JPH05192194A - 遺伝子の検索方法及び装置 - Google Patents
遺伝子の検索方法及び装置Info
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- JPH05192194A JPH05192194A JP22618991A JP22618991A JPH05192194A JP H05192194 A JPH05192194 A JP H05192194A JP 22618991 A JP22618991 A JP 22618991A JP 22618991 A JP22618991 A JP 22618991A JP H05192194 A JPH05192194 A JP H05192194A
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- genes
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- Medical Treatment And Welfare Office Work (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 短期間に多数の遺伝子を同定し、あるいは遺
伝子の機能を推定する方法及びその装置を提供する。 【構成】 遺伝子の検索を行おうとする生物の複数の任
意の遺伝子の塩基配列と、多数種の生物の遺伝子の塩基
配列を含む遺伝子データベースに保存されている遺伝子
のうち、前記遺伝子の検索を行おうとする生物と同種の
生物の遺伝子の塩基配列に加えて、異種の生物の遺伝子
の塩基配列とのホモロジー検索を行う。
伝子の機能を推定する方法及びその装置を提供する。 【構成】 遺伝子の検索を行おうとする生物の複数の任
意の遺伝子の塩基配列と、多数種の生物の遺伝子の塩基
配列を含む遺伝子データベースに保存されている遺伝子
のうち、前記遺伝子の検索を行おうとする生物と同種の
生物の遺伝子の塩基配列に加えて、異種の生物の遺伝子
の塩基配列とのホモロジー検索を行う。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子の検索方法及び
その装置に関し、詳しくは、短期間に多数の遺伝子を同
定し、あるいは遺伝子の機能を推定する方法及びその装
置を提供するものである。
その装置に関し、詳しくは、短期間に多数の遺伝子を同
定し、あるいは遺伝子の機能を推定する方法及びその装
置を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、遺伝子を単離する方法として、遺
伝子の発現産物であるタンパクのアミノ酸配列からその
遺伝子の塩基配列を推定し、その配列をもとに作製した
オリゴヌクレオチドプローブを使用して、あるいは、す
でに知られている他の生物における同機能の遺伝子の配
列をプローブとして、遺伝子ライブラリーの中から目的
の遺伝子のクローンをハイブリダイゼーションにより選
択する方法などが用いられている。
伝子の発現産物であるタンパクのアミノ酸配列からその
遺伝子の塩基配列を推定し、その配列をもとに作製した
オリゴヌクレオチドプローブを使用して、あるいは、す
でに知られている他の生物における同機能の遺伝子の配
列をプローブとして、遺伝子ライブラリーの中から目的
の遺伝子のクローンをハイブリダイゼーションにより選
択する方法などが用いられている。
【０００３】これらの方法は、特定の遺伝子を単離する
のには優れているが、１つの遺伝子を単離するのに非常
に多くの時間と労力を必要とする。通常プローブとして
用いられるオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼ
ーションでは、非特異的なシグナルを生ずることが少な
くないし、また、他種生物の遺伝子配列をプローブとす
る場合には、必ずしもハイブリダイゼーションに必要な
程度の相同性があるとは限らないからである。
のには優れているが、１つの遺伝子を単離するのに非常
に多くの時間と労力を必要とする。通常プローブとして
用いられるオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼ
ーションでは、非特異的なシグナルを生ずることが少な
くないし、また、他種生物の遺伝子配列をプローブとす
る場合には、必ずしもハイブリダイゼーションに必要な
程度の相同性があるとは限らないからである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】したがって、多くの遺
伝子を単離することは非常に困難であるので、少ない労
力で迅速に多数の遺伝子を検索することができる方法が
望まれている。
伝子を単離することは非常に困難であるので、少ない労
力で迅速に多数の遺伝子を検索することができる方法が
望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、ｃＤＮＡクロ
ーン等、遺伝子の一部の配列を遺伝子データベースと比
較することにより、迅速に遺伝子を同定することがで
き、従来単離されていないような遺伝子が多数単離でき
ることを見出し、本発明を完成させた。
を解決するために鋭意研究を行った結果、ｃＤＮＡクロ
ーン等、遺伝子の一部の配列を遺伝子データベースと比
較することにより、迅速に遺伝子を同定することがで
き、従来単離されていないような遺伝子が多数単離でき
ることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】すなわち本発明は、遺伝子の検索を行おう
とする生物の複数の任意の遺伝子の塩基配列と、多数種
の生物の遺伝子の塩基配列を含む遺伝子データベースに
保存されている遺伝子のうち、前記遺伝子の検索を行お
うとする生物と同種の生物の遺伝子の塩基配列に加え
て、異種の生物の遺伝子の塩基配列とのホモロジー検索
を行うことを特徴とする遺伝子の検索方法及び遺伝子の
検索を行う装置に関するものである。
とする生物の複数の任意の遺伝子の塩基配列と、多数種
の生物の遺伝子の塩基配列を含む遺伝子データベースに
保存されている遺伝子のうち、前記遺伝子の検索を行お
うとする生物と同種の生物の遺伝子の塩基配列に加え
て、異種の生物の遺伝子の塩基配列とのホモロジー検索
を行うことを特徴とする遺伝子の検索方法及び遺伝子の
検索を行う装置に関するものである。
【０００７】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
は、上記工程に加えて、任意の工程として、遺伝子ライ
ブラリーの作製、遺伝子の塩基配列の決定、データベー
スとのホモロジーを有する遺伝子の全長を持つクローン
の単離等を含んでもよい。
は、上記工程に加えて、任意の工程として、遺伝子ライ
ブラリーの作製、遺伝子の塩基配列の決定、データベー
スとのホモロジーを有する遺伝子の全長を持つクローン
の単離等を含んでもよい。
【０００８】以下に各工程を説明する。
【０００９】＜１＞遺伝子ライブラリーの作製 本発明の実施には、遺伝子検索を行おうとする生物の遺
伝子の塩基配列を知ることが前提となる。そのために
は、その生物で既知の配列を使用することも可能である
が、未知の遺伝子を多数同定するためには、遺伝子ライ
ブラリーを作製し、複数の遺伝子を選択しこれらの配列
を決定することが好ましい。
伝子の塩基配列を知ることが前提となる。そのために
は、その生物で既知の配列を使用することも可能である
が、未知の遺伝子を多数同定するためには、遺伝子ライ
ブラリーを作製し、複数の遺伝子を選択しこれらの配列
を決定することが好ましい。
【００１０】遺伝子ライブラリーは、染色体ＤＮＡから
作製することもできるが、構造遺伝子を効率よくクロー
ニングするにはｃＤＮＡライブラリーを作製することが
好ましい。ｃＤＮＡライブラリーは、目的とする生物の
細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮ
Ａを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化したも
のをベクターに挿入し、大腸菌等に形質転換することに
より作製することができる。これらの操作方法は、Mole
cular Cloning (Maniatisら、Cold Spring Harbour Lab
oratory）に記載されている。また、ｃＤＮＡクローニ
ングキットが市販されているのでこれらを使用してもよ
い。
作製することもできるが、構造遺伝子を効率よくクロー
ニングするにはｃＤＮＡライブラリーを作製することが
好ましい。ｃＤＮＡライブラリーは、目的とする生物の
細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮ
Ａを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化したも
のをベクターに挿入し、大腸菌等に形質転換することに
より作製することができる。これらの操作方法は、Mole
cular Cloning (Maniatisら、Cold Spring Harbour Lab
oratory）に記載されている。また、ｃＤＮＡクローニ
ングキットが市販されているのでこれらを使用してもよ
い。
【００１１】ライブラリーの作製に用いるベクターは、
多数種市販されており、いずれも使用することが可能で
あるが、塩基配列を決定するためには、ｃＤＮＡフラグ
メントが挿入されたまま配列決定できるベクターが好ま
しい。これはベクターのクローニングサイトのすぐ外側
にプライマー結合配列を有するベクターを使用すればよ
い。このようなベクターとして、例えばｐＵＣシリーズ
等が多種市販されている。
多数種市販されており、いずれも使用することが可能で
あるが、塩基配列を決定するためには、ｃＤＮＡフラグ
メントが挿入されたまま配列決定できるベクターが好ま
しい。これはベクターのクローニングサイトのすぐ外側
にプライマー結合配列を有するベクターを使用すればよ
い。このようなベクターとして、例えばｐＵＣシリーズ
等が多種市販されている。
【００１２】一方、データベースとのホモロジー検索に
より機能の推定された遺伝子の全長を取得するために
は、長いＤＮＡフラグメントを挿入することができるλ
等のファージベクターを用いてライブラリーを作製して
おくのが好ましい。
より機能の推定された遺伝子の全長を取得するために
は、長いＤＮＡフラグメントを挿入することができるλ
等のファージベクターを用いてライブラリーを作製して
おくのが好ましい。
【００１３】本発明において、適用することができる生
物は特に限定されないが、従来、単離同定された遺伝子
の少ない植物に特に有用である。植物のｃＤＮＡライブ
ラリーを作製する場合にはカルスを材料とするのが好ま
しい。カルスの培養条件により、遺伝子の発現すなわちｍ
ＲＮＡを誘導できる場合には、特に好適である。
物は特に限定されないが、従来、単離同定された遺伝子
の少ない植物に特に有用である。植物のｃＤＮＡライブ
ラリーを作製する場合にはカルスを材料とするのが好ま
しい。カルスの培養条件により、遺伝子の発現すなわちｍ
ＲＮＡを誘導できる場合には、特に好適である。
【００１４】カルスの誘導は、一般的には植物体を滅菌
し、種子、茎、葉等の組織を無菌的に寒天培地に植え込
むことにより行われる（J.H.Doddsら, "Experiments in
Plant Tissue Culture" Cambridge Univ. Press 1982
等)。通常、培地にオーキシンあるいはサイトカイニン
等の植物ホルモンを添加することにより、誘導効率を高
めることができる。誘導されたカルスは液体培地中で培
養することができる。
し、種子、茎、葉等の組織を無菌的に寒天培地に植え込
むことにより行われる（J.H.Doddsら, "Experiments in
Plant Tissue Culture" Cambridge Univ. Press 1982
等)。通常、培地にオーキシンあるいはサイトカイニン
等の植物ホルモンを添加することにより、誘導効率を高
めることができる。誘導されたカルスは液体培地中で培
養することができる。
【００１５】＜２＞遺伝子の塩基配列の決定 クローン化されたｃＤＮＡ等の遺伝子の塩基配列の決定
は、Maxam-Gilbert法あるいは、ダイデオキシ法により
行う。これらの内では、ダイデオキシ法が簡便であり好
ましい。ダイデオキシ法による塩基配列の決定は、市販
されているキットを用いて行うことができ、さらに配列
決定を自動的に行うオートシークエンサーが数社から市
販されているので、これらを使用することにより短時間
で塩基配列を決定することができる。
は、Maxam-Gilbert法あるいは、ダイデオキシ法により
行う。これらの内では、ダイデオキシ法が簡便であり好
ましい。ダイデオキシ法による塩基配列の決定は、市販
されているキットを用いて行うことができ、さらに配列
決定を自動的に行うオートシークエンサーが数社から市
販されているので、これらを使用することにより短時間
で塩基配列を決定することができる。
【００１６】＜３＞遺伝子データベースとのホモロジー
検索 上述のようにして得られた塩基配列を、データベースに
保存されている既知の遺伝子の配列と比較し、ホモロジ
ー検索を行う。
検索 上述のようにして得られた塩基配列を、データベースに
保存されている既知の遺伝子の配列と比較し、ホモロジ
ー検索を行う。
【００１７】現在まで報告された遺伝子の塩基配列は、
生物の種を問わず欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）、
米国ロスアラモス国立研究所においてコンピューター入
力されており、その遺伝子の数は、約４３０００に及ぶ
（１９９１年１月現在）。これらは、検索を有効に行え
るようにそれぞれ一定の書式で管理され、ＥＭＢＬ、Ｇ
ｅｎＢａｎｋとして公表されており、フロッピーディス
ク等を媒体として入手することができる。
生物の種を問わず欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）、
