CN110093444B - 鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记、引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记、引物及应用,该鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记的序列位于辣椒叶绿体基因组上rpl23和trnI的基因间隔区。该鉴定辣椒品种的分子标记引物的序列如下SEQID NO:3和SEQID NO:4所示。采用鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记引物可准确地对辣椒材料进行种及变种鉴定和分类。

Description

鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记、引物及其应用
技术领域
本发明涉及植物领域,尤其涉及一种鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记、引物及其应用。
背景技术
辣椒是世界上最重要的农作物之一,同时是中国栽培面积第一的蔬菜。辣椒用途广泛,既可鲜食,也作为调料,辣椒还具有重要的药用价值和观赏用途。辣椒的果实形态、风味和辣味是其最重要的经济性状。不同辣椒材料的果实变异极为丰富。
辣椒属作物大约有32个野生种和5个栽培种,存在2种基本的染色体数目(n=12和n=13),5个辣椒栽培种的染色体数目均为n=12。栽培辣椒的分类始终是一个令人困扰的问题,目前主要是基于几个典型的植物学性状将辣椒分为5个栽培种,这些性状包括种子颜色、花冠颜色和形状、花丝颜色以及每节花数。
基于种间的亲和关系,5个栽培种被进一步归为3个复合群(A、B和P)A复合群包含Capsicum annuum L.(var.glabriusculum(Dunal)Heiser&Pickersgill和var.annuum)、C.frutescens L、C.chinense Jacq和C.galapagoense Hunz。B复合群包括C.chacoenseHunz、C.baccatumL.(var.baccatum和var.pendulum(Willd.)Eshbaugh)、C.praetermissumHeiser&P.G.Sm.和C.tovarii Eshbaugh,P.G.Sm.&Nickrent。P复合群包含C.cardenasii、C.eximium和C.pubescens Ruiz&Pav。
染色体核型分析和分子系统发育研究证明3个类群辣椒的起源地各不相同。虽然根据核型分析能够分出辣椒属中的A复合群材料,但分子水平上清晰区分各种栽培辣椒的问题仍然有待解决。此外,C.annuum是辣椒属中衍生最多的分枝,然而A复合群内不同变种辣椒之间的关系也不甚清楚。
总的来讲,目前依然无法准确地鉴定不同种及变种的栽培辣椒。
发明内容
基于此,有必要提供一种鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记、引物及其应用,可实现准确地对辣椒材料进行种及变种的鉴定和分类。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
本发明提供一种鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记,所述分子标记的序列位于辣椒叶绿体基因组上rpl23和trnI的基因间隔区,包括如SEQID NO:1和SEQID NO:2所示的重复序列。
SEQID NO:1的序列为:
5'-TATTCATATATTATGATATGAATATACCACATCAATTCGTTATG-3'。
SEQID NO:2的序列为:
5'-TGTTCATATATTATGATATGAATATACCACATCAATTCGTTATG-3'。
本发明还提供一种鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记的获取方法,包括如下步骤:
提取辣椒DNA;
构建属于不同种及变种的批量辣椒种质的高通量测序DNA文库,进行高通量测序分析;
以C.annuum的叶绿体基因组为参考基因组,对各个种质测序数据进行叶绿体基因组组装;
通过聚类的方式构建辣栽培椒种及变种的叶绿体泛基因组,获得7个叶绿体泛基因组;
分别对CDS、内含子和基因间隔区的遗传多样性进行分析,在不同泛基因组之间,确定rpl23和trnI的基因间隔区存在丰富的变异,包括如SEQID NO:1和SEQID NO:2所示的44bp串联重复序列。
根据大批量种质的质体基因组组装获得不同种和变种的泛质体基因组,这种策略有助于:(1)避免单一材料的聚类不明确;(b)在质体基因组水平有效评估种内和种间的变异;(c)开发有效的分子标记用于正确区分各个种或变种的质体基因组。
高等植物中,叶绿体基因组中的一些基因,如matk和rbcL通常被优先用来解决分类问题。然而,亲缘关系密切的种或变种之间往往在叶绿体特定基因上缺乏变异。随着高通量测序技术的出现,根据测序数据可以较容易地组装质体基因组,并具有广泛用途。叶绿体基因组是一个具有四分体结构的单一环状染色体,包括2个反向重复区域(IR)、1个大片段单拷贝区(LSC)和1个小片段单拷贝(SSC)。质体基因组的丰富变异以及遗传保守性便于用于高分辨率地分类。
本发明还提供一种鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记引物,所述引物如SEQIDNO:3和SEQID NO:4所示,其中,
SEQID NO:3的序列为:5'-CTTTCCGGAAGTCGATGACT-3',
SEQID NO:4的序列为:5'-ATCCCCCTAAGCATCCATG-3'。
本发明还提供一种鉴定辣椒栽培种及变种的试剂盒,所述试剂盒含上述鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记引物。
