CN109996808B - 用于检测赤霉素的配体结合测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测赤霉素，并且更具体地但非排他地，涉及检测大麦中的赤霉素。本领域的问题是检测赤霉素的测试需要专用设备，这使得它昂贵且耗时。因此本发明的一个目的是提供用于检测赤霉素的配体结合测定，其中上述缺陷可至少部分被克服或缓解和/或提供对本领域而言更有用的替代方式。设想本发明将提供用于通过使用适配体检测大麦种子中赤霉素的使用点配体结合测定。

Description

用于检测赤霉素的配体结合测定
技术领域
本发明涉及配体结合测定，更具体地但非排他地，涉及用于检测大麦中赤霉素的配体结合测定。
发明背景
赤霉素或赤霉酸(GA)是调节生长并影响各种发育过程，包括茎伸长，萌发，休眠，开花，性表现，酶诱导以及叶和果实衰老的植物激素。
所有已知的赤霉素都是四环二萜酸，其通过质体中的萜类化合物途径合成，然后在内质网和胞质溶胶中被修饰直至它们达到其生物活性形式。所有赤霉素都是通过内部-赤霉素烷(ent-gibberellane)骨架衍生的，但是通过内部-贝壳杉烯酸(ent-kaurene)合成。
本领域的问题是检测赤霉素的测试需要专用设备，这使得它昂贵且耗时。
发明目的
因此，本发明的一个目的是提供用于检测赤霉素的配体结合测定，其至少部分地缓解了与现有技术相关的问题。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了用于检测样品中赤霉素的存在的配体结合测定，其包括：
-选择与赤霉素结合的靶标结合元件；和
-靶标结合元件与视觉指示物相关联，使得当靶标结合元件与赤霉素结合时，视觉指示物指示样品中赤霉素的存在。
赤霉素是赤霉酸GA1，GA3，GA4或GA7。
靶标结合元件是靶标部分。该部分是适配体。
适配体具有62个核苷酸，其核酸序列为5′-NHMCVNNNHDGCTGAGGTATGCNNNHWNDYDDNDNNHHHNHNVVHNNNNNDNNDBNHNNNHD-3′(SEQ ID NO：12)，
其中Y是T或C；
其中M是A或C；
其中W是A或T；
其中B是G或C或T；
其中D是A或G或T；
其中H是A或C或T；
其中V是A或G或C；
其中N是A或G或C或T，未知，或其他；
或其互补物，或该分子的RNA等同物或其互补物。
适配体具有62个核苷酸，其核酸序列为5’-TGAGGDVNVNGCTGAGGTATGCMAAYDHMHNVNNNNNHNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDHNNN-3’(SEQ ID NO：13)
其中Y是T或C；
其中M是A或C；
其中D是A或G或T；
其中H是A或C或T；
其中V是A或G或C；
其中N是A或G或C或T，未知，或其他；
或其互补物，或该分子的RNA等同物或其互补物。
适配体可以包含与选自组G1-G10的序列具有至少90％同源性的核酸序列，所述组G1-G10由选自SEQ ID NO：1-11的下列核酸序列，或其互补物，或该分子的RNA等同物或其互补物组成。
适配体结合测定可以是侧流或垂直流测定，其中适配体与运载体结合，并且指示物以来自运载体上适配体结合位点饱和的结合信号的形式提供。
侧流或垂直流测定可以是抑制测定。
运载体可以是金纳米颗粒，并且金纳米颗粒可以通过巯化与适配体结合。
来自高度局部浓集的金纳米颗粒的表面等离子体共振产生样品中不存在赤霉素时的视觉指示物。视觉指示物可以被感知为侧流或垂直流测定的指示部分上的可见红色信号。
来自金纳米颗粒上适配体结合位点的饱和的结合信号的消耗会导致在样品中存在赤霉素时没有红色信号。
可见红色信号是适配体结合的金纳米颗粒复合物使运载体上的结合位点饱和由此阻止金颗粒的聚集的结果。
配体结合测定可以是侧流或垂直流一次性测试的形式，其中产品施加于一次性测试的膜。
垂直流一次性测试可以是标准夹层垂直流测定或竞争性垂直流测定。
配体结合测定可以是非放射性配体结合测定，其包括与荧光团和猝灭剂对化学连接的适配体，使得视觉指示物在赤霉素存在下以荧光形式提供。
荧光团和猝灭剂对可以是核酸染料和荧光杂交探针。
配体结合测定包括与受体和供体对化学连接的适配体，使得在赤霉素存在下以荧光形式提供视觉指示物。
附图简要说明
下面仅通过非限制性示例并参考附图描述本发明的实施方式，其中：
图1是说明对赤霉素靶标的文库响应的富集谱的图表；
图2是描述20个通过指数富集(SELEX)系统进化配体的循环后获得的最丰富的适配体序列的表格；
图3是描绘图2的适配体序列彼此比对并基于90％序列同源性表征为集合的表格；
图4是可能的适配体序列的示意图，其中类别被称为“TGAGG”；
图5是可能的适配体序列的示意图，其中类别被称为“CCACC”；
图6是处于其最稳定形式的来自类别“TGAGG”的序列代表的可能结构的示意图；