米国ロスアラモス国立研究所においてコンピューター入
力されており、その遺伝子の数は、約４３０００に及ぶ
（１９９１年１月現在）。これらは、検索を有効に行え
るようにそれぞれ一定の書式で管理され、ＥＭＢＬ、Ｇ
ｅｎＢａｎｋとして公表されており、フロッピーディス
ク等を媒体として入手することができる。
【００１８】ホモロジー検索に際しては、データベース
に保存されている遺伝子のうち、検索を行おうとする生
物と同種の生物の遺伝子のみでなく、異種の生物の遺伝
子の配列も検索の対象とすることにより、その検索を行
おうとする生物で知られていない遺伝子、あるいは存在
は知られていても単離されていない遺伝子を取得できる
可能性がある。
に保存されている遺伝子のうち、検索を行おうとする生
物と同種の生物の遺伝子のみでなく、異種の生物の遺伝
子の配列も検索の対象とすることにより、その検索を行
おうとする生物で知られていない遺伝子、あるいは存在
は知られていても単離されていない遺伝子を取得できる
可能性がある。
【００１９】ホモロジー検索は、決定された塩基配列を
データベース上の配列と比較することにより行われる。
検索はコンピューターを使用し、例えば、試料の塩基配
列と遺伝子データベースに保存されている遺伝子の塩基
配列から、予め設定された塩基長の任意の領域を取り出
し、これを比較し、同一の配列である場合のみポイント
を加算し、すべての組合せについて比較した後にポイン
トを合計したスコアが一定以上の値であればホモロジー
があるとする。通常は、スコアにして１６０ポイント以
上、あるいは３０塩基以上にわたって相同な配列がある
場合をホモロジーがあるとする。いずれかの配列にヌク
レオチドの挿入を考慮した場合にスコアが高くなるとき
は、最良のスコアとなるようにするのが好ましい。
データベース上の配列と比較することにより行われる。
検索はコンピューターを使用し、例えば、試料の塩基配
列と遺伝子データベースに保存されている遺伝子の塩基
配列から、予め設定された塩基長の任意の領域を取り出
し、これを比較し、同一の配列である場合のみポイント
を加算し、すべての組合せについて比較した後にポイン
トを合計したスコアが一定以上の値であればホモロジー
があるとする。通常は、スコアにして１６０ポイント以
上、あるいは３０塩基以上にわたって相同な配列がある
場合をホモロジーがあるとする。いずれかの配列にヌク
レオチドの挿入を考慮した場合にスコアが高くなるとき
は、最良のスコアとなるようにするのが好ましい。
【００２０】比較すべき各々の配列は、必ずしも全長で
ある必要はなく、特定の領域を指定して検索を行っても
よい。この領域の長さが短すぎる場合には、遺伝子全体
ではホモロジーが少ないものもホモロジーがあると判断
される場合があるので、１００塩基長以上の長さにわた
って検索することが好ましい。
ある必要はなく、特定の領域を指定して検索を行っても
よい。この領域の長さが短すぎる場合には、遺伝子全体
ではホモロジーが少ないものもホモロジーがあると判断
される場合があるので、１００塩基長以上の長さにわた
って検索することが好ましい。
【００２１】ホモロジー検索には、市販のホモロジー検
索プログラムを使用することができる。このようなプロ
グラムとしては、例えばＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＤＣソフト
ウェア開発（株））、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア
エンジニアリング）等がある。
索プログラムを使用することができる。このようなプロ
グラムとしては、例えばＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＤＣソフト
ウェア開発（株））、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア
エンジニアリング）等がある。
【００２２】検索を迅速に行うために、遺伝子の検索を
行おうとする生物の複数の任意の遺伝子の塩基配列を入
力する入力手段と、この入力された配列を記憶する記憶
手段と、この記憶装置から塩基配列を取り出し、多数種
の生物の遺伝子の塩基配列が保存されている遺伝子デー
タベースから取り出した塩基配列とのホモロジー検索を
行う検索手段と、ホモロジー検索の結果を出力する出力
手段とを備えることにより、遺伝子の検索装置を作製す
ることができる。かかる装置の構成の１例を図１に示
す。
行おうとする生物の複数の任意の遺伝子の塩基配列を入
力する入力手段と、この入力された配列を記憶する記憶
手段と、この記憶装置から塩基配列を取り出し、多数種
の生物の遺伝子の塩基配列が保存されている遺伝子デー
タベースから取り出した塩基配列とのホモロジー検索を
行う検索手段と、ホモロジー検索の結果を出力する出力
手段とを備えることにより、遺伝子の検索装置を作製す
ることができる。かかる装置の構成の１例を図１に示
す。
【００２３】入力手段としては例えばキーボードを、出
力手段としてはディスプレイあるいはプリンタを使用す
ることができる。塩基配列の入力は、オートシーケンサ
ーからの出力を直接記憶手段に入力させることにより行
ってもよい。検索手段はコンピューター手段に上記市販
のプログラムを実行させることにより実現することがで
きる。
力手段としてはディスプレイあるいはプリンタを使用す
ることができる。塩基配列の入力は、オートシーケンサ
ーからの出力を直接記憶手段に入力させることにより行
ってもよい。検索手段はコンピューター手段に上記市販
のプログラムを実行させることにより実現することがで
きる。
【００２４】＜４＞ホモロジーを有する遺伝子の単離 ホモロジー検索に使用する配列を決定するためのクロー
ン、特にベクターとしてプラスミドを使用したものは、
遺伝子の全長を含んでいない場合が多い。したがって、
遺伝子全長を得ることが必要な場合には、前期クローン
をプロープとして、ラムダベクター等を用いたライブラ
リーからスクリーニングするのが好ましい。 このスク
リーニングは、プラークハイブリダイゼーションにより
行うことができる。
ン、特にベクターとしてプラスミドを使用したものは、
遺伝子の全長を含んでいない場合が多い。したがって、
遺伝子全長を得ることが必要な場合には、前期クローン
をプロープとして、ラムダベクター等を用いたライブラ
リーからスクリーニングするのが好ましい。 このスク
リーニングは、プラークハイブリダイゼーションにより
行うことができる。
【００２５】プラークハイブリダイゼーションの方法
は、Molecular Cloning 第２版(Maniatisら、Cold Sprin
g Harbor Laboratory) 12.30〜40等に記載されている。
すなわち、寒天重層培地に形成させたファージのプラー
クをナイロンメンブレン等に転写し、タンパクを溶解
し、ＤＮＡをメンブレンに固定する。その後、放射性物
質等で標識したプローブを溶液中でハイブリダイズさ
せ、洗浄後、メンブレンに残留する放射活性等によリ、
プローブがハイブリダイズしたプラークの位置を知るこ
とができる。
は、Molecular Cloning 第２版(Maniatisら、Cold Sprin
g Harbor Laboratory) 12.30〜40等に記載されている。
すなわち、寒天重層培地に形成させたファージのプラー
クをナイロンメンブレン等に転写し、タンパクを溶解
し、ＤＮＡをメンブレンに固定する。その後、放射性物
質等で標識したプローブを溶液中でハイブリダイズさ
せ、洗浄後、メンブレンに残留する放射活性等によリ、
プローブがハイブリダイズしたプラークの位置を知るこ
とができる。
【００２６】位置が特定されたプラークからファージを
取り、ＤＮＡを精製し、必要に応じてプラスミドベクタ
ー等にサブクローニングすることにより、遺伝子を単離
することができる。
取り、ＤＮＡを精製し、必要に応じてプラスミドベクタ
ー等にサブクローニングすることにより、遺伝子を単離
することができる。
【００２７】クローニングされたＤＮＡフラグメントの
長さは、アガロースゲル電気泳動、あるいはＰＣＲ（ポ
リメラーゼ・チェイン・リアクション）法により確認す
ることができる。
長さは、アガロースゲル電気泳動、あるいはＰＣＲ（ポ
リメラーゼ・チェイン・リアクション）法により確認す
ることができる。
【００２８】
【実施例】本発明を、植物カルスを材料とした実施例に
より更に詳細に説明する。イネ品種ヤマホウシのカルス
を作製し、このカルスからｃＤＮＡライブラリーを作製
し、任意に選択したｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を
決定し、遺伝子データベースとのホモロジー検索を行っ
た。以下に、工程ごとに詳説する。
より更に詳細に説明する。イネ品種ヤマホウシのカルス
を作製し、このカルスからｃＤＮＡライブラリーを作製
し、任意に選択したｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を
決定し、遺伝子データベースとのホモロジー検索を行っ
た。以下に、工程ごとに詳説する。
【００２９】＜１＞カルスの作製 植物としてイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．
Ｙａｍａｈｏｕｓｈｉ）を使用し、カルスを作製した。
Ｙａｍａｈｏｕｓｈｉ）を使用し、カルスを作製した。
【００３０】イネの種子を１％の次亜塩素酸ナトリウム
溶液中に３０分放置した後、表１に示すＮ６Ｄ寒天培地
上に置き、カルスを誘導させた。このカルスを切取り、
表２に示すＡ．Ａ液体培地に移し、振盪培養を行い増殖
させた。
溶液中に３０分放置した後、表１に示すＮ６Ｄ寒天培地
上に置き、カルスを誘導させた。このカルスを切取り、
表２に示すＡ．Ａ液体培地に移し、振盪培養を行い増殖
させた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】＜２＞ＲＮＡの抽出 ガーゼを用いて上記カルス培養液を濾過し、２０ｇのカ
ルスを得た。このカルスにチオシアン酸グアニジン溶液
（４Ｍ チオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ２−メル
カプトエタノール）を加え１００ｍｌとし、超高速ホモ
ジナイザーを用いて１分間破砕した。
ルスを得た。このカルスにチオシアン酸グアニジン溶液
（４Ｍ チオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ２−メル
カプトエタノール）を加え１００ｍｌとし、超高速ホモ
ジナイザーを用いて１分間破砕した。
【００３４】この破砕液をダウンズ型ホモジナイザーに
移し、５〜６回上下させることによりカルスを完全に破
砕した。この破砕液に、Ｓａｒｃｏｓｙｌ液を終濃度
０．５％となるように加え、１２０００ｒｐｍで１５分
間遠心分離した。
移し、５〜６回上下させることによりカルスを完全に破
砕した。この破砕液に、Ｓａｒｃｏｓｙｌ液を終濃度
０．５％となるように加え、１２０００ｒｐｍで１５分
間遠心分離した。
【００３５】遠心管に分注した５．７Ｍ ＣｓＣｌ、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に、上記遠心分離した上清を等容
重層し、Ｈｉｍａｃ ５５Ｐ−７２（日立製作所製）超
高速遠心分離機を用いて、２２０００ｒｐｍで３６時
間、２０℃で遠心分離を行った。
０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に、上記遠心分離した上清を等容
重層し、Ｈｉｍａｃ ５５Ｐ−７２（日立製作所製）超
高速遠心分離機を用いて、２２０００ｒｐｍで３６時
間、２０℃で遠心分離を行った。
【００３６】２層に分かれた液層を順次吸い出し、沈澱
にチオシアン酸グアニジン溶液が接触しないようにし
て、この沈澱を０．１％ ＳＤＳを含む１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍｌに溶
解した。この溶液に等容のフェノール・クロロホルム
（フェノール：クロロホルム＝１：１）を加え、１分間
攪拌し、タンパクを変性させた。
にチオシアン酸グアニジン溶液が接触しないようにし
て、この沈澱を０．１％ ＳＤＳを含む１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍｌに溶
解した。この溶液に等容のフェノール・クロロホルム
（フェノール：クロロホルム＝１：１）を加え、１分間
攪拌し、タンパクを変性させた。
【００３７】これを遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０
分）し、水層を回収し、１／１０容の３Ｍ 酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ８．０）、２倍容のエタノールを加え、粗Ｒ
ＮＡ懸濁液として−８０℃で保存した。
分）し、水層を回収し、１／１０容の３Ｍ 酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ８．０）、２倍容のエタノールを加え、粗Ｒ
ＮＡ懸濁液として−８０℃で保存した。
【００３８】次に、この粗ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）+
ＲＮＡをｏｌｉｇｏ（ｄＴ）固定化ラテックス（ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０：第一化学薬品から購入）を用い
て精製した。
ＲＮＡをｏｌｉｇｏ（ｄＴ）固定化ラテックス（ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０：第一化学薬品から購入）を用い
て精製した。
【００３９】２００μｇのＲＮＡを４００μｌの溶出バ
ッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７５）、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）に溶解し、６５℃
