CN101597644A

CN101597644A - 一种基于flc基因的萝卜抽薹特性鉴定方法

Info

Publication number: CN101597644A
Application number: CNA2009100328975A
Authority: CN
Inventors: 柳李旺; 黄丹琼; 龚义勤; 姜立娜; 翟璐璐
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2009-12-09

Abstract

本发明涉及一种基于FLC基因的萝卜植株抽薹特性检测方法，属于生物技术领域。以早、晚抽薹特性萝卜品种中抽薹开花密切相关基因FLC序列的DNA差异为基础，设计两对特异引物NauFLC－F1/NauFLC－R1和NauFLC－F2/NauFLC－R2，利用PCR技术，对材料基因组DNA进行FLC基因特异扩增，根据电泳结果迅速准确判定检验材料属于早抽薹类型还是晚抽薹类型。本发明能够有效用于萝卜种质材料抽薹特性的鉴定，快速、准确、高效，可以显著加快春萝卜耐抽薹优良品种的选育进程。

Description

一种基于FLC基因的萝卜抽薹特性鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种根据不同抽薹特性萝卜品种中FLC基因序列差异对植株抽薹特性进行快速准确鉴定的方法。属于生物技术领域。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.)是起源于我国的一种重要世界性蔬菜，染色体2n＝2x＝18，基因组大小约为526Mbp(汪隆植与何启伟，2005)。我国萝卜栽培历史悠久，其面积在所有蔬菜作物中居第2位，在我国蔬菜生产与供应中占有重要的地位(中国农业统计资料，中国农业出版社，2007)。萝卜不仅是人们重要的蔬菜作物，还具有很好的食疗保健作用，近年来国内外研究发现，萝卜具抗癌防癌、防病毒、杀菌等功效。日本、朝鲜、韩国、俄罗斯、乌克兰、印度、美国、德国、荷兰等国也都有大面积的栽培，一直深受世界人们喜爱。

长期以来，人们为选育适合不同栽培季节、不同用途的萝卜优良品种开展了广泛研究。萝卜是十字花科萝卜属一、二年生草本植物，经过冬季低温处理后容易在春季抽薹，导致萝卜肉质根品质与产量严重下降，造成了春季萝卜供应上的“春淡”现象。研究实践表明，培育春季耐抽薹萝卜优良品种是解决春季萝卜供应严重不足的关键措施。准确快速鉴定种质材料抽薹特性是培育晚抽薹萝卜优良品种的重要技术基础。但是传统的萝卜抽薹特性鉴定方法是通过观察春化后植株的抽薹开花时期进行的，该方法费工费时，使得抽薹特性准确鉴定成为限制萝卜春季耐抽薹优良品种选育进程的重要因素。

在模式植物拟南芥中研究发现，FLC(Flowering Locus C)基因编码MADS盒转录因子，是一种依赖剂量效应的开花抑制剂(Sheldon等1999，2000；He与Amasino 2005)。Michaels与Amasino(1999)、Sheldon等(1999，2000)通过遗传分析发现，拟南芥中FLC等位基因变化产生了早花和晚花生态型；显性FLC等位基因表现为晚花，隐性FLC等位基因表现为早花。春化作用通过抑制春化途径开花植物中FLC基因的表达，使得植物开花提前(Lee与Amasino，1995)。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于针对目前萝卜种质材料抽薹特性鉴定周期长、结果不稳定，从而严重限制了春季耐抽薹优良品种选育进程的问题，研究提供一种新型快速准确的萝卜抽薹特性鉴定方法。该方法显著提高了萝卜种质材料抽薹特性鉴定效率，缩短了春季耐抽薹优良品种选育的时间，鉴定过程科学、迅速，鉴定结果准确、可靠。

技术方案

本发明利用本室克隆的不同抽薹特性萝卜品系中抽薹开花关键基因FLC的基因序列差异与抽薹特性密切相关的特性，根据序列差异区域设计特异引物，以待检验的材料基因组DNA为模板，在本发明的扩增条件下，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带，出现早抽薹特异性条带或晚抽薹特异性条带，据此迅速、准确可靠地鉴定待检植株的抽薹特性。

本发明的技术方案中，各个步骤的技术关键包括：

1、萝卜幼苗的培育；

2、萝卜基因组DNA提取；

(1)取0.2g萝卜幼嫩叶片于研钵中，用液氮充分研磨成粉末，0.4mL/次分两次加入CTAB裂解缓冲液，转移至2.0mL中，轻轻摇匀，于65℃水浴30分钟；

(2)取出离心管，待管中溶液降至室温后，11200rpm离心8分钟，将上清液转入新离心管中；

(3)加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，将离心管缓慢翻转几次，静置2分钟；16℃，11200rpm离心8min；

