CN101248178A - 能够调控植物分化/生长的基因及其用途 - Google Patents

能够调控植物分化/生长的基因及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供赤霉素结合蛋白、编码这些蛋白质的基因、及其应用。本发明的蛋白质起到赤霉素的细胞质受体的作用，并介导植物中的赤霉素应答。过表达这些基因的植物表现为赤霉素高敏感型表型，例如增加的植物高度。反之，其中基因发生突变的植物表现为赤霉素不敏感型表型，并因此变得矮小。因此，通过引入本发明的赤霉素结合基因或通过抑制所述基因的表达可以调节植物分化和生长。

Description

能够调控植物分化/生长的基因及其用途
技术领域
本发明涉及用于植物分化和生长的调节基因以及利用这些基因调节植物分化和生长的方法。对植物分化和生长的调节可以应用于植物育种等领域。
背景技术
赤霉素(GA)是四环双萜类的植物激素家族，它们是植物的不同发育过程(包括生长、开花、和结果)所必需的化合物(非专利文件1)。具体地，通过调节GA的活性可以调控不同植物的生长和分化。例如，农作物产量的变化很大程度上取决于植物的类型，因此通过调节GA信号转导来改良植物类型可以增加农作物产量。但是，至今为止还不知道植物是如何感知(perception)GA、如何传导GA信号以及如何通过GA调节诱导植物生长。最近，本发明人已经分离出水稻中两种类型的GA信号转导突变体。一种是组成型GA应答突变体slender rice1(slr1)(非专利文件2和3)；另一种是GA不敏感型矮小突变体GA-insensitive dwarf2(gid2)(非专利文件4)。SLR1基因编码一种蛋白质，预计其为与拟南芥GAI(非专利文件5)和RGA(非专利文件6)、小麦Rht、玉米d8、和大麦SLN1(非专利文件7)定向进化同源的转录因子。所有这些蛋白(包括上述拟南芥GAI及其后所提到的蛋白质)都被分组到GRAS家族的DELLA亚家族(非专利文件8)。GID2基因编码预计为SCF E3泛素连接酶的F-box亚基的蛋白质，其与拟南芥SLY(非专利文件9)定向进化同源。对这些突变体的分析已经预测出水稻SLR1蛋白(GA信号转导阻抑蛋白)是通过SCFGID2-蛋白体途径来降解的，该途径诱导了GA的下游作用(非专利文件8)。但是，与DELLA蛋白所调节的过程相比较，我们对GA感知过程的了解还很少。至今为止，有一些经生物化学方法研究GA结合蛋白的报道(非专利文件10和11)。但是，还没有鉴定出直接参与GA感知的蛋白质。
非专利文件1：Davies，P.J.，Plant Hormones(Kluwer Academic，Dordrecht，Netherlands，1995)。
非专利文件2：Ikeda，A.et al.，Plant Cell.13，999-1010(2001)
非专利文件3：Itoh，H.et al.，Plant Cell 14，57-70(2002)
非专利文件4：Sasaki，A.et al.，Science 299，1896-1898(2003)
非专利文件5：Peng，J.et al.，Genes Dev.11，3194-3205(1997)
非专利文件6：Silverstone，A.L et al.，Plant Cell 2，155-169(1998)
非专利文件7：Gubler，F.et al.，Plant Physiol.129，191-200(2002)
非专利文件8：Itoh，H.et al.，Trends Plant Sci.8，492-497(2003)
非专利文件9：McGinnis，K.M.et al.，Plant Cell.15，1120-1130(2003)
非专利文件10：Lovegrove，A.et al.，Plant J.15，311-320(1998)
非专利文件11：Nakajima，M.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.241，782-786(1997)
发明内容
本发明欲解决的问题
本发明提供了参与GA信号转导的赤霉素结合蛋白以及编码所述蛋白质的基因。本发明也提供了利用这些基因调节植物分化和生长的方法。解决问题的手段
GA是疏水的和弱酸性的。因为这些生物化学性质，GA以可溶性酸盐的形式存在于植物细胞中和细胞间隙。或者，GA可以是游离酸形式，并因此通过被动扩散透过生物膜(Hooley，R.et al.，Biochem.Soc.Trans.85-89(1992))。已经假定存在着两种类型的GA受体：膜结合型和细胞质型(Hooley，R.et al.，Biochem.Soc.Trans.85-89(1992))。但是，还没有鉴定出这两种GA受体中的任何一种。同时，本发明人成功地分离出了水稻的多个GA不敏感型矮小突变体(GA insensitive dwarf突变体)。为了鉴定出突变体的致病基因，本发明人通过定位克隆指出了突变的位置。因此，本发明人成功地鉴定出GA不敏感型矮小突变的致病基因(GAinsensitive dwarf突变体-1；GID1)。分析该基因发现GID1基因编码了与激素敏感型脂肪酶家族相似的未知蛋白。重组GID1蛋白表现出与有生物学活性的GA如GA4、GA1、和GA3的高亲和力，但是没有表现出与无生物学活性GA如GA9、GA51、和3-epi-GA4的高亲和力。另外，具有对应于三种eid1等位基因中每一种等位基因的突变的突变体GID1蛋白没有表现出与GA的亲和力。此外，GID1对GA4的Kd值为10-7M级，这足以解释所造成的枝条伸长。发现GID1和GA4的结合/解离率也是非常高的。此外，超产GID1的株系表现为GA高敏感型表型。根据这些发现，GID1蛋白被确定为介导GA信号转导的细胞质型受体。本发明所提供的赤霉素结合蛋白基因对于增加赤霉素敏感性以增进植物生长是非常有用的。此外，当通过抑制所述蛋白质的表达将高的农作植物(例如谷类农作物)修饰成矮小型时，可以减少植物的倒伏，提高产量。此外，本发明的蛋白质可以用于评价与有生物学活性的赤霉素的结合。通过使用本发明的蛋白质可以实现调节赤霉素对植物的作用的化合物的筛选和测试。
具体而言，本发明涉及赤霉素结合蛋白、所述蛋白质的基因及其用途。更具体而言，本发明涉及权利要求书中给出的每项发明。意于将包括一个或多个在引用相同的权利要求的权利要求书中给出的发明的组合的发明包含于权利要求书的发明内。具体而言，本发明涉及：
[1]任何一种下面的蛋白质：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9的蛋白质；
(b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9中一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入的氨基酸序列的蛋白质，其具有结合赤霉素的活性；
(c)由在严格条件下与从包含核苷酸序列SEQ ID NO：1、4、6、或8和/或其互补序列的核酸制备出的探针杂交的核酸编码的蛋白，其具有结合赤霉素的活性；
[2][1]的蛋白质，其是任何一种下面的蛋白质：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质；
(b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：2中一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入的氨基酸序列的蛋白质，其具有结合赤霉素的活性；
(c)由在严格条件下与从包含核苷酸序列SEQ ID NO：1和/或与其互补序列的核酸制备出的探针杂交的核酸所编码的蛋白质，其具有结合赤霉素的活性；
[3]包括氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9的[1]或[2]的蛋白质；
[4]包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的[2]的蛋白质；
[5][1]到[4]中的任一蛋白质，其是单子叶植物的蛋白质；
[6]编码[1]到[5]中任一项的蛋白质的核酸；
[7]携带[6]的核酸的载体；
[8]具有被引入其中的[6]的核酸的转化细胞；
[9][8]的转化细胞，其是具有增强的赤霉素敏感性的植物细胞；
[10]引入了[6]的核酸的转化植物，其是具有增强的赤霉素敏感性的植物；
[11][10]的转化植物，其是单子叶植物；
[12][10]或[11]的转化植物的育种材料；
[13]包含结合[1]到[5]中任一项的蛋白质的抗体的多肽或包含所述抗体的抗原结合片段的多肽；
[14]用于抑制[1]到[5]中任一项的蛋白质的表达的核酸的表达载体；
[15]引入了[14]的载体的转化细胞；
[16][15]的转化细胞，其是具有降低的赤霉素敏感性的植物细胞；
[17]引入了[14]的载体的转化植物，其是具有降低的赤霉素敏感性的植物；
[18][17]的转化植物，其是单子叶植物；
[19][17]或[18]的转化植物的育种材料；
[20]用于增强或降低赤霉素敏感性的方法，其包括增加或减少[1]到[5]中任一项的蛋白质的表达的步骤；
[21]用于产生产对赤霉素高敏感或低敏感的植物的方法，其包括从其中增加或降低了[1]到[5]中任一项的蛋白质的表达的植物细胞再生出植物的步骤。
[22]用于检测对赤霉素的应答的方法，其包括步骤：
使赤霉素接触其中提高或降低了[1]到[5]中任一项的蛋白质的表达的植物细胞或植物，并检测所述细胞或植物对赤霉素的应答；
[23]用于检测对赤霉素的应答的方法，其包括步骤：
使测试化合物接触其中提高或降低了[1]到[5]中任一项的蛋白质的表达的植物细胞或植物，并检测所述细胞或植物对赤霉素的应答；
[24][23]的方法，其还包括接触赤霉素的步骤；
[25]用于选择调节赤霉素应答的化合物的方法，其包括步骤：
(a)使其中增加或降低了[1]到[5]中任一项的蛋白质的表达的植物细胞或植物接触测试化合物；
(b)检测所述细胞或植物对赤霉素的应答；和
(c)选择提高或降低赤霉素应答的化合物；
[26][25]的方法，其中步骤(a)在存在赤霉素的情况下进行；
[27]用于结合[1]到[5]中任一项的蛋白质和赤霉素的方法，其包括使所述蛋白质接触赤霉素的步骤；
[28]用于检测赤霉素结合的方法，其包括步骤：使[1]到[5]中任一项的蛋白质接触赤霉素，并检测所述蛋白质和赤霉素之间的结合；
[29]用于检测调节赤霉素和[1]到[5]中任一项的蛋白质之间的相互作用的化合物的方法，其包括步骤：
(a)使测试化合物、赤霉素和所述蛋白质相接触；和
(b)检测赤霉素和所述蛋白质之间的结合；
[30]用于选择抑制赤霉素和[1]到[5]中任一项的蛋白质之间的相互作用的化合物，其包括步骤：
(a)使测试化合物、赤霉素和所述蛋白质相接触；
(b)检测赤霉素和所述蛋白质之间的结合；和
(c)选出抑制结合的化合物；
[31]用于结合[1]到[5]中任一的蛋白质和DELLA蛋白的方法，其包括使这些蛋白质相结合的步骤；
[32]包含[1]到[5]中任一项的蛋白质和赤霉素的复合物；
[33]包含[1]到[5]中任一项的蛋白质和DELLA蛋白的复合物；
[34][32]的复合物，其还包含DELLA蛋白。
附图说明
图1由显示GA不敏感型表型gid1的曲线图和照片组成。a)组描述了在播种后3个月的野生型植株(左侧)和gid1-1植株(右侧)的总体形态(栏(bar)＝10cm)。插入物是播种后4周的gid1-1的放大图像的照片(栏＝1cm)。b)组描述了应答于GA3处理的野生型(实心圈)和gid1-1(实心三角)的第二叶鞘的伸长。栏代表标准差(n＝10)。c)组描述了应答于GA3处理所诱导出的野生型(实心圈)和gid1-1(实心三角)的去胚半粒种子中的α-淀粉酶活性。给出了3次重复试验的代表性数据。d)组描述了DS1/OsGA20ox的RNA凝胶印迹分析。从存在(3、4、7、和8)或不存在(1、2、5、和6)10-6M烯效唑(uniconazol，uni)(一种GA生物合成的抑制剂)的情况下培养2周并经10-5M GA3处理(2、4、6、和8)或未处理过(1、3、5、和7)的野生型和gid1幼苗中提取总RNA。用作为加样对照的溴化乙啶(EtBr)染色凝胶。e)组描述了gid1-1和野生型中水稻GA的代谢途径和GA水平(ng/g鲜重)，给出了3次重复试验的代表性数据组。f)组描述了gid1-1中丧失了GA诱导的SLR1的降解。上方的组是SLR1蛋白的蛋白凝胶印迹分析。播种后2周的gid1-1和野生型幼苗在存在10-6M烯效唑的情况下进行培养，并按图所示的每个时段用10-4M GA3处理幼苗。在每个泳道上加样10μg总蛋白。中间的组使用考马斯亮蓝(CBB)用作加样对照进行染色。下面的组是携带有SLR1启动子-SLR1-GFP的转基因的野生型植株和gid1-1植株的幼叶部分的GFP荧光的共聚焦显微照片。植物在存在10-6M烯效唑的情况下进行培养，并用或不用10-4M GA3处理12小时。g)组描述了对gid1和slr1突变的上位性分析的结果。Slr1-1单突变、slr1/gid1双突变、gid-1单突变植株(根据每个基因的序列鉴定出其基因型)和野生型植株的总体形态(栏＝10cm)。slr1-1/gid1-1双突变体表现为slr1-1表型。根据F2植株(总数＝844)的分离比率[每个表型的分离为：200(slr1-1)、493(WT)、或151(gid1-1)，其对应于4∶9∶3(x2＝0.124，p＝0.940)]证实了这一点。
图2是显示GID1基因的基因组构造的图。a)组显示出gid1被作图于水稻第5号染色体的约80-cM区域中分子标记物c56-10和c57之间约38kb间隔内。b)组描述了四种gid1突变体的突变位点和突变。
图3是显示GID1结构的图。a)组描述了GID1的氨基酸序列。显示了gid1-1、gid1-2、和gid1-3的突变位点。b)组是GID1和NCBI保守区搜索(Conserved Domain Search)数据库中HSL组的共有序列(SEQ IDNO：3)之间的氨基酸序列比较。实心圈代表HSL家族的保守区。数值代表每个序列中距离第一个甲硫氨酸的位置。c)组描述了对携带有Act1启动子-GID1-GFP的转基因水稻植株的幼叶部分的GFP荧光的共聚物显微照片的结果。用10-6M烯效唑(+uni)或10-5M GA3(+GA3)处理植物1周。左面的组，中间的组显示了样品的DAPI染色。
图4显示了GID1的GA结合性能以及超产GID1植物的表型。a)组描述了GID1的GA结合的饱和性。用氚标记的GA4衍生物3H-16，17-二氢GA4、以及用次序渐增浓度的未标记的16，17-二氢GA4孵育重组体GID1。栏代表标准差(n＝3)。b)组描述了a所示的结合数据的斯卡恰特作图的结果。从三次独立试验结果中计算出Kd值(相关系数R2＝0.96)。c)组描述了3H-GA与GID1的结合/解离速率。3H-16，17-二氢GA4的总结合在数分钟内达到了最大值的一半(实心圈)。当向检测混合物中加入未标记的GA4(0.125mM)(箭头)时，3H-GA结合在数分钟内减少到小于10％(实心三角)。栏代表标准差(n＝3)。d)组描述了已经丧失GA结合活性的突变体GID1蛋白。上面的组：对应于三种gid1等位基因的突变体GID1的三种重组蛋白(GID1-1、1-2、和1-3)都不与GA4相互作用。载体衍生的标签蛋白(Vec)也不相互作用。栏代表标准差(n＝3)。下面的组：对本试验所用的重组蛋白的考马斯亮蓝染色。点代表SDS-PAGE谱中的GID或标签蛋白。在这个试验中，每种蛋白质几乎都使用了等量的蛋白质(80pmol)。e)组描述了播种后3个月的超产GID-1植株(Actin1启动子-GID1，右侧)和野生型植株(对照，左侧)的总体形态。栏＝50cm。f)超产GID1植株(实心三角)和野生型植株(实心圈)的第二叶鞘伸长的剂量依赖性GA应答。栏代表标准差(n＝5)。
图5给出了拟南芥GID1(AtGID1)和水稻GID1(OsGID1)的氨基酸序列。三种AtGID1和相关蛋白质的比对。将AtGID1a(SEQ ID NO：5)、AtGID1b(SEQ ID NO：7)、和AtGID1c(SEQ ID NO：9)的序列与OsGID1(SEQ ID NO：2)的序列进行比较。ClustalW程序(Thompson JD et al.(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-80；Chenna R et al.(2003)Nucleic AcidsRes.31：3497-500；日本DNA数据库(DDBJ)的ClustalW网页：http://www.ddbjp/search/clustalw-e.html)用于所述比对。7个克隆与OsGID1定向进化同源，其在BLAST搜索中被评级为第4到第10，并按该次序被命名为“D”到“J”。利用字母联合来自AGI分组命名(AGI码)的ORF名称列表显示出这些克隆。所点出的对应于Gly-196和Arg-251的两个氨基酸对于OsGID1的GA结合活性是至关重要的；在水稻gid1-1和gid1-2突变体中，所述氨基酸已经被其他的氨基酸残基所取代。箭头表示激素敏感型脂肪酶的三个催化中心(Ser(S)、Asp(D)、和His(H))。
图6涉及没有GA结合活性的AtGID1样蛋白。A)组描述了利用大肠杆菌(E.coli)表达系统制备出四种AtGID1样蛋白中每种蛋白的重组蛋白(D，At5g23530；E，At5g06570；F，At5g62180；和G，At3g48700，用AGI码(拟南芥基因组Initiative基因编码)显示出每种蛋白质)。与作为阳性对照(C)的重组AtGID1c的量相比较，10倍量的每种粗制蛋白被用于随后的GA结合检测。星号表示SDS-PAGE中的重组蛋白。B)组描述了利用标准方案评价AtGID1样蛋白(D到G)的GA结合活性。通过总结合活性(B)减去非特异性结合活性(UB：过量未标记GA所不能置换的活性)可以计算出特异性GA结合活性(B-UB)。从3次独立测量中确定出SD。C)组描述了重组AtGID1c蛋白的粗制部分(Cr)及其经Ni柱层析和凝胶过滤层析所获得的纯化部分(GE)的SDS-PAGE谱的结果。星号表示纯化的重组AtGID1c蛋白。D)组描述了重组AtGID1c蛋白的粗制部分(Cr)和纯化部分(GE)的GA结合活性。从3次独立测量中确定出SD。
图7描述了对经ClustalW程序比对的OsGID1和10种类型的拟南芥蛋白的系统进化分析的结果。
图8显示了拟南芥种子中16，17-二氢-GA4的生理活性。根据Yamaguchi等(Plant Cell，10，2115-2126，1988)的方法，测试了GA缺陷型gal-3种子在含16，17-二氢-GA4培养基中的发芽情况。每盘使用了约70到80粒种子。进行3次独立测量，并从这些测量中确定出标准差(SD)。在4℃冷处理3天后，第4天在23℃评价种子的发芽情况。GA4用作参照。
图9显示了AtGID1的GA结合性能A)至C)组描述了对AtGID1的GA结合的斯卡恰特作图分析的结果。显示了AtGID1a(A)、AtGID1b(B)、和AtGID1c(C)的结果。通过向检测混合物中加入不同浓度的GA可以测定出16，17-二氢-GA4的Kd值。从这3次独立的测量中确定出标准差(SD)。插入物显示了AtGID1的GA结合的时间-过程特征和使用过量的未标记的GA4(0.125M)的取代(箭头)。D)到F)组描述了AtGID1在不同pH条件下的GA结合活性。显示了AtGID1a(D)、AtGID1b(E)、和AtGID1c(F)的结果。通过向检测溶液中加入0.125mM GA4确定出非特异性结合活性(UB)，通过用总结合活性(B)减去UB可以确定出特异性结合活性(B-UB)。
图10显示了体内和体外的AtGID1-AtDELLA相互作用。图A)描述了酵母双杂交(Y2H)检测法中存在GA时的AtGID1-AtDELLA相互作用。每种AtGID1作为诱饵，而AtDELLA作为被捕获物。向培养基中加入GA4(10-5M)。当邻-硝基苯酚-β-D-半乳糖吡喃糖苷作为底物时，栏表示β-半乳糖苷酶活性(检测法B)。在每个条形图下面显示了每种转化体在给定培养基中生长2天(检测法A)。重复进行试验4次。从三次测量中确定出图中所示的SD值。B)组描述了Y2H检测法B中的AtGID1-RGA相互作用的剂量应答。向培养基中加入GA4(10-5到10-9M)。试验被重复进行2次。从三次测量中确定出图中所示的SD值。C)组描述了利用AtDELLA对AtGID1的体外GA结合效力的评价结果。左面的组：在混合AtGID1c(C)、氚标记的GA和过量的未标记的GA(+)或没有未标记的GA(-)之后15分钟。加入GAI(G)或RGA(R)，然后根据标准方法测量每个反应混合物中的GA结合活性。源自载体(v)的重组蛋白用作阴性对照。重复进行试验2次。从3次测量中确定出SD值。右面的组：利用抗His标签抗体的重组AtDELLA的Western印迹谱。G，GAI；R，RGA；v，载体；M，分子量标记。
图11显示了GA非依赖性的AtGID1b-AtDELLA相互作用。A)组描述了对在不存在GA的情况下的两种检测法中AtGID1b-RGL1阳性信号的检测。下面的组：检测法A中每种转化体的生长。AtGID1b-GAI的转化体在延长孵育4天后也形成克隆。上面的组：检测法B中每种转化体的β-半乳糖苷酶活性。当使用邻-硝基苯酚-β-D-半乳糖吡喃糖苷时，没有检测到信号。只有当使用非常敏感的底物氯酚红-β-D-半乳糖吡喃糖苷时，才能检测到阳性信号。B)组描述了当使用非常敏感的底物氯酚红-β-D-半乳糖吡喃糖苷，然后使用邻-硝基苯酚-β-D-半乳糖吡喃糖苷时的检测法B的谱。在570nm处测量每个孔的吸光度。
图12描述了AtGID1在水稻gid1-1转化体中的表达以及在拟南芥中的器官特异性。A)组描述了表达pAct1-AtGID1a(a1和a2)、pAct1-AtGID1b(b1和b2)、或pAct1-AtGID1c(c1和c2)的转化体的总体形态。与亲代突变体(gid1-1)和野生型植物(T65)一起显示了在水稻Actin1启动子的控制下过表达AtGID1基因(pAct1-AtGID1)的gid1-1植株。栏表示5cm。B)组描述了通过RT-PCR检测转化体中的AtGID1mRNA。从每个转化体的叶片中获得了约200mg总RNA。PCR循环数是25个(AtGID1)或22个(OsActin)。C)组描述了拟南芥中表达AtGID1的器官的分布。F：花；Si：长角果；St：茎；L：叶；R：根；和S：浸泡种子。PCR循环数是31个(AtGID1)或22个(AtActin)。
具体实施方式
本发明提供了赤霉素结合蛋白和编码所述蛋白质的核酸。所述核酸可以是DNA或RNA，并且其形式不受特别的限制。具体而言，所述核酸可以是基因组DNA、合成DNA、mRNA等，并且可以是单链的或双链的。所述核酸可以是环形的或直链的。在本发明的上下文中，术语“蛋白质”不限于全长蛋白质链，也包括被称作“寡肽”的短肽链。术语“蛋白质”也包括多肽。此外，本发明的蛋白质和基因包括分离的的蛋白质和基因以及重组的蛋白质和基因。术语“分离的蛋白质和基因”指的是从天然状态中分离出的蛋白质和基因，也包括纯化的和人工生成的蛋白质和基因。术语“重组体”指的是经遗传重组或合成生成或复制出的蛋白质和基因。术语“重组核酸”指的是其中在其一端或两端没有和天然状态一样连接核苷酸的核酸。重组核酸包括合成的核酸以及克隆于质粒或其他载体中的核酸。通过用核酸酶、超声处理等切开天然核酸并用连接酶等将其重新连接起来可以生成重组核酸。本发明的重组核酸在此也包括合成的核酸和以质粒或噬菌体或通过PCR扩增出的核酸。或者，当重组体是蛋白质时，术语“重组蛋白”包括合成的蛋白质和重组核酸所表达出的蛋白质。
用本领域技术人员已知的方法可以制备出基因组DNA或cDNA。例如，通过筛选用从所需植物中制备出的基因组DNA所构建出的基因组文库可以获得基因组DNA。同样，通过用由从所需植物制备出的mRNA的逆转录生成的cDNA制备出cDNA文库并筛选文库可以获得cDNA。可以适当地制备出筛选探针，例如，基于核苷酸序列SEQ ID NO：1、4、6、或8可以制备出标记的探针。或者，通过利用cDNA或基因组DNA作为模板的RT-PCR可以扩增出目的DNA。或者，利用市售的DNA合成装置也可以制备出目的DNA。
本发明的蛋白质包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9的蛋白质和与所述蛋白功能等价的蛋白质。术语“功能等价”指的是存在赤霉素结合活性。具体而言，本发明的蛋白质具有与至少其中一种有生物学活性的赤霉素的结合活性。有生物学活性的赤霉素包括GA4、16，17-二氢GA4、GA1、GA3、GA35、和GA37。本发明的蛋白质优选地具有针对一种(例如GA4)或多种赤霉素的结合活性，更优选具有针对两种或多种赤霉素的结合活性，甚至更优选具有针对三种或多种选自GA4、16，17-二氢GA4、GA1和GA3的赤霉素的结合活性，仍更优选具有针对所有四种赤霉素的结合活性。更优选地，本发明的蛋白质与有生物学活性的赤霉素特异性结合。具体而言，优选的是本发明的蛋白质与无活性的赤霉素(GA4甲酯、3-epi-GA4、GA9、和GA51)的亲和力要比其与有生物学活性的赤霉素(例如GA4、16，17-二氢GA4、GA1和GA3)的亲和力低很多。例如，通过确定Kd值确定出结合亲和力。术语“赤霉素”在此指的是有生物学活性的赤霉素，除非有其他说明。
例如通过孵育标记的赤霉素和溶解于结合缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.6)、5mM2-巯基乙醇、和0.1M NaCl)中的蛋白质可以检测出本发明的蛋白质结合赤霉素的能力。通过量化结合于柱的赤霉素可以测量出两者之间的结合(Nakajima，M.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.241，782-786(1997))。具体而言，根据实施例所述的方法可以检测出所述蛋白质与赤霉素的结合。
本发明的蛋白质和核酸的来源不受特殊限制。例如，本发明蛋白和核酸可以来源的植物物种可以包括单子叶植物或双子叶植物。在一个优选的实施方式中，所述物种是单子叶植物，更优选的是禾本科的植物，包括大麦、小麦、和水稻，最优选的是水稻。双子叶植物的实例包括拟南芥。在上面的描述中，术语“来源”意味着所述蛋白质和核酸(i)具有与那些从具体植物获得的蛋白质和核酸相同的结构；(ii)来自对(i)的修饰；或(iii)基于来自(i)的结构(序列)信息的修饰信息所生成的。例如，通过修饰天然基因以插入限制性酶识别序列或添加标签肽以制备融合蛋白已经可以常规地制备出源自天然基因和蛋白质的核酸和蛋白，而不丧失其活性(Sambrook，J.and DW Russell，2001，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)。这些修饰形式(和类似物及衍生物)都包括在本发明的蛋白质和核酸中。特别地，本发明也涉及具有赤霉素结合活性以及高度同源于但排除了SEQ ID NO：2、5、7、或9的序列的蛋白质。
此外，除了实施例所述的水稻和拟南芥GID1蛋白的多态性形式和变体外，本发明的蛋白质也包括水稻和拟南芥赤霉素结合(GID1)蛋白的其他植物同源物(相似物(counterpart))。可以用杂交技术(Southern EM：J.Mol.Biol.98：503，1975)和聚合酶链反应(PCR)技术(Saiki RK，et al：Science 230：1350，1985；Saiki RK，et al：Science 239：487，1988)从相同的或不同的植物物种中分离出编码同源蛋白的核酸。例如，利用具有核苷酸序列SEQ ID Ns：1、4、6、或8或与之互补的序列或其一部分的核酸通过杂交可以分离出编码本发明的蛋白质的核酸。具体而言，当基于核苷酸序列SEQ ID NO：1、4、6、或8或其互补序列或其一部分制备出探针时，可以从水稻和其他植物中分离出在严格条件下与所述探针杂交的核酸。或者，当基于核苷酸序列SEQ ID NO：1、4、6、或8或其互补序列制备出引物时，用PCR可以从水稻和其他植物中扩增出编码目的蛋白的核酸。这些蛋白质包括例如经AGI码(拟南芥基因组Initiative基因编码)标识的蛋白质：At3g05120(AtGID1a；SEQ ID NOs：4和5)、At3g63010(AtGID1b；SEQ ID NOs：6和7)、和At5g27320(AtGID1c；SEQ ID NOs：8和9)。在MIPS(慕尼黑蛋白质序列信息中心)的公开数据库MATDB中或者通过搜索国立生物技术信息中心(NCBI)的网页也可以找到这些蛋白质和基因的结构。
通过从具有核苷酸序列SEQ ID NO：1、4、6、或8或其互补序列的核酸中或从杂交所靶向的核酸中制备出探针，然后检测该探针是否与其他的DNA杂交可以检测出核酸是否彼此杂交。可以通过随机引物法(Sambrook，J.and DW Russell，2001，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY；Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0(Takara，Otsu，Japan))标记探针。本领域技术人员可以选出合适的严格条件。严格条件的实例包括例如在含有5x SSC(1x SSC含150mM NaCl和15mM柠檬酸钠)、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性的鲑精DNA、5x Denhardt溶液(1xDenhardt溶液含0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白、和0.2％Ficoll)的溶液中，48℃下、优选在52℃下、以及更优选在60℃下进行杂交，并在2xSSC中，与杂交相同的温度下、更优选在60℃下、甚至更优选在65℃下震荡的同时洗涤2小时。更优选用1xSSC、甚至更优选用0.5xSSC、以及仍更优选用0.1xSSC进行所述洗涤(Sambrook，J.and DWRussell，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Third Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