图7是处于其不同状态的来自类别“CCACC”的序列代表的可能结构的示意图；
图8是描述代表性序列组G1-G10的表格；
图9是描绘在不同赤霉素浓度下G1与G10的结合响应的图；
图10是描绘G2与四种赤霉素的组合结合响应的图；
图11是描绘G2对赤霉素A1的响应曲线的图；
图12是描绘G2对赤霉素A3的响应曲线的图；
图13是描绘G2对赤霉素A4的响应曲线的图；
图14是描绘G2对赤霉素A7的响应曲线的图；
图15是竞争性抑制测定；和
图16描绘了荧光和荧光共振能量转移(FRET)测定。
具体实施方式
大麦的萌发
大麦种子是活的植物器官，为了方便起见，它们的发育可以分为三个阶段，即，生长，成熟和萌发。然而，由于每个阶段的特征性主要过程之间存在相当大的重叠，并且下一阶段可能在前一阶段完成之前开始，因此不可能清楚地识别从一个阶段到下一个阶段的过渡。前两个阶段只可能在种子仍附着在植物上时完成。尽管最终萌发所需的初始萌发过程在成熟的后期阶段在植物上开始，但最终萌发通常仅在种子从植物上脱离后发生。为了使萌发成功，种子必须达到成熟阶段(收获成熟/成熟)，使得它一旦从植物上脱离就能完全萌发。收获后，大麦种子静止(休眠)，直到环境条件有利于萌发。只有种子被完全吸涨才能成功萌发。吸涨引发种子中的萌发过程。干燥种子的吸涨被认为是萌发的关键阶段。非常快速吸涨引起的胁迫会对干种子的萌发产生负面影响。完全吸涨但然后再次变干的种子也不会成功萌发。
这种现象称为前萌发(pre-germination)。前萌发会降低储存的干种子的活力，因为它会导致种子的部分吸涨，从而引发最终的萌发响应，但无法维持这一过程，或者因为它涉及激素变化，在种子最终达到了收获成熟(maturity)/成熟(ripeness)前的发育阶段起始最终萌发。在两种情况下，种子中的一些储存的储备和储存信使RNA被消耗，这使得种子资源不足以经受长期储存条件。结果是大麦过早萌发并且不能用于麦芽制造过程。无法目视检查种子以确定是否发生了前萌发。
赤霉素和萌发
植物激素之间的相互作用，特别是赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)之间的相互作用，是控制从胚发生过渡到种子萌发的重要因素。在大麦籽粒萌发期间，胚将GA分泌到糊粉层，在那里它促进几种水解酶的合成，这些水解酶参与淀粉储备的动员以维持生长的胚。在休眠种子中以及在不利萌发条件下的幼苗中，这些酶的合成在种子发育期间被ABA阻断。储存后大麦种子的萌发受到前萌发的严重抑制，这种情况的特征是仍在结穗(in the ear)的过早种子萌发(premature seed germination)，也称为“收获前发芽(pre-harvestsprouting)”。这种现象通常是由于成熟的未收获种子长时间暴露于潮湿天气造成的。与萌发相关的过程的这种过早发生可能对ABA和GA之间的平衡产生不利影响，并且以这种方式抑制储存后的萌发。前萌发可对种子施加应激，使得ABA的浓度随着GA的预存储浓度降低到不利水平而增加。
大麦种子需要萌发才能用于麦芽制造过程。不萌发的种子没有足够的萌发能(GE)，因此不能用于麦芽制造过程。因此，确定大麦种子是否含有所需的GE非常重要。通过用GA合成抑制剂处理大麦种子显示赤霉素和GE之间的相关性，其导致严重的萌发抑制。结果表明，GA合成在大麦萌发中起重要作用。因此，赤霉素的测量可以指示大麦种子是否已经达到萌发。
赤霉素检测
检测赤霉素需要专用设备，这使得它昂贵且耗时。通常，从批次中取出样品并送至实验室通过ELISA(酶联免疫吸附测定)进行测试。ELISA测试依赖于抗体的结合。与使用针对低分子量化合物例如赤霉素产生的快速多克隆抗体相关的相当普遍的问题是这种抗体对游离赤霉素的低亲和性。用于免疫的运载体蛋白质化合物偶联物的亲和性通常在仅检测化合物方面较差，因为游离化合物作为独立半抗原不具有足够的免疫原性。因此，抗体不能快速结合赤霉素的小表位。ELISA还需要数小时的孵育和合格的技术人员来进行测定。当从实验室获得结果时，取决于储存条件，该批种子的GE可能已经改变。
适配体提供了抗体的可行替代方案，并且可以克服使用抗体检测赤霉素时遇到的限制。有三种类型的适配体：DNA，RNA和肽适配体。它们都具有非常相似的性质，但均非常独特。理论上，可针对任何分子靶标使用适配体。适配体以高特异性，精确性和亲和性结合其特定靶标。因为适配体在结构上顺应以与其靶标结合，所以与抗体相比，这为适配体提供了更广泛的可能靶标，所述抗体需要抗原和表位以及针对其靶标的免疫应答。
体外选择适配体
根据上述内容，开发了用于检测样品中赤霉素存在的配体结合测定。该测定包括选择结合赤霉素的靶标结合元件。靶标结合元件与视觉指示物相关联，并且当靶标结合元件与赤霉素结合时，视觉指示物指示样品中赤霉素的存在。赤霉素可以是赤霉酸GA1，GA3，GA4或GA7，并且靶标结合元件可以是适配体形式的靶标部分。
