CN102656269B - 阳离子通道活性 - Google Patents

Abstract

本发明部分基于有助于阳离子穿过生物膜流动的膜结合蛋白的功能表征。按照本发明，已经确定至少某些PQ环重复多肽有助于阳离子穿过生物膜流动。

Description

阳离子通道活性

优先权要求

本申请要求于2009年9月25日提交的澳大利亚临时专利申请2009904675的优先权，其内容通过引用结合于此。

领域

本发明涉及有助于阳离子穿过生物膜流动的膜结合蛋白的功能表征。

背景

已经在多种活系统中，例如植物、动物和酵母中，观察到电压不敏感性非选择性阳离子通道(Voltage insensitive Non-Selective Cation Channels，viNSCCs)。这种阳离子通道描述为具有相对低的区分单价阳离子(例如，Na⁺，K⁺，NH₄ ⁺，Li⁺等)的能力并且被二价阳离子如Ca²⁺和Mg²⁺抑制。

电压不敏感性不是严格使用的术语。表现出对电压有一些敏感性的蛋白仍然可以认为属于viNSCC种类内。结果，尽管这些蛋白表现出某种弱的电压依赖性，它们仍然称为viNSCCs。

通过应用电生理学，已经产生了广泛的关于viNSCC蛋白的数据。认为viNSCCs是导致生物学系统中观察到的低亲和性阳离子流动的强候选者。这些包括在暴露于盐碱土条件的植物中观察到的Na⁺快速流动和当它们的根系统暴露于生理性高NH₄ ⁺浓度时NH₄ ⁺流入植物中。

而盐度是涉及土壤中所有盐的通用术语，对大部分农作物系统最相关的盐是NaCl。盐度可以通过产生渗透环境中的变化和通过离子毒性而影响植物的适应性。Na⁺进入植物的主要流动被一种未知的蛋白促进。当根暴露于盐碱条件时，在植物的茎干中观察到Na⁺的快速累积。已经得出在茎干中的Na⁺累积和Na⁺累积毒性症状之间的相关性。

这种流动是被促进的Na⁺穿过细胞膜运动的结果。然而，已经描述了多种促进Na⁺穿过植物膜流动的蛋白，以在Na⁺累积实验中观察到的方式允许Na⁺流动的蛋白的分子性质仍然是未知的。

因此，有助于Na⁺或其他阳离子穿过生物膜流动的膜结合蛋白的鉴定和表征将是合乎需要的。

在本说明书中对任何现有技术的引用不是、也不应该视为对该现有技术在任何国家中形成公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。

概述

本发明部分基于有助于阳离子穿过生物膜流动的膜结合蛋白的功能表征。

因此，在第一方面中，本发明提供一种用于调节穿过细胞膜的阳离子流动的速率、水平或模式的方法，所述方法包括调节PQ环重复多肽在包括细胞膜的细胞中的表达。

在一些实施方案中，所述PQ环重复多肽包括YDR352w-样PQ环重复多肽。

在另一个实施方案中，所述PQ环重复多肽包括YOL092w-样PQ环重复多肽。

通常，考虑按照本发明使用的PQ环重复多肽包括限定电压不敏感性非选择性阳离子通道(viNSCC)的PQ环重复多肽。根据上述，在一些实施方案中，所述PQ环重复多肽包括单价阳离子转运蛋白。在其他实施方案中，PQ环重复多肽的单价阳离子转运可以被多价阳离子抑制。

在一些实施方案中，调节穿过细胞的细胞膜的阳离子流动的速率、水平或模式调节细胞的阳离子耐受性或敏感性。在一个具体的实施方案中，所述方法可以用来增加细胞如植物细胞对Na⁺阳离子的耐受性。

在第二方面中，本发明提供一种具有受调节的穿过细胞的膜的阳离子流动速率、水平或模式的细胞，其中所述调节是在所述细胞中PQ环重复多肽的受调节表达的结果。

在一些实施方案中，本发明的第二方面的细胞按照本发明第一方面的方法产生。

在第三方面中，本发明提供包含一种或多种本发明第二方面的细胞的多细胞结构。

在第四方面中，本发明提供包含PQL核酸的核酸构建体或载体。在一些实施方案中，所述构建体是可用于产生PQ环重复多肽在细胞中表达的表达构建体，如参考本发明第一方面所述。

在第五方面中，本发明提供包含本发明第四方面的核酸构建体或载体的遗传修饰的细胞。

此外，在第六方面中，本发明提供包含一种或多种本发明第五方面的细胞的多细胞结构。

在第七方面中，本发明提供用于确定生物体的阳离子敏感性或耐受性的方法，所述方法包括确定PQ环重复多肽在所述生物体的一个或多个细胞中的表达。在一些实施方案中，相对高水平的表达与生物体中的阳离子敏感性相关。在另一个实施方案中，相对低水平的表达与生物体中的阳离子耐受性相关。

在本说明书中，除非上下文另外需要，词语“包括(comprise)”或其变化如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应该理解为包括所述元件或整数或元件或整数的组，而不排除任意其他的元件或整数或元件或整数的组。

本文所引用的核苷酸和氨基酸序列由序列标识号(SEQ ID NO：)表示。SEQ ID NOs：数字对应序列标识<400>1(SEQ ID NO：1)，<400>2(SEQID NO：2)等。表1提供了序列标识的总结。在说明书最后提供序列表。

表1-序列标识总结

示例性实施方案描述

应该理解，下述描述仅是用于描述具体实施方案的目的，并且不意欲限制上述描述。

如上文所述，本发明部分基于有助于阳离子穿过生物膜流动的膜结合蛋白的功能表征。按照本发明，已经确定至少一些PQ环重复多肽有助于阳离子穿过生物膜流动。

因此，在第一方面中，本发明提供一种用于调节穿过细胞膜的阳离子流动的速率、水平或模式的方法，所述方法包括调节PQ环重复多肽在包括细胞膜的细胞中的表达。

“PQ环重复多肽”，如本文所涵盖的，特征在于在附加膜环(extramembrane loop)之前的脯氨酸和谷氨酰胺(PQ)残基的重复。该基序在本文中称为“PQ环基序”。通常，PQ环重复多肽包含1，2，3，4或5个PQ环重复基序。在一些实施方案中，术语PQ环重复多肽应该理解为包括包含一个或两个PQ环基序的多肽。

在一些实施方案中，所述PQ环重复多肽包含YOL092w-样PQ环重复多肽。

在一些实施方案中，YOL092w-样PQ环重复多肽可以包含一个或多个选自由下述组成的列表的氨基酸基序：

PQIXXNF(SEQ ID NO：5)

其中残基3(I)可以替换为L或V，残基4和5(X)分别可以是任意氨基酸残基或二者中的一个或两个可以不存在，并且残基7(F)可以替换为Y；

或者

GDIFNL(SEQ ID NO：6)

其中残基3(I)可以替换为V或F，残基6(L)可以替换为V；

或者

PQIXLNXKR(SEQ ID NO：7)

其中残基3(I)可以替换为A，残基4(X)可以是任意氨基酸残基或可以不存在，残基5(L)可以替换为K或M，残基7(X)可以是任意氨基酸残基或可以不存在，残基8(K)可以替换为R，并且残基9(R)可以替换为A。

在一些实施方案中，YOL092w-样PQ环重复多肽可以包含：

SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的氨基酸基序；

SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示的氨基酸基序；

SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的氨基酸基序；或

SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的氨基酸基序。

在其他实施方案中，YOL092w-样PQ环重复多肽可以包含与SEQ IDNO：8所示的YOL092w-样PQ环重复多肽共有序列至少20％同一性的氨基酸。

在另一个实施方案中，YOL092w-样PQ环重复多肽可以包含与SEQID NO：9所示的YOL092w PQ环重复多肽的氨基酸序列至少20％同一性的氨基酸序列。

本文述及“至少20％的同一性”应该理解为还包括高于至少20％的同一性水平，包括，例如，至少30％的同一性、至少40％的同一性、至少50％的同一性、至少60％的同一性、至少70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性或至少95％的同一性。

当比较氨基酸序列时，比较的序列应该在至少50个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少200个氨基酸残基、至少300个氨基酸残基的比较窗口或以SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的全长进行比较。当与参照序列(其不包含添加或缺失)比较时，比较窗口可以包括约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以进行两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的最佳序列比对可以通过计算机执行的算法进行，诸如例如通过Altschul等(Nucl.Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402，1997)公开的BLAST家族程序进行。更详细的序列分析的讨论可以在Ausubel等(“CurrentProtocols in Molecular Biology”(现代分子生物学流程)，John Wiley &Sons Inc，1994-1998，第15章，1998)Unit 19.3中找到。

术语“YOL092w-样PQ环重复多肽”还包括包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽的“功能同源物”。功能同源物包括能够调节穿过细胞膜的阳离子流动的速率、水平或模式的任意PQ环重复多肽。

尽管上述，所述功能同源物可以包括，例如，相对于包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽具有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代的多肽；包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽的突变形式或等位基因变体；包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽的直向同源物；包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽的类似物等。

YOL092w-样PQ环重复多肽的实例包括具有下述登记号的多肽：NP_014549(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YOL092w)，EDN64758(酿酒酵母YJM789)，NP_009705(酿酒酵母YBR147w)，NP_594596(Stm1粟酒裂殖酵母(Shizosacharomyces pombe))，拟南芥(Arabidopsis thaliana)At4g20100，拟南芥At4g36850，AAK76703(拟南芥)，拟南芥At2g41050，拟南芥At5g59470，拟南芥At5g40670，拟南芥At4g07390，稻(Oryzasativa)Os01g16170，稻Os07g29610，稻Os12g18110，稻Os01g0266800，XP_001753587(小立碗藓(Physcomitrella patens))，小立碗藓Pp174957，小立碗藓Pp182799，小立碗藓Pp217317和小立碗藓Pp210671。

在一些实施方案中，所述YOL092w-样PQ环重复多肽包含至少5个跨膜结构域。在一些实施方案中，所述YOL092w-样PQ环重复多肽包含至少7个跨膜结构域。在其他实施方案中，所述YOL092w-样PQ环重复多肽包含7个跨膜结构域同时具有连接跨膜结构域3和4的胞质环。

在一些实施方案中，所述PQ环重复多肽包含YDR352w-样PQ环重复多肽。

在一些实施方案中，YDR352w-样PQ环重复多肽可以包含一个或多个选自由下列各项组成的列表的氨基酸基序：

RLPQIXXN(SEQ ID NO：1)