本发明的蛋白质和编码所述蛋白质序列的核酸分别与氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9和CDS核苷酸序列SEQ ID NO：1、4、6、或8高度同源。高同源性指的是序列具有60％或更高、优选65％或更高、更优选70％或更高、甚至更优选75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、仍更优选95％或更高的相同性。例如用BLAST程序(Altschul，S.F.et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)可以确定出序列相同性。具体而言，可以用blastn程序确定出核苷酸序列相同性，而可以用blastp程序确定出氨基酸序列相同性。例如，在NCBI(国立生物技术信息中心)的BLAST网页中，通过将所有过滤程序(filter)例如“低复杂性(Lowcomplexity)”都设定为“关闭(OFF)”然后使用缺省参数可以实施计算(Altschul，S.F.et al.(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.et al.(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.et al.(1997)NucleicAcids Res.25：3389-3402；Zhang，J.&Madden，T.L.(1997)Genome Res.7：649-656)。例如，所述参数可以设定如下：核苷酸的开放缺口补偿(opengap cost)被设定为5，蛋白质的为11；核苷酸的延伸缺口补偿(extend gapcost)被设定为2，蛋白质的为1；核苷酸错配惩罚(mismatch penalty)被设定为-3；核苷酸错配补偿(reward for a nucleotide match)被设定为1；期望值被设定为10；核苷酸的字长被设定为11，蛋白质为2；blast延伸(extension)的Dropoff(X)被设定为20位(blastn)和7位(其他程序)；在不同于blastn的程序中，缺口比对的X dropoff值被设定为15位，缺口比对的终末X dropoff值被设定为50位(blastn)和25位(其他程序)。在氨基酸序列比较中，BLOSUM62可以用作计分矩阵(Henikoff，S.和Henikoff，J.G.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)。可以用比较两个序列的blast2序列程序(Tatiana A et al.(1999)FEMS MicrobiolLett.174：247-250)准备两个序列的比对，并确定出其序列的相同性。通过将缺口处理为错配并忽略CDS外的缺口可以计算出编码序列(CDS)SEQ ID NO：1、4、6、或8、或SEQ ID NO：2、5、7、或9的相同性。
本发明的蛋白质也包括具有包含氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9中一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入的氨基酸序列的蛋白质。制备编码具有修饰氨基酸序列的蛋白质的核酸的方法是本领域技术人员公知的，包括定点诱变(Gotoh，T.et al.(1995)Gene 152，271-275；Zoller，MJ，and Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.et al.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W，and Fritz HJ(1987)Methods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)。蛋白质氨基酸序列中的突变也可以天然发生，来自编码所述蛋白质的核苷酸序列中的突变。因此，本发明包括具有赤霉素结合活性并具有编码天然存在的赤霉素结合蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：2、5、7、或9)中一个或多个氨基酸取代、缺失、添加、和/或插入的氨基酸序列的蛋白质。对少数氨基酸的修饰可能不会影响蛋白质活性(Mark，D.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.&Smith，M.Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.et al.，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413；Bowie et al.，Science(1990)247，1306-1310)。待修饰的氨基酸数目通常是50个氨基酸或更少，优选的是30个氨基酸或更少，更优选的是25个氨基酸或更少、20个氨基酸或更少、15个氨基酸或更少、或10个氨基酸或更少(例如5个氨基酸或更少、或3个氨基酸或更少)。
待突变的氨基酸残基优选地被另一个容许保留氨基酸侧链性质的氨基酸所取代。这些取代被称作保守氨基酸取代。在同一组中可以进行保守取代的氨基酸组包括：疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、和V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、和T)、和具有以下侧链的氨基酸：脂肪族侧链(G、A、V、L、I、和P)、含羟基侧链(S、T、和Y)、含硫原子侧链(C和M)、含羧酸和酰胺侧链(D、N、E、和Q)、碱性侧链(R、K、和H)、和含芳香环侧链(H、F、Y和W)(简写字母代表单字母氨基酸编码)。每个氨基酸修饰前后的亲水指数(Kyte and Doolittle，J Mol Biol.May 5，1982；157(1)：105-32)和亲水值(US 4554101)优选在±2、更优选在±1、甚至更优选在±0.5的范围内。
当修饰氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9时，应当保留HGG基序(SEQ ID NO：2的120到122位)和GXSXG基序(SEQ ID NO：2的196到200位)，两者都是激素敏感型脂肪酶(HSL)家族的共有序列(Osterlund，T.et al.，Biochem.J.319，411-420(1996)；Manco，G.et al.，Arch.Biochem.Biophys.373，182-192(2000))。另外，被修饰的序列优选地包含SEQ ID NO：2的70到119位的区域或SEQ ID NO：5、7、或9的相应区域的氨基酸序列(见图5)。更优选地，被修饰的序列包含SEQ IDNO：2的148到160位以及258到331位的区域或SEQ ID NOs：5、7、或9的相应区域的氨基酸序列。这些优选的蛋白质包括例如包含SEQ IDNO：2的70到350位的区域或SEQ ID NO：5、7、或9的相应区域的氨基酸序列的蛋白质。当修饰不同于SEQ ID NO：2、5、7、或9的蛋白质时，优选的是首先对所述氨基酸序列和这些序列进行比对，然后进行修饰，以确保保留对应于上面所述的区域的区域。利用BLAST 2 SEQUENCES(Tatiana A.et al.，1999，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)、ClustalW程序(Thompson JD et al.(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-80；Chenna R etal.(2003)Nucleic Acids Res.31：3497-500)等可以进行这种比对。
例如通过筛选已知的表达文库可以进行对编码本发明的蛋白质的核酸的植物cDNA文库的筛选。拟南芥和水稻GID1的N末端约70个氨基酸的序列是高度保守的，并对赤霉素结合蛋白具有特异性。因此，可以使用与该区域的任一位置结合的抗体。因此，通过筛选编码与该抗体结合的蛋白质的基因可以分离出本发明的蛋白质。优选的抗体是那些与拟南芥或水稻GID1(SEQ ID NO：2、5、7、或9)的1到70位、优选1到60位、更优选1到50位、以及甚至更优选1到40位的氨基酸区域中的任一个相结合的抗体。或者，水稻GID1的250到289位的氨基酸也是高度保守的，并且对赤霉素具有特异性。因此，也可以优选地使用与该区域的任一位点结合的抗体。例如，利用所述抗体可以进行筛选，所述抗体与水稻GID1(SEQ ID NO：2)的250到289位、优选250到280位、更优选280到270位、甚至更优选280到260位的氨基酸区域中的任一个或与对应于拟南芥GID1的这些氨基酸区域的任一位点结合(见图5)。本发明包括与上面所述的任一抗体结合的蛋白质和反过来与赤霉素结合的蛋白质。
此外，通过合适地与其他蛋白质融合可以将这些蛋白制备成融合蛋白。通过在框内连接编码靶蛋白的DNA、将该连接序列插入表达载体、并在宿主中表达所述所述序列可以制备出融合蛋白。被融合的蛋白质没有特别限制，包括例如标记物蛋白和标签肽。具有本发明的氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9的蛋白质包括在氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9的一端或两端具有如下序列的蛋白质，所述序列包含构成所需蛋白质(例如标签蛋白和其他蛋白质)的附加氨基酸序列。
与本发明的蛋白质相融合的蛋白质包括例如已知的标签肽如FLAG(Hopp，T.P. et al.，BioTechnology(1988)6，1204-1210)、6xHis(其包含6个组氨酸(His)残基)、10xHis、流感血凝素(HA)、人c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原片段、1ck标签、α-微管蛋白片段、B-标签、和蛋白C片段。所添加多肽的长度可以是例如50个氨基酸或更少，优选的是30个氨基酸或更少、25个氨基酸或更少、20个氨基酸或更少、15个氨基酸或更少、或10个氨基酸或更少。其他也可以被融合的蛋白包括例如谷胱甘肽-S转移酶(GST)、流感血凝素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、和麦芽糖结合蛋白(MBP)。也常常用与GST或MBP的融合蛋白收集体外表达的蛋白质(Guan，C.et al.(1987)Gene，67，21-30；Maina，C.V.et al.(1988)Gene，74，365-373；Riggs，P.D.(1990)In Expression and Purificationof Maltose-Binding Protein Fusions.F.M.Ausebel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith and K.Struhl(Eds.)，Current Protocolsin Molecular Biology，pp.16.6.1-16.6.10；Bar-Peled and Raikhel(1996)Anal.Biochem.241：140-142；Brew K，et al.(1975)JBC 250(4)：1434-44；H.Youssoufian，(1998)BioTechniques 24(2)：198-202)。当融合蛋白被设计成在其分界处(boundary)具有肽酶裂解序列时，通过在纯化后切除GST或MBP部分可以收集到单独的目的蛋白。
本发明也涉及携带编码本发明的赤霉素结合蛋白的插入核酸的载体。这些载体没有特殊限制，包括例如质粒、病毒载体、噬菌体、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、PAC(P1衍生的人工染色体)、和TAC(可转化人工染色体)。本发明的载体包括上述蛋白质的编码序列和/或与之互补的序列。例如，当所述载体是双链DNA载体例如质粒载体时，它可以携带本发明的蛋白质的编码序列以及与之互补的序列。当所述载体是包括单链基因组等的病毒载体例如具有正链基因组的病毒时，它可以包含本发明的蛋白质的编码序列，对于具有负链基因组的病毒而言，它可以包含所述序列的互补序列。优选的本发明的载体包括表达本发明的蛋白质的表达载体。这些表达载体可以用于重组蛋白的生产和转化。
通过向细胞内引入上述的表达载体并收集表达的蛋白质可以生成重组蛋白。宿主细胞没有特殊限制，只要它们适合于表达重组蛋白；可以使用细菌(例如大肠杆菌)、酵母、各种动植物细胞(包括昆虫细胞)等。通过本领域技术人员已知的各种方法可以将载体引入到宿主细胞内。例如，用钙方法或电穿孔可以实现向大肠杆菌内的引入(Mandel，M.&Higa，A.，Journal of Molecular Biology，1970，53，158-162；Hanahan，D.，Journal ofMolecular Biology，1983，166，557-580)；当宿主是酵母时，可以使用醋酸锂法(BD Yeastmaker Yeast Transformation System 2，BDBioscience/Clontech)；当宿主是高等真核细胞时，可以使用各种类型的转染试剂(TransIT(R)转染试剂，Mirus Bio Corporation)等。利用本领域技术人员已知的方法可以从宿主细胞或其培养物上清液中收集并纯化出在宿主细胞内表达的重组蛋白。如上所述，重组蛋白可以被表达成与其他蛋白质融合的蛋白质。可以将这些蛋白质制备为例如与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白(pMAL系列；New England BioLabs)、与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白(pGEX系列；Amersham Pharmacia Biotech)；或者当宿主为大肠杆菌时的具有附加的组氨酸标签的蛋白质(pET系列；Novagen)。当重组蛋白被表达为与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白时，利用直链淀粉柱等可以容易地实施亲和纯化。当重组蛋白被表达为与GST的融合蛋白时，利用谷胱甘肽柱可以收集并纯化所述蛋白质。利用镍柱可以收集并纯化具有附加的His标签的蛋白质。
本发明也涉及与本发明的赤霉素蛋白结合的抗体。用本发明的蛋白质或其部分肽作为抗原可以制备出与本发明的蛋白质特异性结合的抗体。在用本发明的纯化蛋白质或其部分肽免疫接种一段时间后，在去除动物(例如兔)的血液凝块之后，可以从血清中制备出多克隆抗体。或者，通过融合骨髓瘤细胞和经上述蛋白质或肽免疫接种过的动物的产抗体细胞、分离产生目的抗体的单克隆细胞(杂交瘤)并从细胞中制备出抗体，可以制备出单克隆抗体(Antibodies：ALaboratory Manual，E.Harlowand D.Lane，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor，NY，1988))。所生成的抗体可以用于纯化或检测本发明的蛋白质或者用于其他目的。本发明的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体、以及包含这些抗体的抗原结合位点的多肽(包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和单链Fv(scFv))。本发明也涉及包含上述抗体的组合物，例如抗血清。
拟南芥和水稻GID1的N末端的头70个氨基酸是高度保守的并对于赤霉素结合蛋白具有特异性。因此，预计与该区域内任一位点结合的抗体都具有非常突出的特征。或者，水稻GID1中250到289位的氨基酸也是高度保守的和并对赤霉素具有特异性。因此，预计与对应于水稻或拟南芥区域的该区域内的任一位点结合的抗体也具有非常突出的特征。具体而言，例如本发明的抗体优选地是与拟南芥或水稻GID1(SEQ ID NO：2、5、7、或9)的1到70位、优选1到60位、更优选1到50位、甚至更优选1到40位的区域内的任一位点结合的抗体；和与水稻GID1(SEQID NO：2)的250到289位、优选的250到280位、更优选的280到270位、甚至更优选的280到265位、仍更优选的280到260位的氨基酸区域内的任一位点结合的抗体。与拟南芥GID1(见图5)的相应氨基酸区域内的任一位点结合的抗体是优选的。
本发明也涉及具有被引入其中的编码本发明的赤霉素结合蛋白的核酸的转化植物细胞和转化植物。通过向植物细胞内引入携带编码本发明的赤霉素结合蛋白的核酸的载体并从所获得的转化植物细胞中再生出植株可以生成这些转化植物。转化植物包括由转化植物细胞再生出的第一代植株以及它的含有引入核酸的植物子代和克隆。所述子代包括经有性或无性繁殖(例如营养体繁殖等)生成的植物。所述子代也包括经自花传粉或异花传粉获得的子代。例如，通过与其他植物杂交生成的F1代和F2代植株以及它们的含有引入核酸的子代也被包括在本发明的转化植物的范围内。
用于植物细胞转化的载体类型不受特殊限制，只要它能够在细胞内表达所插入的基因。例如，可以使用其中编码目的蛋白的序列与所需启动子下游相连接的载体。与编码序列的下游相连接的终止子是优选的。这些启动子包括例如组成型启动子如冠瘿碱启动子(US 5955646)、花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-812、US5352605、US 5530196、US 5858742、US 6255560、EP 131623B2)、肌动蛋白启动子(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：163-171、US 5684239、EP1042491、AU 18809/99、US 5859331、EP 651812B1、EP 1179081A1、US5641876)、泛素启动子(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632；Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689；US5510474、US 5614399、US 6020190、US 6054574)、乙醇脱氢酶启动子(CA 1338858、EP 278658B1、US 5001060、EP 459643B1、US 5290,924)、以及US 5608149、US 5608144、US 5604121、US 5569597、US 5466785、US 5399680、US 5268463和US 5608142所述的其他启动子。已知的诱导型启动子包括例如受乙醇、四环素、类固醇、金属离子或其他化合物或环境刺激物调节的启动子系统。这些诱导型启动子包括例如热休克启动子(Ainley WM，Key JL(1990)Plant Mol Biol 14：949-967；Holtorf S，et al.(1995)Plant Mol Biol 29：637-646)、病原体应答型启动子(PR1-a；WilliamsS，et al.(1992)Biotechnology 10：540-543；Gatz C(1997)Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol 48：89-108)、除草剂安全剂应答型启动子(In2-2、GST-27、De Veylder L，et al.(1997)Plant Cell Physiol 38：568-577)、光应答型启动子(Kuhlemeier C，et al.(1989)Plant Cell 1：471-478)、创伤诱导型启动子(Firek S，et al.(1993)Plant Mol Biol 22：129-142)、乙醇应答型启动子(Salter MG，et al.(1998)Plant J16：127-132)、植物激素应答型启动子(Li Y，et al.(1991)Plant Cell 3：1167-1175)、类固醇应答型启动子(Aoyama T，et al.(1997)Plant J11：605-612)、四环素应答型启动子(GatzC，et al.(1992)Plant J 2：397-404；Weinmann P，et al.(1994)Plant J5：559-569；Sommer S，et al.(1998)Plant Cell Rep 17：891-896)、以及EP637339B1、US 5851796、US 5464758、US 5589362、US 5654168、US5789156、US 5512483、US 6379945、EP 828829A1、EP 1112360A1、WO01/62780、US 4940661、US 4579821、US 4601978、US 5654414、US5689044、US 5789214、AU 708850B2、US 6429362、US 5447858、EP 159884B1、CA 1338010A1、EP 922110A2、US 6084089、EP 812917A1、US6184443、US 5847102、US 5750385、US 5639952和US 5656496所述的其他启动子。
组织特异性启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen et al.(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；VanCamp et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.12(2)：513-524；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco etal.(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka et al.(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J4(3)：495-505等所述的启动子。
终止子包括例如源自花椰菜花叶病毒的终止子和源自章鱼碱合酶基因、胆脂碱合酶基因等的终止子，但并不限于这些终止子(Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell2：1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene 91：151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；Joshi et al.(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639)。例如，可以优化所用的密码子，以便提高基因表达。优化方法见于以下文献：US 5380831、US 5436391、Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498。
利用本领域技术人员已知的方法可以将载体引入到植物细胞内。用于基因转移的植物细胞包括例如悬浮培养细胞、原生质体、植物细胞(例如种子胚鳞细胞、叶盘细胞、愈伤组织细胞)等。具体而言，所述方法包括例如土壤杆菌介导的利用Ti质粒载体的基因转移(EP 270355、EP0116718、Nucl.Acids Res.12(22)：8711-8721(1984)、Townsend et al.，US5563055)、基因枪(US 5100792、EP 444882B1、EP 434616B1、Sanfordet al.，US 4945050、Tomes et al.(1995)″Direct DNA Transfer into IntactPlant Cells via Microprojectile Bombardment″in Plant Cell，Tissue，andOrgan Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926)、微注射(WO 92/09696、WO 94/00583、EP 331083、EP 175966、Green etal.(1987)Plant Tissue and Cell Culture，Academic Press；Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(EP 290395、WO 8706614、Riggset al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606；D’Halluin et al.(1992)Plant Cell 4：1495-1505)、以及DNA的直接整合(DE 4005152、WO 9012096、US 4684611、Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3：2717-2722)、脂质体法(Freeman et al.(1984)Plant Cell Physiol.29：1353)、voltex法(Kindle(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.87：1228)、和聚乙二醇法。向植物细胞内的基因转移也见于以下文献：Oard(1991)Biotech.Adv.9：1-11；Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37；Christou etal.(1988)Plant Physiol.87：671-674；McCabe et al.(1988)Bio/Technology6：923-926；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324；Datta et al.(1990)Biotechnology 8：736-740；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309；Klein et al.(1988)Biotechnology 6：559-563；Tomes，US5240855；Buising et al.，US 5322783、US 5324646；Klein et al.(1988)PlantPhysiol.91：440-444；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8：833-839；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature 311：763-764；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349；De Wet et al.(1985)in TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，N.Y.)，pp.197-209；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports 9：415-418；Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566；Li et al.(1993)PlantCell Reports 12：250-255；Christou and Ford(1995)Annals of Botany75：407-413；Osjoda et al.(1996)Nature Biotechnology 14：745-750。
植物细胞转化也见于以下文献：Toriyarna et al.(1988)Bio/Technology6：1072-1074；Zhang，et al.(1988)Plant Cell Rep.7：379-384；Zhang et al.(1988)Theor.Appl.Genet.76：835-840；Shimamoto et al.(1989)Nature338：274-276；Datta et al.(1990)Bio/Technology 8：736-740；Christou et al.(1991)Bio/Technology 9：957-962；Peng et al.(1991)International RiceResearch Institute，Manila，Philippines，pp.563-574；Cao et al.(1992)PlantCell Rep.11：585-591；Li et al.(1993)Plant Cell Rep.12：250-255；Rathore etal.(1993)Plant Mol.Biol.21：871-884；Fromm et al.(1990)Bio/Technology8：833-839；Tomes et al.(1995)″Direct DNA Transfer into Intact Plant Cellsvia Microprojectile Bombardment″in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；D’Halluin et al.(1992)Plant Cell 4：1495-1505；Walters et al.(1992)PlantMol.Biol.18：189-200；Koziel et al.(1993)Biotechnology 11：194-200；Vasil，I.K.(1994)Plant Mol.Biol.25：925-937；Weeks et al.(1993)Plant Physiol.102：1077-1084；Somers et al.(1992)Bio/Technology 10：1589-1594；WO92/14828；Hiei，et al.(1994)The Plant Journal 6：271-282)；Shimamoto，K.(1994)Current Opinion in Biotechnology 5：158-162；Vasil，et al.(1992)Bio/Technology 10：667-674；Vain，et al.(1995)Biotechnology Advances13(4)：653-671；Vasil，et al.(1996)Nature Biotechnology 14：702。