上面所述的鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记引物或者上面所述的鉴定辣椒栽培种及变种的试剂盒在鉴定辣椒种质或品种中的应用。
在其中一个实施例中,所述应用采用PCR法。
本发明还提供一种鉴定辣椒栽培种及变种的方法,包括如下步骤:
以辣椒DNA为模板,采用上面所述的鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记引物进行PCR扩增,扩增产物进行凝胶电泳检测;
依据电泳结果进行品种判断:
若扩增产物为550bp,则判定该辣椒种质属于Capsicum chacoense;
若扩增产物为730bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.baccatumvar.baccatum;
若扩增产物为640bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.baccatum;
若扩增产物为540bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.annuumvar.glabriusculum;
若扩增产物为525bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.annuum var.annuum;
若扩增产物为535bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.chinense;
若扩增产物为530bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.frutescen;
若扩增产物为670bp,则判定该辣椒种质属于Capsicum galapagoense。
优选地,所述PCR反应体系总体积为15μL,具体成分如下:
Figure BDA0002065833270000041
优选地,所述PCR扩增的程序如下:94℃预变性3min;94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸45s,34次循环;72℃延伸5min。
优选地,所述凝胶电泳采用琼脂糖凝胶电泳。
本发明的有益效果是:
(1)本发明通过泛质体基因组研究确定鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记为位于辣椒叶绿体基因组上rpl23和trnI的基因间隔区,该间隔区序列具有高度的多态性。
(2)本发明的鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记引物能够准确区分复合群A和B及其分支,准确鉴定不同种及变种的栽培辣椒。
附图说明
图1为实施例3中辣椒栽培种及变种鉴定的电泳条带图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
植物材料:来自湖南省蔬菜研究所和美国农业部(USDA-ARS)。
实施例1
本实施例提供一种鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记的获取方法,包括如下步骤:
S1,使用DNeasy植物小型试剂盒提取辣椒DNA。
S2,利用IlluminaTruSeq文库制备试剂盒构建双端测序DNA文库,并利用HiSeq2000进行重测序分析,测序深度为11×。
S3,以C.annuum的叶绿体基因组为参考基因组(GenBank:JX270811)对重测序数据进行叶绿体基因组组装,所用软件为Geneious R11。
S4,叶绿体泛基因组构建:通过聚类的方式构建辣椒种及变种的叶绿体泛基因组,共产生7个叶绿体泛基因组。
S5,利用Tandem Repeat Finder识别串联重复序列:
在种/变种间,分别对CDS、内含子和基因间隔区(IGS)的遗传多样性进行分析。
分析发现rpl23和trnI的IGS在不同泛基因组之间存在明显的长度变异,rpl23和trnI的IGS存在如SEQID NO:1和SEQID NO:2所示的44bp串联重复序列、其他小片段重复序列以及小片段插入与缺失等变异,适合用于下游分析。
其中,SEQID NO:1的序列:
5'-TATTCATATATTATGATATGAATATACCACATCAATTCGTTATG-3'。
SEQID NO:2的序列:
5'-TGTTCATATATTATGATATGAATATACCACATCAATTCGTTATG-3'。
实施例2
本实施例提供一种鉴定辣椒品种的分子标记引物,利用Geneious R11中的引物设计工具设计引物PepID-cp,序列如下表所示:
Figure BDA0002065833270000061
实施例3
本实施例利用实施例2获得的鉴定不同种及变种栽培辣椒的分子标记引物,对来自湖南省蔬菜研究所和美国农业部的39份辣椒材料进行基因型鉴定,并比较分子标记鉴定结果与分类结果,其步骤如下:
(1)以辣椒基因组DNA为模板,浓度为80-150ng/μL;采用分子标记引物PepID-cp进行PCR扩增,其正向引物序列为PepID-cp-F,反向引物序列为PepID-cp-R。
PCR反应体系总体积为15μL,具体成分如下:
Figure BDA0002065833270000071
(2)PCR反应在S1000型PCR仪(Bio-Rad,美国)上进行。PCR扩增程序如下:
94℃预变性3min;94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸45s,34次循环;72℃延伸5min,4℃保存。
(3)扩增产物经1.5%或略高于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
