CN110862991A - 一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39及其应用 - Google Patents

一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39及其应用，具体涉及农业生物技术领域，以水稻品种黄华占(HHZ)总DNA为模板，通过下列碱基序列的引物对TA3 ID NO.1和TA3 ID NO.2进行PCR扩增得到的核苷酸片段：TA3 ID NO.1(5’‑3’)：TGCTCAAAGAATTGGGAGG TA3 ID NO.2(5’‑3’)：CATGGGAAATATACGCAAGCAG。所得PCR产物经限制性内切酶Hae III酶切后，与Pita3呈特异性带型分子标记；本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pita3功能特异性分子标记具有重要的应用价值，利用此标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

Description

一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种水稻稻瘟 病抗性基因RMg39及其应用。
背景技术
利用作物自身的抗性控制病虫害已成安全生产技术的重要组成部分。水 稻是全球最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由异 宗配合子囊菌Magnaporthe grisea(Couch and Kohn，2002)引起的稻瘟病 是限制水稻稳产和高产的重要因素之一。据估计，该病害每年在东亚国家或 地区可造成多达5.5亿美元以上的经济损失(Robert，1991)。20世纪90年 代以来，中国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上，稻谷损失达数亿公斤(陈 彦等，2012)。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，选育与利用抗病 品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。此外，单一抗性品种的持久性(通常 是2-4年)会随着病原菌的迅速变异而失去功效(郑钊等，2009)，因此，合 理的挖掘和利用广谱抗性基因或者聚合多个抗病基因，是获得持久、广谱抗 病品种的重要途径。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，不仅依赖 于育种者具备的丰富经验和敏锐的观察力，鉴定结果也极易受到环境及人为 因素的影响而造成误差，抗性基因的选育效率低下。随着分子标记技术的产 生及发展，其便捷、直接、不受环境影响等优点使其应用价值及前景越来越 受到关注。通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开 发其功能特异性的标记物进行分子标记辅助选择，不仅大大加快了育种步伐， 也提高了分子育种选择的可靠性。
到目前为止，人们已经鉴定出100多个水稻抗瘟基因(Ballini et al., 2008；Chen et al.,2014)，其中至少23个水稻稻瘟病抗性基因已被克隆 (Wang et al.,1999；Quet al.,2006；Hayashi et al.,2010；Jiang et al.， 2012；Hua et al.，2012；Das etal.，2012；Lv et al.,2013)。这些稻 瘟病抗病基因多数具有富亮氨酸重复-核苷酸结合位点(NBS-LRR)蛋白结构， NBS中心区域的功能与ATP结合/水解相关，C-端LRR区域参与了蛋白的相互作 用(Dangl&Jones,2001；Takken&Tameling,2009；Bernoux,2011)。 NBS-LRR基因有成簇排列的倾向，通常簇内基因的同源性很高，与相同抗性途 径的基因也维持着共遗传的规律(Michelmore&Meyers,1998；Leister, 2004)。在第12染色体上，目前至少已定位了20个稻瘟病抗性基因，其中17 个基因成簇分布于Pita位点附近，包括Pi4，Pi6，Pi12，Pi19，Pi20，Pi21， Pi24，Pi31，Pi32，Pi39，Pi42，Pi48，Pi157，Pita，Pita2，Pitq6，Pita3(Yu et al.,1991；Naqvi et al.,1996；Yu et al.,1996；Zheng et al., 1996；Ahn etal.,1997；Hayashi et al.,1998；Ahn et al.,2000；Bryan et al.,2000；Tabien et al.,2000；Zhuang et al.,2002；Sallaud et al., 2003；Hayashi et al.,2006；Liu et al.,2007；Li et al.,2008；Kumar et al.,2010；Huang et al.,2011；Chen et al.,2014)。这17个稻瘟病 抗性基因在在着丝粒附近构成了一个大的抗性基因簇，其中只有1个抗病基因Pita被克隆(Bryan et al.,2000)。另外3个稻瘟病抗性基因Pi39，Pi51和 PiGD-3被定位在第12染色体的长臂上(Liu et al.,2004；Yang et al.,2009； Wang et al.,2012)。但该基因簇中，还有更多的NBS-LRR成员等待人们进 一步的挖掘和利用。
发明内容
通过图位克隆方法(Map-based cloning)，从华南稻区的一个优异抗源 品种黄华占(HHZ)中分离、鉴定到了一个具有广谱、持久抗性的稻瘟病抗性 基因Pita3；