通过使用两种或多种上述基因转移方法的组合可以提高基因转移的效率。例如，已知方法包括那些将经涂有土壤杆菌的微粒投射(project)到植物组织或将微粒与土壤杆菌共培养后，用基因枪破坏植物组织的方法(EP 486234、EP 486233)。
用于制备水稻转化植物的已知方法的更具体的实例包括以下方法：聚乙二醇法(Datta，S.K.(1995)In Gene Transfer To Plants(Potrykus I andSpangenberg Eds.)pp 66-74)、基因枪法(Christou et al.(1991)Bio/technology，9：957-962)、利用愈伤组织的土壤杆菌法(Hiei，Y.et al.，Plant J.6，270-282(1994))、和利用种子的土壤杆菌法(JP 2001-029075)。这些方法可以被优选地用于本发明。
此外，所述载体可以携带合适的选择标记基因，或者可以将含有选择标记基因的质粒载体共引入到植物细胞内，以便有效地选择出转化细胞。可以用于此目的的选择标记基因包括例如潮霉素磷酸转移酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、和乙酰转移酶基因，这些基因赋予了对除草剂草胺膦(phosphinothricin)的耐药性。
根据植物细胞的类型，通过本领域技术人员已知的方法可以实现由转化植物细胞再生植物(R.Abdullah et al.，Bio/Technology，4：1087-1090(1986)；K.Toriyama et al.，Theor. Appl.Genet.，73：16-19(1986)；Y.Yamadaet al.，Plant Cell Reports，5：85-88(1986))。植物再生也见于以下文献：Vasilet al.(1984)in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Vols.I，II，III，Laboratory Procedures and Their Applications(Academic Press)；Weissbach et al.(1989)Methods For Plant Mol.Biol。利用相同的转化株系或其他株系通过自花传粉或异花传粉可以由转化植物获得子代。通过异花传粉也可以制备出其中已经引入了所需表型的杂交体。
通过有性或无性繁殖可以由转化植物获得子代。当从所述植物、其子代或克隆中制备出育种材料时，可以从这些材料大量地生成植物。术语“育种材料”指的是具有生长成整个植物体的能力的植物器官和组织，包括种子、插条以及营养器官和组织。具体而言，营养器官包括树桩、插条、根茎、块茎、鳞茎、地下茎如球根、在土壤中扩展的匍匐根样根茎、在土壤表面水平生长的匍匐茎、和在地面上方形成的鳞芽。
本发明可以适用于所需植物，所述植物包括例如选自禾本科、豆科、茄科、十字花科、葫芦科、藜科、伞形科、紫菀科、蔷薇科、和百合科的植物。具体而言，所述植物包括例如玉米(Zea mays)、芸苔(Brassicanapus和Brassica rapa ssp.)、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor和Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthus annuus)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum和Nicotiana benthamiana)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、番薯(Ipomoea batatus)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobromacacao)、茶树(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Perseaamericana)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏仁(Prunusamygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、野生燕麦(oat)、拟南芥、和其它农作物、蔬菜及观赏植物。本发明优选地适用于单子叶植物和农作物植物。具体而言，这些植物包括禾本科植物、豆科植物和蓼科植物。更优选地，适用本发明的植物包括禾本科植物如水稻、大麦、小麦、黑麦、小米(millet)、稗(Japanese millet)、粟(foxtail millet)、甘蔗、高粱、薏苡(adlay)、玉米、日本草坪草、和燕麦，甚至更优选地包括水稻(稻属)。
所生成的植物优选地具有增强的赤霉素敏感性。赤霉素敏感性的增强表示与引入本发明的核酸之前的亲代株系比较，增强了至少一种赤霉素活性。通过测定植株高度、叶片长度、分蘖数、死亡率、叶鞘伸长率、种子中α-淀粉酶诱导作用等可以检测出赤霉素敏感性。在一个优选的实施方式中，与引入本发明核酸前的亲代株系相比较，增强了本发明的转化体中的两种或多种、更优选3种或多种、或4种或多种赤霉素活性。赤霉素活性包括增加植物高度、叶片长度、和叶鞘伸长率；减少分蘖数目和死亡率；增加发芽和开花；抑制落叶；增加细胞分裂；诱导糊粉细胞中的淀粉酶以及水解酶的合成；以及活化细胞内信号转导(包括诱导GA应答基因的表达)的活性。当植物具有这些特征中的其中一种或多种、优选地两种或多种、三种或多种、或四种或多种特征时，则判定植物中赤霉素敏感性增强。通过测试赤霉素转化体和非转化体之间的作用是否不同或者作用是否依赖于赤霉素的剂量而变化，可以证实这些赤霉素活性的特异性。胞内GA信号转导的检测也见于以下文献：Yazaki J，et al.，DNA Res.，2003，10(6)：249-61；Yazaki J，et al.，Physiol Genomics.，2004，17(2)：87-100；Margis-Pinheiro M，et al.，Plant Cell Rep.，2005，23(12)：819-33；Thomas SG，Sun TP.，Plant Physiol.，2004，135(2)：668-76；Ogawa M，et al.，Plant Cell.，2003，15(7)：1591-604；Gomez-Maldonado J，etal.，Planta.，2004，218(6)：1036-45；Skadsen RW.，Plant Physiol.，1993，102(1)：195-203；Dill A，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.，2001，98(24)：14162-7；Bouquin T，et al.，Plant Physiol.，2001，127(2)：450-8；WashioK.，Biochim Biophys Acta.，2001，1520(1)：54-62；Ogawa M，et al.，Plant MolBiol.，1999，40(4)：645-57；Chono M，et al.，Plant Cell Physiol.，1998，39(9)：958-67；Vishnevetsky M，et al.，J Biol Chem.，1997，272(40)：24747-50；Toyomasu T，et al.，Biosci Biotechnol Biochem.，1995，59(10)：1846-9；Cejudo FJ，et al.，Plant Mol Biol.，1992，20(5)：849-56；Gubler F，Jacobsen JV.，Plant Cell.，1992，4(11)：1435-41；Baulcombe DC，et al.，J Biol Chem.，1987，262(28)：13726-35；Gale MD，Spencer D.，Biochem Genet.，1977，15(1-2)：47-57；Gopalakrishnan B et al.，Plant Mol Biol.，1991，16(3)：463-7；Cho，H.T.，and H.Kende.，1997，Plant Cell 9：1661-1671)。
优选地根据第二叶鞘的伸长和/或去胚半粒种子中α-淀粉酶的诱导确定出赤霉素敏感性(Ueguchi-Tanaka，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，11638-11643(2000)；Yamaguchi，J.(1998)Breeding Sci.48，365-370；Chrispeels，M.J.and Varner，J.E.(1967)Plant Physiol.42：398-406；KashemMA et al.(1998)Planta，205(3)：319-26)。更多的细节见实施例。本发明涉及用于增强赤霉素敏感性的方法，其包括增加本发明的赤霉素结合蛋白的表达的步骤。所述方法也包括用于通过增强赤霉素敏感性而改变表型(例如增强生长或增加植物高度)的方法。例如，可以提高本发明的赤霉素结合蛋白的表达水平，以便获得至少其中一种赤霉素高敏感表型，例如增加生长率。此外，本发明涉及用于增强赤霉素敏感性的方法，其包括向植物细胞内引入编码本发明的赤霉素结合蛋白的核酸并用这些核酸增强赤霉素敏感性的步骤。这些也包括用于通过增强赤霉素敏感性而改变表型(例如增强生长或增加植物高度)的方法和用途。本发明也涉及用于生成具有增强的赤霉素敏感性的植物的方法，其包括生成引入了编码本发明的赤霉素结合蛋白的核酸的植物并利用这些核酸生成所述植物的步骤。这些方法和用途也包括用于生成已经通过增强赤霉素敏感性改变了其表型(具体而言，增强了所述植物的生长或者增加了所述植物的高度)的植物的方法以及这些植物的用途。本发明也涉及编码本发明的赤霉素结合蛋白的核酸，其被单独地用于增强赤霉素敏感性。被用于增强赤霉素敏感性的核酸指的是被唯一地用于增强赤霉素敏感性的核酸。本发明也涉及被唯一地用于通过增强赤霉素敏感性来改变表型(具体而言，即增强生长或增加植物高度)的核酸。预计在增强植物的赤霉素敏感性时发生了生长增强。例如，给农作物例如食用植物应用这些核酸可以增加产量。此外，可以自由地控制植物高度。
本发明也涉及其中本发明的赤霉素结合蛋白的表达受到了抑制的植物。减少了这些植物内源包含的蛋白质的表达量。抑制蛋白质表达表示减少或消除了目的蛋白或编码所述蛋白的mRNA的表达量。所述抑制可以是因为转录抑制、翻译抑制、和/或降低mRNA或蛋白质的稳定性等等。依据由于植物细胞中蛋白质或mRNA水平或蛋白质活性的降低造成的表型改变可以证实表达的抑制。
可以在植物内表达抑制本发明的赤霉素结合蛋白的核酸，以抑制所述蛋白质的表达。这些核酸包括在表达时抑制了编码所述蛋白质的基因的转录和/或翻译的核酸。具体而言，利用反义作用和RNAi。Ecker等利用瞬时基因表达法证实了植物细胞中的反义作用(J.R.Ecker and R.W.Davis，(1986)Proc.Natl.Acad.USA.83：5372)。随后，已经报道反义RNA的表达造成了很多植物(包括烟草和矮牵牛花)中靶基因的表达的降低(A.R.van der Krol et al.，(1988)Nature 333：866)。现在，反义RNA是一种明确的用于抑制植物中基因表达的方法。
如下所示，反义核酸抑制靶基因表达的作用涉及以下多个因素：通过形成三聚体抑制转录，通过与一部分RNA聚合酶生成的局部开放环结构形成杂合体抑制转录，通过在合成过程中与RNA形成杂合体抑制转录，通过在内含子-外显子交界处形成杂合体抑制剪切，通过与剪切体形成部分形成杂合体抑制剪切，通过与mRNA形成杂合体抑制核到细胞质的易位，通过与加帽位点或多(A)位点形成杂合体抑制剪切，通过与翻译起始因子的结合位点形成杂合体抑制翻译起始，通过与邻近起始密码子的核糖体结合位点形成杂合体抑制翻译，通过与mRNA的翻译区或多核糖体结合位点形成杂合体抑制肽链的延伸，通过与核酸-蛋白质相互作用位点形成杂合体抑制基因表达，RNA沉默介导的mRNA降解等等。这些因素抑制了转录、剪切、或翻译的过程或降解了mRNA，并因此抑制了靶基因表达(Hirashima and Inoue，Shin Seikagaku Jikken Koza(NewCourses in Experimental Biochemistry)2，Kakusan(Nucleic Acid)IV：“Idenshi no Fukusei to Hatsugen(Replication and expression of genes)”，Ed.The Japanese Biochemical Society，Tokyo Kagakudojin，pp.319-347，1993；Serio et al.，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6506-6510)。
用于本发明的反义序列可以通过上面所述的任一作用抑制其靶基因的表达。在一个实施方式中，被设计成与基因的mRNA的5’末端邻近的非翻译区互补的反义序列能有效地抑制基因的翻译。或者，也可以使用与编码区或3’非翻译区互补的序列。因此，用于本发明的反义核酸不仅包括那些包含与基因的翻译区反义的序列的核酸，也包括那些包含与非翻译区反义的序列的核酸。所用的反义核酸与合适启动子的下游相连接，含转录终止信号的序列优选地与3’末端相连接。利用已知的方法可以用如上制备到的这些DNA转化所需的植物。反义核酸的序列优选地互补于植物的内源基因或其一部分；但是，序列不必是完全互补的，只要它们能有效地抑制基因的表达。转录RNA具有至少18个或更多个核苷酸，优选地具有20个或更多个核苷酸，以及甚至更优选地具有22、25、30、35、40、50、100、200、或500个核苷酸的序列，其与靶基因转录本的互补序列的相同性优选地是90％或更高，最优选地是95％。所用的反义核酸的长度一般不到5kb，优选地不到2.5kb。
利用编码核酶的DNA也可以抑制内源基因的表达。核酶是具有催化活性的RNA分子。存在各种具有不同活性的核酶。其中，根据对作为RNA裂解酶的核酶的研究，已经可以设计出进行位点特异性RNA裂解的核酶。本发明的核酶包括那些由400个或更多个核苷酸组成的大核酶，例如I组内含子型核酶和含M1RNA的RNAseP核酶、以及具有约40个核苷酸的活性区域的核酶(称作锤头或发夹型核酶)(Makoto Koizumi andEiko Otsuka，(1990)Tanpakushitu，Kakusan，Koso(Protein，Nucleic acid andEnzyme)，35：2191)。
例如，锤头型核酶的自裂解区在3’末端的C15处裂解G13U14C15。U14与9位的A的碱基配对对于该活性是重要的，甚至在15位的核苷酸是A或U而不是C时，仍能发生裂解(M.Koizumi et al.，(1988)FEBS Lett.228：225)。当核酶的底物结合位点被设计成与邻近靶位点的RNA序列互补时，可以生成能够识别靶RNA中序列UC、UU、或UA的限制性内切酶样RNA裂解核酶(M.Koizumi et al.，(1988)FEBS Lett.239：285；MakotoKoizumi and Eiko Otsuka，(1990)Tanpakushitu，Kakusan，Koso(Protein，Nucleic acid and Enzyme)，35：2191；M.Koizumi et al.，(1989)Nucleic AcidsRes.17：7059)。例如，在编码序列SEQ ID NO：1、4、6、和8中有很多潜在的靶位点。
发夹型核酶也可用于抑制基因表达。在烟草环斑病毒卫星RNA的负链中可以找到发夹型核酶(J.M.Buzayan Nature 323：349，1986)。已经显示出，也可以根据这种类型的核酶设计出靶点特异性RNA裂解核酶(Y.Kikuchi and N.Sasaki(1992)Nucleic Acids Res.19：6751；Kikuchi Y.Kagaku to Seibutsu(Chemistry and Biology)1992，30，112)。
所设计的能够裂解其靶点的核酶与启动子和转录终止子相连，使得其可以在植物细胞内被转录。但是，当向转录RNA的5’或3’末端添加额外的序列时，核酶可能丧失其活性。在这种情况中，顺式发挥修剪作用的修剪核酶(trimming ribozyme)可以被排列于核酶部分(moiety)的5’或3’端，以便仅仅从核酶的转录RNA中精确地切割出核酶部分(K.Tairaet al.，(1990)Protein Eng.3：733；A.M.Dzianott and J.J.Bujarski(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86：4823；C.A.Grosshans and R.T.Cech(1991)Nucleic Acids Res.19：3875：K.Taira et al.，(1991)Nucleic Acids Res.19：5125)。此外，通过前后(in tandem)排列这些组成单元以容许靶基因内多个位点的裂解可以进一步地增强作用(N.Yuyama et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.186：1271，1992)。通过用这种核酶特异性地裂解靶基因的转录本可以抑制靶基因表达。
或者，通过经具有与靶基因序列相同的或相似的序列的DNA的转化作用形成的共抑制作用可以实现内源基因表达的抑制。存在两种已知类型的共抑制：转录基因沉默(TGS)和转录后基因沉默(PTGS)。两者指的都是当经转化向植物内引入具有与靶向内源基因相同或相似的序列的基因时，抑制了靶向内源基因的表达的现象，在植物中常常可以看到这种现象(Curr.Biol.7：R793，1997，Curr.Biol.6：810，1996)。这种现象也被称作同源基因沉默(HGS)。例如通过用所制备的载体转换靶植物，可以获得其中本发明的核酸表达受到共抑制的植物，使得本发明的DNA或具有与所述DNA相似序列的DNA可以得到表达，然后从所生成的植物中选出其中与野生型植物相比其靶基因的表达受到抑制的植物。用于共抑制的这些基因不必一定要与靶基因(例如，SEQ ID NO：1、4、6、或8)完全相同，但是所述基因优选地具有至少70％或更高的、优选地80％或更高的、更优选地90％或更高的(例如95％、96％、97％、98％、或99％或更高的)序列相同性。被转录的这些核酸不编码任一具有赤霉素结合活性的蛋白是优选的。例如，为了阻止功能蛋白的表达，优选地使用其蛋白编码序列有着核苷酸缺失、插入、或取代的核酸。
RNA干扰(RNAi)或微RNA(miRNA)介导的表达抑制的部分机制被认为是涉及到PTGS和HGS的共抑制作用(van der Krol AR，et al.，Plant Cell，1990，2(4)：291-9；Jorgensen RA，et al.，Plant Mol Biol，1996，31(5)：957-73；Vance and Vaucheret(2001)Science 292：2277-2280；Kerschen，A.et al.，2004，FEBS Letters 566：223-228；Jorgensen，R.A.，2003，Sensecosuppression in plants：past，present and future.In：RNAi：a Guide to GeneSilencing(ed.G.J.Hannon)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，pp.5-21)。RNAi是一种现象，由此当向细胞内引入具有与靶基因序列相同或相似的序列的双链RNA(此后简称为dsRNA)时，抑制了靶基因的表达。当向细胞内引入约40到数百个碱基对的dsRNA时，RNaseIII样核酸酶Dicer从3’末端切下一段约21到23个碱基对dsRNA，形成siRNA(短干扰RNA或小干扰RNA)。特异性蛋白质与该siRNA的结合形成了核酸酶复合物(RNA诱导的沉默复合物(RISC))。该复合物识别并结合与siRNA的序列相同的序列，并且通过RNaseIII样酶活性在对应于siRNA中心的位点裂解靶基因的mRNA。除此途径外，siRNA的反义链与mRNA结合，并作为RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的引物，以合成dsRNA。该dsRNA再次成为Dicer的底物，这就形成了新的siRNA，并放大了其作用。
在多种真核细胞中都已经观察到了RNAi。目前，RNAi已经被广泛地作为有效抑制靶基因表达的方法(Fire，A.RNA-triggered gene silencing.Trends Genet.15，358-363(1999)；Sharp，P.A.RNA interference 2001.Genes Dev.15，485-490(2001)；Hammond，S.M.，Caudy，A.A.&Hannon，G.J.Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA.Nature Rev.Genet.2，110-1119(2001)；Zamore，P.D.RNA interference：listening to thesound of silence.Nat Struct Biol.8，746-750(2001))。如上所述，尤其是植物中RNAi长期都被认为是共抑制的。利用RNAi抑制基因表达常常被用作制备所需基因的敲除植物的方法(Chuang CF&Meyerowitz EM：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985，2000；Tomita，R.et al.，FEBS Lett.573：117-120)。用于转录诱导抗编码所述蛋白质的基因的RNAi的RNA(RNA-RNAi)的载体也可以被优选地用于本发明，以生成其中本发明的赤霉素结合蛋白的表达受到了抑制的植物。
例如，包括由靶基因的编码序列的一部分组成的有义链及其互补链的双链RNA(dsRNA)可以被用作RNAi-RNA。例如，优选地表达由短双链区组成的siRNA。约21到23个碱基对的siRNA是优选的，但是所述长度并不受特殊限制，只要它在所述siRNA不会对细胞产生毒性的长度范围内。例如，siRNA长度可以是15到49个碱基对，优选的是15到35个碱基对，以及更优选的是21到30个碱基对。通过表达载体的转录可以适当地生成siRNA。所用的启动子包括例如RNA聚合酶III启动子(McManus et al.(2002)RNA 8：842-850)。siRNA的表达载体可以转录出如下的siRNA。例如，由靶蛋白的编码序列构成的RNA和另一个具有其互补链的RNA可以被转录为单个RNA分子；或者它们可以转录为其中两个RNA分子经间隔物(spacer)连接在一起的RNA分子。转录为单链的RNA可以转换成具有发夹结构的双链RNA(自我互补的发夹RNA(hpRNA))，并通过RNAi抑制了靶基因的表达(Smith，N.A.et al.Nature，407：319，2000；Wesley，S.V.et al.Plant J.27：581，2001；Piccin，A.et al.Nucleic Acids Res.29：E55，2001)。
RNAi-RNA的双链区的序列不必与靶基因完全相同，但是序列相同性优选地是90％或更高(例如95％、96％、97％、98％、99％或更高)。通过dsRNA中RNA-RNA配对形成的双链RNA部分不限于配对的双链体，也包括由于错配(相应的核苷酸是不互补的)和/或凸出(缺少相应核苷酸的一条链)所造成的不配对的部分。错配和凸出的数目通常是1到6，优选地是1到3。
与上述所述非常相似的是，miRNA(微RNA)也可以被用于抑制靶基因表达。miRNA可以被表达为前体RNA的一部分(Reinhart et al.(2002)Genes&Development 16：1616-1626；Llave et al.(2002)Plant Cell14：1605-1619)。miRNA的大小一般是约15到30个核苷酸，以及miRNA具有与其靶向mRNA互补的序列。miRNA前体的构建以及miRNA对靶基因表达的抑制见先前发表的文献：McManus et al.(2002)RNA8：842-850；Reinhart et al.supra；Llave et al.(2002)supra。当由表达载体转录出miRNA时，可以使用例如RNA聚合酶III启动子(McManus et al.(2002)RNA 8：842-850)。
通过向植物细胞内引入含有核酸的表达载体并从细胞再生出植物可以生成其中本发明的赤霉素结合蛋白的表达受到抑制的植物，所述核酸例如是如上所述的反义核酸、核酶、共抑制核酸、siRNA、或miRNA，它们都能抑制本发明蛋白的表达。本发明提供了携带有抑制本发明的赤霉素结合蛋白的表达的核酸的载体，具体而言，所述核酸是针对编码本发明的赤霉素结合蛋白的RNA的反义RNA、裂解编码所述蛋白质的RNA的核酶、经共抑制作用抑制所述蛋白质表达的诱导共抑制作用的RNA、编码抑制蛋白质表达的siRNA或miRNA的核酸，以及携带所述核酸的载体。本发明也涉及引入了核酸的植物细胞以及包含所述细胞的植物。通过上述方法可以实现载体引入和植物再生。本发明涉及用于降低赤霉素敏感性的方法，其包括抑制本发明的赤霉素结合蛋白的表达的步骤。对本发明的蛋白质表达的抑制包括通过向所述蛋白质内引入突变来降低或消除所述蛋白质的活性。具体而言，通过向基因内引入突变、缺失或插入破坏(disruption)编码本发明的蛋白质的基因来抑制功能蛋白的表达，可以抑制本发明的蛋白质的表达。所述方法也包括通过降低赤霉素敏感性来改变表型的方法，特别是用于抑制生长、缩短植物高度、或诱导矮小症的方法。例如，本发明的赤霉素结合蛋白的表达水平可以被降低到容许获得至少一种低赤霉素敏感性表型，例如矮小症。本发明也涉及降低赤霉素敏感性的方法，其包括向植物细胞内引入抑制本发明的赤霉素结合蛋白表达的核酸的步骤，和所述核酸降低赤霉素敏感性的用途。这些包括用于通过降低赤霉素敏感性来改变表型的方法和用途，例如抑制生长、缩短植物高度和诱导矮小的方法。本发明也涉及抑制本发明的赤霉素结合蛋白的表达的核酸，所述核酸用于降低赤霉素敏感性。用于降低赤霉素敏感性的核酸指的是被唯一地用于降低赤霉素敏感性的核酸。本发明也涉及被唯一地用于通过降低赤霉素敏感性改变表型(特别是抑制生长、缩短植物高度、或诱导矮小症)的核酸。本发明也涉及用于生产具有降低的赤霉素敏感性的植物的方法，其包括生成被引入了抑制赤霉素结合蛋白表达的核酸的植物的步骤，以及所述核酸在生产具有降低了的赤霉素敏感性的植物中的用途。这些方法和用途也包括用于生产通过降低赤霉素敏感性已经改变了其表型(即已经抑制了其生长、已经缩短了其高度、或者已经诱导了矮小症)的植物的方法和用途。当植物具有多个(2、3或更多个)编码本发明的蛋白质的基因时，通过抑制2个或多个、优选3个或多个、或更优选所有基因的表达可以有效地降低对赤霉素的敏感性。其中已经引入了抑制赤霉素结合蛋白的表达的核酸的转化植物包括从转化植物细胞中再生出的第一代植物、以及作为其子代或克隆的携带所述核酸的植物。可以通过有性或无性繁殖由转化植物获得子代。此外，可以从所述植物、其子代或克隆中获得育种材料(例如种子、果实、插条、根茎、块茎、和树桩)。当通过有性繁殖生成子代时，可以使用自花传粉以及与其他植物的异花传粉。
与亲代株系或野生型植物相比，经上述方法生成的植物中的赤霉素敏感性是降低的。例如依据是否存在一种或多种、优选2种或多种、3种或多种、4种或多种赤霉素作用的特征例如植物高度和叶片长度的缩短、分蘖数和死亡率的增加、叶鞘伸长率的降低、以及淀粉酶诱导程度的降低可以证实赤霉素敏感性的降低。例如，可以提高植物中SD1 mRNA的水平(Sasaki，A.et al.，Nature 416，701-702(2002))(例如1.5倍以上、优选2倍以上、3倍以上、或5倍以上)，其中与对照植物(抑制前的亲代株系)相比，所述植物中的本发明的蛋白质的表达受到了抑制。或者，可以提高植物中GA1的水平(例如2倍以上、优选5倍以上、10倍以上、20倍以上、50倍以上、或100倍以上)，其中与对照植物相比，所述植物中本发明的蛋白质的表达受到了抑制。此外，可以显著地抑制赤霉素引起的SLR1蛋白的降解，其中与对照植物相比，所述植物中本发明的蛋白质的表达受到了抑制。上面描述了赤霉素活性的细节。优选地依据第二叶鞘的伸长和/或去胚半粒种子中淀粉酶的诱导确定出赤霉素敏感性(Ueguchi-Tanaka，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，11638-11643(2000))。具体而言，与亲代株系或野生型相比，降低了赤霉素敏感性降低的植物中的第二叶鞘伸长的程度和/或α-淀粉酶的诱导程度。根据本发明，可以通过如上所述的降低植物的赤霉素敏感性来修饰植物，形成矮小表型。具体地，当高的植物被修饰成短茎矮小型植物时，可以提高它们对倒伏的耐受性。预计可以增加短茎农作物植物的产量。事实上，通过在编码GA20氧化酶(其是一种参与赤霉素生物合成的酶)的基因中引入突变已经开发出了短茎高产水稻变体(IR8)(Sasaki，A.et al.，Nature，2002，416，701-702)。提高农业重要农作物的产量是世界范围内的重要目标。具体地，对开发出高产的农作物植物(例如水稻、小麦、大麦、野生燕麦、黑麦、玉米、和栗树)的变体有着强烈的需要。通过将农作物植物改造成本发明的短茎型可以生成预期具有更高产量的农作物。或者，非农作物植物例如观赏植物也可以被制成矮小型，以便赋予新的美学价值。本发明提供了例如观赏性的矮小盆景水稻植物，其中抑制了本发明的赤霉素结合蛋白的表达。