其中残基2(L)可以替换为I，残基5(I)可以替换为V，F或L，残基6和7(X)分别可以是任意氨基酸残基或二者中的一个或两个可以不存在，并且残基8(N)可以替换为C或I；

或者

YXLS(SEQ ID NO：2)

其中残基1(Y)可以替换为R，残基2(X)可以是任意氨基酸残基或可以不存在，残基3(L)可以替换为F或I并且残基4(S)可以替换为T。

在一些实施方案中，YDR352w-样PQ环重复多肽可以包含SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸基序中的任一个。

在其他实施方案中，YDR352w-样PQ环重复多肽可以包含与SEQ IDNO：3所示的YDR352w-样PQ环重复多肽共有序列至少20％同一性的氨基酸。

在另一个实施方案中，YDR352w-样PQ环重复多肽可包含与SEQ IDNO：4所示的YDR352w PQ环重复多肽的氨基酸序列至少20％同一性的氨基酸序列。

本文述及“至少20％的同一性”应该理解为还包括高于至少20％的同一性水平，包括，例如，至少30％的同一性、至少40％的同一性、至少50％的同一性、至少60％的同一性、至少70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性或至少95％的同一性。

当比较氨基酸序列时，比较的序列应该在至少50个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少200个氨基酸残基、至少300个氨基酸残基的比较窗口或以SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的全长进行比较。当与参照序列(其不包含添加或缺失)比较时，比较窗口可以包括约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以进行两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的最佳序列比对可以通过计算机执行的算法进行，诸如例如通过Altschul等(Nucl.Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402，1997)公开的BLAST家族程序进行。更详细的序列分析的讨论可以在Ausubel等(“CurrentProtocols in Molecular Biology”(现代分子生物学流程)，John Wiley &Sons Inc，1994-1998，第15章，1998)Unit 19.3中找到。

术语“YDR352w-样PQ环重复多肽”还包括包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽的“功能同源物”。功能同源物包括能够调节穿过细胞膜的阳离子流动的速率、水平或模式的任意PQ环重复多肽。

尽管上述，所述功能同源物可以包括，例如，相对于包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽具有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代的多肽；包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽的突变形式或等位基因变体；包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽的直向同源物；包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽的类似物等。

YDR352w-样PQ环重复多肽的实例包括具有下述登记号的多肽：gi|151942326酿酒酵母YJM789，gi|167389211酿酒酵母YDR352w，gi|114554372黑猩猩(Pan troglodytes)，gi|92110021人(Homo sapiens)，gi|34526924人，gi|168002094小立碗藓，gi|119615288人，gi|153791811人，gi|119599108人，gi|47077705人，和Os7g29610。

通常，考虑按照本发明使用的PQ环重复多肽包括限定电压不敏感性非选择性阳离子通道(viNSCC)的PQ环重复多肽。

当在本文中述及时，“电压不敏感性非选择性阳离子通道”或“viNSCC”是指具有相对低的区分单价阳离子(例如，Na⁺，K⁺，NH₄ ⁺，Li⁺)的能力的阳离子通道多肽。在一些实施方案中，viNSCCs还可以被多价阳离子如Ca²⁺和Mg²⁺抑制。术语“电压不敏感性”在关于viNSCCs使用时不是严格使用的术语。因此，表现出对电压有一些敏感性的蛋白仍然可以认为属于viNSCC种类内(例如，参见Davenport和Tester，Plant Physiol.(植物生理学)122：823-834，2000)。因此，尽管PQ环重复多肽可能表现出某种弱的电压依赖性，其仍然可以称为本发明范围内的viNSCCs。按照上述，viNSCCs也可以称为NSCCs，并且为了本说明书的目的，这两个术语应该认为是同义的并且可互换的。

根据上述，在一些实施方案中，所述PQ环重复多肽包括单价阳离子转运蛋白。在其他实施方案中，所述单价阳离子包括Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、甲铵、Tris⁺或胆碱+中的一种或多种。

在其他实施方案中，PQ环重复多肽的单价阳离子转运可以被多价阳离子抑制。

可以抑制PQ环重复蛋白的单价阳离子转运的多价阳离子的实例包括二价阳离子，包括Be²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Sr²⁺，Ba²⁺和Ra²⁺，以及二价过渡金属离子，如Zn²⁺，Fe²⁺等。在一些实施方案中，二价阳离子可以是Ca²⁺。

在一些实施方案中，多价阳离子可以是三价阳离子，如La³⁺。

如上文所述，本发明提供用于调节穿过细胞膜的阳离子流动的速率、水平或模式的方法。

当在本文中述及时，“细胞膜”可以是细胞的任意膜，调节阳离子穿过所述膜流动的速率、水平或模式是合乎需要的。所述细胞膜的实例包括，例如，质膜或细胞器膜，如叶绿体膜、类囊体膜、线粒体膜(内膜或外膜)、内质网、高尔基体膜、液泡膜、核膜、顶体膜、自噬体膜、酵解酶体膜、乙醛酸循环体膜、氢酶体膜、溶酶体膜、黑素体膜、纺锤剩体膜、过氧化物酶体膜、小泡膜等。

在一些实施方案中，本发明提供用于调节阳离子穿过细胞质膜流动的速率、水平或模式的方法。

本发明所涉及的细胞可以包括任意包含上文所讨论的膜的细胞。因此，所述细胞可以是动物细胞，包括哺乳动物细胞、人细胞、鸟细胞、昆虫细胞、爬行动物细胞等；植物细胞，包括被子植物或裸子植物高等植物以及低等植物如苔藓类、蕨类植物和木贼属植物(horsetails)的植物细胞；真菌细胞，如酵母或丝状真菌等。备选地，所述细胞也可以是原核细胞，如细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞)、或古细菌(archaea)细胞。

在一些实施方案中，所述细胞可以是，例如，植物细胞，维管植物细胞，包括单子叶或双子叶被子植物细胞或裸子植物细胞。在一些实施方案中，所述植物细胞是单子叶植物细胞。在一些实施方案中，所述单子叶植物细胞可以是谷物作物植物细胞。

当用在本文中时，术语“谷物作物植物”包括生产用作人或动物食物的食用谷物的禾本科(Poaceae，grass family)的成员。禾本科谷物作物植物的实例包括大麦、小麦、稻、玉米、稷、高粱、黑麦、黑小麦、燕麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、野生稻、斯佩尔特小麦等。然而，术语谷物作物植物还应该理解成包括也生产可食用谷物并且其已知为假谷物(pseudocereals)的多种非禾本科物种，诸如苋紫(amaranth)、荞麦(buckwheat)和奎奴亚藜(quinoa)。

在其他实施方案中，植物可以是双子叶植物，包括，例如，豆类如大豆(大豆属物种(Glycine spp.))、豌豆和苜蓿(clovers)，其他双子叶油种子作物，如芸苔属物种(Brassica spp.)，和茄科(solanaceous)作物植物，如番茄、胡椒、辣椒、马铃薯、茄子等。

在一些实施方案中，调节穿过细胞的细胞膜的阳离子流动的速率、水平或模式调节细胞的阳离子耐受性或敏感性。

例如，在一些实施方案中，细胞中的PQ环重复多肽可以被下调，以减少特定阳离子穿过质膜的流动，并且因此降低细胞对所述阳离子的敏感性和/或增加细胞对环境阳离子的耐受性。在一些实施方案中，所述阳离子可以是单价阳离子。在其他实施方案中，所述阳离子可以包括Na⁺，K⁺，NH₄ ⁺，甲铵，Tris⁺或胆碱⁺中的任意一种或多种。在一些实施方案中，所述方法可以用于增加细胞如植物细胞对Na⁺阳离子的耐受性。

相反地，本发明还考虑增加阳离子穿过细胞膜的流动。在这些实施方案中，可以增加细胞中PQ环重复多肽的表达。如后面在实施例中所述，在生物体的所有细胞中组成性增加阳离子的膜流动性可以增加所述生物体整体对阳离子的耐受性。

如上文所述，本发明部分基于对细胞中PQ环重复多肽表达的调节。

当在本文中述及时，调节PQ环重复多肽的“表达”包括调节该多肽的水平和/或活性。

调节多肽的“水平”应该理解为包括细胞中或细胞特定部分中PQ环重复多肽的水平或量的增加或减少。类似地，调节PQ环重复多肽的“活性”应该理解为包括，例如，细胞中PQ环重复多肽的全部活性、特异性活性、半衰期和/或稳定性的增加或减少。

例如，“增加”意欲指在细胞中PQ环重复多肽的活性水平的1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2-倍，5-倍，10-倍，20倍，50-倍，100-倍的增加。例如，“减少”意欲指在细胞中PQ环重复多肽的活性水平的1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的减少。

“调节”还应该理解为包括将特定的PQ环重复多肽引入到通常不表达所引入的多肽的细胞中，或在正常表达所述多肽的细胞中基本上完全抑制PQ环重复多肽活性。

本发明涉及可以调节细胞中PQ环重复多肽表达的任何方式。例如，这包括这样的方法，如应用调节细胞中的PQ环重复多肽活性的试剂，包括应用激动剂或拮抗剂；应用模拟细胞中的PQ环重复多肽活性的试剂；调节细胞中编码PQ环重复多肽的核酸的表达；影响细胞中改变的或突变的核酸的表达，从而由所述细胞表达具有增加的或减少的特异性活性、半衰期和/或稳定性的PQ环重复多肽；或调节细胞中PQ环重复多肽的表达模式和/或靶向，例如，通过修饰与PQ环重复多肽相缔合的转录控制序列和/或信号肽而进行调节。

在一些实施方案中，多肽的表达通过调节细胞中编码PQ环重复多肽的核酸的表达而被调节。

当在本文中述及时，编码PQ环重复多肽的核酸(“PQL核酸”)是指编码PQ环重复多肽或所述多肽的功能活性片段或变体的任何核酸。PQL核酸的具体实例包括编码本文上述PQ环重复多肽的核酸。

本发明的PQL核酸可以来源于任何来源。例如，PQL核酸可以来源于生物体，如植物、动物或真菌。备选地，PQL核酸可以是合成的核酸。

本发明所涉及的PQL核酸还可以包括一个或多个非翻译区，如3’和5’非翻译区和/或内含子。

例如，本发明所涉及的PQL核酸可以包括例如mRNA序列，cDNA序列或基因组核苷酸序列。

关于PQL核酸表达的术语“调节”可以包括增加或减少细胞中PQL核酸的转录和/或翻译。

例如，“增加”意欲指PQL核酸的转录和/或翻译的1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2-倍，5-倍，10-倍，20-倍，50-倍，100-倍或更多的增加。例如，“减少”是指PQL核酸的转录和/或翻译的1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的减少。调节还包括在特定细胞中引入通常不存在的PQL核酸的表达；或在通常具有这样的活性的细胞中对PQL核酸表达的基本上完全的抑制(例如，敲除)。