(4)将上清液吸入新离心管中，加入70μL 3.0M醋酸钠(pH 5.2)与900μL预冷异丙醇并缓慢翻转1min，放于-20℃冰箱4h；

(5)8℃，11200rpm，离心6分钟，倒掉上清液，加入200μL预冷的70％乙醇清洗DNA小团；

(6)倒掉上清液，真空干燥，加100μL灭菌的TE缓冲液溶解DNA，质量体积比0.8％琼脂糖凝胶电泳检测质量；DNA用紫外分光光度计测定浓度后，再灭菌的1×TE缓冲液或ddH₂O稀释至10ng/μL用于PCR扩增分析。

3、FLC基因特异引物设计与合成；

本发明用于鉴定萝卜植株抽薹性状的FLC基因特异引物有两对，序列如下：

4、使用特异引物进行PCR扩增

PCR反应体系20μL，基因组DNA 20ng，Mg²⁺1.5mmol·L^-1，dNTPs 0.2mmol·L^-1，正反引物各0.375μmol·L^-1，Taq酶1U；PCR扩增反应在热循环仪上进行，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性40S，52℃退火50S，72℃延伸70S，35个循环；72℃延伸8min。

5、双垂直板非变性浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行电泳。扩增产物在双垂直板浓度为质量体积比8％的非变性丙烯酰胺凝胶电泳，120V稳压电泳2.5h，电泳结束后进行体积比10％乙醇、质量体积比0.5％冰乙酸固定15min；质量体积比0.2％AgNO₃溶液银染15min；银染后用质量体积比1.5％NaOH、质量体积比0.4％甲醛、质量体积比0.002％NaS₂O₃显色，待条带清晰可见后，可见灯箱下观察拍照。用引物对NauFLC-F1/NauFLC-R1扩增出的带型中，晚抽薹材料特异条带分子量为330bp，早抽薹材料特异条带分子量为380bp；用引物对NauFLC-F2/NauFLC-R2扩增出的带型中，晚抽薹材料特异条带分子量为250bp，早抽薹材料特异条带分子量为310bp。

6、根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果对植株抽薹特性进行鉴定分析。将仅具有早抽薹特异条带的植株鉴定为早抽薹单株，FLC基因位点纯合；仅具有晚抽薹特异条带的植株鉴定为晚抽薹单株，FLC基因位点纯合；同时具有早、晚抽薹特异条带的植株鉴定为晚抽薹单株，FLC基因位点杂合。

有益效果

本发明课题组从不同抽薹特性萝卜品系中分离克隆出FLC基因组DNA序列，进一步分析发现来源于不同抽薹特性萝卜品系的FLC基因碱基序列存在显著差异，且该差异性与抽薹特性密切相关。通过特异引物可以区分不同抽薹特性萝卜品系FLC基因序列差异，从而使得根据FLC基因序列特征可以准确快速判定不同材料的抽薹特性，大大提高了抽薹性状的鉴定效率，加速了萝卜晚抽薹优良品种的选育进程。

本发明利用早、晚抽薹特性萝卜品系中FLC基因组序列的差异性，设计特异引物，通过PCR反应，分析萝卜植株FLC基因特异条带，据此快速准确地判断待检验的萝卜材料的抽薹特性，结果稳定可靠，不受材料生长环境条件与发育时期影响，可以大大缩短种质材料抽薹特性鉴定时间，在萝卜春季耐抽薹优良品种选育中具有良好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1的引物对NauFLC-F1/NauFLC-R1与NauFLC-F2/NauFLC-R2的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图

具体实施方式

1.萝卜幼苗的培育

待检验的萝卜材料种子用25℃水浸泡10min，使种子物理吸水饱满。取干净的培养皿，底部铺一层湿润的滤纸，将种子均匀铺开，盖好皿盖，放入25℃的恒温箱中催芽，24h后取出播种于穴盘中，置温室或塑料大棚中(昼/夜温度为25/15℃，自然光照)生长。

2.萝卜基因组DNA的提取

(1)取0.2g左右萝卜幼嫩叶片于研钵中。用液氮充分研磨成粉末，分两次加入(0.4mL/次)CTAB裂解缓冲液，转移至2.0mL中，轻轻摇匀，于65℃水浴30分钟。

(2)取出离心管，待管中溶液降至室温后，11200rpm离心8分钟，将上清液转入新离心管中。

(3)加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，将离心管缓慢翻转几次，静置2分钟；16℃，11200rpm离心8min。

(4)将上清液吸入新离心管中，加入70μL 3.0M醋酸钠(pH 5.2)与900μL预冷异丙醇并缓慢翻转1min，放于-20℃冰箱4h。

(5)8℃，11200rpm，离心6分钟，倒掉上清液，加入200μL预冷的70％乙醇清洗DNA小团。

(6)倒掉上清液，真空干燥。加100μL灭菌的TE缓冲液溶解DNA，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测质量；DNA用紫外分光光度计测定浓度后，再灭菌的1×TE缓冲液或ddH₂O稀释至10ng/μL用于PCR扩增分析。