で５分間処理した後、氷中で急冷した。このＲＮＡ溶液
に５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌと１００μｌのｏｌｉｇｏ
ｔｅｘ−３０ｄＴを加え混合した。
ッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７５）、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）に溶解し、６５℃
で５分間処理した後、氷中で急冷した。このＲＮＡ溶液
に５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌと１００μｌのｏｌｉｇｏ
ｔｅｘ−３０ｄＴを加え混合した。
【００４０】３７℃に５分間置いた後、１５０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、上清を除き、沈澱に５００μ
ｌの溶出バッファーと５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加
え、穏やかに懸濁し、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡをｏｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０から容出させた。これを再び遠心
分離し、上清に等容のフェノール・クロロホルムを加
え、静かに攪拌した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分
離し、水層を回収した。
ｍで１０分間遠心分離し、上清を除き、沈澱に５００μ
ｌの溶出バッファーと５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加
え、穏やかに懸濁し、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡをｏｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０から容出させた。これを再び遠心
分離し、上清に等容のフェノール・クロロホルムを加
え、静かに攪拌した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分
離し、水層を回収した。
【００４１】このフェノール・クロロホルム処理を再度
行い、水層に１／１０容の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．６）と２倍容のエタノールを加え、−８０℃で３０
分放置した後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、沈澱を１２５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
６）に溶解させた。
行い、水層に１／１０容の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．６）と２倍容のエタノールを加え、−８０℃で３０
分放置した後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、沈澱を１２５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
６）に溶解させた。
【００４２】この溶液に２５０μｌのエタノールを加
え、−１８０℃で３０分間放置した後、１５０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、沈澱を回収した。この沈澱を
７０％エタノールで洗浄し、エタノールを除去した後、
１０μｌの精製水に溶解し、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ画
分として保存した。
え、−１８０℃で３０分間放置した後、１５０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、沈澱を回収した。この沈澱を
７０％エタノールで洗浄し、エタノールを除去した後、
１０μｌの精製水に溶解し、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ画
分として保存した。
【００４３】＜３＞ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを材料としてｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。ｃＤＮＡの合成は、アマシャム社
製のｃＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ合成システム・プラ
ス）を用いて、キットに添付されているマニュアル通り
に行った。
ブラリーを作製した。ｃＤＮＡの合成は、アマシャム社
製のｃＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ合成システム・プラ
ス）を用いて、キットに添付されているマニュアル通り
に行った。
【００４４】ｃＤＮＡの塩基配列決定用のライブラリー
として、プラスミドｐＵＣ１１８をクローニングベクタ
ーに用いたライブラリーを作製した。このプラスミドの
マルチクローニングサイトのEcoRI部位に、EcoRIアダプ
ターを末端に連結した上記ｃＤＮＡフラグメントをＴ４
リガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
した。
として、プラスミドｐＵＣ１１８をクローニングベクタ
ーに用いたライブラリーを作製した。このプラスミドの
マルチクローニングサイトのEcoRI部位に、EcoRIアダプ
ターを末端に連結した上記ｃＤＮＡフラグメントをＴ４
リガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
した。
【００４５】一方、遺伝子データベースとのホモロジー
の認められたｃＤＮＡの全長を再クローンするために、
λファージをベクターとするライブラリーを、アマシャ
ム社製のλｇｔ１０アダプター法によるクローニングキ
ット（ｃＤＮＡクローニングシステム、クローニングサ
イト：EcoRI）を用いて作製した。
の認められたｃＤＮＡの全長を再クローンするために、
λファージをベクターとするライブラリーを、アマシャ
ム社製のλｇｔ１０アダプター法によるクローニングキ
ット（ｃＤＮＡクローニングシステム、クローニングサ
イト：EcoRI）を用いて作製した。
【００４６】＜４＞塩基配列の決定 上記で得られたｐＵＣ１１８によるｃＤＮＡライブラリ
ーからクローンを任意に選択し、これらの株からプラス
ミドをボイリング法（Maniatisら、Molecularcloning V
ol.2 1.29〜30）あるいはアルカリＳＤＳ法により抽出
し、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により精製した。
ｃＤＮＡフラグメントの確認は、アガロースゲル電気泳
動により行った。
ーからクローンを任意に選択し、これらの株からプラス
ミドをボイリング法（Maniatisら、Molecularcloning V
ol.2 1.29〜30）あるいはアルカリＳＤＳ法により抽出
し、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により精製した。
ｃＤＮＡフラグメントの確認は、アガロースゲル電気泳
動により行った。
【００４７】得られたプラスミドのうち約５００個につ
いて、ｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を、ダイデオキ
シ法によりApplied Biosistems社製のオートシークエン
サーを用いて決定した。
いて、ｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を、ダイデオキ
シ法によりApplied Biosistems社製のオートシークエン
サーを用いて決定した。
【００４８】＜５＞ｃＤＮＡ配列と遺伝子データバンク
とのホモロジー検索 上記のようにして塩基配列を決定したｃＤＮＡについて
遺伝子データベースを用いてホモロジー検索を行った。
ホモロジー検索は、データベースとしてＧｅｎｅＢａｎ
ｋを、ホモロジー検索のプログラムとしてＤＮＡＳＩＳ
（日立ソフトウエアエンジニアリング）を用いて行っ
た。
とのホモロジー検索 上記のようにして塩基配列を決定したｃＤＮＡについて
遺伝子データベースを用いてホモロジー検索を行った。
ホモロジー検索は、データベースとしてＧｅｎｅＢａｎ
ｋを、ホモロジー検索のプログラムとしてＤＮＡＳＩＳ
（日立ソフトウエアエンジニアリング）を用いて行っ
た。
【００４９】検索を行った約５００個のｃＤＮＡ配列の
うち、５３個が何らかの遺伝子と高いホモロジーを有し
ていた。そのようなｃＤＮＡ配列を配列表の配列番号１
〜４に例示する。
うち、５３個が何らかの遺伝子と高いホモロジーを有し
ていた。そのようなｃＤＮＡ配列を配列表の配列番号１
〜４に例示する。
【００５０】これらの内、Ｃ２７は、トウモロコシのpy
ruvate orthophoshate dikinase遺伝子と、Ｓ７７は、Z
ymomonas mobilisのpyruvate decarboxylase 遺伝子
と、Ｓ９４は、ウシのbrain-specific 14-3-3 protein
tau chain mRNAと、ＡＫ１０８は、chickin 90kDa heat
shock protein mRNAとホモロジーを有していた。
ruvate orthophoshate dikinase遺伝子と、Ｓ７７は、Z
ymomonas mobilisのpyruvate decarboxylase 遺伝子
と、Ｓ９４は、ウシのbrain-specific 14-3-3 protein
tau chain mRNAと、ＡＫ１０８は、chickin 90kDa heat
shock protein mRNAとホモロジーを有していた。
【００５１】トウモロコシのpyruvate orthophoshate d
ikinase遺伝子以外は、いずれも植物では単離されていな
い遺伝子であり、本発明により初めて植物にこれらと同
機能の遺伝子が存在することが示唆された。
ikinase遺伝子以外は、いずれも植物では単離されていな
い遺伝子であり、本発明により初めて植物にこれらと同
機能の遺伝子が存在することが示唆された。
【００５２】上記遺伝子の配列のうち、ｃＤＮＡとホモ
ロジーがある部分の配列を、相当する部分のｃＤＮＡ配
列とともに図２〜５に示す。上段はｃＤＮＡの配列を、
下段はホモロジーのある遺伝子の配列を示す。縦線は両
者で一致する塩基を、配列の上下の数字は５’末端から
の塩基数を示す。
ロジーがある部分の配列を、相当する部分のｃＤＮＡ配
列とともに図２〜５に示す。上段はｃＤＮＡの配列を、
下段はホモロジーのある遺伝子の配列を示す。縦線は両
者で一致する塩基を、配列の上下の数字は５’末端から
の塩基数を示す。
【００５３】また、これらの配列の相同性を、ハー・プ
ロットで示したのが図６〜９である。すなわち、ｃＤＮ
Ａ配列を縦軸、上記遺伝子のホモロジーのある部分の配
列を横軸にとり、それぞれの軸上の塩基が同一である座
標が１２以上連続する場合にこれらの座標を点で示した
ものである。したがって、点が直線状に並んでいればそ
の部分がホモロジーを有することを示す。これらの結果
からも、上記配列は高いホモロジーを有していることが
わかる。
ロットで示したのが図６〜９である。すなわち、ｃＤＮ
Ａ配列を縦軸、上記遺伝子のホモロジーのある部分の配
列を横軸にとり、それぞれの軸上の塩基が同一である座
標が１２以上連続する場合にこれらの座標を点で示した
ものである。したがって、点が直線状に並んでいればそ
の部分がホモロジーを有することを示す。これらの結果
からも、上記配列は高いホモロジーを有していることが
わかる。
【００５４】例示したもの以外の遺伝子で、ホモロジー
検索にかかったものの例を下記に示す。植物で知られて
いるものとしては、Pyruvate orthophosphate dikinas
e、Ribosomal protein、Ubiquitin、rDNA repeating un
it、Cytochrome P-450 NADPH-P450 reductase、ACP (Ac
yl carrier protein)、α-tubulin、Alcohol dehydroge
nase、Malic enzyme、Phosphoglycerate kinase、α-am
ylase、Elongation factor 1α、Sucrose synthase、Gl
yceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase、S-adenosyl
metionine synthetase、Calmodulinをコードする遺伝子
と高いホモロジーを有するｃＤＮＡが検出された。
検索にかかったものの例を下記に示す。植物で知られて
いるものとしては、Pyruvate orthophosphate dikinas
e、Ribosomal protein、Ubiquitin、rDNA repeating un
it、Cytochrome P-450 NADPH-P450 reductase、ACP (Ac
yl carrier protein)、α-tubulin、Alcohol dehydroge
nase、Malic enzyme、Phosphoglycerate kinase、α-am
ylase、Elongation factor 1α、Sucrose synthase、Gl
yceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase、S-adenosyl
metionine synthetase、Calmodulinをコードする遺伝子