通过针对专有的适配体文库筛选游离赤霉素来进行适配体的体外选择。使用通过指数富集(SELEX)方法进行的珠基的配体系统进化。鉴定了对GA1，GA3，GA4和GA7具有结合亲和性的适配体。将所有四种靶标混合成一种溶液，终浓度各为1mM。如前所述，赤霉素是由二萜酸通过萜类化合物途径合成的植物激素，产生四环二萜酸。这些生物活性分子涉及植物发育的各个方面，然而，对于该项目感兴趣的是它们的检测对于监测萌发而言是重要的。在所有已知的赤霉素中，GA1，GA3，GA4和GA7是最具生物活性的，因此它们用作体外选择的靶标。
针对四种赤霉素的适配体的体外选择在20个珠基的SELEX方法的循环中进行，并且示于图1。典型的体外选择实验倾向于在10-15个循环内结束，然而，由于适配体分子的缓慢富集，该项目进行20个循环。在第12个循环结束时观察到成功适配体分离的第一个指示，因为在赤霉素存在下从固体支持物洗脱的DNA的速率超过了在没有赤霉素的情况下洗脱的DNA的速率。在第12个循环结束时，提交文库用于深度测序分析。然而，测序数据表明仅开始所需序列的富集，并且未观察到一种特定序列的明显优势。结果，体外选择再恢复进行8个循环。到第20个循环结束时，文库对赤霉素靶标的响应有明显的富集情况，如图1所示。然后提交该文库进行深度测序分析。
深度测序分析
Figure BDA0002005767320000071
MiSeq用于深度序列分析以分析第14、16、18和20个循环。通过对几个渐进循环进行多重测序分析，可以监测文库中具有不同富集程度的序列。此外，可以在整个选择循环中跟踪前10个最丰富序列的表现。测序数据的分析首先查看文库中特定序列的频率。体外选择是序列分子之间的一种竞争形式，其中最有响应性的序列被选择性富集，而舍弃不良或无活性的序列。观察到的频度更高(或丰富)的序列表明这些分子对赤霉素靶标具有某种形式的有利活性。
图2显示了在第20个富集循环结束时按丰度顺序排列的序列。在表格的第二和第三列中，跟踪相应的序列，以查看它们在第18个循环和第16个循环中的排名。这种类型的分析可能能够描述分子在许多选择循环上与其他分子竞争时的增长或削减。例如，排第3和第5的序列在较早的体外选择循环中排名很高，然而，到第20个循环时，随着更有力的序列开始增加，它们的群已经下降。排第1的序列是高增长速率的示例。在第16个循环中，它在群中排第8，然而，在仅仅两个循环(第18个循环)之后，它成为第四大优势群，然后在最终循环中成为最具优势的群。这是期望的模式并且可以指示活性适配体。
图3显示所有排序的序列然后彼此比对并基于90％序列相似性分类到集合中。一旦汇集，可以进行相同的分析以确定特定类别在选择过程中的富集或下降速率。在该组数据中，排第一的类别是图2中发现的第二丰富的序列(SEQ ID NO：2)，而图2中最丰富的序列(SEQ ID NO：1)在分类方面排第二。有两个可能对确定适配体活性很重要的值得注意的趋势。第一个是排第二的类别在第16到20个循环内发展的快速率。其次，大多数序列和类别以“TGAGG”的特定序列模式开始。
结构分析
图4和5是分别用于进一步分析排名靠前的“CCACC”类别和“TGAGG”类别的示意图。(示意图由以下参考文献生成：1)Crooks GE，Hon G，Chandonia JM，Brenner SE WebLogo：序列标识生成器(A sequence logo generator)，Genome Research，14：1188-1190，(2004)，2)Schneider TD，Stephens RM.1990.序列标志：显示共识序列的新方法(SequenceLogos：A New Way to Display Consensus Sequences).Nucleic Acids Res.18：6097-6100)。“CCACC”类别可以概括为具有核酸序列5′-NHMCVNNNHDGCTGAGGTATGCNNNHWNDYDDNDNNHHHNHNVVHNNNNNDNNDBNHNNNHD-3′(SEQ ID NO：12)的62个核苷酸的适配体分子，其中Y是T或C，M是A或C，W是A或T，B是G或C或T，D是A或G或T，H是A或C或T，V是A或G或C且N是A或G或C或T。类似地，“TGAGG”类别可以概括为具有核酸序列5′-TGAGGDVNVNGCTGAGGTATGCMAAYDHMHNVNNNNNHNNNNNNNNNNNNNNNNNNNHNNN-3′(SEQ ID NO：13)的62个核苷酸的适配体分子，其中Y是T或C，M是A或C，D是A或G或T，H是A或C或T，V是A或G或C，且N是A或G或C或T。概况的序列或其互补物，或该分子的RNA等同物也可能有效。
“TGAGG”是高度保守的序列，且很容易在测序文库中找到。事实上，“TGAGG”在每个序列中重复两次，第二次在捕获位点处发现。