如图1所示,在电泳条带图中,Capsicum chacoense(CCha)所对应的扩增产物约为550bp,C.baccatumvar.baccatum(CBB)所对应的扩增产物约为730bp,C.baccatum(CB)所对应的扩增产物约为640bp,C.annuumvar.glabriusculum(CAG)所对应的扩增产物约为540bp,C.annuumvar.annuum(CAA)所对应的扩增产物约为525bp,C.chinense(CC)所对应的扩增产物约为535bp,C.frutescen(CF)所对应的扩增产物约为530bp,Capsicumgalapagoense(CG)所对应的扩增产物约为670bp。
以鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记引物PepID-cp-F和PepID-cp-R为引物,采用PCR法和凝胶电泳检测相配合的方式,能够准确地鉴定栽培辣椒种质和品种的分类。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记、引物及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tattcatata ttatgatatg aatataccac atcaattcgt tatg 44
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttcatata ttatgatatg aatataccac atcaattcgt tatg 44
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctttccggaa gtcgatgact 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atccccctaa gcatccatg 19

Claims (10)

1.一种鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记,所述分子标记的序列位于辣椒叶绿体基因组上rpl23和trnI的基因间隔区,包括如SEQID NO:1和SEQID NO:2所示的重复序列。
2.一种权利要求1所述的鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记的获取方法,其特征在于,包括如下步骤:
提取辣椒DNA;
构建属于不同种及变种的批量辣椒种质的高通量测序DNA文库,进行高通量测序分析;
以C.annuum的叶绿体基因组为参考基因组,对各个种质测序数据进行叶绿体基因组组装;
通过聚类的方式构建辣椒栽培种及变种的叶绿体泛基因组,获得7个叶绿体泛基因组;
分别对CDS、内含子和基因间隔区的遗传多样性进行分析,在不同泛基因组之间,确定rpl23和trnI的基因间隔区存在变异,包括如SEQID NO:1和SEQID NO:2所示的重复序列。
3.一种鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记引物,所述引物如SEQID NO:3和SEQID NO:4所示。
4.一种鉴定辣椒栽培种及变种的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含权利要求3所述的鉴定辣椒品种的分子标记引物。
5.权利要求3所述的鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记引物或者权利要求4所述的鉴定辣椒栽培种及变种的试剂盒在鉴定辣椒种质或品种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用采用PCR法。
7.一种鉴定辣椒栽培种及变种的方法,其特征在于,包括如下步骤:
以辣椒DNA为模板,采用权利要求3所述的鉴定辣椒栽培种及变种的分子标记引物进行PCR扩增,扩增产物进行凝胶电泳检测;
依据电泳结果进行品种判断:
若扩增产物为550bp,则判定该辣椒种质或品种属于Capsicum chacoense;
若扩增产物为730bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.baccatum var.baccatum;
若扩增产物为640bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.baccatum;
若扩增产物为540bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.annuum var.glabriusculum;
若扩增产物为525bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.annuum var.annuum;
若扩增产物为535bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.chinense;
若扩增产物为530bp,则判定该辣椒种质或品种属于C.frutescen;
若扩增产物为670bp,则判定该辣椒种质属于Capsicum galapagoense。
8.根据权利要求7所述的鉴定辣椒栽培种及变种的方法,其特征在于,所述PCR反应体系总体积为15μL,具体成分如下:
Figure FDA0002485082170000021
9.根据权利要求7所述的鉴定辣椒栽培种及变种的方法,其特征在于,所述PCR扩增的程序如下:94℃预变性3min;94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸45s,34次循环;72℃延伸5min。
10.根据权利要求7至9任一项所述的鉴定辣椒栽培种及变种的方法,其特征在于,所述凝胶电泳采用琼脂糖凝胶电泳。
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