通过长片段PCR扩增(Long Rangement PCR Amplification)以及染色体 步移(Chromosome Working)的方法，获得了Pita3位点区域的候选基因组序 列；
通过FGenesh预测，该区域包括了5个编码NBS-LRR类蛋白的基因： Pita3-Nbs1～5(Chen et al.,2014)；
Pita3位于Pita基因区域，Pita/ta3区域基因位点的整合图谱如图1所示 (Chenet al.,2014)；
值得注意的是，同样位于Pita基因区域的Pita3，其对应的专化性小种的 抗谱却与Pita的抗谱明显不同，如表1所示；
针对各等位基因的结构域测序分析表明，抗病Pita3与感病Pita3-NIP的 结构域存在多个氨基酸差异；Pita3具有广谱、持久的稻瘟病抗性，且遗传力 较高，使之更适合广泛应用于稻瘟病抗性育种计划中；
表1 Pita3和Pita基因的抗谱比较
Figure BDA0002240444370000031
Figure BDA0002240444370000041
Figure BDA0002240444370000051
为此，本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因Pita3基因特异性单 碱基差异(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)分子标记Pita3N5s，以 提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利 用的效率；
其中，一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39，以水稻品种黄华占(HHZ)总DNA 为模板，通过下列碱基序列的引物对TA3 ID NO.1和TA3 ID NO.2进行PCR扩增 得到的核苷酸片段：
TA3 ID NO.1(5’-3’)：TGCTCAAAGAATTGGGAGG
TA3 ID NO.2(5’-3’)：CATGGGAAATATACGCAAGCAG
所得PCR产物经限制性内切酶Hae III酶切后，与Pita3呈特异性带型分子 标记；
所述稻瘟病抗性基因Pita3包括5个编码NBS-LRR类蛋白的基因，其中， 基因特异性分子标记Pita3N5s位于第5个NBS-LRR类蛋白基因中；
所述稻瘟病抗性基因Pita3为通过图位克隆方法(Map-based cloning) 从水稻品种抗源品种黄华占(HHZ)中分离鉴定得到。
一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、利用多序列比对软件工具，对比日本晴、Pita3的候选基因区域 序列，比较Pita3对应区域的NBS-LRR类基因的核苷酸序列，筛查Pita3中 特异的、能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特 异性单碱基(SNP)差异位点，得知该SNP位于候选基因Pita3–Nbs5中；
步骤2、根据dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences；Neffet al.,2002.Trends in Genetics 18:613-615)标记的开发原理， 利用步骤1)获得的SNP信息，在SNP上游100-200bp处设计基因特异性上 游引物，在该SNP处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，引物对碱基 序列如下：
TA3 ID NO.1(5’-3’)：TGCTCAAAGAATTGGGAGG
TA3 ID NO.2(5’-3’)：CATGGGAAATATACGCAAGCAG
利用上述引物对，以水稻品种抗源品种黄华占(HHZ)总DNA为模板，进行PCR 扩增，得到可进行电泳检测的DNA片段，即为所述稻瘟病抗性基因Pita3基 因特异性单碱基差异(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)分子标记 Pita3N5s；
步骤3、利用步骤2中的引物对，对多个不同水稻品种的总DNA进行PCR 扩增反应，获得Pita3基因多个抗源品种对应于Pita3特异SNP位点的片段， 与步骤2获得的DNA片段进行比较验证，从而确定Pita3基因特异性的分子 标记Pita3N5s。
一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39的应用，具体为稻瘟病抗性基因Pita3 基因特异性单碱基差异(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)分子标记 Pita3N5s在鉴别Pita3基因区域不同稻瘟病抗性基因的应用。
在一个优选地实施方式中，所述稻瘟病抗性基因Pita3基因特异性单碱 基差异(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)分子标记Pita3N5s在鉴别 普栽水稻品种中稻瘟病抗性基因的应用。
本发明的技术效果和优点：
本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pita3功能特异性分子标记具有重要的 应用价值，利用此标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合 育种，以及转基因育种中利用的效率。
附图说明
图1为本发明的Pita3和Pita基因位点的整合图谱。
图2为本发明的Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s在Pita3基因区域 不同稻瘟病抗性基因的验证。