と高いホモロジーを有するｃＤＮＡが検出された。
【００５５】植物で知られていないものとしては、Pyru
vate decarboxylase、Brain specific protein、Heat s
hock protein (90KD)、Succinate dehydrogenase、Valy
l t-RNA synthetase、SIR3 (Silent information regul
ator)、T complex polypeptide、Adenylate kinase、In
itiation factor (eIF-4D)、Initiation factor (eIF-4
A)、Elonganation factor G (fus gene)、RNA polymera
se II(subunit)、Plasma membrane calcium ATPase、Su
rfeitlocus processed pseudogene、Signal recognitio
n particle receptor、elav protein、fsh membrane pr
oteinをコードする遺伝子と高いホモロジーを有するｃ
ＤＮＡが検出された。
vate decarboxylase、Brain specific protein、Heat s
hock protein (90KD)、Succinate dehydrogenase、Valy
l t-RNA synthetase、SIR3 (Silent information regul
ator)、T complex polypeptide、Adenylate kinase、In
itiation factor (eIF-4D)、Initiation factor (eIF-4
A)、Elonganation factor G (fus gene)、RNA polymera
se II(subunit)、Plasma membrane calcium ATPase、Su
rfeitlocus processed pseudogene、Signal recognitio
n particle receptor、elav protein、fsh membrane pr
oteinをコードする遺伝子と高いホモロジーを有するｃ
ＤＮＡが検出された。
【００５６】この結果からわかるように、本発明によ
り、植物で知られている遺伝子のみならず、従来知られ
ていない遺伝子も多数選択することができた。これらの
うちいくつかについては、ｃＤＮＡをプローブとしてλ
を用いたライブラリーからスクリーニングを行い、ｃＤ
ＮＡの全長が取得された。
り、植物で知られている遺伝子のみならず、従来知られ
ていない遺伝子も多数選択することができた。これらの
うちいくつかについては、ｃＤＮＡをプローブとしてλ
を用いたライブラリーからスクリーニングを行い、ｃＤ
ＮＡの全長が取得された。
【００５７】
【発明の効果】本発明により、通常遺伝子の単離等に必
要なタンパクの精製、アミノ酸配列の決定、合成オリゴ
ヌクレオチドプローブを用いたプラークハイブリダイゼ
ーション等を行うことなく、多数の遺伝子を同定し、あ
るいは遺伝子の機能を推定するなど遺伝子の検索を短期
間で容易に行うことができる。さらに、従来検索しよう
とする生物で知られていない遺伝子を単離することがで
きる。
要なタンパクの精製、アミノ酸配列の決定、合成オリゴ
ヌクレオチドプローブを用いたプラークハイブリダイゼ
ーション等を行うことなく、多数の遺伝子を同定し、あ
るいは遺伝子の機能を推定するなど遺伝子の検索を短期
間で容易に行うことができる。さらに、従来検索しよう
とする生物で知られていない遺伝子を単離することがで
きる。
【図１】本発明の遺伝子の検索装置の構成の１例を示す
図
図
【図２】ｃＤＮＡ Ｃ２７と、トウモロコシのpyruvate
orthophoshate dikinase遺伝子の配列を比較した図
orthophoshate dikinase遺伝子の配列を比較した図
【図３】 ｃＤＮＡ Ｓ７７と、Zymomonas mobilisのpyr
uvate decarboxylase 遺伝子の配列を比較した図
uvate decarboxylase 遺伝子の配列を比較した図
【図４】 ｃＤＮＡ Ｓ９４と、ウシのbrain-specific 1
4-3-3 protein tauchin mRNAの配列を比較した図
4-3-3 protein tauchin mRNAの配列を比較した図
【図５】 ｃＤＮＡ ＡＫ１０８と、chickin 90kDa heat
shock protein mRNAの配列を比較した図
shock protein mRNAの配列を比較した図
【図６】 ｃＤＮＡ Ｃ２７と、トウモロコシのpyruvate
orthophoshate dikinase遺伝子の配列を比較したハー・
プロット
orthophoshate dikinase遺伝子の配列を比較したハー・
プロット
【図７】 ｃＤＮＡ Ｓ７７と、Zymomonas mobilisのpyr
uvate decarboxylase 遺伝子の配列を比較したハー・プ
ロット
uvate decarboxylase 遺伝子の配列を比較したハー・プ
ロット
【図８】 ｃＤＮＡ Ｓ９４と、ウシのbrain-specific 1
4-3-3 protein tauchain mRNAの配列を比較したハー・
プロット
4-3-3 protein tauchain mRNAの配列を比較したハー・
プロット
【図９】 ｃＤＮＡ ＡＫ１０８と、chickin 90kDa heat
shock protein mRNAの配列を比較したハー・プロット
shock protein mRNAの配列を比較したハー・プロット
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２８２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 AAAGAAGTAC AGAAGCATTA ACCAGATCAC TGGGTTAAAG GGTACTGCTG TGAATGTTCA 60 GTGCATGGTC TTTGGCAACA TGGGTGACAC TTCAGGCACT GGTGTTCTCT TTACTAGGAA 120 CCCTAGTACT GGAGAGAGAA AACTTTATGG TGAATTCCTT GTCAATGCTC AGGGTGAGGA 180 TGTGGTTGCT GGAATCAGAA CTCCACAAGA TCTTGATACC ATGAAGGATT GCATGCCAGA 240 GCCCTTATGC AGAACTAGTT GAGAATTGCA AAATCTTGGA AA 282 配列番号：２ 配列の長さ：１８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 GGCTCAATTG GTTGGTCCGT CGGCGCCACG CTCGGATACC CCAGGGCCCA AGGACAAGCG 60 CTGTCATCTC TGCATCGGCG ACGGAAGCTT CCAGATGACG GCGCAGGACG TGTCGACGAT 120 GCTGCGCTGC GGGCAGAAGA GCATCATCTT CCTCATCAAC AACGGCGGGT ACACCATCGA 180 GTGAGA 186 配列番号：３ 配列の長さ：２２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 GCTGCCCTGC CTACAACTTA CCCGATAAGG CTTGGACTTG CACTGAACTT CTCAGTGTTC 60 TACTATGAGA TACTGAACTC ACCAGACCGT GCTTGCAACC TTGCAAAGCA GGCGTTCGAC 120 GATGCTATTG CTGAACTGGA CACTCTTGGC GAGGAGTCTT ACAAGGACAG CACCTTGATC 180 ACGAACTTCT TCGTGACATC TGACTCTCTG GACTCTGACA TCG 223 配列番号：４ 配列の長さ：３５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 AAGAAAAAGA AGAAGATCAA GGAAGTCTCT CACGAGTGGA ACTGATGAAC AAGCAGAAAC 60 CCTTTGGTTG AGGAAGCCAG AGGAGATCAC CAAGGAAGAG TACGCTGCTT TCTACAAGAG 120 CTTGACAAAC GACTGGGAGG AACATCTGGC TGTCAAGCAC TTCTCTGTGG AGGGTCAGCT 180 TGAATTCAAG GCCATCCTGT TTGTACCAAA GAGAGCGCCC ATTTGACCTC TTTGACACCA 240 GGAAGAAGCA AAACAACATC AAGCTGTACG ACGCCGGGTG TTTATCATGG ACAACTGTGA 320 GGAGTTGATC CCAGAGTGGC TCAGCTTTGT CAAGGGCATT GTTGATTCTG AAGACC 356
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 AAAGAAGTAC AGAAGCATTA ACCAGATCAC TGGGTTAAAG GGTACTGCTG TGAATGTTCA 60 GTGCATGGTC TTTGGCAACA TGGGTGACAC TTCAGGCACT GGTGTTCTCT TTACTAGGAA 120 CCCTAGTACT GGAGAGAGAA AACTTTATGG TGAATTCCTT GTCAATGCTC AGGGTGAGGA 180 TGTGGTTGCT GGAATCAGAA CTCCACAAGA TCTTGATACC ATGAAGGATT GCATGCCAGA 240 GCCCTTATGC AGAACTAGTT GAGAATTGCA AAATCTTGGA AA 282 配列番号：２ 配列の長さ：１８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 GGCTCAATTG GTTGGTCCGT CGGCGCCACG CTCGGATACC CCAGGGCCCA AGGACAAGCG 60 CTGTCATCTC TGCATCGGCG ACGGAAGCTT CCAGATGACG GCGCAGGACG TGTCGACGAT 120 GCTGCGCTGC GGGCAGAAGA GCATCATCTT CCTCATCAAC AACGGCGGGT ACACCATCGA 180 GTGAGA 186 配列番号：３ 配列の長さ：２２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 GCTGCCCTGC CTACAACTTA CCCGATAAGG CTTGGACTTG CACTGAACTT CTCAGTGTTC 60 TACTATGAGA TACTGAACTC ACCAGACCGT GCTTGCAACC TTGCAAAGCA GGCGTTCGAC 120 GATGCTATTG CTGAACTGGA CACTCTTGGC GAGGAGTCTT ACAAGGACAG CACCTTGATC 180 ACGAACTTCT TCGTGACATC TGACTCTCTG GACTCTGACA TCG 223 配列番号：４ 配列の長さ：３５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 AAGAAAAAGA AGAAGATCAA GGAAGTCTCT CACGAGTGGA ACTGATGAAC AAGCAGAAAC 60 CCTTTGGTTG AGGAAGCCAG AGGAGATCAC CAAGGAAGAG TACGCTGCTT TCTACAAGAG 120 CTTGACAAAC GACTGGGAGG AACATCTGGC TGTCAAGCAC TTCTCTGTGG AGGGTCAGCT 180 TGAATTCAAG GCCATCCTGT TTGTACCAAA GAGAGCGCCC ATTTGACCTC TTTGACACCA 240 GGAAGAAGCA AAACAACATC AAGCTGTACG ACGCCGGGTG TTTATCATGG ACAACTGTGA 320 GGAGTTGATC CCAGAGTGGC TCAGCTTTGT CAAGGGCATT GTTGATTCTG AAGACC 356
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子の検索方法及び
その装置に関し、詳しくは、短期間に多数の遺伝子を同
定し、あるいは遺伝子の機能を推定する方法及びその装
置を提供するものである。
その装置に関し、詳しくは、短期間に多数の遺伝子を同
定し、あるいは遺伝子の機能を推定する方法及びその装
置を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、遺伝子を単離する方法として、遺
伝子の発現産物であるタンパクのアミノ酸配列からその
遺伝子の塩基配列を推定し、その配列をもとに作製した
オリゴヌクレオチドプローブを使用して、あるいは、す
でに知られている他の生物における同機能の遺伝子の配
列をプローブとして、遺伝子ライブラリーの中から目的
の遺伝子のクローンをハイブリダイゼーションにより選
択する方法などが用いられている。
伝子の発現産物であるタンパクのアミノ酸配列からその
遺伝子の塩基配列を推定し、その配列をもとに作製した
オリゴヌクレオチドプローブを使用して、あるいは、す
でに知られている他の生物における同機能の遺伝子の配
列をプローブとして、遺伝子ライブラリーの中から目的
の遺伝子のクローンをハイブリダイゼーションにより選
択する方法などが用いられている。
【０００３】これらの方法は、特定の遺伝子を単離する
のには優れているが、１つの遺伝子を単離するのに非常
に多くの時間と労力を必要とする。通常プローブとして
用いられるオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼ
ーションでは、非特異的なシグナルを生ずることが少な
くないし、また、他種生物の遺伝子配列をプローブとす
る場合には、必ずしもハイブリダイゼーションに必要な
程度の相同性があるとは限らないからである。
のには優れているが、１つの遺伝子を単離するのに非常
に多くの時間と労力を必要とする。通常プローブとして
用いられるオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼ
ーションでは、非特異的なシグナルを生ずることが少な
くないし、また、他種生物の遺伝子配列をプローブとす
る場合には、必ずしもハイブリダイゼーションに必要な
程度の相同性があるとは限らないからである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】したがって、多くの遺
伝子を単離することは非常に困難であるので、少ない労
力で迅速に多数の遺伝子を検索することができる方法が
望まれている。
伝子を単離することは非常に困難であるので、少ない労
力で迅速に多数の遺伝子を検索することができる方法が
望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、ｃＤＮＡクロ
ーン等、遺伝子の一部の配列を遺伝子データベースと比
較することにより、迅速に遺伝子を同定することがで
き、従来単離されていないような遺伝子が多数単離でき
ることを見出し、本発明を完成させた。
を解決するために鋭意研究を行った結果、ｃＤＮＡクロ
ーン等、遺伝子の一部の配列を遺伝子データベースと比
較することにより、迅速に遺伝子を同定することがで
き、従来単離されていないような遺伝子が多数単離でき
ることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】すなわち本発明は、遺伝子の検索を行おう
とする生物の複数の任意の遺伝子の塩基配列と、多数種
の生物の遺伝子の塩基配列を含む遺伝子データベースに
保存されている遺伝子のうち、前記遺伝子の検索を行お
うとする生物と同種の生物の遺伝子の塩基配列に加え
て、異種の生物の遺伝子の塩基配列とのホモロジー検索
を行うことを特徴とする遺伝子の検索方法及び遺伝子の
検索を行う装置に関するものである。
とする生物の複数の任意の遺伝子の塩基配列と、多数種
の生物の遺伝子の塩基配列を含む遺伝子データベースに
保存されている遺伝子のうち、前記遺伝子の検索を行お
うとする生物と同種の生物の遺伝子の塩基配列に加え
て、異種の生物の遺伝子の塩基配列とのホモロジー検索
を行うことを特徴とする遺伝子の検索方法及び遺伝子の
検索を行う装置に関するものである。
【０００７】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
は、上記工程に加えて、任意の工程として、遺伝子ライ
ブラリーの作製、遺伝子の塩基配列の決定、データベー
スとのホモロジーを有する遺伝子の全長を持つクローン
の単離等を含んでもよい。
は、上記工程に加えて、任意の工程として、遺伝子ライ
ブラリーの作製、遺伝子の塩基配列の決定、データベー
スとのホモロジーを有する遺伝子の全長を持つクローン
の単離等を含んでもよい。
【０００８】以下に各工程を説明する。
【０００９】＜１＞遺伝子ライブラリーの作製 本発明の実施には、遺伝子検索を行おうとする生物の遺
伝子の塩基配列を知ることが前提となる。そのために
は、その生物で既知の配列を使用することも可能である
が、未知の遺伝子を多数同定するためには、遺伝子ライ
ブラリーを作製し、複数の遺伝子を選択しこれらの配列
を決定することが好ましい。
伝子の塩基配列を知ることが前提となる。そのために
は、その生物で既知の配列を使用することも可能である
が、未知の遺伝子を多数同定するためには、遺伝子ライ
ブラリーを作製し、複数の遺伝子を選択しこれらの配列
を決定することが好ましい。
【００１０】遺伝子ライブラリーは、染色体ＤＮＡから
作製することもできるが、構造遺伝子を効率よくクロー
ニングするにはｃＤＮＡライブラリーを作製することが
好ましい。ｃＤＮＡライブラリーは、目的とする生物の
細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮ
Ａを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化したも
のをベクターに挿入し、大腸菌等に形質転換することに
より作製することができる。これらの操作方法は、Mole
cular Cloning (Maniatisら、Cold Spring Harbour Lab
oratory）に記載されている。また、ｃＤＮＡクローニ
ングキットが市販されているのでこれらを使用してもよ
い。
作製することもできるが、構造遺伝子を効率よくクロー
ニングするにはｃＤＮＡライブラリーを作製することが
好ましい。ｃＤＮＡライブラリーは、目的とする生物の
細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮ
Ａを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化したも
のをベクターに挿入し、大腸菌等に形質転換することに
より作製することができる。これらの操作方法は、Mole
cular Cloning (Maniatisら、Cold Spring Harbour Lab
oratory）に記載されている。また、ｃＤＮＡクローニ
ングキットが市販されているのでこれらを使用してもよ
い。
【００１１】ライブラリーの作製に用いるベクターは、
多数種市販されており、いずれも使用することが可能で
あるが、塩基配列を決定するためには、ｃＤＮＡフラグ
メントが挿入されたまま配列決定できるベクターが好ま
しい。これはベクターのクローニングサイトのすぐ外側
にプライマー結合配列を有するベクターを使用すればよ
い。このようなベクターとして、例えばｐＵＣシリーズ
等が多種市販されている。
多数種市販されており、いずれも使用することが可能で
あるが、塩基配列を決定するためには、ｃＤＮＡフラグ
メントが挿入されたまま配列決定できるベクターが好ま
しい。これはベクターのクローニングサイトのすぐ外側
にプライマー結合配列を有するベクターを使用すればよ
い。このようなベクターとして、例えばｐＵＣシリーズ
等が多種市販されている。
【００１２】一方、データベースとのホモロジー検索に
より機能の推定された遺伝子の全長を取得するために
は、長いＤＮＡフラグメントを挿入することができるλ
等のファージベクターを用いてライブラリーを作製して
おくのが好ましい。
より機能の推定された遺伝子の全長を取得するために
は、長いＤＮＡフラグメントを挿入することができるλ
等のファージベクターを用いてライブラリーを作製して
おくのが好ましい。
【００１３】本発明において、適用することができる生
物は特に限定されないが、従来、単離同定された遺伝子
の少ない植物に特に有用である。植物のｃＤＮＡライブ
ラリーを作製する場合にはカルスを材料とするのが好ま
しい。カルスの培養条件により、遺伝子の発現すなわちｍ
ＲＮＡを誘導できる場合には、特に好適である。
物は特に限定されないが、従来、単離同定された遺伝子
の少ない植物に特に有用である。植物のｃＤＮＡライブ
ラリーを作製する場合にはカルスを材料とするのが好ま
しい。カルスの培養条件により、遺伝子の発現すなわちｍ
ＲＮＡを誘導できる場合には、特に好適である。
【００１４】カルスの誘導は、一般的には植物体を滅菌
し、種子、茎、葉等の組織を無菌的に寒天培地に植え込
むことにより行われる（J.H.Doddsら, "Experiments in
Plant Tissue Culture" Cambridge Univ. Press 1982
等)。通常、培地にオーキシンあるいはサイトカイニン
等の植物ホルモンを添加することにより、誘導効率を高
めることができる。誘導されたカルスは液体培地中で培
養することができる。
し、種子、茎、葉等の組織を無菌的に寒天培地に植え込
むことにより行われる（J.H.Doddsら, "Experiments in
Plant Tissue Culture" Cambridge Univ. Press 1982
等)。通常、培地にオーキシンあるいはサイトカイニン
等の植物ホルモンを添加することにより、誘導効率を高
めることができる。誘導されたカルスは液体培地中で培
養することができる。
【００１５】＜２＞遺伝子の塩基配列の決定 クローン化されたｃＤＮＡ等の遺伝子の塩基配列の決定
は、Maxam-Gilbert法あるいは、ダイデオキシ法により
行う。これらの内では、ダイデオキシ法が簡便であり好
ましい。ダイデオキシ法による塩基配列の決定は、市販
されているキットを用いて行うことができ、さらに配列
決定を自動的に行うオートシークエンサーが数社から市
販されているので、これらを使用することにより短時間
で塩基配列を決定することができる。
は、Maxam-Gilbert法あるいは、ダイデオキシ法により
行う。これらの内では、ダイデオキシ法が簡便であり好
ましい。ダイデオキシ法による塩基配列の決定は、市販
されているキットを用いて行うことができ、さらに配列
決定を自動的に行うオートシークエンサーが数社から市
販されているので、これらを使用することにより短時間
で塩基配列を決定することができる。
【００１６】＜３＞遺伝子データベースとのホモロジー
検索 上述のようにして得られた塩基配列を、データベースに
保存されている既知の遺伝子の配列と比較し、ホモロジ
ー検索を行う。
検索 上述のようにして得られた塩基配列を、データベースに
保存されている既知の遺伝子の配列と比較し、ホモロジ
ー検索を行う。
【００１７】現在まで報告された遺伝子の塩基配列は、
生物の種を問わず欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）、
米国ロスアラモス国立研究所においてコンピューター入
力されており、その遺伝子の数は、約４３０００に及ぶ
（１９９１年１月現在）。これらは、検索を有効に行え
るようにそれぞれ一定の書式で管理され、ＥＭＢＬ、Ｇ
ｅｎＢａｎｋとして公表されており、フロッピーディス
ク等を媒体として入手することができる。
生物の種を問わず欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）、
米国ロスアラモス国立研究所においてコンピューター入
力されており、その遺伝子の数は、約４３０００に及ぶ
（１９９１年１月現在）。これらは、検索を有効に行え
るようにそれぞれ一定の書式で管理され、ＥＭＢＬ、Ｇ
ｅｎＢａｎｋとして公表されており、フロッピーディス
ク等を媒体として入手することができる。
【００１８】ホモロジー検索に際しては、データベース
に保存されている遺伝子のうち、検索を行おうとする生
物と同種の生物の遺伝子のみでなく、異種の生物の遺伝
子の配列も検索の対象とすることにより、その検索を行
おうとする生物で知られていない遺伝子、あるいは存在
は知られていても単離されていない遺伝子を取得できる
可能性がある。
に保存されている遺伝子のうち、検索を行おうとする生
物と同種の生物の遺伝子のみでなく、異種の生物の遺伝
子の配列も検索の対象とすることにより、その検索を行
おうとする生物で知られていない遺伝子、あるいは存在
は知られていても単離されていない遺伝子を取得できる
可能性がある。
【００１９】ホモロジー検索は、決定された塩基配列を
データベース上の配列と比較することにより行われる。
検索はコンピューターを使用し、例えば、試料の塩基配
列と遺伝子データベースに保存されている遺伝子の塩基
配列から、予め設定された塩基長の任意の領域を取り出
し、これを比較し、同一の配列である場合のみポイント
を加算し、すべての組合せについて比較した後にポイン
トを合計したスコアが一定以上の値であればホモロジー
があるとする。通常は、スコアにして１６０ポイント以
上、あるいは３０塩基以上にわたって相同な配列がある
場合をホモロジーがあるとする。いずれかの配列にヌク
レオチドの挿入を考慮した場合にスコアが高くなるとき
は、最良のスコアとなるようにするのが好ましい。
データベース上の配列と比較することにより行われる。
検索はコンピューターを使用し、例えば、試料の塩基配
列と遺伝子データベースに保存されている遺伝子の塩基
配列から、予め設定された塩基長の任意の領域を取り出
し、これを比較し、同一の配列である場合のみポイント
を加算し、すべての組合せについて比較した後にポイン
トを合計したスコアが一定以上の値であればホモロジー
があるとする。通常は、スコアにして１６０ポイント以
上、あるいは３０塩基以上にわたって相同な配列がある
場合をホモロジーがあるとする。いずれかの配列にヌク
レオチドの挿入を考慮した場合にスコアが高くなるとき
は、最良のスコアとなるようにするのが好ましい。
【００２０】比較すべき各々の配列は、必ずしも全長で
ある必要はなく、特定の領域を指定して検索を行っても
よい。この領域の長さが短すぎる場合には、遺伝子全体
ではホモロジーが少ないものもホモロジーがあると判断
される場合があるので、１００塩基長以上の長さにわた
って検索することが好ましい。
ある必要はなく、特定の領域を指定して検索を行っても
よい。この領域の長さが短すぎる場合には、遺伝子全体
ではホモロジーが少ないものもホモロジーがあると判断
される場合があるので、１００塩基長以上の長さにわた
って検索することが好ましい。
【００２１】ホモロジー検索には、市販のホモロジー検
索プログラムを使用することができる。このようなプロ
グラムとしては、例えばＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＤＣソフト
ウェア開発（株））、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア
エンジニアリング）等がある。
索プログラムを使用することができる。このようなプロ