“CCACC”序列类别不如“TGAGG”序列家族明显。存在表明保守位点的某些位置。
序列代表的结构
图6和7描绘了从m倍分析(http：//unafold.rna.albany.edu/)获得的结果。图6描绘了代表“CCACC”类别的序列的结构。左结构(A)是结合/识别前状态。在赤霉素存在下，该结构将转变为中间(B)或右形式(C)(两者都是更稳定的构象)。因此，“CCACC”类别具有三种可能的结构构象，其中ΔG为-14.89，-14.85和-14.01，表明序列内发现的结构比“TGAGG”分子更稳定。此外，这些结构表明存在两种状态的结构转换机制。第一种状态是固定和识别结构，由此适配体序列与固体支持物杂交并“准备”结合赤霉素。第二种状态(更稳定的结构)表明了在赤霉素存在下的适配体形成和从固体支持物解离。
“CCACC”类别的结构转换的基本原理来源于核苷酸位置30至42的变化。该序列空间用于与固定在固体支持物(磁珠或琼脂糖珠)上的互补“捕获”序列杂交。在赤霉素存在下，序列重新折叠成更稳定的结构并取代捕获序列，从而从固体支持物释放出来。
图6描绘了以其最稳定形式来自“TGAGG”类别的代表序列的结构，并且当存在其他结构时，最稳定的结构在22摄氏度下具有-11.96kcal/mol的ΔG。尽管对于“TGAGG”类别没有观察到明显的结构转换构象，但发夹结构的存在提示了可能识别赤霉素的可能基序。
初始结合响应测试
图3中列出的SEQ ID NO：1-8，10和11经化学合成并使用10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。图8中再次列出了SEQ ID NO及其对应的组编号。在三种不同浓度(250μM，500μM和1000μM)下评估初始广泛响应测试。所有数据值出自至少三个重复。总之，序列显示出对赤霉素混合物的一些活性响应。选择G2作为进一步研究的理想适配体。图9描绘了在三种不同浓度的赤霉素下G1至G10的结合响应。
G2与赤霉素的结合
图10描绘了针对浓度范围为0至1mM的个体赤霉素(A1，A3，A4和A7)评估的G2的组合结合响应。荧光测量基于从固体支持物释放的荧光DNA的量。
从图10中可以看出，G2适配体对赤霉素的混合物有响应。图11至图14显示G2适配体对赤霉素A7的活性响应最高，对赤霉素A1的活性最低。近似的Kd值如下：赤霉素A1-225μM，赤霉素A3-171μM，赤霉素A4-116μM，和赤霉素A7-80μM。
适配体选择过程的结论
筛选针对赤霉素A1，A3，A4和A7的适配体在20个循环的体外选择实验中成功进行。通过使用一个集合中的所有四个靶分子进行选择，最终的适配体G2能够识别所有四个靶标。
实施方式
配体结合测定的第一个实施方式可以是侧流或垂直流测定，其包括与运载体结合的适配体。运载体可以是金纳米颗粒，并且金纳米颗粒可以通过巯化与适配体结合。以来自运载体上适配体结合位点饱和的结合信号的形式提供指示物。侧流或垂直流测定可以是抑制测定。至少一种巯化的适配体通过金纳米颗粒的晶格结构与适配体寡核苷酸上的巯基之间的相互作用与金结合。
来自高度局部浓集的金纳米颗粒的表面等离子体共振产生不存在赤霉素时的视觉指示物。视觉指示物可以被感知为侧流或垂直流测定的指示部分上的可见红色信号。来自金纳米颗粒上适配体结合位点饱和的结合信号的消耗导致存在赤霉素时没有红色信号。可见红色信号是适配体结合的金纳米颗粒复合物使运载体上的结合位点饱和由此阻止金颗粒的聚集的结果。
配体结合测定可以是侧流或垂直流动一次性测试的形式，其中产品施加于一次性测试的指定部分，如膜。垂直流一次性测试可以是标准夹层垂直流测定或竞争性垂直流测定。该测试可包括竞争性抑制方式，其中阴性对照代表一次性测试单元的膜上的可见红色部分。在竞争性形式中，如果靶标存在于测试样本中，这将使适配体包被的金纳米颗粒上的结合位点饱和，使得适配体包被的金纳米颗粒将不再结合膜，其中采用卵清蛋白或其他肽偶联的赤霉素用于促进与膜的结合。该过程总结于图15。
配体结合测定的第二个实施方式可以是非放射性配体结合测定的形式，其包括与荧光团和猝灭剂对化学连接的适配体。在该实施方式中，视觉指示物以赤霉素存在下溶液的荧光形式提供。荧光团和猝灭剂对可以是核酸染料和荧光杂交探针。由此得出，在赤霉素存在下，猝灭剂从荧光团/猝灭剂对中脱离，产生荧光团特异性的荧光信号，如图16(A)所示。此外，结合信号的增加因此揭示了抗原的存在，并且还可以相对于标准量化信号。
靶标的测试1将在用于从样品的源材料中提取抗原的缓冲溶液中进行。提取缓冲溶液可包括但不限于TBS(Tris缓冲盐水)。此外，荧光计用于检测荧光团特异性荧光的荧光，并且可以针对预先校准的标准或值进行潜在量化。
