Assignee: Fujian Yuanwangyuan Seeds Group Co.,Ltd. Assignor: CROP Research Institute OF FUJIAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2023350000364 Denomination of invention: A SSR primer and method for purity identification of hybrid seeds of zucchini Granted publication date: 20201110 License type: Common License Record date: 20230926 |
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Application publication date: 20171010 Assignee: XIAMEN ZHONGXIA SEED Co.,Ltd. Assignor: Crop Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Fujian Provincial Germplasm Resources Center) Contract record no.: X2024350000009 Denomination of invention: A SSR primer and method for purity identification of hybrid seeds of zucchini Granted publication date: 20201110 License type: Common License Record date: 20240115 |
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