グラムとしては、例えばＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＤＣソフト
ウェア開発（株））、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア
エンジニアリング）等がある。
【００２２】検索を迅速に行うために、遺伝子の検索を
行おうとする生物の複数の任意の遺伝子の塩基配列を入
力する入力手段と、この入力された配列を記憶する記憶
手段と、この記憶装置から塩基配列を取り出し、多数種
の生物の遺伝子の塩基配列が保存されている遺伝子デー
タベースから取り出した塩基配列とのホモロジー検索を
行う検索手段と、ホモロジー検索の結果を出力する出力
手段とを備えることにより、遺伝子の検索装置を作製す
ることができる。かかる装置の構成の１例を図１に示
す。
行おうとする生物の複数の任意の遺伝子の塩基配列を入
力する入力手段と、この入力された配列を記憶する記憶
手段と、この記憶装置から塩基配列を取り出し、多数種
の生物の遺伝子の塩基配列が保存されている遺伝子デー
タベースから取り出した塩基配列とのホモロジー検索を
行う検索手段と、ホモロジー検索の結果を出力する出力
手段とを備えることにより、遺伝子の検索装置を作製す
ることができる。かかる装置の構成の１例を図１に示
す。
【００２３】入力手段としては例えばキーボードを、出
力手段としてはディスプレイあるいはプリンタを使用す
ることができる。塩基配列の入力は、オートシーケンサ
ーからの出力を直接記憶手段に入力させることにより行
ってもよい。検索手段はコンピューター手段に上記市販
のプログラムを実行させることにより実現することがで
きる。
力手段としてはディスプレイあるいはプリンタを使用す
ることができる。塩基配列の入力は、オートシーケンサ
ーからの出力を直接記憶手段に入力させることにより行
ってもよい。検索手段はコンピューター手段に上記市販
のプログラムを実行させることにより実現することがで
きる。
【００２４】＜４＞ホモロジーを有する遺伝子の単離 ホモロジー検索に使用する配列を決定するためのクロー
ン、特にベクターとしてプラスミドを使用したものは、
遺伝子の全長を含んでいない場合が多い。したがって、
遺伝子全長を得ることが必要な場合には、前期クローン
をプロープとして、ラムダベクター等を用いたライブラ
リーからスクリーニングするのが好ましい。 このスク
リーニングは、プラークハイブリダイゼーションにより
行うことができる。
ン、特にベクターとしてプラスミドを使用したものは、
遺伝子の全長を含んでいない場合が多い。したがって、
遺伝子全長を得ることが必要な場合には、前期クローン
をプロープとして、ラムダベクター等を用いたライブラ
リーからスクリーニングするのが好ましい。 このスク
リーニングは、プラークハイブリダイゼーションにより
行うことができる。
【００２５】プラークハイブリダイゼーションの方法
は、Molecular Cloning 第２版(Maniatisら、Cold Sprin
g Harbor Laboratory) 12.30〜40等に記載されている。
すなわち、寒天重層培地に形成させたファージのプラー
クをナイロンメンブレン等に転写し、タンパクを溶解
し、ＤＮＡをメンブレンに固定する。その後、放射性物
質等で標識したプローブを溶液中でハイブリダイズさ
せ、洗浄後、メンブレンに残留する放射活性等によリ、
プローブがハイブリダイズしたプラークの位置を知るこ
とができる。
は、Molecular Cloning 第２版(Maniatisら、Cold Sprin
g Harbor Laboratory) 12.30〜40等に記載されている。
すなわち、寒天重層培地に形成させたファージのプラー
クをナイロンメンブレン等に転写し、タンパクを溶解
し、ＤＮＡをメンブレンに固定する。その後、放射性物
質等で標識したプローブを溶液中でハイブリダイズさ
せ、洗浄後、メンブレンに残留する放射活性等によリ、
プローブがハイブリダイズしたプラークの位置を知るこ
とができる。
【００２６】位置が特定されたプラークからファージを
取り、ＤＮＡを精製し、必要に応じてプラスミドベクタ
ー等にサブクローニングすることにより、遺伝子を単離
することができる。
取り、ＤＮＡを精製し、必要に応じてプラスミドベクタ
ー等にサブクローニングすることにより、遺伝子を単離
することができる。
【００２７】クローニングされたＤＮＡフラグメントの
長さは、アガロースゲル電気泳動、あるいはＰＣＲ（ポ
リメラーゼ・チェイン・リアクション）法により確認す
ることができる。
長さは、アガロースゲル電気泳動、あるいはＰＣＲ（ポ
リメラーゼ・チェイン・リアクション）法により確認す
ることができる。
【００２８】
【実施例】本発明を、植物カルスを材料とした実施例に
より更に詳細に説明する。イネ品種ヤマホウシのカルス
を作製し、このカルスからｃＤＮＡライブラリーを作製
し、任意に選択したｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を
決定し、遺伝子データベースとのホモロジー検索を行っ
た。以下に、工程ごとに詳説する。
より更に詳細に説明する。イネ品種ヤマホウシのカルス
を作製し、このカルスからｃＤＮＡライブラリーを作製
し、任意に選択したｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を
決定し、遺伝子データベースとのホモロジー検索を行っ
た。以下に、工程ごとに詳説する。
【００２９】＜１＞カルスの作製 植物としてイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．
Ｙａｍａｈｏｕｓｈｉ）を使用し、カルスを作製した。
Ｙａｍａｈｏｕｓｈｉ）を使用し、カルスを作製した。
【００３０】イネの種子を１％の次亜塩素酸ナトリウム
溶液中に３０分放置した後、表１に示すＮ６Ｄ寒天培地
上に置き、カルスを誘導させた。このカルスを切取り、
表２に示すＡ．Ａ液体培地に移し、振盪培養を行い増殖
させた。
溶液中に３０分放置した後、表１に示すＮ６Ｄ寒天培地
上に置き、カルスを誘導させた。このカルスを切取り、
表２に示すＡ．Ａ液体培地に移し、振盪培養を行い増殖
させた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】＜２＞ＲＮＡの抽出 ガーゼを用いて上記カルス培養液を濾過し、２０ｇのカ
ルスを得た。このカルスにチオシアン酸グアニジン溶液
（４Ｍ チオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ２−メル
カプトエタノール）を加え１００ｍｌとし、超高速ホモ
ジナイザーを用いて１分間破砕した。
ルスを得た。このカルスにチオシアン酸グアニジン溶液
（４Ｍ チオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ２−メル
カプトエタノール）を加え１００ｍｌとし、超高速ホモ
ジナイザーを用いて１分間破砕した。
【００３４】この破砕液をダウンズ型ホモジナイザーに
移し、５〜６回上下させることによりカルスを完全に破
砕した。この破砕液に、Ｓａｒｃｏｓｙｌ液を終濃度
０．５％となるように加え、１２０００ｒｐｍで１５分
間遠心分離した。
移し、５〜６回上下させることによりカルスを完全に破
砕した。この破砕液に、Ｓａｒｃｏｓｙｌ液を終濃度
０．５％となるように加え、１２０００ｒｐｍで１５分
間遠心分離した。
【００３５】遠心管に分注した５．７Ｍ ＣｓＣｌ、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に、上記遠心分離した上清を等容
重層し、Ｈｉｍａｃ ５５Ｐ−７２（日立製作所製）超
高速遠心分離機を用いて、２２０００ｒｐｍで３６時
間、２０℃で遠心分離を行った。
０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に、上記遠心分離した上清を等容
重層し、Ｈｉｍａｃ ５５Ｐ−７２（日立製作所製）超
高速遠心分離機を用いて、２２０００ｒｐｍで３６時
間、２０℃で遠心分離を行った。
【００３６】２層に分かれた液層を順次吸い出し、沈澱
にチオシアン酸グアニジン溶液が接触しないようにし
て、この沈澱を０．１％ ＳＤＳを含む１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍｌに溶
解した。この溶液に等容のフェノール・クロロホルム
（フェノール：クロロホルム＝１：１）を加え、１分間
攪拌し、タンパクを変性させた。
にチオシアン酸グアニジン溶液が接触しないようにし
て、この沈澱を０．１％ ＳＤＳを含む１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍｌに溶
解した。この溶液に等容のフェノール・クロロホルム
（フェノール：クロロホルム＝１：１）を加え、１分間
攪拌し、タンパクを変性させた。
【００３７】これを遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０
分）し、水層を回収し、１／１０容の３Ｍ 酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ８．０）、２倍容のエタノールを加え、粗Ｒ
ＮＡ懸濁液として−８０℃で保存した。
分）し、水層を回収し、１／１０容の３Ｍ 酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ８．０）、２倍容のエタノールを加え、粗Ｒ
ＮＡ懸濁液として−８０℃で保存した。
【００３８】次に、この粗ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）+
ＲＮＡをｏｌｉｇｏ（ｄＴ）固定化ラテックス（ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０：第一化学薬品から購入）を用い
て精製した。
ＲＮＡをｏｌｉｇｏ（ｄＴ）固定化ラテックス（ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０：第一化学薬品から購入）を用い
て精製した。
【００３９】２００μｇのＲＮＡを４００μｌの溶出バ
ッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７５）、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）に溶解し、６５℃
で５分間処理した後、氷中で急冷した。このＲＮＡ溶液
に５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌと１００μｌのｏｌｉｇｏ
ｔｅｘ−３０ｄＴを加え混合した。
ッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７５）、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）に溶解し、６５℃
で５分間処理した後、氷中で急冷した。このＲＮＡ溶液
に５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌと１００μｌのｏｌｉｇｏ
ｔｅｘ−３０ｄＴを加え混合した。
【００４０】３７℃に５分間置いた後、１５０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、上清を除き、沈澱に５００μ
ｌの溶出バッファーと５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加
え、穏やかに懸濁し、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡをｏｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０から容出させた。これを再び遠心
分離し、上清に等容のフェノール・クロロホルムを加
え、静かに攪拌した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分
離し、水層を回収した。
ｍで１０分間遠心分離し、上清を除き、沈澱に５００μ
ｌの溶出バッファーと５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加
え、穏やかに懸濁し、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡをｏｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０から容出させた。これを再び遠心
分離し、上清に等容のフェノール・クロロホルムを加
え、静かに攪拌した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分
離し、水層を回収した。
【００４１】このフェノール・クロロホルム処理を再度
行い、水層に１／１０容の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．６）と２倍容のエタノールを加え、−８０℃で３０
分放置した後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、沈澱を１２５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
６）に溶解させた。
行い、水層に１／１０容の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．６）と２倍容のエタノールを加え、−８０℃で３０
分放置した後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、沈澱を１２５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
６）に溶解させた。
【００４２】この溶液に２５０μｌのエタノールを加