3.PCR特异引物设计和合成

本发明的用于鉴定萝卜植株抽薹特性的FLC基因特异引物有两对，序列如下：

4.PCR扩增及产物电泳

PCR反应体系20μL，基因组DNA 20ng，Mg²⁺1.5mmol·L^-1，dNTPs 0.2mmol·L^-1，正反引物各0.375μmol·L^-1，Taq酶1U；PCR扩增反应在PTC-100热循环仪上进行，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性40S，52℃退火50S，72℃延伸70S，35个循环；72℃延伸8min。

扩增产物在双垂直板浓度为8％的非变性丙烯酰胺凝胶电泳，120V稳压电泳2.5h，电泳结束后进行10％乙醇、0.5％冰乙酸固定15min；0.2％AgNO₃溶液银染15min；银染后用1.5％NaOH、0.4％甲醛、0.002％NaS₂O₃显色，待条带清晰可见后，可见灯箱下观察拍照。

5、萝卜植株抽薹特性分析

应用两对FLC基因特异引物进行扩增，经过8％非变性丙烯酰胺凝胶电泳后，能够出现早、晚抽薹FLC基因特异条带。引物对NauFLC-F1/NauFLC-R1扩增出的带型中，晚抽薹材料特异条带分子量为330bp，早抽薹材料特异条带分子量为380bp；引物对NauFLC-F2/NauFLC-R2扩增出的带型中，晚抽薹材料特异条带分子量为250bp，早抽薹材料特异条带分子量为310bp。将仅具有早抽薹特异条带的植株鉴定为早抽薹单株(FLC基因位点纯合)；仅具有晚抽薹特异条带的植株鉴定为晚抽薹单株(FLC基因位点纯合)；同时具有早、晚抽薹特异条带的植株鉴定为晚抽薹单株(FLC基因位点杂合)。

<110>南京农业大学

<120>一种基于FLC基因的萝卜抽薹特性鉴定方法

<130>说明书

<140>00

<141>2009-06-02

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>NauFLC-F1

<222>(1)..(21)

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<223>

<400>4

cggaaacaca actggaatct atga 24

Claims

1、一种基于FLC基因的萝卜抽薹特性鉴定方法，其特征是：

用引物对NauFLC-F1/NauFLC-R1NauFLC，

NauFLC-F1，GCCAACCCATAGCTTCAACTT；

NauFLC-R1，GAAGGGATATAAGAGGGGTAGAAG；

通过PCR扩增萝卜植株DNA检测萝卜植株FLC基因的抽薹类型，扩增出的晚抽薹特异DNA条带分子量为330bp，早抽薹特异DNA条带分子量为380bp；

或者用引物对NauFLC-F2/NauFLC-R2，

NauFLC-F2，TAGGCTTAAGAAAACTCAG；

NauFLC-R2，CGGAAACACAACTGGAATCTATGA

通过PCR扩增萝卜植株DNA检测萝卜植株FLC基因的抽薹类型，扩增出早抽薹特异DNA条带分子量为310bp，晚抽薹特异DNA条带分子量为250bp。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征为，

根据权利要求1所述的PCR扩增结果，将仅具有早抽薹特异DNA条带的种质材料判定为FLC基因位点纯合的早抽薹单株，仅具有晚抽薹特异DNA条带的种质材料判定为FLC基因位点纯合的晚抽薹单株，同时具有早、晚两种抽薹特异DNA条带的种质材料判定为FLC基因位点杂合的晚抽薹单株。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征为，

1)萝卜基因组DNA的提取

(3)加入800μL体积比24∶1的氯仿∶异戊醇，将离心管缓慢翻转几次，静置2分钟；16℃，11200rpm离心8min；

(4)将上清液吸入新离心管中，加入70μL pH 5.2的3.0M醋酸钠与900μL预冷异丙醇并缓慢翻转1min，放于-20℃冰箱4h；

(6)倒掉上清液，真空干燥，加100μL灭菌的TE缓冲液溶解DNA，质量体积比0.8％琼脂糖凝胶电泳检测质量；DNA用紫外分光光度计测定浓度后，再灭菌的1×TE缓冲液或ddH₂O稀释至10ng/μL用于PCR扩增分析；

2)PCR扩增及产物电泳

PCR反应体系20μL，基因组DNA 20ng，Mg²⁺1.5mmol·L^-1，dNTPs 0.2mmol·L^-1，正反引物各0.375μmol·L^-1，Taq酶1U；PCR扩增反应在PTC-100热循环仪上进行，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性40S，52℃退火50S，72℃延伸70S，35个循环；72℃延伸8min；

扩增产物在双垂直板浓度为质量体积比8％的非变性丙烯酰胺凝胶电泳，120V稳压电泳2.5h，电泳结束后进行体积比10％乙醇、质量体积比0.5％冰乙酸固定15min；质量体积比0.2％AgNO₃溶液银染15min；银染后用质量体积比1.5％NaOH、质量体积比0.4％甲醛、质量体积比0.002％NaS₂O₃显色，待条带清晰可见后，可见灯箱下观察拍照。