本发明涉及可以调节PQL核酸表达的任何方式。例如，用于调节PQL核酸表达的示例性方法包括，例如：细胞的遗传修饰，以上调或下调内源性PQL核酸表达；通过转化PQL核酸进行遗传修饰；遗传修饰，以增加细胞中PQL核酸的拷贝数；将调节细胞中的内源性PQL核酸表达的核酸分子施用到所述细胞中；等等。

在一些实施方案中，PQL核酸表达通过细胞的遗传修饰进行调节。术语“遗传修饰”用在本文中应该理解为包括相对于未遗传修饰形式的细胞，在遗传修饰的细胞中对PQL核酸表达施加改变的任何遗传修饰。示例性类型的遗传修饰包括：随机诱变(诸如转座子、化学、UV和噬菌体诱变)以及对过表达或不足表达内源性PQL核酸的突变体的选择；将一种或多种在细胞中指导PQL核酸的表达和/或过表达的核酸分子瞬时或稳定导入所述细胞中；通过内源性PQL核酸的位点定向诱变调节内源性PQ环重复多肽；将一种或多种抑制内源性PQL核酸表达的核酸分子导入到细胞中，所述核酸分子例如，共抑制构建体或RNAi构建体；等等。

在一些实施方案中，本发明涉及通过向细胞中引入PQL核酸的表达，上调细胞中PQL核酸的表达和/或增加细胞中PQL核酸的拷贝数来增加细胞中PQ环重复多肽的水平。

在多种细胞类型中转化和表达所引入的核苷酸序列的方法在本领域中是已知的，并且本发明涉及使用任何适当的方法。

然而，关于植物细胞的转化，举例而言，参考Zhao等(Mol Breeding(分子杂交)DOI 10.1007/s11032-006-9005-6，2006)，Katsuhara等(PlantCell Physiol(植物细胞生理学)44(12)：1378-1383，2003)，Ohta等(FEBSLetters(FEBS通信)532：279-282，2002)和Wu等(Plant Science(植物科学)169：65-73，2005)。

在其他实施方案中，本发明还提供了用于下调细胞中PQL核酸表达的方法。例如，随着PQL核酸序列的鉴定，本发明还有助于使用下述方法诸如在细胞中敲除或敲降(knockdown)PQL核酸的方法，所使用的方法包括，例如：

(i)插入诱变，包括通过与敲除构建体同源重组而敲除或敲降细胞中的核酸(靶向的基因分解的实例参见Terada等，Nat.Biotechnol.(自然生物技术)20：1030-1034，2002)；

(ii)细胞中的转录后基因沉默(PTGS)或核酸的RNAi(关于PTGS和RNAi的综述参见Sharp，Genes Dev.(基因发育)15(5)：485-490，2001；和Hannon，Nature(自然)418：244-51，2002)；

(iii)用针对核酸反义构建体转化细胞(反义抑制的实例参见van derKrol等，Nature(自然)333：866-869；van der Krol等，BioTechniques(生物技术)6：958-967；和van der Krol等，Gen.Genet.(基因遗传学)220：204-212)；

(iv)用针对核酸的共抑制构建体转化细胞(共抑制的实例参见vander Krol等，Plant Cell(植物细胞)2(4)：291-299)；

(v)用编码针对核酸的双链RNA的构建体转化细胞(dsRNA介导的基因沉默的实例参见Waterhouse等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA(美国国家科学院学报)95：13959-13964，1998)；

(vi)用编码针对核酸的siRNA或发夹RNA的构建体转化细胞(siRNA或发夹RNA介导的基因沉默的实例参见Lu等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)32(21)：e171；doi：10.1093/nar/gnh170，2004)；和

(vii)插入miRNA靶序列，以致其与核酸可操作性连接(miRNA介导的基因沉默的实例参见Brown等，Blood(血液)110(13)：4144-4152，2007)。

本发明还通过使用合成的寡核苷酸，例如，针对PQL核酸的siRNAs或microRNAs促进细胞中PQL核酸的下调(合成的siRNA介导的沉默的实例参见Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)98：9742-9747，2001；Elbashir等，Genes Dev.(基因发育)15：188-200，2001；Elbashir等，Nature(自然)411：494-498，2001；Elbashir等，EMBO J.(胚胎学杂志)20：6877-6888，2001；和Elbashir等，Methods(方法)26：199-213，2002)。

除了上述实例之外，所引入的核酸还可以包括不直接与PQL核酸相关但是仍然可以直接或间接地调节细胞中PQL核酸的表达的核苷酸序列。实例包括编码促进或抑制细胞中内源性PQL核酸分子的表达的转录因子或其它蛋白的核酸分子；和直接或间接地促进或抑制内源性PQ环重复多肽表达的其它非翻译的RNAs等。

为了影响在遗传修饰的细胞中所引入的核酸的表达，在适当的情形中，可以将所引入的核酸可操作性地与一种或多种转录控制序列和/或启动子(如天然PQL核酸启动子或异源启动子)连接。

术语“转录控制序列”应该理解为包括影响可操作性连接的核酸的转录的任何核酸序列。转录控制序列可以包括，例如，前导序列、多腺苷酸化序列、启动子、增强子或上游活化序列、和转录终止子。典型地，转录控制序列至少包括启动子。术语“启动子”用在本文中描述在细胞中赋予、激活或增强核酸分子的表达的任何核酸。

在一些实施方案中，至少一种转录控制序列与PQL核酸可操作性连接。出于本说明书的目的，当转录控制序列能够促进、抑制或以其它方式调节给定的基因或其它核苷酸序列的转录时，认为该转录控制序列与所述基因或其它核苷酸序列“可操作性连接”。

关于表达所发生的细胞、组织、器官或发育阶段，响应外界刺激特别如生理胁迫、病原体、或金属离子，或响应一种或多种转录激活剂，启动子可以组成型或差异型调节可操作性连接的核苷酸序列的表达。因此，依据本发明的方法所用的启动子可以包括，例如，组成型启动子、可诱导的启动子、组织特异性启动子或可激活的启动子。

本发明涉及使用任何在目的细胞中有活性的启动子。因此，本领域普通技术人员将容易地确定在细菌、真菌、动物细胞或植物细胞的任一种中有活性的宽泛数量的启动子。

然而，在一些实施方案中，可以使用植物细胞。因此，在这些实施方案中，可以使用植物活性的组成型、可诱导的、组织特异性的或可激活的启动子。

植物组成型启动子典型地在几乎所有的植物组织中指导表达，并且很大程度上不依赖于环境和发育因子。依据本发明可以使用的组成型启动子的实例包括植物病毒来源的启动子，如花椰菜花叶病毒35S和19S(CaMV 35S和CaMV 19S)启动子；细菌性植物病原体来源的启动子，如来源于农杆菌属物种(Agrobacterium spp.)的冠瘿碱启动子；例如，农杆菌属来源的胭脂碱合酶(nos)启动子；和植物来源的启动子，如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基基因(rbcS)启动子，植物泛蛋白启动子(Pubi)和稻肌动蛋白启动子(Pact)。

“可诱导的”启动子包括，但不限于，化学可诱导的启动子和物理可诱导的启动子。化学可诱导的启动子包括具有通过化学化合物如醇、抗生素、类固醇、金属离子或其它化合物调节的活性的启动子。化学可诱导的启动子的实例包括：醇调节的启动子(例如，参见欧洲专利637 339)；四环素调节的启动子(例如，参见美国专利5,851,796和美国专利5,464,758)；类固醇响应性启动子，如糖皮质激素受体启动子(例如，参见美国专利5,512,483)，雌激素受体启动子(例如，参见欧洲专利申请1 232 273)，蜕皮激素受体启动子(例如，参见美国专利6,379,945)等；金属响应性启动子，如金属硫蛋白启动子(例如，参见美国专利4,940,661，美国专利4,579,821和US 4,601,978)；和发病机理相关的启动子，如几丁质酶或溶菌酶启动子(例如，参见美国专利5,654,414)或PR蛋白质启动子(例如，参见美国专利5,689,044，美国专利5,789,214，澳大利亚专利708850，美国专利6,429,362)。

可诱导的启动子也可以是物理调节的启动子，其由非化学环境因素如温度(热和冷)、光等调节。物理调节的启动子的实例包括热休克启动子(例如，参见美国专利5,447858，澳大利亚专利732872，加拿大专利申请1324097)；冷诱导启动子(例如，参见美国专利6,479,260，美国专利6,184,443和美国专利5,847,102)；光诱导启动子(例如，参见美国专利5,750,385和加拿大专利1321563)；光抑制启动子(例如，参见新西兰专利508103和美国专利5,639,952)。

“组织特异性启动子”包括优先或特异性在生物体的一种或多种特异性细胞、组织或器官和/或生物体的一个或多个发育阶段表达的启动子。应该理解组织特异性启动子也是组成型或可诱导的。

植物组织特异性启动子的实例包括：根特异性启动子，如美国专利申请2001047525中所述的那些；果实特异性启动子，包括子房特异性和花托组织特异性启动子，诸如在欧洲专利316441，美国专利5,753,475和欧洲专利申请973 922中所述的那些；和种子特异性启动子，诸如在澳大利亚专利612326和欧洲专利申请0 781 849和澳大利亚专利746032中所述的那些。

启动子还可以是可由一种或多种转录激活剂激活的启动子，其在本文中称为“可激活的启动子”。例如，可激活的启动子可以包括与上游激活序列(UAS)可操作性连接的最小的启动子，所述上游激活序列(UAS)包括用于一种或多种转录激活剂的DNA结合位点等。

当在本文中述及时，术语“最小的启动子”应该理解为包括结合至少RNA聚合酶结合位点和任选的TATA盒与转录起始位点和/或一个或多个CAAT盒的任何启动子。在一些实施方案中，其中所述细胞是植物细胞，最小的启动子可以来源于花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子。所述来源于CaMV 35S的最小的启动子可以包括，例如，基本上对应于CaMV 35S启动子的位置-90至+1(转录起始位点)的序列(也称为-90