图3为本发明的Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s在27份水稻材料 中稻瘟病抗性基因型的验证。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图2所示，其中，
M:DNA ladder；
泳道1：DNA模板为抗性基因供体品种黄华占(HHZ)；
泳道2：DNA模板为感病品种丽江新团黑谷(LTH)；
泳道3：DNA模板为感病品种日本晴(NIP)；
泳道4：DNA模板为抗病品种青六矮(QLA)；
泳道5：DNA模板为感病品种美香占(MXZ)；
泳道6：DNA模板为抗病品种丰华占(FHZ)；
泳道7：DNA模板为感病品种CO39。
如图3所示，其中，
M:DNA ladder；
泳道1：DNA模板为抗性基因供体品种黄华占(HHZ)；
泳道2：DNA模板为感病品种日本晴(NIP)；
泳道3～29的DNA模板为依次为：三香B、博B、华农B、谷丰B、七丝 银占、粤太B、华育B、新银占、明恢63、广恢880、五山丝苗、粤晶丝苗2 号、马坝银占、华占、五山油占、辐恢838、广恢998、深恢7116、广恢290、 金航丝苗、胜巴丝苗、巴太香占、玉香油占、桂99、抗白香占、丰丝占、丰 八占；
在上述的基础上，稻瘟病抗性基因Pita3基因特异性分子标记及其引物 设计与检测具体为包括如下：
1)特异单碱基差异(SNP)位点的分析：
利用多序列比对软件工具，对比日本晴、Pita3的候选基因区域序列，比 较Pita3对应区域的NBS-LRR类基因的核苷酸序列，筛查Pita3中特异的、 能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱 基(SNP)差异位点，具有基因特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pita3与 pita3-NIP(日本晴)等位基因侧翼序列的多序列结果如下所示，
Figure BDA0002240444370000081
NBS5-NIP TCTTGTGCCTACCTTGTTGATATCCCCCCTGGG A CCCCGCC
其中，加黑加粗字母号G标出该SNP位点信息，由此鉴定到在Pita3-N5 部分具有的功能特异性单碱基差异(SNP)；
2)设计引物：
根据dCAPS标记的设计原理，在所述SNP位点上游100-200bp处设计基 因特异性上游引物，在该SNP位点处设计带有错配碱基的基因特异性下游引 物，引物对碱基序列如下所示：
TA3 ID NO.1(5’-3’)：TGCTCAAAGAATTGGGAGG
TA3 ID NO.2(5’-3’)：CATGGGAAATATACGCAAGCAG
3)选择水稻代表品种
选择携带有Pita3基因及其等位基因的代表品种如下：
水稻品种黄华占(HHZ)，为Pita3供体品种；
感病对照品种:日本晴(NIP)、丽江新团黑谷(LTH)、美香占(MXZ)、 CO39；
测试品种依次为：三香B、博B、华农B、谷丰B、七丝银占、粤太B、华 育B、新银占、明恢63、广恢880、五山丝苗、粤晶丝苗2号、马坝银占、华 占、五山油占、辐恢838、广恢998、深恢7116、广恢290、金航丝苗、胜巴 丝苗、巴太香占、玉香油占、桂99、抗白香占、丰丝占、丰八占；
4)PCR扩增，获得相应的多态性片段
利用上述引物对TA3 ID NO.1和TA3 ID NO.2，以上述水稻品种的总DNA 为模板，进行常规PCR扩增，扩增出的片段为155bp；
扩增反应体系如下：
ddH2O：13.3μl(补足至20μl)
10×PCR buffer(Mg2+Plus)：2μl
dNTPs(2.5mM each)：1.6μl
TA3 ID NO.1(10μM)：1μl
TA3 ID NO.2(10μM)：1μl
TaKaRa TaqTM(5U/μl)：0.1μl
DNA模版(20-50ng/μl)：1μl
PCR温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1 分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存；
PCR反应结束后，利用限制性内切酶Hae III对所获得的PCR产物进行酶 切，反应体系如下：
ddH2O：5.5μl(补足至12μl)
10×buffer 1：1.2μl
BSA：1.2μl
PCR产物：5μl
Hae III：0.3μl
在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8％的聚丙烯酰胺凝胶上 进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时，电泳图谱如图2所示；其中，低带 代表含有Pita3基因，高带为不含Pita3基因；
测序检测PCR产物，以水稻品种EBZ总DNA为模板，扩增出的片段为 Pita3N5s；
实施例2
本实施例还提供了抗性基因Pita3基因特异性分子标记在检测稻瘟病抗 性基因Pita3等位基因的应用；
根据多态性的PCR产物条带，可以把含有目标基因Pita3与其它感病 pita3基因等位基因的品种区分开来；如图2所示，Pita3的供体品种及含有 Pita3的近等基因系具有基因特异性分子标记的存在，使用限制性内切酶Hae III酶切时可以在特异性分子标记Pita3N5s处切断,而形成低条带；而不含 Pita3基因供体品种在特异性分子标记Pita3N5s处因酶切位点不匹配，使用 限制性内切酶Hae III酶切时不可以在特异性分子标记Pita3N5s处切断，只 有高条带；
如附图2所示，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pita3基 因特异性分子标记可在检测品种或品系中只是非含有稻瘟病抗性基因Pita3 基因等方面得到应用；