え、−１８０℃で３０分間放置した後、１５０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、沈澱を回収した。この沈澱を
７０％エタノールで洗浄し、エタノールを除去した後、
１０μｌの精製水に溶解し、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ画
分として保存した。
え、−１８０℃で３０分間放置した後、１５０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、沈澱を回収した。この沈澱を
７０％エタノールで洗浄し、エタノールを除去した後、
１０μｌの精製水に溶解し、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ画
分として保存した。
【００４３】＜３＞ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを材料としてｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。ｃＤＮＡの合成は、アマシャム社
製のｃＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ合成システム・プラ
ス）を用いて、キットに添付されているマニュアル通り
に行った。
ブラリーを作製した。ｃＤＮＡの合成は、アマシャム社
製のｃＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ合成システム・プラ
ス）を用いて、キットに添付されているマニュアル通り
に行った。
【００４４】ｃＤＮＡの塩基配列決定用のライブラリー
として、プラスミドｐＵＣ１１８をクローニングベクタ
ーに用いたライブラリーを作製した。このプラスミドの
マルチクローニングサイトのEcoRI部位に、EcoRIアダプ
ターを末端に連結した上記ｃＤＮＡフラグメントをＴ４
リガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
した。
として、プラスミドｐＵＣ１１８をクローニングベクタ
ーに用いたライブラリーを作製した。このプラスミドの
マルチクローニングサイトのEcoRI部位に、EcoRIアダプ
ターを末端に連結した上記ｃＤＮＡフラグメントをＴ４
リガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
した。
【００４５】一方、遺伝子データベースとのホモロジー
の認められたｃＤＮＡの全長を再クローンするために、
λファージをベクターとするライブラリーを、アマシャ
ム社製のλｇｔ１０アダプター法によるクローニングキ
ット（ｃＤＮＡクローニングシステム、クローニングサ
イト：EcoRI）を用いて作製した。
の認められたｃＤＮＡの全長を再クローンするために、
λファージをベクターとするライブラリーを、アマシャ
ム社製のλｇｔ１０アダプター法によるクローニングキ
ット（ｃＤＮＡクローニングシステム、クローニングサ
イト：EcoRI）を用いて作製した。
【００４６】＜４＞塩基配列の決定 上記で得られたｐＵＣ１１８によるｃＤＮＡライブラリ
ーからクローンを任意に選択し、これらの株からプラス
ミドをボイリング法（Maniatisら、Molecularcloning V
ol.2 1.29〜30）あるいはアルカリＳＤＳ法により抽出
し、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により精製した。
ｃＤＮＡフラグメントの確認は、アガロースゲル電気泳
動により行った。
ーからクローンを任意に選択し、これらの株からプラス
ミドをボイリング法（Maniatisら、Molecularcloning V
ol.2 1.29〜30）あるいはアルカリＳＤＳ法により抽出
し、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により精製した。
ｃＤＮＡフラグメントの確認は、アガロースゲル電気泳
動により行った。
【００４７】得られたプラスミドのうち約５００個につ
いて、ｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を、ダイデオキ
シ法によりApplied Biosistems社製のオートシークエン
サーを用いて決定した。
いて、ｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を、ダイデオキ
シ法によりApplied Biosistems社製のオートシークエン
サーを用いて決定した。
【００４８】＜５＞ｃＤＮＡ配列と遺伝子データバンク
とのホモロジー検索 上記のようにして塩基配列を決定したｃＤＮＡについて
遺伝子データベースを用いてホモロジー検索を行った。
ホモロジー検索は、データベースとしてＧｅｎｅＢａｎ
ｋを、ホモロジー検索のプログラムとしてＤＮＡＳＩＳ
（日立ソフトウエアエンジニアリング）を用いて行っ
た。
とのホモロジー検索 上記のようにして塩基配列を決定したｃＤＮＡについて
遺伝子データベースを用いてホモロジー検索を行った。
ホモロジー検索は、データベースとしてＧｅｎｅＢａｎ
ｋを、ホモロジー検索のプログラムとしてＤＮＡＳＩＳ
（日立ソフトウエアエンジニアリング）を用いて行っ
た。
【００４９】検索を行った約５００個のｃＤＮＡ配列の
うち、５３個が何らかの遺伝子と高いホモロジーを有し
ていた。そのようなｃＤＮＡ配列を配列表の配列番号１
〜４に例示する。
うち、５３個が何らかの遺伝子と高いホモロジーを有し
ていた。そのようなｃＤＮＡ配列を配列表の配列番号１
〜４に例示する。
【００５０】これらの内、Ｃ２７は、トウモロコシのpy
ruvate orthophoshate dikinase遺伝子と、Ｓ７７は、Z
ymomonas mobilisのpyruvate decarboxylase 遺伝子
と、Ｓ９４は、ウシのbrain-specific 14-3-3 protein
tau chain mRNAと、ＡＫ１０８は、chickin 90kDa heat
shock protein mRNAとホモロジーを有していた。
ruvate orthophoshate dikinase遺伝子と、Ｓ７７は、Z
ymomonas mobilisのpyruvate decarboxylase 遺伝子
と、Ｓ９４は、ウシのbrain-specific 14-3-3 protein
tau chain mRNAと、ＡＫ１０８は、chickin 90kDa heat
shock protein mRNAとホモロジーを有していた。
【００５１】トウモロコシのpyruvate orthophoshate d
ikinase遺伝子以外は、いずれも植物では単離されていな
い遺伝子であり、本発明により初めて植物にこれらと同
機能の遺伝子が存在することが示唆された。
ikinase遺伝子以外は、いずれも植物では単離されていな
い遺伝子であり、本発明により初めて植物にこれらと同
機能の遺伝子が存在することが示唆された。
【００５２】上記遺伝子の配列のうち、ｃＤＮＡとホモ
ロジーがある部分の配列を、相当する部分のｃＤＮＡ配
列とともに図２〜５に示す。上段はｃＤＮＡの配列を、
下段はホモロジーのある遺伝子の配列を示す。縦線は両
者で一致する塩基を、配列の上下の数字は５’末端から
の塩基数を示す。
ロジーがある部分の配列を、相当する部分のｃＤＮＡ配
列とともに図２〜５に示す。上段はｃＤＮＡの配列を、
下段はホモロジーのある遺伝子の配列を示す。縦線は両
者で一致する塩基を、配列の上下の数字は５’末端から
の塩基数を示す。
【００５３】また、これらの配列の相同性を、ハー・プ
ロットで示したのが図６〜９である。すなわち、ｃＤＮ
Ａ配列を縦軸、上記遺伝子のホモロジーのある部分の配
列を横軸にとり、それぞれの軸上の塩基が同一である座
標が１２以上連続する場合にこれらの座標を点で示した
ものである。したがって、点が直線状に並んでいればそ
の部分がホモロジーを有することを示す。これらの結果
からも、上記配列は高いホモロジーを有していることが
わかる。
ロットで示したのが図６〜９である。すなわち、ｃＤＮ
Ａ配列を縦軸、上記遺伝子のホモロジーのある部分の配
列を横軸にとり、それぞれの軸上の塩基が同一である座
標が１２以上連続する場合にこれらの座標を点で示した
ものである。したがって、点が直線状に並んでいればそ
の部分がホモロジーを有することを示す。これらの結果
からも、上記配列は高いホモロジーを有していることが
わかる。
【００５４】例示したもの以外の遺伝子で、ホモロジー
検索にかかったものの例を下記に示す。植物で知られて
いるものとしては、Pyruvate orthophosphate dikinas
e、Ribosomal protein、Ubiquitin、rDNA repeating un
it、Cytochrome P-450 NADPH-P450 reductase、ACP (Ac
yl carrier protein)、α-tubulin、Alcohol dehydroge
nase、Malic enzyme、Phosphoglycerate kinase、α-am
ylase、Elongation factor 1α、Sucrose synthase、Gl
yceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase、S-adenosyl
metionine synthetase、Calmodulinをコードする遺伝子
と高いホモロジーを有するｃＤＮＡが検出された。
検索にかかったものの例を下記に示す。植物で知られて
いるものとしては、Pyruvate orthophosphate dikinas
e、Ribosomal protein、Ubiquitin、rDNA repeating un
it、Cytochrome P-450 NADPH-P450 reductase、ACP (Ac
yl carrier protein)、α-tubulin、Alcohol dehydroge
nase、Malic enzyme、Phosphoglycerate kinase、α-am
ylase、Elongation factor 1α、Sucrose synthase、Gl
yceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase、S-adenosyl
metionine synthetase、Calmodulinをコードする遺伝子
と高いホモロジーを有するｃＤＮＡが検出された。
【００５５】植物で知られていないものとしては、Pyru
vate decarboxylase、Brain specific protein、Heat s
hock protein (90KD)、Succinate dehydrogenase、Valy
l t-RNA synthetase、SIR3 (Silent information regul
ator)、T complex polypeptide、Adenylate kinase、In
itiation factor (eIF-4D)、Initiation factor (eIF-4
A)、Elonganation factor G (fus gene)、RNA polymera
se II(subunit)、Plasma membrane calcium ATPase、Su
rfeitlocus processed pseudogene、Signal recognitio
n particle receptor、elav protein、fsh membrane pr
oteinをコードする遺伝子と高いホモロジーを有するｃ
ＤＮＡが検出された。
vate decarboxylase、Brain specific protein、Heat s
hock protein (90KD)、Succinate dehydrogenase、Valy
l t-RNA synthetase、SIR3 (Silent information regul
ator)、T complex polypeptide、Adenylate kinase、In
itiation factor (eIF-4D)、Initiation factor (eIF-4
A)、Elonganation factor G (fus gene)、RNA polymera
se II(subunit)、Plasma membrane calcium ATPase、Su
rfeitlocus processed pseudogene、Signal recognitio
n particle receptor、elav protein、fsh membrane pr
oteinをコードする遺伝子と高いホモロジーを有するｃ
ＤＮＡが検出された。
【００５６】この結果からわかるように、本発明によ
り、植物で知られている遺伝子のみならず、従来知られ
ていない遺伝子も多数選択することができた。これらの
うちいくつかについては、ｃＤＮＡをプローブとしてλ
を用いたライブラリーからスクリーニングを行い、ｃＤ
ＮＡの全長が取得された。
り、植物で知られている遺伝子のみならず、従来知られ
ていない遺伝子も多数選択することができた。これらの
うちいくつかについては、ｃＤＮＡをプローブとしてλ
を用いたライブラリーからスクリーニングを行い、ｃＤ
ＮＡの全長が取得された。
【００５７】
【発明の効果】本発明により、通常遺伝子の単離等に必
要なタンパクの精製、アミノ酸配列の決定、合成オリゴ
ヌクレオチドプローブを用いたプラークハイブリダイゼ
ーション等を行うことなく、多数の遺伝子を同定し、あ
るいは遺伝子の機能を推定するなど遺伝子の検索を短期
間で容易に行うことができる。さらに、従来検索しよう
とする生物で知られていない遺伝子を単離することがで
きる。
要なタンパクの精製、アミノ酸配列の決定、合成オリゴ
ヌクレオチドプローブを用いたプラークハイブリダイゼ
ーション等を行うことなく、多数の遺伝子を同定し、あ
るいは遺伝子の機能を推定するなど遺伝子の検索を短期
間で容易に行うことができる。さらに、従来検索しよう