本发明也涉及用于结合赤霉素和本发明的蛋白质的方法，其包括使赤霉素和所述蛋白质接触的步骤。所述赤霉素可以是任一有生物学活性的赤霉素。另外，本发明也涉及用于结合本发明的蛋白质和DELLA蛋白的方法，其包括使本发明的蛋白质和DELLA蛋白接触的步骤。此外，本发明也涉及将赤霉素、DELLA蛋白和本发明的蛋白质结合在一起的方法，其包括容许它们共存的步骤。如下所述，这些方法可以用于检测调节结合的化合物或者用于筛选调节结合的化合物。经这种筛选获得的化合物可以用于调节赤霉素信号转导。利用生理溶液可以合适地实施结合反应。这些溶液包括例如结合缓冲液[20mM Tris-HCl(pH7.6)、5mM 2-巯基乙醇、和0.1M NaCl]，但不限于此。本发明也涉及由赤霉素和本发明的蛋白质组成的分离的复合物，以及由DELLA蛋白和本发明的蛋白质组成的分离的复合物。此外，本发明也涉及由赤霉素、DELLA蛋白和本发明的蛋白质组成的分离的化合物。
DELLA蛋白指的是分组在植物GRAS家族的DELLA亚家族中的GA信号转导调节蛋白(Peng J et al.(1999)Nature 400：256-261；Itoh，H.etal.，Trends Plant Sci.8，492-497(2003))。已知DELLA蛋白具有抑制赤霉素信号转导的功能。存在多种已知的DELLA蛋白，包括例如拟南芥RGA、GAI、RGL1、RGL2和RGL3、水稻SLR1、大麦SLN1、玉米D8、和小麦RHT(Fleet，C.M.，and Sun，T.-P.(2005)Curr.Opin.Plant Biol.，8，77-85；Dill，A.，and Sun，T.(2001)Genetics，159，777-785；Ueguchi-Tanaka，M.et al.(2005)Nature，437，693-698；Chandler PM et al.(2002)Plant Physiol 129：181-190；Gubler F et al.(2002)Plant Physiol 129：191-200；Peng J et al.(1999)Nature 400：256-261)。更具体而言，DELLA蛋白包括例如RGA(位置：At2g01570、登陆号；NM_126218、CDS：207..1967、蛋白质ID：NP_178266)、GAI(位置：At1g14920、登陆号；NM_101361、CDS：189..1787、蛋白质ID：NP_172945)、RGL1(位置：At1g66350、登陆号；NM 105306、CDS：133..1665、蛋白质ID：NP_176809)、RGL2(位置：At3g03450、登陆号；NM_111216、CDS：128..1768、蛋白质ID：NP_186995)、RGL3(位置：At5g17490、登陆号；AK117226、CDS：191..1759、蛋白质ID：BAC41902)、水稻SLR1(登陆号；AB030956、CDS：216..2090、蛋白质ID：BAA90749)、大麦SLN1(登陆号；AF460219、CDS：1765..3618、蛋白质ID：AAL66734、Q8W127)、玉米D8(登陆号；AJ242530、CDS：1..1890、蛋白质ID：CAB51557)、和小麦RHT(登陆号；AJ242531、CDS：1..1869、蛋白质ID：CAB51555，Q9ST59)。
例如通过如杂交的方法可以分离出其他植物的DELLA蛋白，所述杂交使用从上面所列的DELLA基因的编码序列(CDS)或其互补序列制备出的探针。本领域技术人员可以适当地选择杂交条件。这些条件例如是在含有5xSSC(1xSSC含150mM NaCl和15mM柠檬酸钠)、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑精DNA、5xDenhardt溶液(1xDenhardt溶液含有0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白、和0.2％Ficoll)的溶液中在48℃、优选52℃、以及更优选60℃下进行杂交，随后在与杂交所用温度相同的温度、优选60℃、更优选65℃摇晃下用2xSSC洗涤2小时。更优选地在1xSSC、甚至更优选地在0.5xSSC、以及仍更优选地在0.1xSSC中进行洗涤(Sambrook，J.and DW Russell，2001，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
DELLA蛋白的氨基酸序列或编码序列因此优选地分别具有与任一上述的拟南芥或水稻DELLA蛋白或核酸高度同源的序列。高度同源性指的是60％以上、优选65％以上、更优选70％以上、甚至更优选75％以上、80％以上、85％以上、90％以上，以及仍更优选95％以上的相同性。用在此所述的方法确定出序列相同性。
本发明提供了用于赤霉素应答检测(评价)的方法，其包括使赤霉素接触植物或植物细胞的以及检测所述植物或植物细胞中赤霉素应答的步骤，在所述植物或植物细胞中已经提高或降低了本发明的蛋白质的表达。术语“赤霉素应答检测”指的是赤霉素应答的定性和/或定量检测，以及可以是检测是否存在赤霉素应答、确定赤霉素应答的程度等等。这些赤霉素应答也包括赤霉素引起的表型变化，例如植物高度和生长速度的变化。这些其中提高或降低了本发明的蛋白质的表达的植物和植物细胞也包括所需的其中已知增加或降低(或消除)了所述蛋白质或mRNA的量的植物和植物细胞。这些植物和植物细胞可以是例如其中已经被描述的或已知的增加或降低了所述蛋白质或mRNA的量的植物和植物细胞。所述检测可以利用引入了编码本发明的赤霉素结合蛋白的载体或编码抑制所述蛋白质的表达的核酸(反义核酸、siRNA等)的载体的植物或植物细胞进行实施。例如，可以使引入了编码本发明的蛋白质的核酸的植物或植物细胞接触有生物学活性的赤霉素，然后可以检测赤霉素应答。这些检测使得能够确定出引入编码本发明的蛋白质的核酸所引起的赤霉素应答的增强或增强的程度。或者，提供使引入了核酸例如反义核酸或siRNA的植物或植物细胞接触赤霉素然后检测赤霉素应答可以确定出赤霉素应答的降低以及降低的程度，所述核酸抑制了编码本发明的蛋白质的核酸的表达。用已知的方法可以检测出赤霉素应答。
本发明也提供了用于赤霉素应答检测的方法，其包括使其中已经提高或降低了本发明的蛋白质的表达的植物或植物细胞接触测试化合物以及检测所述植物或细胞中的赤霉素应答的步骤。所述赤霉素应答检测指的是赤霉素应答的定性和/或定量测量，包括检测是否存在赤霉素应答以及确定赤霉素应答的程度。例如，因为已经增强了其中已经提高了本发明的蛋白质的表达的植物的赤霉素敏感性，可以清楚地检测出测试化合物对赤霉素应答的作用。此外，通过比较所述结果和用测试化合物处理野生型植物所获得的结果可以测试出所述作用的特异性。或者，利用其中已经降低了本发明的蛋白质的表达的植物，通过测试化合物的检测可以测定出以独立于本发明的蛋白质的方式诱导赤霉素应答的作用。这些检测法可以评价不包括本发明的蛋白质的调节赤霉素信号转导的蛋白质或其他化合物。
利用测试化合物的上述检测还可以包括接触赤霉素的步骤。具体而言，本发明提供了赤霉素应答的检测方法，其包括步骤：(a)在存在赤霉素时，使其中已经提高了本发明的蛋白质的表达的植物或植物细胞接触测试化合物；和(b)检测存在或不存在所述测试化合物时所述植物或细胞中的赤霉素应答。这些赤霉素包括所需的有生物学活性的化合物。这些方法能够检测调节赤霉素应答的化合物。这些检测可以用于评价测试化合物是否能够调节赤霉素应答或者评价其调节的程度。
在这些检测方法的一个实施方式中，本发明提供了用于选择调节赤霉素应答的化合物的方法。具体而言，可以在存在测试化合物的情况下实施上述检测方法，可以检测出赤霉素应答。然后，选择增强或降低赤霉素应答的测试化合物。该方法能够筛选新的赤霉素衍生物或抑制赤霉素作用的化合物。作为比较的对照物，在没有(或低剂量)测试化合物或存在其他化合物时实施所述检测。可以选出与对照的赤霉素应答相比增强或降低了赤霉素应答的测试化合物。
另外，本发明也提供了用于检测赤霉素结合的方法，其包括使本发明的蛋白质接触赤霉素以及检测赤霉素与所述蛋白质的结合的步骤。本发明也涉及用作赤霉素结合蛋白的本发明的蛋白质。用作赤霉素结合蛋白的蛋白质指的是被唯一地用于赤霉素结合的蛋白质。这些赤霉素包括所需的有生物学活性赤霉素。通过在此所述的方法可以检测赤霉素结合。此外，在检测方法的一个实施方式中，本发明提供了能够调节赤霉素和本发明的蛋白质之间的相互作用的化合物的检测方法。具体而言，通过使测试化合物、赤霉素和本发明的蛋白质相接触以及通过检测赤霉素和所述蛋白质的结合可以评价测试化合物是否增强或抑制了赤霉素和本发明的蛋白质之间的结合或者增强或抑制的程度。作为对照，在没有(或低剂量)测试化合物或存在其他化合物的情况下检测赤霉素和本发明的蛋白质之间的结合并且可以比较结果。此外，该检测方法的一个实施方式中，本发明提供了选择增强或抑制赤霉素和本发明的蛋白质之间的结合的化合物的方法。具体而言，在使测试化合物、赤霉素和本发明的蛋白质相接触之后，检测赤霉素和所述蛋白质之间的结合。通过选择增强或抑制所述结合的化合物，获得了增强或抑制赤霉素和本发明的蛋白质之间的结合的化合物。作为对照，可以在没有(或低剂量)测试化合物或存在其他化合物的情况下检测赤霉素和本发明的蛋白质之间的结合，并且可以比较结果。这些方法能够筛选调节赤霉素应答的新的化合物。
实施例
下面将参照实施例具体地描述本发明，但是所述实施例不应当作为对本发明的限制。通过引用将在此引用的所有先前技术的参考文献并入本说明书。
植物材料和生长条件
在下面的实施例中，水稻变体Oryza sativa L.cv.Taichung 65、japonica(突变体来源的原始株系)、4个gid1突变体等位基因(gid1-1到gid1-4)、和slender ricel(slr1-1)(Ikeda，A.et al.，Plant Cell.13，999-1010(2001))用作示例。Gid1突变体等位基因是由下面的诱变剂引起的：N-甲基-N-亚硝基脲(gid1-1)、细胞培养物(gid1-2和gid1-4)、和γ射线(gid1-3)。所有水稻植株都在30℃(白天)和24℃(夜间)的温室中进行培养。
GA应答检测
利用Ueguchi-Tanaka，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，11638-11643(2000)所述的方法实施针对第二叶鞘的伸长和水稻去胚半粒种子的α-淀粉酶的诱导作用的GA应答检测。
质粒构建
用PCR扩增对应于野生型和突变体GID1的全长cDNA的DNA序列，以生成重组水稻GID1蛋白。将有和没有突变的GID1 cDNA序列插入到pGEX-4T(Pharmacia)内。对于互补检测，用PstI消化来自BAC克隆的水稻基因组DNA，分离出覆盖整个GIDI序列的6.7-kb DNA片段，并将其克隆到pBluescript(R)内。将该片段平截(blunt)并插入到耐潮霉素的二元载体pGI-Hm12的SmaI位点内(Hm-2被修饰；Sato，Y.et al.，Plant Mol.Biol.，1998，38：983-998)。先前已经描述了SLR1启动子-SLR1-GFP的构建(Itoh，H.et al.，Plant Cell 14，57-70(2002))。如Hiei，Y.et al.，Plant J.6，270-282(1994)所述，通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的转化将这些构建体引入到水稻细胞内。
内源性GA的测量和其他分析
用如先前所述的气相色谱选择性离子监测法(Kobayashi，M.et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.59，1969-1970(1995))实施对水稻内源性GA的定量分析。如先前所述进行RNA凝胶印迹分析和Western印迹分析(Itoh，H.et al.，Plant Cell 14，57-70(2002))。
赤霉素结合检测
在赤霉素结合检测中，[1，2，16，17-3H4]16，17-二氢-GA4用作标记的GA4。利用具有一些改变的先前方法实施体外GA结合检测(Nakajima，M.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.241，782-786(1997))。将纯化的重组GID1蛋白(400pmol)溶解于300μl结合缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 7.6)、5mM 2-巯基乙醇、和0.1M NaCl]内，并在25℃下与100μl3H-16，17-二氢GA4(6pmol)孵育2个小时，不存在未标记的GA4(非特异性结合)或存在833倍过量的未标记的GA4(总结合)。然后，将0.1ml反应混合物加样到NAP-5柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上。舍弃结合缓冲液的洗脱物(0.6ml)，收集随后的洗脱物(0.2ml)，并测定放射性。通过从总结合的量减去非特异性结合的量可以计算出反映出可置换GA结合位点的数目的特异性结合活性。对其他的GA也可以实施与上相同的方法。
实施例1：鉴定赤霉素不敏感型矮小突变体
为了分离出参与赤霉素感知的基因，筛选水稻的GA不敏感型矮小突变体(gid)，并鉴定出不同基因座上的数个gid突变。其中一种突变体gid1-1表现出严重的矮小症和深绿色的变大了的叶片，这是已知的水稻GA相关突变体的典型表型(Sasaki，A.et al.，Science 299，1896-1898(2003)；Itoh，H et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，8909-8914(2001)；Sakamoto，T.et al.，Plant Physiol.134，1642-1653(2004))(图1a)。该突变是隐性遗传的，因为没有孕性花发育，所以所述突变体被保持为杂合植物。在所进行的测试范围内，该gid1植物都没有显示出任一类型的GA应答性。10-8M以上的GA3促进了野生型植物(WT)的第二叶鞘的伸长，但是第二叶鞘的伸长在gid1-1植物根本没有得到促进(图1b)。此外，10-9M以上的GA3诱导了野生型种子的α-淀粉酶活性，但是在gid1-1种子没有诱导作用(图1c)。在野生型中观察到了GA3对SD1/OsGA20ox2(Sasaki，A.et al.，Nature 416，701-702(2002))(一种GA生物合成基因)(Thornton，T.M.et al.，Trends Plant Sci.4，424-428(1999))表达的负反馈作用，但是这在gid1-1植物中没有观察到，以及SD1 mRNA累积到高水平(图1d)。此外，测量了内源性GA的水平，结果表明gid1-1比野生型蓄积了约120倍多的GA1(图1e)。这些结果都证明gid1-1是GA不敏感型突变体。
接下来，进行gid1和slr1的上位性分析。双突变体表现出slr1表型(图1g)。这表明GID1和SLR1作用于相同的GA信号转导途径，并且SLR1上位性地作用于GID1。GA依赖性SLR1降解对于GA作用是至关重要的，已知当降解受到抑制时，植物会表现出gid表型(Sasaki，A.et al.，Science 299，1896-1898(2003))。进行SLR1的免疫印迹分析，以检测gid1-1中的SLR1降解是否受到了抑制。对于野生型植物，在用GA3处理后30分钟内诱导SLR1完全降解；但是，对于gid1-1，无论是否进行GA3处理(甚至处理2个小时后)，SLR1蛋白仍保持相同水平(图1f中上面的组)。在其中已经被引入SLR1启动子-SLR1-GFP的转基因植物中也观察到了gid1中SLR1对GA3应答的稳定性增加；在gid1-1中甚至在GA3处理后的也观察到了GFP信号，而在野生型的核中没有观察到信号(图1f中下面的组)。这些结果证明GID1对于SLR1降解是至关重要的。
实施例2：赤霉素受体基因的克隆
用定位克隆分离出GID1基因，确定出四种类型的突变体等位基因中的突变位点，以阐明GID1的分子功能(图2)。预计GID基因是由1个内含子和2个外显子组成的，并编码354个氨基酸残基的多肽(图2b和3a)。对该基因全长cDNA序列的分析证实所预计的外显子区域是正确的，以及该基因的确被转录。当覆盖GID基因的整个区域的6.7-kb PstI片段被引入到gid1-1中时，发现表型恢复成正常表型。
分析GID1蛋白的氨基酸序列，发现GID1包含激素敏感型脂肪酶(HSL)家族的共有序列(图3b)。事实上，GID具有GXSXG和HGG基序(图3b中的点)，其是HSL家族中最保守的基序(Osterlund，T.et al.，Biochem.J.319，411-420(1996)；Manco，G.et al.，Arch.Biochem.Biophys.373，182-192(2000))。Gid1-1等位基因中GXSXG基序的第一个位点的D对G的单氨基酸取代造成了严重表型(图3a)。因此，表明GXSXG基序对于GID1功能是重要的。GID1和HSL蛋白家族之间的结构相似性表明水稻GID1具有HSL样功能。通过观察表达Act1启动子-GID1-GFP的转基因植物中的GFP信号研究了GID1的细胞定位。GID1-GFP蛋白主要位于细胞核，同时在细胞质内检测到弱信号。在GA3处理前后不会改变该细胞定位(图3c)。
实施例3：赤霉素受体的分子分析
Gid1中不会出现GA引起的SLR1降解(图1f)。因此，假定GID1与GID2一样也参与了SLR1的降解，或者GID1作用于GA信号转导中SLR1的上游。Gid1和其它GA相关突变体之间的表型精确比较发现，与GA不敏感型突变体例如gid2(Sasaki，A.et al.，Science 299，1896-1898(2003))和ADELLA型显性的GA不敏感型矮小突变体(Itoh，H.et al.，PlantCell 14，57-70(2002))相比，gid1表型与GA缺陷型突变体的严重等位基因例如cps(Sakamoto，T.et al.，Plant Physiol.134，1642-1653(2004))和kao(Sakamoto，T.et al.，Plant Physiol.134，1642-1653(2004))的表型更为相似。根据gid1的这个表型特征，预计GID1参与了GA感知。为了验证这种可能性，利用非平衡凝胶过滤(Nakajima，M.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.241，782-786(1997))直接检查了GID1和放射性同位素标记的GA之间的相互作用。和预期的一样，GID1表现出与氚标记的GA4衍生物(3H4-16，17-二氢-GA4)的结合活性，利用过量的未标记的GA4可以取代大多数结合。结合是可取代的事实表明结合是GA特异性的。相反地，热变性的GID1、重组GID2、水稻GA信号转导分子的其他成员没有表现出任何特异性的结合活性。接下来，通过利用氚标记的GA4衍生物和各种GA之间的竞争作用测试了GID1的配体特异性。表1显示了每种GA的浓度，这是50％抑制氚标记GA4的衍生物与GID1的结合所需的浓度(IC50)。GID1表现出对有生物学活性的GA例如GA4、16，17-二氢-GA4、GA1、和GA3的高亲和力，但是没有显示出或几乎没有显示出与无生物学活性的GA的亲和力。每种GA的IC50值都与其生理学活性非常一致。
表1：各种GA在3H-GA4衍生物与GID1蛋白结合中的竞争作用
Figure A20068002123200501
[测试了有生物学活性的GA(GA4、16，17-二氢-GA4、GA1、和GA3)、具有弱活性的GA(GA35和GA37)、以及无活性的GA(GA4甲酯、3-epi-GA4、GA9、和GA51)；**：IC50表示50％抑制所需的浓度。Rel％表示相对值(％)]
接下来，分析GID1与GA结合的动力学。为了计算出GID1与GA结合的Kd值，利用各种浓度的GA4衍生物测量GA结合的饱和性(图4a)。依据两种GA的竞争效率，斯卡恰特作图分析发现16，17-二氢-GA4和GA4的Kd值分别是1.4×10-6M和2.8×10-7M(图4b和表1)。这些Kd值可以合理地解释应答于所施用的有生物学活性的GA的水稻枝条伸长的原因(图1c)。此外，也检查了所述结合的结合速率和解离速率。GID1和GA4衍生物之间的结合/解离所需的半衰期(half-time)是数分钟或更短(图4c)，说明这些反应发生得非常快。这种GA结合的快速动力学被认为是有利于起到细胞质受体的作用。然后研究了源自三种gid1等位基因gid1-1、gid1-2和gid1-3的突变体蛋白的GA结合活性，所述等位基因表现出严重的矮小表型。突变体GID1蛋白完全丧失了其与GA的结合活性(图4d)。这表明GID1-1和GID1-2中单个氨基酸取代造成了GA结合活性的丧失，并因此引起水稻植株的完全的GA不敏感性。综合这些结果，可以推论出GID1符合GA受体所需的传统标准(Kende，H.&Gardner，Annu.Rev.Plant，Physiol.27，267-290(1976))，所述标准是(i)可逆性；(ii)高配体特异性；(iii)合理的与生物学活性的配体的亲和力；和(iv)GA结合特性的饱和性。
实施例4：赤霉素受体基因的转基因植物
如果GID1起到GA受体的作用，预计过表达GID1的植物会表现为GA高敏感型表型。因此，生成了在水稻肌动蛋白基因的强启动子调控下过表达GID1的转基因水稻植株。与野生型相比较，过表达GID1的植物表现为高的植物高度、长的浅绿色叶片、减少的分蘖数和降低的死亡率。在过度施用GA后，所有这些植物与获得的表型相匹配(图4e)。过表达GID1植物的第二叶鞘伸长的GA应答性比野生型高出约100倍(图4f)。
如上所述，GID1对GA4的Kd值对于水稻枝条的伸长是合适的。但是，该值比糊粉细胞中GA介导的应答例如α-淀粉酶诱导作用高出约10倍(图1c)。假定三聚体G蛋白的α-亚基参与了糊粉细胞的高敏感的GA应答(Ueguchi-Tanaka，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，11638-11643(2000))。具体而言，联合三聚体G蛋白介导的膜受体系统促进GID1的GA感知是可能的，这可以作为糊粉细胞中GA受体系统的另一个元件(Hooley，R.et al.，Planta 183，274-280(1991)；Jones，H.D.et al.，Plant Cell 10，245-254(1998))。
GID1编码一种既往未知的蛋白质，并共有HSL家族的保守序列。HSL是哺乳动物脂肪细胞中脂解作用的激素调节方面的主要酶(Yeaman，S.J.，Biochem J.379，11-22(2004))。在接收到来自激素(例如去甲肾上腺素和胰岛素)的信号之后，HSL水解三甘油。尽管植物中没有体外受体活性的遗传学证据，但是Kumar和Klessig已经报道了水杨酸(SA)结合蛋白2(SABP2)是具有脂肪酶活性的HSL家族成员，其可以与SA相互作用(Kumar，D.&Klessig，D.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 100，16101-16106(2003))。本发明已经证实GID1是参与植物信号感知系统的HSL家族成员，并通过作为细胞质GA受体来调节GA信号。
实施例5：拟南芥赤霉素受体的鉴定
通过基因序列数据库搜索找到了多个编码与如上所述鉴定的水稻GID1(OsGID1)蛋白的氨基酸序列相似的蛋白质的拟南芥基因。图5显示了OsGID1的氨基酸序列和10个与OsGID1高度相似的拟南芥基因编码的推定氨基酸序列的比对。来自两个水稻gid1突变体(图2b和3a)的两个氨基酸残基Gly-196和Arg-251被认为对于GA相互作用至关重要。这两个残基中，Gly残基存在于图5所列的所有基因，而Arg残基只存在于头三个基因。这说明这三个候选物具有与OsGID1相似的GA结合活性，但是其他候选物却并非如此。
利用大肠杆菌由头7个表现出与OsGID1的高度相似性的基因生成了重组蛋白，并通过利用氚标记的GA4衍生物16，17-二氢-GA4的非平衡凝胶过滤法检查了它们的GA结合活性。具体而言，利用依据AtGID1的全长cDNA序列设计的以及在其每个末端都具有合适的限制性酶切位点的特异性引物，用PCR扩增出AtGID1基因的编码区。在经序列分析确认之后，将每个cDNA片段连接到pET32a载体(Novagen/MerckBiosciences，Madison，WI，USA)或pGEX-4T-2载体(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ，USA；currently，a part of GE Healthcare)内。用SDS-PAGE验证重组蛋白的生成；载体框作(cassette)为阴性对照。利用[1，2，16，17-3H4]-16，17-二氢-GA4(4.55TBq/mmol)(由DuPont/NEN(Boston，MA，USA)定制)，与如上所述相似地实施GA结合检测。用未标记的GA4(1.25mM)测量非特异性结合。利用10种25到1500nM浓度范围内的浓度的16，17-二氢-GA4实施动力学分析的饱和实验。用15nM[1，2，16，17-3H4]-16，17-二氢-GA4和5种浓度的未标记竞争物进行竞争检测。通过先前所述的方法用pET32a制备出重组的RGA和GAI蛋白。
如一级结构所预计的那样，头3个基因的产物表现出可逆的GA结合活性，其他4个基因的产物却没有类似表现(图6)。这3种基因被命名为AtGID1a(At3g05120)、AtGID1b(At3g63010)、和AtGID1c(At5g27320)。这3种AtGID1的氨基酸序列表明这些基因分别编码345个氨基酸的多肽(39kDa、pI＝6.6、AtGID1a)、358个氨基酸的多肽(40kDa、pI＝7.4、AtGID1b)、和344个氨基酸的多肽(38kDa、pI＝7.2、AtGID1c)。AtGID1的氨基酸序列表现出彼此之间67％到85％的相同性，以及与OsGID160％到63％的相同性。
系统进化分析确认了这三种AtGID1都被分类到与OsGID1相同的组中，并且被分类到独立于其它基因的组中(图7)。虽然AtGID1a和AtGID1c可以被分类到相同的亚组内，而AtGID1b属于独立的亚组，系统进化树表明AtGID1b的生物学功能不同于其他AtGID1。
实施例6：拟南芥GID1的GA结合性能
利用氚标记的GA4衍生物16，17-二氢-GA4检查如上鉴定出的3种AtGID1的GA结合的动力学、配体选择性、和pH依赖性。16，17-二氢-GA4有两种化学异构体，取决于C-16的位置，但是两种异构体都能与AtGID1同样地结合。16，17-二氢-GA4对GA缺陷型拟南芥突变体gal-3萌发的生理学作用约为GA4的1/10(图8)。首先，通过不同地变化孵育时间和解离时间研究了在加入过量的未标记的GA4后，氚标记的16，17-二氢-GA4和每种AtGID1的结合随着时间变化的特点。如图9A到C的插入物所示，GA从AtGID1a复合物的解离要比其从AtGID1b复合物的解离慢，而AtGID1b与GA的结合要比AtGID1a快。相反地，AtGID1c与GA的结合要比AtGID1b慢，但是GA从AtGID1c复合物的解离以及其从AtGID1b复合物的解离之间没有明显差异。此外，在各种浓度GA的平衡条件下，分析了每种AtGID1的GA结合的动力学。结果，发现AtGID1b与16，17-二氢-GA4的亲和力(Kd＝4.8×10-7M)比AtGID1a与16，17-二氢-GA4的亲和力(Kd＝2.0×10-6M)和AtGID1c与16，17-二氢-GA4的亲和力(Kd＝1.9×10-6M)高4倍(图9A到9c)。
通过观察向检测混合物中加入GA后对重组蛋白和氚标记的16，17-二氢-GA4之间的结合的竞争性抑制来检查每种AtGID1的配体选择性(表2)。表1显示了在此检测法中所检查的每种GA的结构。利用抑制50％的示踪剂(15nM)结合的GA浓度(IC50值)评价了配体选择性。所有的AtGID1都显示出非常相似的配体选择性。在所测试的GA中，GA4具有最强的抑制作用，而也被分类为活性GA的GA3和GA1具有中等作用。同时，无生理学活性的GA没有作用，说明它们不与AtGID1相互作用。
表2：GA在AtGID1-GA结合中的竞争能力
Figure A20068002123200551
[用IC50值(M)评价每种GA的作用。每个数值都表示至少两次测量的平均值。取GA4的数值作为100(％)，括弧中显示了每种GA的相对值。
H2-GA4：16，17-二氢-GA4；GA4-Me：GA4甲酯]
从氨基酸序列预计的AtGID1a的pH值要明显低于其他两种AtGID1的值。因此，研究了pH值对每种AtGID1的GA结合的作用。虽然所有的AtGID1都表现出在中性pH环境中具有最强的GA结合活性，但是它们在其他pH条件下的GA结合行为是不同的。虽然AtGID1b表现出最强的pH依赖性，AtGID1a和AtGID1c更能容许非中性pH的其他pH条件(AtGID1b的GA结合的最佳pH范围是6.4到7.5；AtGID1a的GA结合的最佳pH范围是6.4到9.0；AtGID1c的GA结合的最佳pH范围为5.7到8.3；图9D到9F)。这些生物化学实验都证实了所有3种AtGID1都具有合理的GA结合活性，AtGID1b在GA结合亲和力和pH依赖性方面的性能不同于其他两种AtGID1。
实施例7：体内和体外的AtGID1-AtDELLA相互作用