CaMV 35S最小启动子)，对应于CaMV 35S启动子的位置-60至+1的序列(也称为-60CaMV 35S最小启动子)或对应于CaMV 35S启动子的位置-45至+1的序列(也称为-45CaMV 35S最小启动子)。

如上文所述，可激活的启动子可以包括与上游激活序列(UAS)融合的最小的启动子。UAS可以是能够结合转录激活剂以激活最小启动子的任何序列。示例性的转录激活剂包括，例如：酵母来源的转录激活剂，如Gal4，Pdr1，Gcn4和Ace1；病毒来源的转录激活剂，VP16；Hap1(Hach等，JBiol Chem(生物化学杂志)278：248-254，2000)；Gaf1(Hoe等，Gene(基因)215(2)：319-328，1998)；E2F(Albani等，J Biol Chem(生物化学杂志)275：19258-19267，2000)；HAND2(Dai和Cserjesi，J Biol Chem(生物化学杂志)277：12604-12612，2002)；NRF-1和EWG(Herzig等，J Cell Sci(细胞科学杂志)113：4263-4273，2000)；P/CAF(Itoh等，Nucl Acids Res(核酸研究)28：4291-4298，2000)；MafA(Kataoka等，J Biol Chem(生物化学杂志)277：49903-49910，2002)；人激活转录因子4(Liang和Hai，J Biol Chem(生物化学杂志)272：24088-24095，1997)；Bcl10(Liu等，BiochemBiophys Res Comm(生物化学生物物理研究通讯)320(1)：1-6，2004)；CREB-H(Omori等，Nucl Acids Res(核酸研究)29：2154-2162，2001)；ARR1和ARR2(Sakai等，Plant J(植物杂志)24(6)：703-711，2000)；Fos(Szuts和Bienz，Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院学报)97：5351-5356，2000)；HSF4(Tanabe等，J Biol Chem(生物化学杂志)274：27845-27856，1999)；MAML1(Wu等，Nat Genet(自然遗传学)26：484-489，2000)。

在一些实施方案中，所述UAS包括能够与GAL4转录激活剂的至少DNA结合结构域结合的核苷酸序列。

所述转录控制序列还可以包括终止子。术语“终止子”是指在转录单位末端给出终止转录的信号的DNA序列。终止子是通常包含多腺苷酸信号的3′-非翻译DNA序列，其促进向初级转录物的3′-端添加多腺苷酸序列。如启动子序列那样，终止子可以是在要使用所述终止子的细胞、组织或器官中可操作的任何终止子序列。可以用于植物细胞的适宜的终止子序列的实例包括：胭脂碱合酶(nos)终止子，CaMV 35S终止子，章鱼肉碱合酶(ocs)终止子，马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pin)终止子，诸如pinII和pinIII终止子等。

在第二方面中，本发明提供具有受调节的穿过细胞的膜的阳离子流动速率、水平或模式的细胞，其中所述调节是在所述细胞中PQ环重复多肽的受调节表达的结果。

当用于本文时，术语“细胞”应该理解为包括任何细胞类型，包括细菌、古细菌和真核细胞，包括，例如，动物、植物和真菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以包括，例如，植物细胞、单子叶植物细胞或谷物作物植物细胞。

在一些实施方案中，本发明第二方面的细胞按照本发明第一方面的方法产生。在其他实施方案中，本发明第二方面的细胞按上文关于本发明的第一方面所述进行遗传修饰。

当在本文中述及时，“遗传修饰的细胞”包括关于野生型细胞被遗传修饰的细胞。因此，遗传修饰的细胞可以是本身被遗传修饰的细胞和/或所述细胞保留关于野生型细胞的修饰的后代。

在第三方面中，本发明提供包括一个或多个本发明第二方面的细胞的多细胞结构。

当在本文中述及时，“多细胞结构”包括一个或多个细胞的任何聚集。

因此，多细胞结构特异性包括组织、器官、完整生物体及其部分。此外，多细胞结构还应该理解为包括培养的细胞的多细胞聚集，如群落、植物愈伤组织(plant calli)、液体或悬浮培养物等。

如上文提及的，在一些实施方案中，所述细胞是植物细胞，并且因此，本发明包括包含一个或多个本发明第三方面所述的植物细胞的完整植物、植物组织、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或培养的植物组织(例如，愈伤组织或混悬培养物)。在其他实施方案中，所述细胞是单子叶植物细胞或谷物作物细胞，并且因此，本发明还特别包括包含一个或多个单子叶植物或谷物作物植物细胞的完整植物、植物组织、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或培养的植物组织(例如，愈伤组织或混悬培养物)。

在第四方面中，本发明提供包含前述PQL核酸的核酸构建体或载体。

本发明的核酸构建体或载体可以由任意多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。

例如，所述构建体或载体可以由下述各项构成：单链和双链DNA，作为单链和双链区域的混合物的DNA，单链和双链RNA，作为单链和双链区域的混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂交分子，其可以是单链的或更典型地是双链的或是单链和双链区域的混合物。另外，所述构建体或载体可以包括包含RNA或DNA或包含RNA和DNA二者的三链区域。所述构建体或载体还可以包含一个或多个修饰的碱基或为稳定性或其他原因修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化的(或其他标记的)碱基和不常见的碱基如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“核酸”包括化学、酶、或代谢修饰的形式。

在一些实施方案中，所述构建体是可以如本发明第一方面所述用于影响细胞中PQ环重复多肽表达的表达构建体。

因此，所述载体或构建体可以进一步包含下述中的一种或多种：用于一种或多种宿主的复制起点；在一种或多种宿主中有活性的选择标记基因；和/或一种或多种转录控制序列。

当用于本文时，术语“选择标记基因”包括赋予基因在其中表达的细胞表型以促进转染或转化遗传构建体的细胞的选择和/或鉴定的任意基因。

本领域中已知多种编码适当的选择标记的核苷酸序列。编码选择标记的示例性的核苷酸序列包括，例如，特别是：抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，赋予抗生素金担子素A(aureobasidin A)抗性的AURI-C基因，新霉素磷酸转移酶基因(例如，nptI和nptII)和潮霉素磷酸转移酶基因(例如，hpt)；除草剂抗性基因，包括草铵膦(glufosinate)、草丁膦(phosphinothricin)或双丙氨膦(bialaphos)抗性基因，如草丁膦乙酰转移酶编码基因(例如bar)，草甘膦(glyphosate)抗性基因，包括3-烯酰丙酮酰莽草酸5-磷酸合酶(3-enoylpyruvyl shikimate 5-phosphate synthase)编码基因(例如aroA)，溴苯腈(bromyxnil)抗性基因，包括溴苯腈腈水解酶编码基因，磺胺抗性基因，包括二氢蝶酸合酶(dihydropterate synthase)编码基因(例如sul)和磺酰脲(sulfonylurea)抗性基因，包括乙酰乳酸合酶编码基因；酶编码报告基因如GUS和氯霉素乙酰转移酶(CAT)编码基因；荧光报告基因，如绿色荧光蛋白编码基因；和基于发光的报告基因，如萤光素酶基因。

此外，应该注意到，所述选择标记基因可以是构建体中独立的开放阅读框，或可以作为与另一种多肽(例如，PQ环重复多肽)的融合蛋白而表达。

如上述，所述核酸构建体或载体还可以包括一种或多种上述转录控制序列。在一些实施方案中，至少一种转录控制序列可操作性地与前述本发明第一方面的核酸序列连接。

如上文提及，所述控制序列还可以包括如前文所述的终止子。

所述构建体可以进一步包括意欲将所述遗传构建体维持在原核生物或真核生物中和/或所述遗传构建体在原核生物或真核生物中复制和/或将所述遗传构建体或其部分整合到真核或原核细胞的基因组中的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述载体或构建体适合通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化至少部分转移到植物细胞中。因此，在一些实施方案中，所述构建体可以包括左和/或右T-DNA边界序列。

本领域技术人员将容易确定适当的T-DNA边界序列。然而，术语“T-DNA边界序列”应该理解为包括，例如，任何基本上同源和基本上直接重复的核苷酸序列，所述核苷酸序列划定由农杆菌属物种(Agrobacterium sp.)细胞转移到对农杆菌属介导的转化敏感的植物细胞中的核酸分子的界限。例如，参考Peralta和Ream的论文(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，82(15)：5112-5116，1985)和Gelvin的综述(Microbiology and Molecular Biology Reviews(微生物学和分子生物学综述)，67(1)：16-37，2003)。

在一些实施方案中，所述载体或构建体适合通过农杆菌属介导的转化转移到植物中。然而，本发明还涉及对遗传构建体进行任何适当的修饰，所述修饰促进通过细菌而不是农杆菌属物种的细菌介导的插入到植物细胞中，例如如在Broothaerts等(Nature(自然)433：629-633，2005)中所述。

本领域技术人员应该知晓如何产生本文所述的构建体和在具体的细胞或细胞类型中获得它们表达的要求。实施本发明所需要的遗传操作可能需要将本文所述的遗传构建体或其衍生物在原核细胞(如大肠杆菌(E.coli)细胞)或植物细胞或动物细胞中繁殖。

在第五方面中，本发明提供包含本发明第四方面的核酸构建体或载体的遗传修饰的细胞。

所述核酸可以使用本领域已知的适于所用细胞类型的任何方法引入。

在细胞是植物细胞的实施方案中，关于引入核酸分子的适合的方法包括，例如：农杆菌属介导的转化，其它细菌介导的转化(参见Broothaerts等，2005，同上)，基于微粒轰击的转化法和基于直接的DNA摄入的方法。Roa-Rodriguez等(Agrobacterium-mediated transformation of plants(农杆菌属-介导的植物转化)，第3版，CAMBIA Intellectual Property Resource(CAMBIA知识产权资源)，Canberra，澳大利亚，2003)评述了用于宽范围植物物种的宽泛数量的合适的农杆菌属介导的植物转化法。微粒轰击也可以用来转化植物组织和用于转化植物、特别是谷物植物的方法，并且Casas等(Plant Breeding Rev.(植物杂交综述)13：235-264，1995)评述了所述方法。直接的DNA摄入转化流程如原生质体转化和电穿孔详细记述在Galbraith等(eds.)，Methods in Cell Biology(细胞生物学方法)Vol.50，Academic Press(学院出版社)，San Diego，1995中。除了上述方法之外，还可以使用一定范围的其它转化流程。这些包括细胞和组织的渗透、电穿孔，胚的电穿孔，显微注射，花粉管途径，碳化硅和脂质体介导的转化。Rakoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.(细胞分子生物学通信)7：849-858，2002)评述了诸如这些的方法。一定范围的其它植物转化法对于本领域的技术人员也是明显的。