配体结合测定可包括与受体和供体对化学连接的适配体，使得在赤霉素存在下以溶液的荧光形式提供视觉指示物。在抗原存在下，受体从受体/供体对中脱离，导致发射波长的变化，如图16(B)所示。应注意，发射波长信号的差异因此揭示了抗原的存在。鉴于上述情况，初始和终点发射波长之间的差异可以相对于标准量化并提供目标浓度的定量分析。
靶标的测试将在用于从样品的源材料中提取抗原的缓冲溶液中进行，其中提取缓冲溶液可包括但不限于TBS(Tris缓冲盐水)。此外，荧光计用于检测荧光团特异性荧光的荧光，并且可以针对预先校准的标准或值进行潜在量化。荧光非常敏感，可以检测到非常低浓度的分析物。它也非常有特异性，因为荧光团信号非常有特异性。由于荧光团设计为在非常窄的带隙内发射，因此产生具有良好信噪比的非常高质量的信号。
设想本发明将提供用于快速检测赤霉素的使用点(point-of-use)配体结合测定。具体地，使用点测定将有利于确定将提供质量指示的种子的萌发能。
Figure BDA0002005767320000111
序列表
<110> 约翰内斯堡大学（University of Johannesburg）
<120> 用于检测赤霉素的配体结合测定
<130> 86#LPS
<160> 13
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
ccaccacaaa gctgaggtat gcgggtatgc agctgtaacg atgccgttgc tgtaggctgc 60
aa 62
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
tgagggacca gctgaggtat gcaaacgcca agtgtgtaca tgggagcatt tccatagtac 60
ca 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
tgagggaccg gctgaggtat gcaaacgcct gataagtaaa gtagatctct actgtgctca 60
ta 62
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
tgaggacaac gctgaggtat gcaaataaca acaattcaga ggctaggccc tctgaggatc 60
gt 62
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
cgaccaggca gctgaggtat gctgtaacac atagaattat ggtatatggc agtcgattac 60
ga 62
<210> 6
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
gcacccggaa gctgaggtat gccacaagtc agtggctatg acgaatcata gccgtgacct 60
cg 62
<210> 7
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
cgccaggcat gctgaggtat gctgtaacac atgagagtaa tgatatcggg acaggtacgc 60
cc 62
<210> 8
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
caccaaggca gctgaggtat gctgtaacac aaggtacaaa cgacttaagt ttggccctga 60
ct 62
<210> 9
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
tgccaagcat gctgaggtat gctgtaacac actagcctac ggtaaggaac gttgtggttg 60
ca 62
<210> 10
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
tgaggagcga gctgaggtat gccaacaaca cgtgttcagt acgtgtacta gaaacgcgtc 60
gt 62
<210> 11
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
ccggtagggt gctgaggtat gctgtaacac acaaaaattg cgtctacgca atctcggatg 60
ac 62
<210> 12
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> Misc_feature