拟南芥有5种DELLA蛋白(RGA、GAI、RGL1、RGL2、和RGL3；统称为AtDELLA；Fleet，C.M.，and Sun，T.-P.(2005)Curr.Opin.Plant Biol.，8，77-85；Dill，A.，and Sun，T.(2001)Genetics，159，777-785)；因此，有着15种可能的GID1/DELLA蛋白的组合。为了验证AtGID1-AtDELLA之间的正相互作用，利用酵母双杂交(Y2H)系统进行两个实验。在第一个实验(检测A)中，利用其中只有阳性克隆才能存活的给定培养基进行可存活集落的检测。在第二个实验(检测B)中，测量了作为AtGID1-AtDELL相互作用的报告基因产物的β-半乳糖苷酶活性。
在Y2H实验中使用了BD Matchmaker双杂交系统3(Clontech，PaloAlto，CA，USA；Takara Bio的新部分)。在通过测序确认了AtGID1基因的PCR产物之后，将PCR产物克隆到pGBKT7DNA-BD穿梭载体内，以构建出诱饵质粒。同样，将每种AtDELLA基因(GAI末端包括EcoRI和XhoI位点、RGA末端包括BamHI和XhoI位点、RGL1末端包括SmaI和SacI位点、RGL2末端包括SmaI和ClaI位点、RGL3末端包括SmaI和XhoI位点)的整个编码区都克隆到pGADT7AD载体内。使用酿酒酵母(S.cerevisiae)AH109(MATa)菌株或Y187(MATα)菌株，以及DNA-BD和AD载体框被用作阴性对照。在产品说明书(Yeast ProtocolsHandbook#PT3024-1；http://www.clontech.com/)中描述了酵母检测所用方法的详细内容。独立地实施试验4次。每次都获得了相似的结果。
GA4在GA结合检测中表现出对所有AtGID1中最强的亲和力(表2)。因此，使用GA4(10-5 M)，并将其加入到培养基中。如图10A所示，在检测A中，在存在GA的情况下，所有AtGID1-AtDELLA对的酵母转化体都形成了集落，而在其他的阴性对照的情况下都有形成集落。在检测B中，还检测了所有15对的β-半乳糖苷酶活性。如上所述，可以检测到所有GA依赖性方式的AtGID1-AtDELLA相互作用；但是，在没有GA时也能检测到AtGID1b和一些AtDELLA之间的相互作用，尽管较弱(图11)。这些观察说明AtGID1和AtDELLA之间的相互作用可以GA依赖性方式发生在植物中，但是AtGID1b-RGL1相互作用可以GA非依赖性方式发生。
如图10A所示，AtGID1-RGA对中β-半乳糖苷酶的酶活性水平是相对中等的，因此这适合于比较目的；因此，用检测B测试了AtGID1-RGA相互作用对不同浓度GA4的剂量应答。只有在GA4超过10-7M时，才能检测到AtGID1a-RGA和AtGID1c-RGA相互作用，但是即使当GA4为10-8M时，AtGID1也可以与RGA相互作用(图10B)。
如上所述，通过使用Y2H系统，表明所有的AtGID1都清楚地与AtDELLA蛋白相互作用。接下来，在体外检查了AtDELLA是否对AtGID1的GA结合活性产生某种影响。在结合了标记的16，17-二氢-GA4和AtGID1之后，向溶液中加入AtDELLA，并测量GA结合活性。图10c清楚地显示了在加入AtDELLA之后AtGID1的结合活性提高。AtDELLA的体外作用看起来独立于DELLA的类型，RGA和GAI都显示出对AtGID1c的GA结合的相似作用(图10c)。另外，检查了在向反应混合物添加DELLA蛋白之后AtGID1c-GA相互作用的结合亲和力。斯卡恰特作图法显示存在RGA时AtGID1c和16，17-二氢-GA4之间的结合的Kd值为1.2×10-8M，而在存在GAI时的值为4.6×10-8M；因此，值比没有AtDELLA时的值(图9c所示，Kd＝1.9×10-6M)降低至约1/100。因此，AtDELLA的存在增强了AtGID1-GA结合。
实施例8：AtGID1对水稻gid1-1表型的互补作用
为了证明AtGID1在体内具有与水稻GID1(OsGID1)相同的功能，用水稻gid1-1背景生成了在组成型启动子Act1的调控下过表达各种AtGID1基因的转化体。具体而言，用PCR制备出其每个末端都包含合适的限制性酶切位点(AtGID1a/c为SmaI位点；AtGID1b为XbaI和SmaI位点)的AtGID1的全长cDNA，并将其插入到携带有水稻肌动蛋白启动子(pAct1)和NOS终止子的二元载体内(Sentoku，N.et al.(2000)Develop.Biol.，220，358-364)。在确认插入之后，通过土壤杆菌介导的转化将pAct1-AtGID1片段引入到水稻gid1-1植株内。
获得了AtGID1a和AtGID1b的各8个株系，并获得了AtGID1c的14个株系。在所有携带AtGID1克隆的转基因植物中都挽救了gid1-1矮小表型(图12A)。这说明AtGID1在水稻中起到GA受体的作用。AtGID1a植物的高度比其他转基因植物和野生型植物的高度稍矮(图12A)。在几乎所有的AtGID1a植物中都可以看到这种趋势。这些转基因植物中AtGID1a mRNA表达水平与其他的AtGID1相同(图12B)。因此，认为AtGID1a的GA受体功能要比AtGID1b和AtGID1c的GA受体功能弱，至少在水稻中如此。此外，通过GA3的外源性处理还测试了这些携带AtGID1的转化体的GA应答。在这个实验中，每株分蘖植物都被分成了两株幼苗植物。每天给一株幼苗植物施用GA3一次，施用5天，同时给另一株幼苗植物施用不含GA3的模拟溶液。这些植物被证实为正常地应答于所添加的GA，与野生型植物的应答相似。从两个独立实验中获得了非常相似的结果。
实施例9：AtGID1在各种器官中的表达
用半定量RT-PCR分析了AtGID1基因在各种拟南芥器官(特别是约10cm高植物(萌发后40到45天)的茎、花、长角果、叶、根、和浸泡的种子中的表达。根据Kim等(Kim，Y.-C.et al.(2005)Plant Cell Physiol.，46，1317-1325)，用表3所列的特异性引物进行总RNA制备和RT-PCR。已经确认了所述引物对上述表达载体的特异性。通过2个循环间隔的不同数目PCR循环的试验性实验确定出了每个基因的合适的PCR循环数目，使得每种可视产物的量都在特定的动态范围之内。独立地实施实验至少2次。每次都获得了相似的结果。
表3：RT-PCR所用的引物
Figure A20068002123200591
(Fwd：前向引物；Rev：反向引物)
如图12c所示，可以检测出AtGID1基因在不同器官中的表达。该结果也得到公开阵列(array)数据库例如NASC阵列(Craigon DJ et al.，Nucleic Acids Res.32：D575-7，2004；http://affymetrix.arabidopsis.info/narrays/experimentbrowse.pl)和基因图谱(Gene Atlas)(Zimmermann P et al.，Plant Physiol.136：2621-2632，2004；https://www.genevestigator.ethz.ch/at/index.php)的支持。这说明三种AtGID在不同的拟南芥器官中发挥作用。
工业应用性
本发明提供了介导赤霉素应答信号的赤霉素结合蛋白以及编码所述蛋白质的基因。通过调控本发明的蛋白质的表达可以调节植物分化和生长。例如，通过提高本发明的蛋白质的表达可以提高生长速率，反之，通过降低本发明的蛋白质的表达，可以缩短植物高度和提高它们的倒伏耐受性。本发明因此可以用于提高农作物产量以及生成具有新的美学价值的观赏植物。
序列表
<110>国立大学法人名古屋大学
<120>能够调控植物分化/生长的基因及其用途
<130>N1-A0501P
<150>JP 2005-116432
<151>2005-04-14
<160>26
<170>Patentln version 3.3
<210>1
<211>1062
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1062)
<400>1
atg gcc ggc agc gac gag gtc aac cgc aac gag tgc aag acg gtg gtg    48
Met Ala Gly Ser Asp Glu Val Asn Arg Asn Glu Cys Lys Thr Val Val
1               5                   10                  15
ccg ctc cac aca tgg gtg ctc atc tcc aac ttc aag ctg tcg tac aac    96
Pro Leu His Thr Trp Val Leu Ile Ser Asn Phe Lys Leu Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
att ctg cgg cgg gcg gac ggg acg ttc gag cgg gac ctc ggg gag tac   144
Ile Leu Arg Arg Ala Asp Gly Thr Phe Glu Arg Asp Leu Gly Glu Tyr
        35                  40                  45
ctg gac agg agg gtg ccg gcg aac gcg cgg ccg ctg gag ggg gtg tcg    192
Leu Asp Arg Arg Val Pro Ala Asn Ala Arg Pro Leu Glu Gly Val Ser
    50                  55                  60
tcg ttc gac cac atc atc gac cag tcg gtg ggg ctg gag gtg cgc atc    240
Ser Phe Asp His Ile Ile Asp Gln Ser Val Gly Leu Glu Val Arg Ile
65                  70                  75                  80
tac cgg gcg gcg gcg gag ggt gac gcg gag gag ggg gcg gcg gcg gtg    288
Tyr Arg Ala Ala Ala Glu Gly Asp Ala Glu Glu Gly Ala Ala Ala Val
                85                  90                  95
acg cgg ccc atc ctt gag ttc ctg acg gac gcg cca gcg gcg gag ccg    336
Thr Arg Pro Ile Leu Glu Phe Leu Thr Asp Ala Pro Ala Ala Glu Pro
            100                 105                 110
ttc ccg gtg atc ata ttc ttc cac ggc ggc agc ttc gtg cac tcg tcg    384
Phe Pro Val Ile Ile Phe Phe His Gly Gly Ser Phe Val His Ser Ser
        115                 120                 125
gcc agc tcg acc atc tac gac agt ctg tgc cgc cgg ttc gtg aag ctg    432
Ala Ser Ser Thr Ile Tyr Asp Ser Leu Cys Arg Arg Phe Val Lys Leu
    130                 135                 140
agc aag ggc gtc gtg gtg tcc gtc aac tac cgg cgc gcg ccg gag cac    480
Ser Lys Gly Val Val Val Ser Val Asn Tyr Arg Arg Ala Pro Glu His
145                 150                 155                 160
cgc tac ccg tgc gcg tac gac gac ggg tgg acc gcg ctc aag tgg gtc    528
Arg Tyr Pro Cys Ala Tyr Asp Asp Gly Trp Thr Ala Leu Lys Trp Val
                165                 170                 175
atg tcg cag ccg ttc atg cgc agc ggc ggc gac gcg cag gcc cgc gtg    576
Met Ser Gln Pro Phe Met Arg Ser Gly Gly Asp Ala Gln Ala Arg Val
            180                 185                 190
ttc ctc tcc ggc gac agc tcc ggc ggc aac atc gcc cac cac gtc gcc    624
Phe Leu Ser Gly Asp Ser Ser Gly Gly Asn Ile Ala His His Val Ala
        195                 200                 205
gtc cgc gcc gcc gac gag ggc gtc aag gtc tgc ggc aac atc ctg ctc    672
Val Arg Ala Ala Asp Glu Gly Val Lys Val Cys Gly Asn Ile Leu Leu
    210                 215                 220
aac gcc atg ttc ggc ggc acc gag cgc acg gag tcg gag cgg cgg ctc    720
Asn Ala Met Phe Gly Gly Thr Glu Arg Thr Glu Ser Glu Arg Arg Leu
225                 230                 235                 240
gac ggc aag tac ttc gtg acg ctc cag gac agg gac tgg tac tgg aag    768
Asp Gly Lys Tyr Phe Val Thr Leu Gln Asp Arg Asp Trp Tyr Trp Lys
                245                 250                 255
gcg tac ctg ccg gag gac gcc gac cgg gac cat ccg gcg tgc aac ccg    816
Ala Tyr Leu Pro Glu Asp Ala Asp Arg Asp His Pro Ala Cys Asn Pro
            260                 265                 270
ttc ggc ccg aac ggc cgg cgg ctc ggg ggc ctc ccc ttc gcc aag agc    864
Phe Gly Pro Asn Gly Arg Arg Leu Gly Gly Leu Pro Phe Ala Lys Ser
        275                 280                 285
ctc atc atc gtg tcg ggc ctg gac ctc acc tgc gac cgg cag ctc gcc    912
Leu Ile Ile Val Ser Gly Leu Asp Leu Thr Cys Asp Arg Gln Leu Ala
    290                 295                 300
tac gcc gac gcc ctc cgg gag gac ggc cac cac gtc aag gtt gtc caa    960
Tyr Ala Asp Ala Leu Arg Glu Asp Gly His His Val Lys Val Val Gln
305                 310                 315                 320
tgc gag aac gcc acg gtg ggg ttc tac ctg ttg ccc aac acc gtc cac    1008
Cys Glu Asn Ala Thr Val Gly Phe Tyr Leu Leu Pro Asn Thr Val His
                325                 330                 335
tac cac gag gtc atg gag gag atc tcc gac ttc ctc aac gct aac ctc    1056
Tyr His Glu Val Met Glu Glu Ile Ser Asp Phe Leu Asn Ala Asn Leu
            340                 345                 350
tac tac                                                            1062
Tyr Tyr
<210>2
<211>354
<212>PRT
<213>Oryza sativa
<400>2
Met Ala Gly Ser Asp Glu Val Asn Arg Asn Glu Cys Lys Thr Val Val
1               5                   10                  15
Pro Leu His Thr Trp Val Leu Ile Ser Asn Phe Lys Leu Ser Tyr Asn
            20                  25                  30
Ile Leu Arg Arg Ala Asp Gly Thr Phe Glu Arg Asp Leu Gly Glu Tyr
        35                  40                  45
Leu Asp Arg Arg Val Pro Ala Asn Ala Arg Pro Leu Glu Gly Val Ser
    50                  55                  60
Ser Phe Asp His Ile Ile Asp Gln Ser Val Gly Leu Glu Val Arg Ile
65                  70                  75                  80
Tyr Arg Ala Ala Ala Glu Gly Asp Ala Glu Glu Gly Ala Ala Ala Val
                85                  90                  95
Thr Arg Pro Ile Leu Glu Phe Leu Thr Asp Ala Pro Ala Ala Glu Pro
            100                 105                 110
Phe Pro Val Ile Ile Phe Phe His Gly Gly Ser Phe Val His Ser Ser
        115                 120                 125
Ala Ser Ser Thr Ile Tyr Asp Ser Leu Cys Arg Arg Phe Val Lys Leu
    130                 135                 140
Ser Lys Gly Val Val Val Ser Val Asn Tyr Arg Arg Ala Pro Glu His
145                 150                 155                 160
Arg Tyr Pro Cys Ala Tyr Asp Asp Gly Trp Thr Ala Leu Lys Trp Val
                165                 170                 175
Met Ser Gln Pro Phe Met Arg Ser Gly Gly Asp Ala Gln Ala Arg Val
            180                 185                 190
Phe Leu Ser Gly Asp Ser Ser Gly Gly Asn Ile Ala His His Val Ala
        195                 200                 205
Val Arg Ala Ala Asp Glu Gly Val Lys Val Cys Gly Asn Ile Leu Leu
    210                 215                 220
Asn Ala Met Phe Gly Gly Thr Glu Arg Thr Glu Ser Glu Arg Arg Leu
225                 230                 235                 240
Asp Gly Lys Tyr Phe Val Thr Leu Gln Asp Arg Asp Trp Tyr Trp Lys
                245                 250                 255
Ala Tyr Leu Pro Glu Asp Ala Asp Arg Asp His Pro Ala Cys Asn Pro
            260                 265                 270
Phe Gly Pro Asn Gly Arg Arg Leu Gly Gly Leu Pro Phe Ala Lys Ser
        275                 280                 285
Leu Ile Ile Val Ser Gly Leu Asp Leu Thr Cys Asp Arg Gln Leu Ala
    290                 295                 300
Tyr Ala Asp Ala Leu Arg Glu Asp Gly His His Val Lys Val Val Gln
305                 310                 315                 320
Cys Glu Asn Ala Thr Val Gly Phe Tyr Leu Leu Pro Asn Thr Val His
                325                 330                 335
Tyr His Glu Val Met Glu Glu Ile Ser Asp Phe Leu Asn Ala Asn Leu
            340                 345                 350
Tyr Tyr
<210>3
<211>245
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Consensus  sequence of hormone sensitive lipases(HSLs)
<400>3
Pro Val Arg Val Tyr Arg Pro Asp Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Pro
1               5                   10                  15
Val Val Leu Tyr Leu His Gly Gly Gly Tyr Val Leu Gly Ser Leu Arg
            20                  25                  30
Thr His Asp Ala Leu Val Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val
        35                  40                  45
Val Val Ser Val Asp Tyr Arg Leu Ala Glu His Pro Phe Pro Ala Ala
    50                  55                  60
Leu Glu Asp Ala Tyr Ala Ala Tyr Arg Trp Leu Arg Ala Asn Ala Ala
65                  70                  75                  80
Glu Leu Gly Ile Asp Pro Ser Arg Ile Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala
                85                  90                  95
Gly Gly His Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ala Arg Asp Arg Gly
            100                 105                 110
Leu Pro Leu Pro Ala Ala Gln Val Leu Ile Ser Pro Leu Leu Asp Leu
        115                 120                 125
Thr Ser Ser Ala Ala Ser Leu Pro Gly Tyr Gly Glu Ala Asp Leu Leu
    130                 135                 140
Asp Ala Ala Ala Ile Leu Ala Trp Phe Ala Asp Leu Tyr Leu Gly Ala
145                 150                 155                 160
Ala Pro Asp Arg Glu Asp Pro Glu Ala Ser Pro Leu Ala Ser Asp Asp
                165                 170                 175
Leu Ser Gly Leu Pro Pro Thr Leu Ile Gln Thr Ala Glu Phe Asp Pro
            180                 185                 190
Leu Arg Asp Glu Gly Glu Ala Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Ala Gly
        195                 200                 205
Val Pro Val Glu Leu Arg Val Tyr Pro Gly Met Ile His Gly Phe Asp
    210                 215                 220
Leu Leu Thr Phe Pro Glu Ala Arg Ser Ala Leu Arg Gln Ile Ala Ala
225                 230                 235                 240
Phe Leu Arg Ala Ala
                245
<210>4
<211>1035
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1035)
<400>4
atg gct gcg agc gat gaa gtt aat ctt att gag agc aga aca gtg gtt     48
Met Ala Ala Ser Asp Glu Val Asn Leu Ile Glu Ser Arg Thr Val Val
1               5                   10                  15
cct ctc aat aca tgg gtt tta ata tcc aac ttc aaa gta gcc tac aat     96
Pro Leu Asn Thr Trp Val Leu Ile Ser Asn Phe Lys Val Ala Tyr Asn
            20                  25                  30
atc ctt cgt cgc cct gat gga acc ttt aac cga cac tta gct gag tat    144