上述构建体或载体可以作为DNA分子、作为附加体(例如，质粒、黏端质粒、人工染色体等)的一部分而保持在细胞中或其可以整合到细胞的基因组DNA中。

当用于本文时，术语“基因组DNA”在其最广泛语境上应该理解为包括组成细胞的遗传互补的任意和所有DNA。因此，细胞的基因组DNA应该理解为包括染色体、线粒体DNA、质体DNA、叶绿体DNA、内源性质粒DNA等。因此，术语“基因组整合的”涉及染色体整合、线粒体DNA整合、质体DNA整合、叶绿体DNA整合、内源性质粒整合等。

术语“细胞”，当用于本文时，应该理解为包括任意细胞类型，包括细菌、古细菌和真核细胞，包括，例如，动物、植物和真菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以包括，例如，植物细胞、单子叶植物细胞、或谷物作物植物细胞。

此外，在第六方面中，本发明提供包含一个或多个本发明第五方面的细胞的多细胞结构。

如上文提及的，在一些实施方案中，所述细胞是植物细胞，因此，本发明包括包含一个或多个本发明第五方面所述的植物细胞的完整植物、植物组织、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或培养的植物组织(例如，愈伤组织或混悬培养物)。在其他实施方案中，所述细胞是单子叶植物细胞或谷物作物细胞，并且因此，本发明还特别涉及包含一个或多个单子叶植物或谷物作物植物细胞的完整植物、植物组织、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或培养的植物组织(例如，愈伤组织或混悬培养物)。

在第七方面中，本发明提供用于确定生物体的阳离子敏感性或耐受性的方法，所述方法包括确定PQ环重复多肽在一个或多个所述生物体细胞中的表达。

在一些实施方案中，相对高水平的表达与生物体中的阳离子敏感性相关。

在一些实施方案中，在生物体的所有细胞中的相对高水平的表达与所述生物体中的阳离子耐受性相关。

在另一个实施方案中，相对低水平的表达与生物体中的阳离子耐受性相关。

如本文所引用的，“确定PQ环重复多肽的表达”包括确定PQ环重复多肽本身的水平和/或活性，和/或PQL核酸的水平、活性、转录或翻译。

确定核酸或多肽表达水平和/或模式的方法在本领域中是已知的。检测RNA表达的示例性方法包括这样的方法，诸如定量或半定量反转录酶PCR(例如，参见Burton等，Plant Physiology(植物生理学)134：224-236，2004)，原位杂交(例如，参见Linnestad等，Plant Physiology(植物生理学)118：1169-1180，1998)；RNA印迹法(例如，参见Mizuno等，PlantPhysiology(植物生理学)132：1989-1997，2003)；等等。用于确定多肽表达的示例性方法包括蛋白质印迹法(例如，参见Fido等，Methods Mol Biol.(分子生物学方法)49：423-37，1995)；ELISA(例如，参见Gendloff等，Plant Molecular Biology(植物分子生物学)14：575-583)；免疫显微镜法(例如，参见Asghar等，Protoplasma(原生质)177：87-94，1994)等等。在另一个实施方案中，PQL核酸序列的表达可以通过确定在生物体的一个或多个细胞的基因组DNA中存在的PQL核酸的数目来确定。

在一些实施方案中，本发明第七方面的方法适于确定植物的阳离子敏感性或耐受性。在其他实施方案中，本发明第七方面的方法适于确定例如单子叶植物或谷物作物植物的阳离子敏感性或耐受性。

在其他实施方案中，本发明第七方面的方法可以用来确定生物体的阳离子敏感性或耐受性，然后基于所确定的阳离子敏感性或耐受性来选择个体生物体。例如，在植物的情形中，可以选择具有提高的阳离子耐受性的植物栽培在高阳离子土壤中，或可以选择具有提高的阳离子耐受性的植物用于育种方案，从而产生植物的阳离子耐受性培育品种。

最后，参考标准的分子生物学教科书，其包含用于实施本发明所包括的基本技术的方法，其包括用于产生本文所述的各种基因构建体的DNA限制性和连接。参见，例如，Maniatis等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress(冷泉港实验室出版社)，纽约，1982)和Sambrook等(2000，同上)。

本发明通过下述非限制性实施例进行进一步的描述：

附图简述

图1显示在过表达YDR352w，YOL092w或pYES3对照的酿酒酵母菌株31019b中的¹⁴C标记的MA流动。酿酒酵母菌株31019b(mep1Δ，mep2Δ，mep3Δ，ura3Δ)(Marini等，EMBO J.13：3456-3463，2000)被转化了包含YDR352w、YOL092w或没有插入物的pYES3-DEST(Smith等，Proceedings of the National Academy of Sciences(国家科学院学报)92：9373-9377，1995，由M.Shelden改进(未公布的))。将细胞生长并重悬在pH7.0的20mM KPO₄ ^-缓冲液中。在T＝0时加入50mM ¹⁴C标记的MA，并且通过0.45μm的膜过滤而对细胞取样。相对于总细胞蛋白确定MA含量。通过两因素方差分析(two-way ANOVA)确定数据显著性，并且所示的显著性是相对于空载体对照的。YDR352w和YOL092w仅在30分钟后的流动显著不同。(n＝5).(^*＝P值＜0.005；^**＝P值＜0.001；^***＝P值＜0.0001)。

图2显示浓度依赖性¹⁴C标记的MA流动。酿酒酵母菌株31019b(mep1Δ，mep2Δ，mep3Δ，ura3Δ)(Marini等，2000，同上)被转化了包含YDR352w、YOL092w或没有插入物的pYES3(Smith et al.，1995，同上)。将细胞生长并重悬在pH 7.0的20mM KPO₄ ^-缓冲液中。加入不同浓度的¹⁴C标记的MA，并且通过0.45μm膜过滤对细胞取样。相对于总细胞蛋白确定MA含量。通过两因素方差分析确定数据显著性，并且所示的显著性是相对于空载体对照的。(n＝6)。

图3显示时间依赖性的流入酿酒酵母菌株31019b的²²Na流动数据。酿酒酵母菌株31019b(mep1，2，3Δ，ura3Δ)(Marini等，2000，同上)被转化了包含YDR352w、YOL092w或没有插入物的pYES3(Smith et al.，1995，同上)。A图显示综合数据，而B图显示Na⁺累积高于空载体对照的Na⁺累积，其通过从表达PQ环重复蛋白的酵母的Na⁺累积中减去空载体值而计算。将细胞生长并重悬在pH 7.0的20mM KPO₄ ^-缓冲液中。在T＝0时加入50mM ²²Na标记的MA，并且通过0.45μm的膜过滤而对细胞取样。相对于总细胞蛋白确定MA含量。通过两因素方差分析确定数据显著性，并且所示的显著性是相对于空载体对照的。由于天然Na⁺传导蛋白的结果，在数据中更可能存在更大的变化。

图4显示在表达YDR352w的非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞中分析阳离子流动的浸浴溶液的最优化。将非洲爪蟾卵母细胞注射YDR352w cRNA或不含核酸酶的H₂O。将卵母细胞在各浸浴溶液中暴露于标准电压流程。A)100mM氯化胆碱，2mM MgCl₂，1mM CaCl₂，5mMMES/Tris pH 6.5；B)200mM甘露醇，2mM MgCl₂，1mM CaCl₂，pH 7.0Tris；C)200mM甘露醇，2mM MgCl₂，2mM BaCl₂，pH 7.0Tris；D)200mM甘露醇，5mM MES/Tris pH 7.0。缓冲液D)没有表现出Ca²⁺激活的Cl^-通道的迹象，并且用作进一步实验的基础(n＝最小值4).

图5A至C显示外部Na⁺浓度对表达酿酒酵母PQ环重复蛋白的卵母细胞的电流传导的影响。在一定范围的Na⁺浓度下，将注射了来自YDR352w或YOL092w的cRNA的卵母细胞与注射了不含核酸酶的H₂O的卵母细胞进行比较。浓度为分别在标准缓冲液中的100mM NaCl(A)，10mM NaCl(B)和1mM NaCl(C)，如在实施例7中所述。随着Na⁺浓度增加，相对于E_Cl而言，E_rev向理论E_Na变化，这证实Na⁺是流动的离子。(n＝5)。

图5D和E显示作为外部Na⁺浓度的函数在表达酿酒酵母PQ环重复蛋白的非洲爪蟾卵母细胞中诱导的电流的比较。在浸浴在包含不同Na⁺浓度的缓冲液中的表达YDR352w(A)或YOL092w(B)的卵母细胞之间的I/V关系。缓冲液为基于甘露醇/MES的，在需要时加入NaCl。随着外部Na⁺浓度增加，E_rev向右侧变化，趋向于计算的E_Na值。这证实相对于Cl^-而言Na⁺是被运输的离子，Cl^-随着浓度增加将引起E_Rev向左侧变化。(n＝5)。

图6显示TEA⁺对通过YDR352w和YOL092w的Na⁺流动的影响。研究K⁺通道阻断剂TEA⁺对YDR352w和YOL092w的影响。与在单独的90mM NaCl(缓冲液(B)：90mM NaCl，5mM MES/Tris)中的那些卵母细胞相比较，存在TEA(缓冲液(A)：10mM TEA-OH，90mM NaCl，5mMMES/Tris pH 7.0)表现出更大的电流。这可能是由于TEA⁺通过这些蛋白的流动或TEA⁺作用为天然NSCCs的激动剂的结果。

图7A显示关于表达YDR352w或YOL092w的非洲爪蟾的NSCC活性。在浸浴在不同阳离子缓冲液中的卵母细胞中表达YOL092w(A)或YDR352w(B)的I/V关系。浸浴溶液是200mM甘露醇和pH 7.0的5mMMES/Tris的基质(base)，按上述加入阳离子。

图7B显示与注射H₂O的对照相比较的NSCC活性。比较通过注射了YDR352w或YOL092w cRNA的卵母细胞或注射了H₂O的对照的阳离子电流。关于包含100mM Na⁺(A)，100mM NH₄ ⁺(C)和100mM胆碱⁺(D)的浸浴溶液的数据显著不同于注射水的对照。由于大量的天然爪蟾卵母细胞的活性，关于浸浴在100mM K⁺(B)中的卵母细胞的数据没有显著不同于注射水的对照。(关于(A)，(B)，和(D)，n＝5。关于(C)，n＝2)。