<222> (1)...(1)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (6)...(8)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (23)...(25)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (28)...(28)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (33)...(33)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (35)...(36)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (40)...(40)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (42)...(42)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (46)...(50)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (52)...(53)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (56)...(56)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (58)...(60)
<223> n = a, g, t, c
<400> 12
nhmcvnnnhd gctgaggtat gcnnnhwndy ddndnnhhhn hnvvhnnnnn dnndbnhnnn 60
hd 62
<210> 13
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> Misc_Features
<222> (8)...(8)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (10)...(10)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (31)...(31)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (33)...(37)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (39)...(57)
<223> n = a, g, t, c
<220>
<221> Misc_feature
<222> (60)...(62)
<223> n = a, g, t, c
<400> 13
tgaggdvnvn gctgaggtat gcmaaydhmh nvnnnnnhnn nnnnnnnnnn nnnnnnndhn 60
nn 62

Claims (10)

1.一种用于配体结合测定的设备，所述配体结合测定用于检测样品中赤霉素存在，包括：
-选择与赤霉素结合的靶标结合元件；和
-靶标结合元件与视觉指示物相关联，当所述靶标结合元件与赤霉素结合时，所述视觉指示物指示所述样品中赤霉素的存在；
其特征在于，所述靶标结合元件是适配体，所述适配体的核酸序列包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO：2。
2.如权利要求1所述的设备，其中所述设备用于侧流或垂直流测定，其中所述适配体与运载体结合，并且所述指示物以来自运载体上适配体结合位点饱和的结合信号的形式提供。
3.如权利要求2所述的设备，其中所述测定是抑制测定。
4.如权利要求2或3所述的设备，其中运载体是通过硫醇化与所述适配体结合的金纳米颗粒。
5.如权利要求4所述的设备，其中通过来自高度局部浓集的金纳米颗粒的表面等离子体共振来提供样品中不存在赤霉素时的视觉指示物。
6.如权利要求5所述的设备，其中所述视觉指示物被感知为侧流或垂直流测定的指示部分上的可见红色信号。
7.如权利要求6所述的设备，其中所述可见红色信号是适配体结合的金纳米颗粒复合物使运载体上的结合位点饱和由此阻止金颗粒的聚集的结果。
8.如权利要求1所述的设备，其中所述设备用于非放射性配体结合测定，其包括与荧光团和猝灭剂对化学连接的适配体，使得视觉指示物在赤霉素存在下以荧光形式提供。
9.如权利要求8所述的设备，其中所述荧光团和猝灭剂对是核酸染料和荧光杂交探针。
10.如权利要求1所述的设备，其中所述配体结合测定包括与受体和供体对化学连接的适配体，使得在赤霉素存在下以荧光形式提供视觉指示物。
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