Ile Leu Arg Arg Pro Asp Gly Thr Phe Asn Arg His Leu Ala Glu Tyr
        35                  40                  45
cta gac cgt aaa gtc act gca aac gcc aat ccg gtt gat ggg gtt ttc    192
Leu Asp Arg Lys Val Thr Ala Asn Ala Asn Pro Val Asp Gly Val Phe
    50                  55                  60
tcg ttc gat gtc ttg att gat cgc agg atc aat ctt cta agc aga gtc    240
Ser Phe Asp Val Leu Ile Asp Arg Arg Ile Asn Leu Leu Ser Arg Val
65                  70                  75                  80
tat aga cca gct tat gca gat caa gag caa cct cct agt att tta gat    288
Tyr Arg Pro Ala Tyr Ala Asp Gln Glu Gln Pro Pro Ser Ile Leu Asp
                85                  90                  95
ctc gag aag cct gtt gat ggc gac att gtc cct gtt ata ttg ttc ttc    336
Leu Glu Lys Pro Val Asp Gly Asp Ile Val Pro Val Ile Leu Phe Phe
            100                 105                 110
cat gga ggt agc ttt gct cat tct tct gca aac agt gcc ate tac gat    384
His Gly Gly Ser Phe Ala His Ser Ser Ala Asn Ser Ala Ile Tyr Asp
        115                 120                 125
act ctt tgt cgc agg ctt gtt ggt ttg tgc aag tgt gtt gtt gtc tct    432
Thr Leu Cys Arg Arg Leu Val Gly Leu Cys Lys Cys Val Val Val Ser
    130                 135                 140
gtg aat tat cgg cgt gca cca gag aat cca tac cct tgt gct tat gat    480
Val Asn Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Asn Pro Tyr Pro Cys Ala Tyr Asp
145                 150                 155                 160
gat ggt tgg att gct ctt aat tgg gtt aac tcg aga tct tgg ctt aaa    528
Asp Gly Trp Ile Ala Leu Asn Trp Val Asn Ser Arg Ser Trp Leu Lys
                165                 170                 175
tcc aag aaa gac tca aag gtc cat att ttc ttg gct ggt gat agc tct    576
Ser Lys Lys Asp Ser Lys Val His Ile Phe Leu Ala Gly Asp Ser Ser
            180                 185                 190
gga ggt aac atc gcg cat aat gtg gct tta aga gcg ggt gaa tcg gga    624
Gly Gly Asn Ile Ala His Asn Val Ala Leu Arg Ala Gly Glu Ser Gly
        195                 200                 205
atc gat gtt ttg ggg aac att ctg ctg aat cct atg ttt ggt ggg aat    672
Ile Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Leu Asn Pro Met Phe Gly Gly Asn
    210                 215                 220
gag aga acg gag tct gag aaa agt ttg gat ggg aaa tac ttt gtg acg    720
Glu Arg Thr Glu Ser Glu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Tyr Phe Val Thr
225                 230                 235                 240
gtt aga gac cgc gat tgg tac tgg aaa gcg ttt tta ccc gag gga gaa    768
Val Arg Asp Arg Asp Trp Tyr Trp Lys Ala Phe Leu Pro Glu Gly Glu
                245                 250                 255
gat aga gag cat cca gcg tgt aat ccg ttt agc ccg aga ggg aaa agc    816
Asp Arg Glu His Pro Ala Cys Asn Pro Phe Ser Pro Arg Gly Lys Ser
            260                 265                 270
tta gaa gga gtg agt ttc ccc aag agt ctt gtg gtt gtc gcg ggt ttg    864
Leu Glu Gly Val Ser Phe Pro Lys Ser Leu Val Val Val Ala Gly Leu
        275                 280                 285
gat ttg att aga gat tgg cag ttg gca tac gcg gaa ggg ctc aag aaa    912
Asp Leu Ile Arg Asp Trp Gln Leu Ala Tyr Ala Glu Gly Leu Lys Lys
    290                 295                 300
gcg ggt caa gag gtt aag ctt atg cat tta gag aaa gca act gtt ggg    960
Ala Gly Gln Glu Val Lys Leu Met His Leu Glu Lys Ala Thr Val Gly
305                 310                 315                 320
ttt tac ctc ttg cct aat aac aat cat ttc cat aat gtt atg gat gag   1008
Phe Tyr Leu Leu Pro Asn Asn Asn His Phe His Asn Val Met Asp Glu
                325                 330                 335
att tcg gcg ttt gta aac gcg gaa tgt                               1035
Ile Ser Ala Phe Val Asn Ala Glu Cys
            340                 345
<210>5
<211>345
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>5
Met Ala Ala Ser Asp Glu Val Asn Leu Ile Glu Ser Arg Thr Val Val
1               5                   10                  15
Pro Leu Asn Thr Trp Val Leu Ile Ser Asn Phe Lys Val Ala Tyr Asn
            20                  25                  30
Ile Leu Arg Arg Pro Asp Gly Thr Phe Asn Arg His Leu Ala Glu Tyr
        35                  40                  45
Leu Asp Arg Lys Val Thr Ala Asn Ala Asn Pro Val Asp Gly Val Phe
    50                  55                  60
Ser Phe Asp Val Leu Ile Asp Arg Arg Ile Asn Leu Leu Ser Arg Val
65                  70                  75                  80
Tyr Arg Pro Ala Tyr Ala Asp Gln Glu Gln Pro Pro Ser Ile Leu Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Lys Pro Val Asp Gly Asp Ile Val Pro Val Ile Leu Phe Phe
            100                 105                 110
His Gly Gly Ser Phe Ala His Ser Ser Ala Asn Ser Ala Ile Tyr Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Cys Arg Arg Leu Val Gly Leu Cys Lys Cys Val Val Val Ser
    130                 135                 140
Val Asn Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Asn Pro Tyr Pro Cys Ala Tyr Asp
145                 150                 155                 160
Asp Gly Trp Ile Ala Leu Asn Trp Val Asn Ser Arg Ser Trp Leu Lys
                165                 170                 175
Ser Lys Lys Asp Ser Lys Val His Ile Phe Leu Ala Gly Asp Ser Ser
            180                 185                 190
Gly Gly Asn Ile Ala His Asn Val Ala Leu Arg Ala Gly Glu Ser Gly
        195                 200                 205
Ile Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Leu Asn Pro Met Phe Gly Gly Asn
    210                 215                 220
Glu Arg Thr Glu Ser Glu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Tyr Phe Val Thr
225                 230                 235                 240
Val Arg Asp Arg Asp Trp Tyr Trp Lys Ala Phe Leu Pro Glu Gly Glu
                245                 250                 255
Asp Arg Glu His Pro Ala Cys Asn Pro Phe Ser Pro Arg Gly Lys Ser
            260                 265                 270
Leu Glu Gly Val Ser Phe Pro Lys Ser Leu Val Val Val Ala Gly Leu
        275                 280                 285
Asp Leu Ile Arg Asp Trp Gln Leu Ala Tyr Ala Glu Gly Leu Lys Lys
    290                 295                 300
Ala Gly Gln Glu Val Lys Leu Met His Leu Glu Lys Ala Thr Val Gly
305                 310                 315                 320
Phe Tyr Leu Leu Pro Asn Asn Asn His Phe His Asn Val Met Asp Glu
                325                 330                 335
Ile Ser Ala Phe Val Asn Ala Glu Cys
            340                 345
<210>6
<211>1074
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1074)
<400>6
atg gct ggt ggt aac gaa gtc aac ctt aac gaa tgc aag aga att gtc    48
Met Ala Gly Gly Asn Glu Val Asn Leu Asn Glu Cys Lys Arg Ile Val
1               5                   10                  15
cca ctc aac aca tgg gtc ctc att tcc aat ttc aag ctt gct tac aaa    96
Pro Leu Asn Thr Trp Val Leu Ile Ser Asn Phe Lys Leu Ala Tyr Lys
            20                  25                  30
gtc ctc cgt cgc cct gac ggt tct ttc aac cgc gac ctc gcc gag ttc    144
Val Leu Arg Arg Pro Asp Gly Ser Phe Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe
        35                  40                  45
ctt gac cgt aaa gtt ccc gcc aac tct ttc ccc ctc gac ggc gtt ttc    192
Leu Asp Arg Lys Val Pro Ala Asn Ser Phe Pro Leu Asp Gly Val Phe
    50                  55                  60
tcc ttc gac cac gtc gac tca aca act aac ctt ctc acc aga atc tac    240
Ser Phe Asp His Val Asp Ser Thr Thr Asn Leu Leu Thr Arg Ile Tyr
65                  70                  75                  80
caa cct gcg tct ctc ctt cat cag acc cgt cac gga acc ctc gag cta    288
Gln Pro Ala Ser Leu Leu His Gln Thr Arg His Gly Thr Leu Glu Leu
                85                  90                  95
acc aaa cct ctc agt act aca gag atc gtc cct gtt ctc att ttc ttc    336
Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Glu Ile Val Pro Val Leu Ile Phe Phe
            100                 105                 110
cat gga ggc agc ttc act cat tcc tcc gcc aat agt gct atc tac gac    384
His Gly Gly Ser Phe Thr His Ser Ser Ala Asn Ser Ala Ile Tyr Asp
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act ttc tgc cga cgc ctt gtc acc att tgc ggt gtt gtt gtt gtc tct    432
Thr Phe Cys Arg Arg Leu Val Thr Ile Cys Gly Val Val Val Val Ser
    130                 135                 140
gtt gat tac cgg aga tcc cct gag cat cgc tac cct tgt gct tac gac    480
Val Asp Tyr Arg Arg Ser Pro Glu His Arg Tyr Pro Cys Ala Tyr Asp
145                 150                 155                 160
gat gga tgg aac gct ctc aac tgg gtc aag tcc aga gtc tgg ctt cag    528
Asp Gly Trp Asn Ala Leu Asn Trp Val Lys Ser Arg Val Trp Leu Gln
                165                 170                 175
agt ggt aaa gac tcc aat gtt tat gtt tat ttg gct gga gat agc tct    576
Ser Gly Lys Asp Ser Asn Val Tyr Val Tyr Leu Ala Gly Asp Ser Ser
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gga ggc aac att gct cac aat gtc gct gtc aga gct acc aat gaa gga    624
Gly Gly Asn Ile Ala His Asn Val Ala Val Arg Ala Thr Asn Glu Gly
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gtc aaa gtg ttg ggg aac att ctt ctt cat cca atg ttt ggt gga cag    672
Val Lys Val Leu Gly Asn Ile Leu Leu His Pro Met Phe Gly Gly Gln
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gag agg act cag tct gag aag acc ctt gat ggc aaa tac ttt gtg act    720
Glu Arg Thr Gln Ser Glu Lys Thr Leu Asp Gly Lys Tyr Phe Val Thr
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ata caa gat cga gat tgg tat tgg agg gct tat cta ccg gaa ggt gaa    768
Ile Gln Asp Arg Asp Trp Tyr Trp Arg Ala Tyr Leu Pro Glu Gly Glu
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gat aga gat cat cca gca tgt aat ccc ttt ggc ccg aga ggt caa agc    816
AspArg Asp His Pro Ala Cys Asn Pro Phe Gly Pro Arg Gly Gln Ser
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ctt aaa gga gtc aac ttt cca aag agt ctt gtt gtt gtc gct ggt tta    864
Leu Lys Gly Val Asn Phe Pro Lys Ser Leu Val Val Val Ala Gly Leu
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gat ctt gtt caa gat tgg caa tta gcc tat gtg gat ggg ctt aag aag    912
Asp Leu Val Gln Asp Trp Gln Leu Ala Tyr Val Asp Gly Leu Lys Lys
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act ggt ctt gaa gtc aat ctt ttg tat ttg aaa caa gct acc att ggc    960
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ttt tac ttc ttg cct aac aat gat cac ttt cat tgt ctt atg gaa gag    1008
Phe Tyr Phe Leu Pro Asn Asn Asp His Phe His Cys Leu Met Glu Glu
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ttg aat aag ttt gtg cac tcc ata gag gat tct caa agc aag tca agt    1056
Leu Asn Lys Phe Val His Ser Ile Glu Asp Ser Gln Ser Lys Ser Ser
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cct gtg ctt ctt act cct                                            1074
Pro Val Leu Leu Thr Pro
        355
<210>7
<211>358
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>7
Met Ala Gly Gly Asn Glu Val Asn Leu Asn Glu Cys Lys Arg Ile Val
1               5                   10                  15
Pro Leu Asn Thr Trp Val Leu Ile Ser Asn Phe Lys Leu Ala Tyr Lys
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Val Leu Arg Arg Pro Asp Gly Ser Phe Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe
        35                  40                  45
Leu Asp Arg Lys Val Pro Ala Asn Ser Phe Pro Leu Asp Gly Val Phe
    50                  55                  60
Ser Phe Asp His Val Asp Ser Thr Thr Asn Leu Leu Thr Arg Ile Tyr
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Gln Pro Ala Ser Leu Leu His Gln Thr Arg His Gly Thr Leu Glu Leu
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Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Glu Ile Val Pro Val Leu Ile Phe Phe
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His Gly Gly Ser Phe Thr His Ser Ser Ala Asn Ser Ala Ile Tyr Asp
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Val Asp Tyr Arg Arg Ser Pro Glu His Arg Tyr Pro Cys Ala Tyr Asp
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Asp Gly Trp Asn Ala Leu Asn Trp Val Lys Ser Arg Val Trp Leu Gln
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Ser Gly Lys Asp Ser Asn Val Tyr Val Tyr Leu Ala Gly Asp Ser Ser
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Gly Gly Asn Ile Ala His Asn Val Ala Val Arg Ala Thr Asn Glu Gly
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Val Lys Val Leu Gly Asn Ile Leu Leu His Pro Met Phe Gly Gly Gln
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Glu Arg Thr Gln Ser Glu Lys Thr Leu Asp Gly Lys Tyr Phe Val Thr
225                 230                 235                 240
Ile Gln Asp Arg Asp Trp Tyr Trp Arg Ala Tyr Leu Pro Glu Gly Glu
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Leu Lys Gly Val Asn Phe Pro Lys Ser Leu Val Val Val Ala Gly Leu
        275                 280                 285
Asp Leu Val Gln Asp Trp Gln Leu Ala Tyr Val Asp Gly Leu Lys Lys
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Thr Gly Leu Glu Val Asn Leu Leu Tyr Leu Lys Gln Ala Thr Ile Gly
305                 310                 315                 320
Phe Tyr Phe Leu Pro Asn Asn Asp His Phe His Cys Leu Met Glu Glu