图8显示平衡阴离子由Cl^-变化为SO₄ ^2-影响电流迹线。用50mMNa₂SO₄浸浴溶液(缓冲液(B)：50mM Na₂SO₄，5mM MES/Tris pH 7.0)替换100mM NaCl浸浴溶液(缓冲液(A)：100mM NaCl，5mM MES/Tris pH 7.0)略微影响Na⁺通过YOL092w的流动，但是不影响由YOL092w表达所催化的流动。在(B)中YOL092w流动的抑制可能是改变的穿过膜的SO₄ ^2-流动的结果。(n＝5)。

图9中图A、B和C显示不同的外部Ca²⁺浓度对通过爪蟾卵母细胞中所表达的YDR352w或YOL092w的Na⁺传导的影响。由于Na⁺流动所诱导的电流通过在浸浴溶液中存在Ca²⁺而减小。当用2mM Ca²⁺缓冲液(I/V曲线(B)：100mM NaCl，2mM CaCl₂，5mM MES/Tris pH 7.0)替换浸浴溶液时，在0mM Ca²⁺的电流(I/V曲线(A)：100mMNaCl，5mM MES/Tris pH 7.0)减小约50％。将浸浴溶液变换为10mM Ca²⁺缓冲液(I/V曲线(C)：100mM NaCl，10mM CaCl₂，5mM MES/Tris)又将电流减小约20％。总计，加入10mM CaCl₂，初始0mM Ca²⁺流动被减少60％。在所有图表中，关于表达PQ环的卵母细胞的I/V曲线显著不同于注射水的对照。n＝5。

图9中图D、E和F显示Ca²⁺浓度对通过爪蟾卵母细胞中所表达的YDR352w和YOL092w的Na⁺流动的影响。通过在具有不同Ca²⁺浓度的100mM NaCl浸浴溶液中的电压钳制技术测量通过表达YDR352w(A)或YOL092w(B)的爪蟾卵母细胞的Na⁺流动。Na⁺流动在不存在Ca²⁺时最大，随着加入包含2mM CaCl₂或10mM CaCl₂的缓冲液逐步减小。随着增加的Ca²⁺浓度，趋向于正电位以及趋向于理论E_Ca的逆转电位变化，连同先前诱导的Ca²⁺激活的Cl^-通道表明Ca²⁺对Na⁺流动的抑制可能是被转运的Ca²⁺的函数。(n＝5)

图10显示关于图4所示数据的代表性迹线。在注射了YDR352wcRNA(A，B，C和D)或不含核酸酶的H₂O(E，F，G，和H)的卵母细胞中记录代表性的电流迹线。迹线对应于前图的I/V曲线，A和E为关于图4缓冲液A、B，F为关于缓冲液B、C，G为关于缓冲液C和D，H为关于缓冲液D。

图11A显示在转化了空pYES3载体的酿酒酵母菌株31019b中的MA⁺毒性和摄入。将酿酒酵母菌株31019b用空pYES3-DEST载体转化，并且将细胞生长并涂布。Grensons极限培养基(Grenson，Biochimica etBiophysica Acta 127：339-346，1966)补充了0.1％L-脯氨酸，100mM MA和2％半乳糖，并且Ca²⁺和pH调节如下：1)10mM Ca²⁺pH 6.5；2)0.2mMCa²⁺pH 6.5；3)10mM Ca²⁺pH 7.0，4)0.2mM Ca²⁺pH 7.0；5)YNB+2％葡萄糖作为负载对照。

图11B显示在转化了在半乳糖诱导载体BG1805中的YDR352w的酿酒酵母菌株31019b中的MA⁺毒性和摄入。将酿酒酵母菌株31019b转化包含YDR352w的酵母表达载体BG1805。(A)将细胞生长并涂布。Grensons极限培养基(Grenson，1966，同上)补充了0.1％L-脯氨酸，100mM MA和2％半乳糖，并且Ca²⁺和pH调节如下：1)10mM Ca²⁺pH 6.5；2)0.2mMCa²⁺pH 6.5；3)10mM Ca²⁺pH 7.0，4)0.2mM Ca²⁺pH 7.0；5)YNB+2％葡萄糖作为负载对照。(B)将转化的31019b细胞在pH 7.0的包含0.5mM¹⁴C-MA，20mM KPO₄ ^-和2％D-半乳糖的反应缓冲液中温育。在收集的细胞中在20分钟温育后使用闪烁计数测量¹⁴C MA的净摄入。所示的数据是平均值±SE(n＝10)。

图11C显示在转化了在半乳糖诱导载体BG1805中的YOL092w的酿酒酵母菌株31019b中的MA⁺毒性和摄入。将酿酒酵母菌株31019b转化包含YOL092w的酵母表达载体BG1805。(A)将细胞生长并涂布。Grensons极限培养基(Grenson，1966，同上)补充了0.1％L-脯氨酸，100mM MA和2％半乳糖，并且Ca²⁺和pH调节如下：1)10mM Ca²⁺pH 6.5；2)0.2mMCa²⁺pH 6.5；3)10mM Ca²⁺pH 7.0，4)0.2mM Ca²⁺pH 7.0；5)YNB+2％葡萄糖作为负载对照。(B)将转化的31019b细胞在pH 7.0的包含0.5mM¹⁴C-MA，20mM KPO₄ ^-和2％D-半乳糖的反应缓冲液中温育。在收集的细胞中在20分钟温育后使用闪烁计数测量¹⁴C MA的净摄入。所示的数据是平均值±SE(n＝10)。

图12显示关于本文所述的电生理数据的电压流程。

图13显示酿酒酵母YDR352w、YOL092w和YBR147w的CLUSTALW比对，标记出具有PQ环重复和推定目的区。YDR352w、YOL092w和非常相似的YBR147w的氨基酸序列用CLUSTAL-W算法进行比对。存在高度的序列保守性，特别是在跨膜区和‘PQ环’区。推定的G蛋白结合区由Chung等(J.Biol.Chem.(生物化学杂志)276：40190-40201，2001)预测。跨膜结构域在SGD中使用改编的Gene3D(Buchan等，Genome Res.(基因组研究)12：503-514，2002)预测。

图14显示表现出与YDR352w的序列相似性的拟南芥、酿酒酵母、稻、普通小麦(Triticum aestivum)、粟酒裂殖酵母和人蛋白的系统发育树。使用标准参数通过BLAST算法将YDR352w的蛋白序列与NCBI的蛋白序列数据库进行比较。还获得包含注释的PQ环重复的蛋白的另外的蛋白序列。使用CLUSTALW算法比对蛋白序列，并且生成系统发育树(MacVector，USA)。

图15显示注射了YDR352w cRNA(A，B，C)，YOL092w cRNA(D，E，F)或H₂O(G，H，I)的卵母细胞的代表性时间依赖性电流曲线。将卵母细胞浸浴在加入1mM NaCl(A，D，G)，10mM NaCl(B，E，H)或100mM NaCl(C，F，I)的基质缓冲液(参见本章的方法)中。

图16显示注射了YDR352w cRNA(A，B)，YOL092w cRNA(C，D)或H₂O(E，F)的卵母细胞的代表性时间依赖性电流曲线。。将卵母细胞浸浴在具有100mM NaCl(A，C，E)或50mM Na₂SO₄(B，D，F)的基质缓冲液(参见本章的方法)中。

图17显示与公众可获得的基因组数据库相比较时显示出与YDR352w和YOL092w有某种程度的相似性的蛋白的系统发育树。

图18显示两种酵母(Yol092wp和Ydr352wp)，六种拟南芥(AtPQL1-6)，三种稻(Os01g16170，Os07g29610和Os12g18110)，六种小立碗藓(Pp174957，Pp182799，Pp217317，Pp210671，Pp159185和Pp160065)和两种细菌(FtPQL和UpPQL)PQ环蛋白(用以锚定树)的蛋白序列的进化树。高等植物PQ环蛋白分离为进化枝I，II和III。

图19是由来自酵母-Yol092wp(左上)、和拟南芥-AtPQL1，2和3(分别为右上、左下、右下)的PQ环蛋白的预测的蛋白拓扑结构的图。

图20举例说明转化了AtPQL1、AtPQL2、或AtPQL3的酿酒酵母的盐敏感性测定的结果。将十倍连续稀释液点样到补充了500mM NaCl和/或10mM CaCl₂的SD-尿嘧啶培养基上。将平板在30℃温育2天。与对照相比，表达AtPQL1的酵母表现出减小的生长速率，这通过加入10mMCaCl₂而恢复。与对照相比，表达AtPQL1的酵母还表现出提高的盐敏感性。同样，这种敏感性可以被10mM CaCl₂恢复，这表明Ca²⁺可能与AtPQL1相互作用。

图21是显示转化了AtPQL1、AtPQL2、或AtPQL3的酿酒酵母的生长的示意图。将细胞在补充了0mM CaCl或10mM CaCl的SD-尿嘧啶培养基上生长。生长表示为对照最大生长的百分数(n＝3)。与对照相比，表达AtPQL1的酵母表现出减小的生长速率，这通过加入10mM CaCl₂而恢复。

图22是显示转化了AtPQL1、AtPQl2、或AtPQL3的酿酒酵母的生长减慢的示意图。将细胞在补充了500mM NaCl，和0mM CaCl或10mMCaCl的SD-尿嘧啶培养基上生长。生长表示为未处理的转化体的最大生长的百分数(n＝3)。与对照相比，表达AtPQL1的酵母表现出提高的盐敏感性。这种敏感性可以被10mM CaCl₂恢复。

图23A是显示不用NaCl的水栽培生长的植物的生物量累积的示意图。K.O＝基因敲除的株系，amiRNA＝基因敲降的株系，35S＝过表达的株系。转基因株系发生分离，因此包含无效(nulls)。结果是平均值±平均值的标准误差。

图23B是显示在应用50mM NaCl3天后的水栽培生长的植物的生物量累积的示意图。K.O＝基因敲除的株系，amiRNA＝基因敲降的株系，35S＝过表达的株系。转基因株系发生分离，因此包含无效(nulls)。结果是平均值±平均值的标准误差。

图24是显示水栽培生长的植物的耐盐性的示意图。％耐盐性通过将每个株系在盐胁迫下的平均生物量除以该株系在对照条件下的平均生物量而计算。K.O＝基因敲除的株系，amiRNA＝基因敲降的株系，35S＝过表达的株系。转基因株系发生分离，因此包含无效。