实施例3
本实施例还提供了抗性基因Pita3基因特异性分子标记在检测华南地区 普栽水稻品种中稻瘟病抗性基因的应用；
采集27个本研究室收集的、华南地区重要水稻品种，依次为：三香B、 博B、华农B、谷丰B、七丝银占、粤太B、华育B、新银占、明恢63、广恢 880、五山丝苗、粤晶丝苗2号、马坝银占、华占、五山油占、辐恢838、广 恢998、深恢7116、广恢290、金航丝苗、胜巴丝苗、巴太香占、玉香油占、 桂99、抗白香占、丰丝占、丰八占，分别提取其基因组DNA,并以此为模板， 利用实施例1中开发、确定的实验程序，对抗性基因Pita3基因特异性的分 子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检测；根据PCR产物(条带)的大小，可 以检测该品种或品系中是非含有稻瘟病抗性基因Pita3；如图3所示，在抗谱 表型为Pita3型的个体中能检测到Pita3N5s基因特异性分子标记的存在，而 其他不含Pita3基因的个体则不能检测到该分子标记；
如附图3所示，试验结果与设计分析的相吻合，表明抗性基因Pita3基 因特异性分子标记可在检测生产上普栽品种是否含有稻瘟病抗性基因Pita3 等方面得到应用。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39及其应用
<141> 2019-10-18
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 207
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
sncsnctast tgctcaaaga attgggaggt cgtgttgata catcagatga tgagcgtcag 60
ctcatatgca agctccgaac attcctacat cttgtgccta ccttgttgat atcccccctg 120
gggccccgcc acgtaagagg tatgtagaaa aactgcaaat ggtgtttttc catatatttt 180
gaccctgctt gcgtatattt cccatga 207

Claims (4)

1.一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39，其特征在于，以水稻品种黄华占(HHZ)总DNA为模板，通过下列碱基序列的引物对TA3 ID NO.1和TA3 ID NO.2进行PCR扩增得到的核苷酸片段：
TA3 ID NO.1(5’-3’)：TGCTCAAAGAATTGGGAGG
TA3 ID NO.2(5’-3’)：CATGGGAAATATACGCAAGCAG
所得PCR产物经限制性内切酶Hae III酶切后，与Pita3呈特异性带型分子标记；
所述稻瘟病抗性基因Pita3包括5个编码NBS-LRR类蛋白的基因，其中，基因特异性分子标记Pita3N5s位于第5个NBS-LRR类蛋白基因中；
所述稻瘟病抗性基因Pita3为通过图位克隆方法从水稻品种抗源品种黄华占(HHZ)中分离鉴定得到。
2.根据权利要求1所述的一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、利用多序列比对软件工具，对比日本晴、Pita3的候选基因区域序列，比较Pita3对应区域的NBS-LRR类基因的核苷酸序列，筛查Pita3中特异的、能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基(SNP)差异位点，得知该SNP位于候选基因Pita3–Nbs5中；
步骤2、根据dCAPS标记的开发原理，利用步骤1)获得的SNP信息，在SNP上游100-200bp处设计基因特异性上游引物，在该SNP处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下：
TA3 ID NO.1(5’-3’)：TGCTCAAAGAATTGGGAGG
TA3 ID NO.2(5’-3’)：CATGGGAAATATACGCAAGCAG
利用上述引物对，以水稻品种抗源品种黄华占(HHZ)总DNA为模板，进行PCR扩增，得到可进行电泳检测的DNA片段，即为所述稻瘟病抗性基因Pita3基因特异性单碱基差异分子标记Pita3N5s；
步骤3、利用步骤2中的引物对，对多个不同水稻品种的总DNA进行PCR扩增反应，获得Pita3基因多个抗源品种对应于Pita3特异SNP位点的片段，与步骤2获得的DNA片段进行比较验证，从而确定Pita3基因特异性的分子标记Pita3N5s。
3.一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39的应用，其特征在于，具体为稻瘟病抗性基因Pita3基因特异性单碱基差异分子标记Pita3N5s在鉴别Pita3基因区域不同稻瘟病抗性基因的应用。
4.根据权利要求3所述的一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39的应用，其特征在于：所述稻瘟病抗性基因Pita3基因特异性单碱基差异分子标记Pita3N5s在鉴别普栽水稻品种中稻瘟病抗性基因的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103937789A (zh) * 2014-04-30 2014-07-23 广东省农业科学院植物保护研究所 水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s及其制备方法和应用

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