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Leu Asn Lys Phe Val His Ser Ile Glu Asp Ser Gln Ser Lys Ser Ser
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Pro Val Leu Leu Thr Pro
        355
<210>8
<211>1035
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1035)
<400>8
atg gct gcg agc gat gaa gtt aat ctt att gag agc aga aca gtg gtt     48
Met Ala Ala Ser Asp Glu Val Asn Leu Ile Glu Ser Arg Thr Val Val
1               5                   10                  15
cct ctc aat aca tgg gtt tta ata tcc aac ttc aaa gta gcc tac aat     96
Pro Leu Asn Thr Trp Val Leu Ile Ser Asn Phe Lys Val Ala Tyr Asn
            20                  25                  30
atc ctt cgt cgc cct gat gga acc ttt aac cga cac tta gct gag tat    144
Ile Leu Arg Arg Pro Asp Gly Thr Phe Asn Arg His Leu Ala Glu Tyr
        35                  40                  45
cta gac cgt aaa gtc act gca aac gcc aat ccg gtt gat ggg gtt ttc    192
Leu Asp Arg Lys Val Thr Ala Asn Ala Asn Pro Val Asp Gly Val Phe
    50                  55                  60
tcg ttc gat gtc ttg att gat cgc agg atc aat ctt cta agc aga gtc    240
Ser Phe Asp Val Leu Ile Asp Arg Arg Ile Asn Leu Leu Ser Arg Val
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tat aga cca gct tat gca gat caa gag caa cct cct agt att tta gat    288
Tyr Arg Pro Ala Tyr Ala Asp Gln Glu Gln Pro Pro Ser Ile Leu Asp
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ctc gag aag cct gtt gat ggc gac att gtc cct gtt ata ttg ttc ttc    336
Leu Glu Lys Pro Val Asp Gly Asp Ile Val Pro Val Ile Leu Phe Phe
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cat gga ggt agc ttt gct cat tct tct gca aac agt gcc atc tac gat    384
His Gly Gly Ser Phe Ala His Ser Ser Ala Asn Ser Ala Ile Tyr Asp
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act ctt tgt cgc agg ctt gtt ggt ttg tgc aag tgt gtt gtt gtc tct    432
Thr Leu Cys Arg Arg Leu Val Gly Leu Cys Lys Cys Val Val Val Ser
    130                 135                 140
gtg aat tat cgg cgt gca cca gag aat cca tac cct tgt gct tat gat    480
Val Asn Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Asn Pro Tyr Pro Cys Ala Tyr Asp
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gat ggt tgg att gct ctt aat tgg gtt aac tcg aga tct tgg ctt aaa    528
Asp Gly Trp Ile Ala Leu Asn Trp Val Asn Ser Arg Ser Trp Leu Lys
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tcc aag aaa gac tca aag gtc cat att ttc ttg gct ggt gat agc tct    576
Ser Lys Lys Asp Ser Lys Val His Ile Phe Leu Ala Gly Asp Ser Ser
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Ile Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Leu Asn Pro Met Phe Gly Gly Asn
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Glu Arg Thr Glu Ser Glu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Tyr Phe Val Thr
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tta gaa gga gtg agt ttc ccc aag agt ctt gtg gtt gtc gcg ggt ttg    864
Leu Glu Gly Val Ser Phe Pro Lys Ser Leu Val Val Val Ala Gly Leu
        275                 280                 285
gat ttg att aga gat tgg cag ttg gca tac gcg gaa ggg ctc aag aaa    912
Asp Leu Ile Arg Asp Trp Gln Leu Ala Tyr Ala Glu Gly Leu Lys Lys
    290                 295                 300
gcg ggt caa gag gtt aag ctt atg cat tta gag aaa gca act gtt ggg    960
Ala Gly Gln Glu Val Lys Leu Met His Leu Glu Lys Ala Thr Val Gly
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Phe Tyr Leu Leu Pro Asn Asn Asn His Phe His Asn Val Met Asp Glu
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att tcg gcg ttt gta aac gcg gaa tgt                               1035
Ile Ser Ala Phe Val Asn Ala Glu Cys
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<210>9
<211>345
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>9
Met Ala Ala Ser Asp Glu Val Asn Leu Ile Glu Ser Arg Thr Val Val
1               5                   10                  15
Pro Leu Asn Thr Trp Val Leu Ile Ser Asn Phe Lys Val Ala Tyr Asn
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Ile Leu Arg Arg Pro Asp Gly Thr Phe Asn Arg His Leu Ala Glu Tyr
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Leu Asp Arg Lys Val Thr Ala Asn Ala Asn Pro Val Asp Gly Val Phe
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Ser Phe Asp Val Leu Ile Asp Arg Arg Ile Asn Leu Leu Ser Arg Val
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Tyr Arg Pro Ala Tyr Ala Asp Gln Glu Gln Pro Pro Ser Ile Leu Asp
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Leu Glu Lys Pro Val Asp Gly Asp Ile Val Pro Val Ile Leu Phe Phe
            100                 105                 110
His Gly Gly Ser Phe Ala His Ser Ser Ala Asn Ser Ala Ile Tyr Asp
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Thr Leu Cys Arg Arg Leu Val Gly Leu Cys Lys Cys Val Val Val Ser
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Val Asn Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Asn Pro Tyr Pro Cys Ala Tyr Asp
145                 150                 155                 160
Asp Gly Trp Ile Ala Leu Asn Trp Val Asn Ser Arg Ser Trp Leu Lys
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Gly Gly Asn Ile Ala His Asn Val Ala Leu Arg Ala Gly Glu Ser Gly
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Glu Arg Thr Glu Ser Glu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Tyr Phe Val Thr
225                 230                 235                 240
Val Arg Asp Arg Asp Trp Tyr Trp Lys Ala Phe Leu Pro Glu Gly Glu
                245                 250                 255
Asp Arg Glu His Pro Ala Cys Asn Pro Phe Ser Pro Arg Gly Lys Ser
            260                 265                 270
Leu Glu Gly Val Ser Phe Pro Lys Ser Leu Val Val Val Ala Gly Leu
        275                 280                 285
Asp Leu Ile Arg Asp Trp Gln Leu Ala Tyr Ala Glu Gly Leu Lys Lys
    290                 295                 300
Ala Gly Gln Glu Val Lys Leu Met His Leu Glu Lys Ala Thr Val Gly
305                 310                 315                 320
Phe Tyr Leu Leu Pro Asn Asn Asn His Phe His Asn Val Met Asp Glu
                325                 330                 335
Ile Ser Ala Phe Val Asn Ala Glu Cys
            340                 345
<210>10
<211>335
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>10
Met Ala Thr Asp Ser Gln Pro Asn Gln Lys Leu Thr Leu Pro Leu Lys
1               5                   10                  15
Thr Arg Ile Ala Leu Thr Val Ile Ser Thr Met Thr Asp Asn Ala Gln
            20                  25                  30
Arg Pro Asp Gly Thr Ile Asn Arg Arg Phe Leu Arg Leu Phe Asp Phe
        35                  40                  45
Arg Ala Pro Pro Asn Pro Lys Pro Val Asn Ile Val Ser Thr Ser Asp
    50                  55                  60
Phe Val Val Asp Gln Ser Arg Asp Leu Trp Phe Arg Leu Tyr Thr Pro
65                  70                  75                  80
His Val Ser Gly Asp Lys Ile Pro Val Val Val Phe Phe His Gly Gly
                85                  90                  95
Gly Phe Ala Phe Leu Ser Pro Asn Ala Tyr Pro Tyr Asp Asn Val Cys
            100                 105                 110
Arg Arg Phe Ala Arg Lys Leu Pro Ala Tyr Val Ile Ser Val Asn Tyr
        115                 120                 125
Arg Leu Ala Pro Glu His Arg Tyr Pro Ala Gln Tyr Asp Asp Gly Phe
    130                 135                 140
Asp Ala Leu Lys Tyr Ile Glu Glu Asn His Gly Ser Ile Leu Pro Ala
145                 150                 155                 160
Asn Ala Asp Leu Ser Arg Cys Phe Phe Ala Gly Asp Ser Ala Gly Gly
                165                 170                 175
Asn Ile Ala His Asn Val Ala Ile Arg Ile Cys Arg Glu Pro Arg Ser
            180                 185                 190
Ser Phe Thr Ala Val Lys Leu Ile Gly Leu Ile Ser Ile Gln Pro Phe
        195                 200                 205
Phe Gly Gly Glu Glu Arg Thr Glu Ala Glu Lys Gln Leu Val Gly Ala
    210                 215                 220
Pro Leu Val Ser Pro Asp Arg Thr Asp Trp Cys Trp Lys Ala Met Gly
225                 230                 235                 240
Leu Asn Arg Asp His Glu Ala Val Asn Val Gly Gly Pro Asn Ala Val
                245                 250                 255
Asp Ile Ser Gly Leu Asp Tyr Pro Glu Thr Met Val Val Val Ala Gly
            260                 265                 270
Phe Asp Pro Leu Lys Asp Trp Gln Arg Ser Tyr Tyr Glu Trp Leu Lys
        275                 280                 285
Leu Cys Gly Lys Lys Ala Thr Leu Ile Glu Tyr Pro Asn Met Phe His
    290                 295                 300
Ala Phe Tyr Ile Phe Pro Glu Leu Pro Glu Ala Gly Gln Leu Ile Met
305                 310                 315                 320
Arg Ile Lys Asp Phe Val Asp Glu Arg Val Ala Ser Leu Ser Ala
                325                 330                 335
<210>11
<211>329
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>11
Met Gly Ser Leu Gly Glu Glu Pro Gln Val Ala Glu Asp Cys Met Gly
1               5                   10                  15
Leu Leu Gln Leu Leu Ser Asn Gly Thr Val Leu Arg Ser Glu Ser Ile
            20                  25                  30
Asp Leu Ile Thr Gln Gln Ile Pro Phe Lys Asn Asn Gln Thr Val Leu
        35                  40                  45
Phe Lys Asp Ser Ile Tyr His Lys Pro Asn Asn Leu His Leu Arg Leu
    50                  55                  60
Tyr Lys Pro Ile Ser Ala Ser Asn Arg Thr Ala Leu Pro Val Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Phe His Gly Gly Gly Phe Cys Phe Gly Ser Arg Ser Trp Pro His
                85                  90                  95
Phe His Asn Phe Cys Leu Thr Leu Ala Ser Ser Leu Asn Ala Leu Val
            100                 105                 110
Val Ser Pro Asp Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Arg Leu Pro Ala Ala
        115                 120                 125
Phe Glu Asp Ala Glu Ala Val Leu Thr Trp Leu Trp Asp Gln Ala Val
    130                 135                 140
Ser Asp Gly Val Asn His Trp Phe Glu Asp Gly Thr Asp Val Asp Phe
145                 150                 155                 160
Asp Arg Val Phe Val Val Gly Asp Ser Ser Gly Gly Asn Ile Ala His
                165                 170                 175
Gln Leu Ala Val Arg Phe Gly Ser Gly Ser Ile Glu Leu Thr Pro Val
            180                 185                 190
Arg Val Arg Gly Tyr Val Leu Met Gly Pro Phe Phe Gly Gly Glu Glu
        195                 200                 205
Arg Thr Asn Ser Glu Asn Gly Pro Ser Glu Ala Leu Leu Ser Leu Asp
    210                 215                 220
Leu Leu Asp Lys Phe Trp Arg Leu Ser Leu Pro Asn Gly Ala Thr Arg
225                 230                 235                 240
Asp His His Met Ala Asn Pro Phe Gly Pro Thr Ser Pro Thr Leu Glu
                245                 250                 255
Ser Ile Ser Leu Glu Pro Met Leu Val Ile Val Gly Gly Ser Glu Leu
            260                 265                 270
Leu Arg Asp Arg Ala Lys Glu Tyr Ala Tyr Lys Leu Lys Lys Met Gly
        275                 280                 285
Gly Lys Arg Val Asp Tyr Ile Glu Phe Glu Asn Lys Glu His Gly Phe
    290                 295                 300
Tyr Ser Asn Tyr Pro Ser Ser Glu Ala Ala Glu Gln Val Leu Arg Ile
305                 310                 315                 320
Ile Gly Asp Phe Met Asn Asn Leu Ser
                325
<210>12
<211>327
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>12
Met Ser Glu Pro Ser Pro Ile Ala Asp Pro Tyr Ala Tyr Leu Asn Ile
1               5                   10                  15
Val Asn Asn Pro Asp Gly Ser Ile Thr Arg Asp Leu Ser Asn Phe Pro
            20                 25                 30
Cys Thr Ala Ala Thr Pro Asp Pro Ser Pro Leu Asn Pro Ala Val Ser
        35                  40                  45
Lys Asp Leu Pro Val Asn Gln Leu Lys Ser Thr Trp Leu Arg Leu Tyr
    50                  55                  60
Leu Pro Ser Ser Ala Val Asn Glu Gly Asn Val Ser Ser Gln Lys Leu
65                  70                  75                  80
Pro Ile Val Val Tyr Tyr His Gly Gly Gly Phe Ile Leu Cys Ser Val
                85                  90                  95
Asp Met Gln Leu Phe His Asp Phe Cys Ser Glu Val Ala Arg Asp Leu
            100                 105                 110
Asn Ala Ile Val Val Ser Pro Ser Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Arg
        115                 120                 125
Leu Pro Ala Ala Tyr Asp Asp Gly Val Glu Ala Leu Asp Trp Ile Lys
    130                 135                 140
Thr Ser Asp Asp Glu Trp Ile Lys Ser His Ala Asp Phe Ser Asn Val
145                 150                 155                 160
Phe Leu Met Gly Thr Ser Ala Gly Gly Asn Leu Ala Tyr Asn Val Gly
                165                 170                 175
Leu Arg Ser Val Asp Ser Val Ser Asp Leu Ser Pro Leu Gln Ile Arg
            180                 185                 190
Gly Leu Ile Leu His His Pro Phe Phe Gly Gly Glu Glu Arg Ser Glu
        195                 200                 205
Ser Glu Ile Arg Leu Met Asn Asp Gln Val Cys Pro Pro Ile Val Thr
    210                 215                 220
Asp Val Met Trp Asp Leu Ser Leu Pro Val Gly Val Asp Arg Asp His