图25显示水栽培法生长2周然后加入75mM NaCl12天的分离的T₂35S：：OsPQL1水稻植物中的钠浓度。第三片完全展开的叶片的火焰光度法确定来自两种株系的植物具有比野生型(WT)Nipponbare植物显著更低的茎干Na⁺(n＝12)。35S-OsPQL-A和35S-OsPQL-B是用相同的35S：：OsPQL构建体转化的水稻愈伤组织的独立转化体。

图26显示AtPQL1在烟草表皮细胞中的定位。具有与AtPQL1蛋白融合的绿色荧光蛋白(GFP)的DNA构建体由Anna Antmann博士(University of Glasgow)友好提供，并且转化到烟草表皮细胞中。使用共聚焦显微镜显现GFP的定位。

实施例1

在酿酒酵母中作为推定的viNSCCs的PQ环重复蛋白

开发基于酿酒酵母的筛选来鉴定推定的viNSCCs。该筛选依赖于NH₄ ⁺类似物甲铵(MA)通过viNSCC的流动而在酵母中产生毒性表型。通过改变生长培养基的Ca²⁺浓度和pH，我们能够选择表现出过表达viNSCCs预期表型的蛋白。

这种筛选在酵母中鉴定了表现出过表达viNSCCs预期表型响应的PQ环重复种类的两种蛋白(图11A，B和C)。开展一系列的实验来验证这些蛋白作用为viNSCCs。

实施例2

随着表达YDR352w或YOL092w，阳离子流入酿酒酵母中

基于它们在存在毒性MA浓度下在酿酒酵母菌株31019b的细胞中赋予毒性表型的能力而选择YDR352w和YOL092w。该菌株没有所有三种其天然高亲和力NH₄ ⁺/MA转运蛋白的功能性表达，这允许其在包含高MA浓度的培养基上存活。

YDR352w和YOL092w的过表达导致毒性表型，这种毒性表型随增加的Ca²⁺(图11A，B和C)减轻。为了证实这种表型是增加的MA流动的结果，测量在外部浓度为0.5mM的MA下的¹⁴C标记的MA流动。当与空载体对照相比时，过表达YDR352w或YOL092w的细胞导致随时间增加的MA积聚。摄入服从算术回归(arithmetic regression)，并且在30分钟时具有是空载体对照2.5-3倍的积聚速率(图1)。还检验了通过这些蛋白的浓度依赖性MA流动(图2)。按照不饱和模式的MA摄入显著高于空载体对照。过表达YDR352w的细胞表现出比过表达YOL092w的那些细胞更高的MA流动能力，尽管它们二者相对于空载体对照均表现出显著的LATS活性。

使用²²Na流动分析进行表达YDR352w或YOL092w的细胞中离子选择性的研究(图3A和B)。当与空载体对照细胞相比较时，在过表达YDR352w和YOL092w的细胞中，Na⁺流动显著更高。

实施例3

通过在非洲爪蟾卵母细胞中表达来表征YDR352w和YOL092w介导的流 动

非洲爪蟾卵母细胞有效用于研究膜结合蛋白的电生理学。YDR352w的cRNA用于优化分析通过PQ环重复蛋白的阳离子流动的条件。最初的实验使用氯化胆碱作为浸浴溶液中的主要阳离子。这允许良好的电流流动，而不会由于其尺寸而自身转运。这些实验揭示，当以超极化电位钳制电压时，在注射了YDR352w cDNA的卵母细胞中的强电流诱导(图4，图A和图10，图A)。这指示天然的爪蟾Ca²⁺激活的Cl^-通道。这种电流的诱导表明所表达的蛋白诱导天然的Ca²⁺激活的Cl^-通道或YDR352w促进Ca²⁺流入卵母细胞并且驱动这种Ca²⁺激活的Cl^-通道电流。这种电流将干扰向内正电流的观察，并且因此必须将其最小化。为了减少潜在的变化源，使用最小化(minimalistic)的浸浴溶液，将200mM甘露醇用最少量的Tris-Cl缓冲至pH 7.0。在该基质缓冲液中有1mM CaCl₂和2mM MgCl₂(图4，图B和图10，图B)，存在与Ca²⁺激活的Cl^-通道相似的电流，尽管当与基于氯化胆碱缓冲的迹线相比较时，减少很多。这表明更高的外部Cl^-浓度诱导Ca²⁺激活的Cl^-通道或胆碱本身通过该蛋白流动并且有助于在负膜电位下的整体流动或可能是二者的组合。用Ba²⁺代替Ca²⁺进一步减小注射YDR352w的卵母细胞和注射水的卵母细胞之间的差异(图4，图C和图10，图C)，这表明Ca²⁺的存在诱导电流流动。去除所有二价阳离子，仅留下5mM MES/Tris，有效消除在负电位的任何向内的阳离子/向外的阴离子流动(图4，图D和图10，图D)。作为在负膜电位观察到的低电流流动的结果(其为可以观察到向内阳离子流动条件)，选择这种缓冲液作为进一步实验的基质。

实施例4

在表达YDR352w和YOL092w的非洲爪蟾卵母细胞中表征阳离子流动

在电生理学中转运蛋白/通道的表征典型地包括分析种类亲和性和鉴定阻断剂。使用这样的方法研究YDR352w和YOL092w。当与注射水的对照相比较时，在注射YDR352w或YOL092w cRNA的非洲爪蟾卵母细胞中，Na⁺、胆碱⁺和Ca²⁺流动增加。初步的实验还表明，当表达这些蛋白时，MA⁺、NH₄ ⁺、和K⁺流动也改变。

在用于检测在非洲爪蟾中表达的阳离子中，证明Na⁺是最有用的。在注射水的对照中的天然电流相对小，并且被检验蛋白激发大的Na⁺诱导的电流。为了确保所观察到的电流是由于Na⁺的内流而不是Cl^-的外流，使用具有不同NaCl浓度的包含一系列缓冲剂的缓冲液(图5，图A，B和C)。随着Na⁺浓度增加，所绘制的I/V曲线的逆转电位(E_rev)变得更正(图5，图D和E)，这同阳离子流入相一致(与Cl^-阴离子的外流相比而言)。

对于所有检验的Na⁺浓度，当与注射水的对照相比较时，关于向内和向外的阳离子流动均记录显著更高的流动(图5，图15)。而已经确定向内的电流是Na⁺的结果，但是在正膜电位观察到的阳离子流程可能不是由于Na⁺流动造成的。最可能的是所观察到的流动是由于K⁺运动造成的，因为这是卵母细胞中主要的单价阳离子。当在基质缓冲液中以正电位钳制电压时，在注射YDR352w的卵母细胞中观察到类似增加的向外流动(图4，图D和图10，图D)。这与这些PQ环重复蛋白促进阳离子的双向流动相一致。

K⁺通常是在酵母和爪蟾卵母细胞表达系统中流动的主要阳离子，并且有时可以促进其他阳离子的流动。因此，其与研究天然K⁺转运系统对由这些PQ环重复蛋白所记录的流动的影响相关。为了这一目的，使用TEA⁺作为K⁺通道阻断剂的作用。向包含90mM NaCl的浸浴溶液中加入10mM TEA⁺没有改变流动的一般趋势，但是确实影响电流幅度(图6)。这些数据表明TEA⁺由YOL092w和YDR352w运载或TEA⁺作用为NSCC诱导的迹线的激动剂，这提高它们的Na⁺运载能力。随着加入TEA⁺，逆转电位没有显著改变，这表明TEA⁺本身不被运载。可能的是，E_rev中的任何差异通过存在高得多的Na⁺和内部K⁺浓度而减弱。鉴于TEA⁺、MA和NH₄ ⁺之间的结构相似性以及所观察到的MA和NH₄ ⁺流动特征(图1，2和7)，可能的TEA⁺流动是令人感兴趣的。

通过用Na₂SO₄替换NaCl来研究Cl^-对所观察到的电流的影响(图8)。

对于表达YDR352w的卵母细胞，电流不变，这表明总电流不受外部Cl^-浓度影响。随着将Cl^-替换为SO₄ ^2-，关于YOL092w的电流减小。这可能是由于Cl^-诱导的影响的减少或作为对加入SO₄ ^2-的响应。

阳离子选择性的分析表明，这些PQ环重复蛋白在单价阳离子之间具有差的区分性。在表达YDR352w或YOL092w的卵母细胞中，胆碱+、Na⁺、K⁺和NH₄ ⁺的流动增加(图7)。

对照卵母细胞表现出高的K⁺流动程度，这掩盖了任何潜在的通过所检验的PQ环重复蛋白的K⁺流动。在注射YDR352w的卵母细胞和仅注射H₂O的卵母细胞中测量NH₄ ⁺流动。对于可获得的数据，强烈表明YDR352w促进NH₄ ⁺流动。

还研究了不同的Ca²⁺浓度对表达YDR352w和/或YOL092w的卵母细胞中的Na⁺流动的影响(图9)。加入2mM CaCl₂，记录到向内和向外电流二者的显著减小，加入10mM CaCl₂，减小更多。

实施例5

¹⁴ C标记的MA流动和 ²² Na标记的Na ⁺ 流动分析

包含YDR352w或YOL092w的pDONR(Invitrogen)载体用来利用LRclonase反应将目的插入物重组到载体pYES2-DEST中(Invitrogen)。将包含在pYES3-DEST中的YDR352w或YOL092w的细胞或包含空载体的细胞在补充了2％D-葡萄糖(w/v)的液体YNB中生长至饱和，通过在4000xg离心4分钟收集，并且用于接种pH 6.5的具有0.1％L-脯氨酸和2％D-半乳糖(w/v)的Grensons液体培养基至OD₆₀₀＝0.1。在28℃以200rpm摇动，将细胞温育过夜，并且在OD₆₀₀＝0.4-0.7时通过以4000xg离心进行收集，在MilliQ H₂O中洗涤两次，并且重悬在具有2％(w/v)D-半乳糖的20mM KPO₄ ^-缓冲液pH 6.5中产生OD₆₀₀～4-6。将1M MACl或NaCl的储液加入到pH 7.0的20mM KPO₄ ^-缓冲液中至所需要的浓度，并用¹⁴CMA(Amersham)或²²Na(Amersham)标记。在t＝0时，将其加入到等体积的重悬细胞中，并且在流动实验过程中持续摇动。在指定的时间，将样品取出，通过0.45μM硝基纤维素滤器(Whatman)并用10ml冰冷的20mMKPO₄ ^-缓冲液洗涤，从而终止流动。收集膜，置于7ml闪烁小瓶(Sarstedt)中，并且加入4ml闪烁液(Perkin Elmer)。将样品在液闪计数器(Packard)中计数。将计数转化为等量的MA⁺或Na⁺，并且将样品针对总蛋白归一化，这来自于改进的Lowry法(Peterson，Analytical Biochemistry(分析生物化学)83：346-356，1977)。