とする生物で知られていない遺伝子を単離することがで
きる。
【００５８】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２８２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 AAAGAAGTAC AGAAGCATTA ACCAGATCAC TGGGTTAAAG GGTACTGCTG TGAATGTTCA 60 GTGCATGGTC TTTGGCAACA TGGGTGACAC TTCAGGCACT GGTGTTCTCT TTACTAGGAA 120 CCCTAGTACT GGAGAGAGAA AACTTTATGG TGAATTCCTT GTCAATGCTC AGGGTGAGGA 180 TGTGGTTGCT GGAATCAGAA CTCCACAAGA TCTTGATACC ATGAAGGATT GCATGCCAGA 240 GCCCTTATGC AGAACTAGTT GAGAATTGCA AAATCTTGGA AA 282
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 AAAGAAGTAC AGAAGCATTA ACCAGATCAC TGGGTTAAAG GGTACTGCTG TGAATGTTCA 60 GTGCATGGTC TTTGGCAACA TGGGTGACAC TTCAGGCACT GGTGTTCTCT TTACTAGGAA 120 CCCTAGTACT GGAGAGAGAA AACTTTATGG TGAATTCCTT GTCAATGCTC AGGGTGAGGA 180 TGTGGTTGCT GGAATCAGAA CTCCACAAGA TCTTGATACC ATGAAGGATT GCATGCCAGA 240 GCCCTTATGC AGAACTAGTT GAGAATTGCA AAATCTTGGA AA 282
【００５９】配列番号：２ 配列の長さ：１８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 GGCTCAATTG GTTGGTCCGT CGGCGCCACG CTCGGATACC CCAGGGCCCA AGGACAAGCG 60 CTGTCATCTC TGCATCGGCG ACGGAAGCTT CCAGATGACG GCGCAGGACG TGTCGACGAT 120 GCTGCGCTGC GGGCAGAAGA GCATCATCTT CCTCATCAAC AACGGCGGGT ACACCATCGA 180 GTGAGA 186
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 GGCTCAATTG GTTGGTCCGT CGGCGCCACG CTCGGATACC CCAGGGCCCA AGGACAAGCG 60 CTGTCATCTC TGCATCGGCG ACGGAAGCTT CCAGATGACG GCGCAGGACG TGTCGACGAT 120 GCTGCGCTGC GGGCAGAAGA GCATCATCTT CCTCATCAAC AACGGCGGGT ACACCATCGA 180 GTGAGA 186
【００６０】配列番号：３ 配列の長さ：２２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 GCTGCCCTGC CTACAACTTA CCCGATAAGG CTTGGACTTG CACTGAACTT CTCAGTGTTC 60 TACTATGAGA TACTGAACTC ACCAGACCGT GCTTGCAACC TTGCAAAGCA GGCGTTCGAC 120 GATGCTATTG CTGAACTGGA CACTCTTGGC GAGGAGTCTT ACAAGGACAG CACCTTGATC 180 ACGAACTTCT TCGTGACATC TGACTCTCTG GACTCTGACA TCG 223
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 GCTGCCCTGC CTACAACTTA CCCGATAAGG CTTGGACTTG CACTGAACTT CTCAGTGTTC 60 TACTATGAGA TACTGAACTC ACCAGACCGT GCTTGCAACC TTGCAAAGCA GGCGTTCGAC 120 GATGCTATTG CTGAACTGGA CACTCTTGGC GAGGAGTCTT ACAAGGACAG CACCTTGATC 180 ACGAACTTCT TCGTGACATC TGACTCTCTG GACTCTGACA TCG 223
【００６１】配列番号：４ 配列の長さ：３５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ｙ
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 AAGAAAAAGA AGAAGATCAA GGAAGTCTCT CACGAGTGGA ACTGATGAAC AAGCAGAAAC 60 CCTTTGGTTG AGGAAGCCAG AGGAGATCAC CAAGGAAGAG TACGCTGCTT TCTACAAGAG 120 CTTGACAAAC GACTGGGAGG AACATCTGGC TGTCAAGCAC TTCTCTGTGG AGGGTCAGCT 180 TGAATTCAAG GCCATCCTGT TTGTACCAAA GAGAGCGCCC ATTTGACCTC TTTGACACCA 240 GGAAGAAGCA AAACAACATC AAGCTGTACG ACGCCGGGTG TTTATCATGG ACAACTGTGA 320 GGAGTTGATC CCAGAGTGGC TCAGCTTTGT CAAGGGCATT GTTGATTCTG AAGACC 356
ａｍａｈｏｕｓｈｉ） 配列の特徴： 配列 AAGAAAAAGA AGAAGATCAA GGAAGTCTCT CACGAGTGGA ACTGATGAAC AAGCAGAAAC 60 CCTTTGGTTG AGGAAGCCAG AGGAGATCAC CAAGGAAGAG TACGCTGCTT TCTACAAGAG 120 CTTGACAAAC GACTGGGAGG AACATCTGGC TGTCAAGCAC TTCTCTGTGG AGGGTCAGCT 180 TGAATTCAAG GCCATCCTGT TTGTACCAAA GAGAGCGCCC ATTTGACCTC TTTGACACCA 240 GGAAGAAGCA AAACAACATC AAGCTGTACG ACGCCGGGTG TTTATCATGG ACAACTGTGA 320 GGAGTTGATC CCAGAGTGGC TCAGCTTTGT CAAGGGCATT GTTGATTCTG AAGACC 356
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】 ｃＤＮＡ ＡＫ１０８と、chicken 90kDa
heat shock protein mRNAの配列を比較したハー・プロ
ット
heat shock protein mRNAの配列を比較したハー・プロ
ット
Claims (6)
- 【請求項１】 遺伝子の検索を行おうとする生物の複数
の任意の遺伝子の塩基配列と、多数種の生物の遺伝子の
塩基配列を含む遺伝子データベースに保存されている遺
伝子のうち、前記遺伝子の検索を行おうとする生物と同
種の生物の遺伝子の塩基配列に加えて、異種の生物の遺
伝子の塩基配列とのホモロジー検索を行うことを特徴と
する遺伝子の検索方法。 - 【請求項２】 前記ホモロジー検索は、前記遺伝子の検
索を行おうとする生物の複数の任意の遺伝子の塩基配列
のうちの一部と、前記遺伝子データベースから取り出し
た遺伝子の塩基配列のうち指定された領域とから、それ
ぞれ予め設定された塩基長の任意の部位の塩基配列を取
り出し、これらを比較し、同一の配列である場合のみポ
イントを加算し、すべての組合せについて比較した後に
ポイントの合計でホモロジーの高低を判断することを特
徴とする請求項１記載の遺伝子の検索方法。 - 【請求項３】 前記任意の遺伝子の塩基配列は、ｃＤＮ
Ａの塩基配列であることを特徴とする請求項１記載の遺
伝子の検索方法。 - 【請求項４】 前記ｃＤＮＡは、植物カルス由来のｍＲ
ＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーから選択された
ものであることを特徴とする請求項３記載の遺伝子の検
索方法。 - 【請求項５】 前記任意の遺伝子の塩基配列が１００塩
基長以上であることを特徴とする請求項１〜４記載の遺
伝子の検索方法。 - 【請求項６】 遺伝子の検索を行おうとする生物の複数
の任意の遺伝子の塩基配列を入力する入力手段と、この
入力された配列を記憶する記憶手段と、この記憶装置か
ら塩基配列を取り出し、多数種の生物の遺伝子の塩基配
列が保存されている遺伝子データベースから取り出した
塩基配列とのホモロジー検索を行う検索手段と、ホモロ
ジー検索の結果を出力する出力手段とを備えた遺伝子の
検索装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22618991A JPH05192194A (ja) | 1991-09-05 | 1991-09-05 | 遺伝子の検索方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22618991A JPH05192194A (ja) | 1991-09-05 | 1991-09-05 | 遺伝子の検索方法及び装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05192194A true JPH05192194A (ja) | 1993-08-03 |
Family
ID=16841283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22618991A Pending JPH05192194A (ja) | 1991-09-05 | 1991-09-05 | 遺伝子の検索方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05192194A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0877177A (ja) * | 1994-09-01 | 1996-03-22 | Fujitsu Ltd | リスト処理システムとその方法 |
| WO1999030167A1 (fr) * | 1997-12-06 | 1999-06-17 | Genox Research, Inc. | Systeme de gestion de donnees-echantillons |
| JPH11175552A (ja) * | 1997-12-12 | 1999-07-02 | Fujitsu Ltd | データベース検索装置及びデータベース検索プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体 |
| JPH11353404A (ja) * | 1998-06-11 | 1999-12-24 | Hitachi Ltd | 電子カルテシステム |
| KR20020005535A (ko) * | 2001-11-08 | 2002-01-17 | 이성섭 | BAC-end sequencing 및 STC approach genome sequencingwith shotgun 방법의 전체 염기 서열 결정 연구의 자동화및 통합화를 지원하는 소프트웨어 설계·제작 모형 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03100865A (ja) * | 1989-09-14 | 1991-04-25 | Fujitsu Ltd | 類似タンパク質検索装置 |
-
1991
- 1991-09-05 JP JP22618991A patent/JPH05192194A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03100865A (ja) * | 1989-09-14 | 1991-04-25 | Fujitsu Ltd | 類似タンパク質検索装置 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0877177A (ja) * | 1994-09-01 | 1996-03-22 | Fujitsu Ltd | リスト処理システムとその方法 |
| WO1999030167A1 (fr) * | 1997-12-06 | 1999-06-17 | Genox Research, Inc. | Systeme de gestion de donnees-echantillons |
| JPH11175552A (ja) * | 1997-12-12 | 1999-07-02 | Fujitsu Ltd | データベース検索装置及びデータベース検索プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体 |
| JPH11353404A (ja) * | 1998-06-11 | 1999-12-24 | Hitachi Ltd | 電子カルテシステム |
| KR20020005535A (ko) * | 2001-11-08 | 2002-01-17 | 이성섭 | BAC-end sequencing 및 STC approach genome sequencingwith shotgun 방법의 전체 염기 서열 결정 연구의 자동화및 통합화를 지원하는 소프트웨어 설계·제작 모형 |
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