225                 230                 235                 240
Glu Tyr Ser Asn Pro Thr Val Gly Asp Gly Ser Glu Lys Leu Glu Lys
                245                 250                 255
Ile Gly Arg Leu Arg Trp Lys Val Met Met Ile Gly Gly Glu Asp Asp
            260                 265                 270
Pro Met Ile Asp Leu Gln Lys Asp Val Ala Lys Leu Met Lys Lys Lys
        275                 280                 285
Gly Val Glu Val Val Glu His Tyr Thr Gly Gly His Val His Gly Ala
    290                 295                 300
Glu Ile Arg Asp Pro Ser Lys Arg Lys Thr Leu Phe Leu Ser Ile Lys
305                 310                 315                 320
Asn Phe Ile Phe Ser Val Leu
                325
<210>13
<211>329
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>13
Met Asp Ser Glu Ile Ala Ala Asp Tyr Ser Pro Met Leu Ile Ile Tyr
1               5                   10                  15
Lys Ser Gly Arg Ile Glu Arg Leu Val Gly Glu Thr Thr Val Pro Pro
            20                  25                  30
Ser Ser Asn Pro Gln Asn Gly Val Val Ser Lys Asp Val Val Tyr Ser
        35                  40                  45
Pro Asp Asn Asn Leu Ser Leu Arg Ile Tyr Leu Pro Glu Lys Ala Ala
    50                  55                  60
Thr Ala Glu Thr Glu Ala Ser Val Lys Leu Pro Leu Leu Val Tyr Phe
65                  70                  75                  80
His Gly Gly Gly Phe Leu Val Glu Thr Ala Phe Ser Pro Thr Tyr His
                85                  90                  95
Thr Phe Leu Thr Ala Ala Val Ser Ala Ser Asp Cys Val Ala Val Ser
            100                 105                 110
Val Asp Tyr Arg Arg Ala Pro Glu His Pro Ile Pro Thr Ser Tyr Asp
        115                 120                 125
Asp Ser Trp Thr Ala Leu Lys Trp Val Phe Ser His Ile Ala Gly Ser
    130                 135                 140
Gly Ser Glu Asp Trp Leu Asn Lys His Ala Asp Phe Ser Lys Val Phe
145                 150                 155                 160
Leu Ala Gly Asp Ser Ala Gly Ala Asn Ile Thr His His Met Thr Met
                165                 170                 175
Lys Ala Ala Lys Asp Lys Leu Ser Pro Glu Ser Leu Asn Glu Ser Gly
            180                 185                 190
Ile Ser Gly Ile Ile Leu Val His Pro Tyr Phe Trp Ser Lys Thr Pro
        195                 200                 205
Val Asp Asp Lys Glu Thr Thr Asp Val Ala Ile Arg Thr Trp Ile Glu
    210                 215                 220
Ser Val Trp Thr Leu Ala Ser Pro Asn Ser Lys Asp Gly Ser Asp Asp
225                 230                 235                 240
Pro Phe Ile Asn Val Val Gln Ser Glu Ser Val Asp Leu Ser Gly Leu
                245                 250                 255
Gly Cys Gly Lys Val Leu Val Met Val Ala Glu Lys Asp Ala Leu Val
            260                 265                 270
Arg Gln Gly Trp Gly Tyr Trp Glu Lys Leu Gly Lys Ser Arg Trp Asn
        275                 280                 285
Gly Glu Val Leu Asp Val Val Glu Thr Lys Gly Glu Gly His Val Phe
    290                 295                 300
His Leu Arg Asp Pro Asn Ser Glu Lys Ala His Glu Leu Val His Arg
305                 310                 315                 320
Phe Ala Gly Phe Ile Lys Gly Asp Lys
                325
<210>14
<211>314
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>14
Met Glu Ser Thr Lys Lys Gln Val Ser Leu Glu Leu Leu Pro Trp Leu
1               5                   10                  15
Val Val His Thr Asp Gly Thr Val Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Val
            20                  25                  30
Cys Pro Pro Gly Leu Asp Pro Ile Thr Gly Val Phe Ser Lys Asp Ile
        35                  40                  45
Ile Ile Glu Pro Lys Thr Gly Leu Ser Ala Arg Ile Tyr Arg Pro Phe
    50                 55                 60
Ser Ile Gln Pro Gly Gln Lys Ile Pro Leu Met Leu Tyr Phe His Gly
65                  70                  75                  80
Gly Ala Phe Leu Ile Ser Ser Thr Ser Phe Pro Ser Tyr His Thr Ser
                85                  90                  95
Leu Asn Lys Ile Val Asn Gln Ala Asn Val Ile Ala Val Ser Val Asn
            100                 105                 110
Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Pro Leu Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Ser
        115                 120                 125
Trp Thr Ala Leu Lys Asn Ile Gln Ala Ile Asn Glu Pro Trp Ile Asn
    130                 135                 140
Asp Tyr Ala Asp Leu Asp Ser Leu Phe Leu Val Gly Asp Ser Ala Gly
145                 150                 155                 160
Ala Asn Ile Ser His His Leu Ala Phe Arg Ala Lys Gln Ser Asp Gln
                165                 170                 175
Thr Leu Lys Ile Lys Gly Ile Gly Met Ile His Pro Tyr Phe Trp Gly
            180                 185                 190
Thr Gln Pro Ile Gly Ala Glu Ile Lys Asp Glu Ala Arg Lys Gln Met
        195                 200                 205
Val Asp Gly Trp Trp Glu Phe Val Cys Pro Ser Glu Lys Gly Ser Asp
    210                 215                 220
Asp Pro Trp Ile Asn Pro Phe Ala Asp Gly Ser Pro Asp Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Leu Gly Cys Glu Arg Val Met Ile Thr Val Ala Glu Lys Asp Ile Leu
                245                 250                 255
Asn Glu Arg Gly Lys Met Tyr Tyr Glu Arg Leu Val Lys Ser Glu Trp
            260                 265                 270
Lys Gly Lys Val Glu Ile Met Glu Thr Lys Glu Lys Asp His Val Phe
        275                 280                 285
His Ile Phe Glu Pro Asp Cys Asp Glu Ala Met Glu Met Val Arg Cys
    290                 295                 300
Leu Ala Leu Phe Ile Asn Gln Val Glu Ala
305                 310
<210>15
<211>344
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>15
Met Ala Thr Ile Ser Phe Ser His Asn His Gln Ser Ser Asp Asn Arg
1               5                   10                  15
Arg Gly Gly Ser His His His Arg His Gly Pro Val Val Glu Glu Ile
            20                  25                  30
Glu Gly Leu Ile Lys Val Phe Asn Asp Gly Cys Val Glu Arg Pro Pro
        35                  40                  45
Ile Val Pro Ile Val Ser Pro Thr Ile His Pro Ser Ser Lys Ala Thr
    50                  55                  60
Ala Phe Asp Ile Lys Leu Ser Asn Asp Thr Trp Thr Arg Val Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Pro Asp Ala Ala Ala Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Leu Val
                85                  90                  95
Tyr Phe His Gly Gly Gly Phe Cys Val Gly Ser Ala Ala Trp Ser Cys
            100                 105                 110
Tyr His Asp Phe Leu Thr Ser Leu Ala Val Lys Ala Arg Cys Val Ile
        115                 120                 125
Val Ser Val Asn Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Arg Leu Pro Ala Ala
    130                 135                 140
Tyr Asp Asp Gly Val Asn Val Val Ser Trp Leu Val Lys Gln Gln Ile
145                 150                 155                 160
Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Pro Ser Trp Leu Ser Lys Cys Asn Leu Ser
                165                 170                 175
Asn Val Phe Leu Ala Gly Asp Ser Ala Gly Ala Asn Ile Ala Tyr Gln
            180                 185                 190
Val Ala Val Arg Ile Met Ala Ser Gly Lys Tyr Ala Asn Thr Leu His
        195                 200                 205
Leu Lys Gly Ile Ile Leu Ile His Pro Phe Phe Gly Gly Glu Ser Arg
    210                 215                 220
Thr Ser Ser Glu Lys Gln Gln His His Thr Lys Ser Ser Ala Leu Thr
225                 230                 235                 240
Leu Ser Ala Ser Asp Ala Tyr Trp Arg Leu Ala Leu Pro Arg Gly Ala
                245                 250                 255
Ser Arg Asp His Pro Trp Cys Asn Pro Leu Met Ser Ser Ala Gly Ala
            260                 265                 270
Lys Leu Pro Thr Thr Met Val Phe Met Ala Glu Phe Asp Ile Leu Lys
        275                 280                 285
Glu Arg Asn Leu Glu Met Cys Lys Val Met Arg Ser His Gly Lys Arg
    290                 295                 300
Val Glu Gly Ile Val His Gly Gly Val Gly His Ala Phe His Ile Leu
305                 310                 315                 320
Asp Asn Ser Ser Val Ser Arg Asp Arg Ile His Asp Met Met Cys Arg
                325                 330                 335
Leu His Asn Phe Ile His Pro Ser
            340
<210>16
<211>336
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>16
Met Gly Gly Thr Lys Leu Thr His Val Thr Thr Thr Asn Pro Asn Asn
1               5                   10                  15
Ser Asn Ile His Gly Pro Val Val Asp Glu Val Glu Gly Leu Ile Lys
            20                  25                  30
Val Tyr Lys Asp Gly His Val Glu Arg Ser Gln Leu Leu Pro Cys Val
        35                  40                  45
Asp Pro Ser Leu Pro Leu Glu Leu Gly Val Thr Cys Ser Asp Val Val
    50                  55                  60
Ile Asp Lys Leu Thr Asn Val Trp Ala Arg Leu Tyr Val Pro Met Thr
65                  70                  75                  80
Thr Thr Lys Ser Ser Val Ser Lys Leu Pro Leu Ile Val Tyr Phe His
                85                  90                  95
Gly Gly Gly Phe Cys Val Gly Ser Ala Ser Trp Leu Cys Tyr His Glu
            100                 105                 110
Phe Leu Ala Arg Leu Ser Ala Arg Ser Arg Cys Leu Val Met Ser Val
        115                 120                 125
Asn Tyr Arg Leu Ala Pro Glu Asn Pro Leu Pro Ala Ala Tyr Glu Asp
    130                 135                 140
Gly Val Asn Ala Ile Leu Trp Leu Asn Lys Ala Arg Asn Asp Asn Leu
145                 150                 155                 160
Trp Ala Lys Gln Cys Asp Phe Gly Arg Ile Phe Leu Ala Gly Asp Ser
                165                 170                 175
Ala Gly Gly Asn Ile Ala Gln Gln Val Ala Ala Arg Leu Ala Ser Pro
            180                 185                 190
Glu Asp Leu Ala Leu Lys Ile Glu Gly Thr Ile Leu Ile Gln Pro Phe
        195                 200                 205
Tyr Ser Gly Glu Glu Arg Thr Glu Ser Glu Arg Arg Val Gly Asn Asp
    210                 215                 220
Lys Thr Ala Val Leu Thr Leu Ala Ser Ser Asp Ala Trp Trp Arg Met
225                 230                 235                 240
Ser Leu Pro Arg Gly Ala Asn Arg Glu His Pro Tyr Cys Lys Pro Val
                245                 250                 255
Lys Met Ile Ile Lys Ser Ser Thr Val Thr Arg Thr Leu Val Cys Val
            260                 265                 270
Ala Glu Met Asp Leu Leu Met Asp Ser Asn Met Glu Met Cys Asp Gly
        275                 280                 285
Asn Glu Asp Val Ile Lys Arg Val Leu His Lys Gly Val Gly His Ala
    290                 295                 300
Phe His Ile Leu Gly Lys Ser Gln Leu Ala His Thr Thr Thr Leu Glu
305                 310                 315                 320
Met Leu Cys Gln Ile Asp Ala Phe Ile His His Tyr Asp Pro Leu Asn
                325                 330                 335
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Claims (34)

1. 一种蛋白质，其为以下蛋白质中的任一种：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9的蛋白质；
(b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9中一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入的氨基酸序列的蛋白质，其具有结合赤霉素的活性；
(c)由在严格条件下与从包含核苷酸序列SEQ ID NO：1、4、6、或8和/或其互补序列的核酸制备出的探针杂交的核酸编码的蛋白质，其具有结合赤霉素的活性。
2. 权利要求1的蛋白质，其是以下蛋白质中的任一种：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质；
(b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：2中一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入的氨基酸序列的蛋白质，其具有结合赤霉素的活性；
(c)由在严格条件下与从包含核苷酸序列SEQ ID NO：1和/或其互补序列的核酸制备出的探针杂交的核酸编码的蛋白质，其具有结合赤霉素的活性。
3. 权利要求1的蛋白质，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：2、5、7、或9。
4. 权利要求2的蛋白质，其包括氨基酸序列SEQ ID NO：2。
5. 权利要求2的蛋白质，其是单子叶植物的蛋白质。
6. 编码权利要求1的蛋白质的核酸。
7. 携带权利要求6的核酸的载体。
8. 其中引入权利要求6的核酸的转化细胞。
9. 权利要求8的转化细胞，其是具有增强的赤霉素敏感性的植物细胞。
10. 一种转化植物，其引入了权利要求6的核酸，所述植物是具有增强的赤霉素敏感性的植物。
11. 权利要求10的转化植物，其是单子叶植物。
12. 权利要求10的转化植物的育种材料。
13. 一种多肽，其包括与权利要求1的蛋白质结合的抗体或者包括所述抗体的抗原结合片段。
14. 一种核酸的表达载体，所述核酸抑制权利要求1的蛋白质的表达。
15. 一种转化细胞，其引入了权利要求14的载体。
16. 权利要求15的转化细胞，其是具有降低的赤霉素敏感性的植物细胞。
17. 一种转化植物，其引入了权利要求14的载体，所述植物是具有降低的赤霉素敏感性的植物。
18. 权利要求17的转化植物，其是单子叶植物。
19. 权利要求17的转化植物的育种材料。
20. 用于增强或降低赤霉素敏感性的方法，其包括增加或降低权利要求1的蛋白质表达的步骤。
21. 用于产生对赤霉素的高敏感性或低敏感性的植物的方法，其包括从其中提高或降低了权利要求1的蛋白质表达的植物细胞再生植物的步骤。
22. 用于检测对赤霉素的应答的方法，其包括使赤霉素接触植物细胞或植物以及检测所述细胞或植物对赤霉素的应答的步骤，所述植物细胞或植物中权利要求1的蛋白质的表达被提高或降低。
23. 用于检测对赤霉素的应答的方法，其包括使测试化合物接触植物细胞或植物以及检测所述细胞或植物对赤霉素的应答的步骤，所述植物细胞或植物中权利要求1的蛋白质的表达被提高或降低。
24. 权利要求23的方法，还包括接触赤霉素的步骤。
25. 用于选择调节赤霉素应答的化合物的方法，其包括步骤：
(a)使测试化合物接触植物细胞或植物，所述植物细胞或植物中权利要求1的蛋白质的表达被提高或降低；
(b)检测所述细胞或植物对赤霉素的应答；和
(c)选择提高或降低赤霉素应答的化合物。
26. 权利要求25的方法，其中步骤(a)在存在赤霉素时实施。
27. 用于结合权利要求1的蛋白质和赤霉素的方法，其包括使所述蛋白质接触赤霉素的步骤。
28. 用于检测赤霉素结合的方法，其包括步骤：使赤霉素接触权利要求1的蛋白质以及检测所述蛋白质和赤霉素之间的结合。
29. 用于检测调节赤霉素和权利要求1的蛋白质之间相互作用的化合物的方法，其包括步骤：
(a)使测试化合物、赤霉素和所述蛋白质相接触；和
(b)检测赤霉素和所述蛋白质之间的结合。
30. 用于选择抑制赤霉素和权利要求1的蛋白质之间相互作用的化合物的方法，其包括步骤：
(a)使测试化合物、赤霉素和所述蛋白质相接触；
(b)检测赤霉素和所述蛋白质之间的结合；和
(c)选择抑制结合的化合物。
31. 用于结合权利要求1的蛋白质和DELLA蛋白的方法，其包括使这些蛋白质结合的步骤。
32. 包含权利要求1的蛋白质和赤霉素的复合物。
33. 包含权利要求1的蛋白质和DELLA蛋白的复合物。
34. 权利要求32的复合物，其还包括DELLA蛋白。
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