实施例6

合成cRNA并且注射到非洲爪蟾卵母细胞中

按照标准流程(Zhou等，Plant，Cell & Environment(植物、细胞和环境)30：1566-1577，2007)，使用Calcium Frog Ringers溶液(96mM NaCl，2mMKCl，5mM MgCl₂，5mM HEPES，0.6mM CaCl₂)加8％马血清，0.1mg/ml四环素，青霉素1000u/ml和链霉素0.1mg/ml)，制备非洲爪蟾的卵母细胞。包含YDR352w或YOL092w的pDONR(Invitrogen)载体用来利用LRclonase反应将目的插入物重组到载体pGEMHE中(Invitrogen)。将包含目的基因的pGEMHE载体用Sph1(NEB)消化过夜以将DNA线性化。按照供应商的流程使用mMessage mMachine 5′加帽RNA转录试剂盒(Ambion)来合成关于目的基因的cRNA。将cRNA浓度标准化至1μg/μL，并且用显微注射器(Drummond‘Nanoject II’自动纳升注射器，DrummondScientific，Broomall，PA，USA)将46nL注射到每个卵母细胞中。对照卵母细胞注射46nL不含核酸酶的H₂O。使用前，将注射的卵母细胞在16℃在Calcium Frog Ringers溶液中温育3天。

实施例7

在非洲爪蟾卵母细胞中表达的酿酒酵母PQ环重复蛋白的电生理学

除非另外指明，卵母细胞电压钳制在25℃在由pH 7.0的5mM MES/Tris组成的基质缓冲液(加入目的离子)中发生。利用甘露醇将渗透性保持在200mOsm。使用基因钳500电压钳放大器(Gene Clamp 500voltageclamp amplifier)(Axon Instruments(Axon仪器)，Molecular Devices(分子装置)，Sunnyvale，CA，USA)放大信号，并且使用Clampex 8.2(AxonInstruments)显示。将卵母细胞用充满3M KCl的玻璃毛细管刺穿。将负责维持电压钳和电流流动的电极浸浴在该3M KCl溶液中。所用的电压流程如图12所示。

实施例8

讨论

当在膜片钳实验中观察时，最初认为电压不敏感性NSCCs是“漏”电流。观察通过这些蛋白的通道介导的电流通常需要低外部Ca²⁺浓度，并且因此认为是失去膜完整性的结果。详细的研究确定单价阳离子流动比二价阳离子流动有利，并且因此存在所推导的蛋白。

由于它们的发现，已经探求了电压不敏感性NSCCs的遗传性质。已经在兔心脏的‘起搏器’窦房结细胞中记录了具有viNSCC特性的电流，并且可能在调节心跳中起重要作用。例如，还已经在非洲爪蟾、多种植物物种和酵母中记录了相似的电流。

由于这些蛋白催化高容量单价阳离子流动，因此它们具有显著影响细胞功能的潜力。正是这种潜力使得viNSCCs成为负责当植物暴露于盐条件下时在植物中观察到大的Na⁺流动的强候选物。

迄今为止，viNSCCs的分子性质尚是未知的。这可能时由于使用异源筛选作为viNSCCs被动催化离子流动的难度并且因此表现出微小的表型。

¹⁴C标记的MA⁺和²²Na⁺标记的流动均提示YDR352w和YOL092w是阳离子通道。当与空载体对照比较时，对于YDR352w和YOL092w两种过表达细胞，¹⁴C标记的MA流动表现出在LATS范围内始终更高的MA流动速率(图1)。浓度曲线显示这些蛋白表现出充分在酵母的LATS范围内的不饱和MA摄入动力学(图2)。²²Na⁺流动实验反映MA⁺流动数据，显示与空载体转化的对照细胞相比，增加的Na⁺流入过表达YDR352w或YOL092w的细胞中的速率(图3A和B)。

在过表达YDR352w和YOL092w二者的细胞中观察到的增加的阳离子流入能力与对于过表达的viNSCC预期的相一致。在50mM MA⁺和50mM Na⁺的流动均大于空载体对照的流动。仅在用50mM MA⁺5分钟后(图1)或在用50mM NaCl 15分钟后(图3A和B)，流动变得与空载体对照显著不同。类似地，在MA浓度模式中在空载体对照和候选蛋白之间的分辨率仅获得对于YDR352w的25mM和对于YOL092w的50mM。流动MA或Na⁺(或二者)的天然酵母蛋白在该菌株是主动的。这包括YDR352w和YOL092w，即我们的候选NSCCs。因此，空载体对照将以与用这些候选基因转化的那些相似的方式作用，不同在于在转化的细胞中的候选蛋白过表达。预计分辨率差，并且作为结果观察到差的分辨率，尤其是对于Na⁺流动，因为所有天然Na⁺转运蛋白仍然存在。由于已经从这些菌株删除了天然MEPs，所以MA流动的分辨率可能好于Na⁺。但是，当与对照细胞比较时，在候选基因转化的细胞中观察到MA和Na⁺流动模式的显著不同。

在爪蟾中表达YDR352w和YOL092w cRNA显著增加在包含Na⁺的浸浴溶液中卵母细胞中的电流流动。电流幅度受Na⁺浓度影响，在较高的Na⁺浓度观察到较大的电流(图5)。Na⁺浓度越大，E_rev越正向移动。这证实所记录的电流是Na⁺流动的结果(相对于Cl^-而言)。这种特性的证实通过用50mMNa₂SO₄替换100mMNaCl获得(图8)，其揭示出E_rev中的很小差异。

当在酵母中过表达和当在爪蟾卵母细胞中过表达时，YDR352w和YOL092w均表现出相似的生理学。这并不令人惊讶，因为它们共有大部分序列和预测的结构特性。在这些数据中，微小的差异是明显的，这表明对于每种蛋白的谨慎作用。当在超极化膜中时，这些蛋白表现出差异。在不含Ca²⁺的Na⁺浸浴溶液中显示的YDR352w的电流/电压关系在所研究的电位范围内对于两种蛋白是合理线性的。然而，YOL092w在-70mV以下的电位表现出线性丧失，这反映在注射水的对照卵母细胞中所示的反应。

观察到的电流表现出不同程度的时间依赖性。总体上，通过YDR352w激发的电流几乎不表现出时间依赖性(图10中图A，B和C以及图15中图A，B和C)。当使用SO₄ ^2-作为Na⁺偶联的阴离子时，在低的膜电位观察到某种时间依赖性(图16中图A和B)。由于当Cl^-为平衡离子时，没有观察到这种依赖性，并且在注射YOL092w(图16中图C和D)和注射水(图16中图E和F)的卵母细胞中均也观察到差异，其可能是在浸浴溶液中存在SO₄ ^2-的假象。YOL092w激发的电流大部分是独立于时间的，例外的是当浸浴溶液中存在100mM Na⁺时(图15中图D，E和F)。在这些条件下，在-90mV以下的电位获得的电流表现出时间依赖性减小，直到约1.5秒后达到稳定状态。用于产生I/V曲线的电流测量采用进入电压钳1.2至1.6秒的电流平均值。

Ca²⁺活性的变化影响Na⁺流动导致的电流，并且略微改变E_rev(图9)。随着浸浴溶液中Ca²⁺浓度增加，存在E_rev的微小正迁移，这表明Ca²⁺可能通过这些蛋白流动。在表达YDR352w的卵母细胞中观察到的Ca²⁺激活的Cl^-的激活(图4中图A和图10中图A)也表明Ca²⁺流动增加。当从0mMCa²⁺浸浴溶液变换到2mM Ca²⁺浸浴溶液时，在所有迹线中电流减小约50％。当Ca²⁺浓度从2mM增加至10mM时，电流进一步减小20％。总体上，向先前不包含的Ca²⁺的浸浴溶液中加入10mM Ca²⁺将电流减小约60％。

单价阳离子之间的弱区分性是viNSCCs的定义特征。当在非洲爪蟾卵母细胞中表达YDR352w和YOL092w时，研究YDR352w和YOL092w的单价阳离子通道选择性(图7A和B)。存在YDR352w或YOL092w催化胆碱⁺和Na⁺流动。初步的数据强烈地表明当表达这些基因时，K₊、NH₄ ⁺和MA⁺流动也增加(图1，2和7)。Ca²⁺激活的Cl^-通道的诱导，结合Ca²⁺对Na⁺流动具有抑制作用，还表明Ca²⁺流动也通过这些蛋白促进。

实施例9

PQ环重复蛋白的特征

固体培养基生长表型(图11中图A，B和C)和¹⁴C标记的MA⁺流动数据(图1和2)表明YDR352w和YOL092w是推定的viNSCCs。这些蛋白均属于PQ环重复种类的蛋白。因此，所选择的酵母PQ环蛋白最可能是viNSCC候选物。YDR352w和YOL092w，以及非常相似的YBR147w，在酵母菌属基因组数据库(Saccharomyces Genome Database，SGD)中没有记录已知的生物学或分子功能。因为预测YBR147w不是膜缔合的，所以通过基因组数据库检索没有选择YBR147w。由于其与其他PQ环重复蛋白的相似性，这可能是错误的。

PQ环重复蛋白的特征在于，在额外的膜环之前的脯氨酸和谷氨酰胺(PQ)残基的重复(图13)。它们在很大程度上没有得到注解。表征的PQ环重复蛋白的实例是人CTNS和MPDU1，酿酒酵母ERS1和来自粟酒裂殖酵母的stm1+。CTNS和ERS1将L-半胱氨酸转运穿过生物膜。在酵母中的ERS1缺失突变体也已经在ER中参与蛋白保留的破坏。HsMPDU1已经与涉及脂质连接的寡糖的‘翻转酶’机制相关。Stm1已经表现出与G蛋白相互作用，并且因此指定为G蛋白偶联的受体。

已经从所研究的PQ环蛋白获得一些结构信息(图13)。PQ环基序的环2可能在蛋白定位中是重要的，如用HsCTNS所示。其他PQ环蛋白的GFP定位已经表明它们整合在多种膜中，其中环2表现出对正确的蛋白运输是至关重要的。Stm1的第三个预测的胞质结构域预计是G蛋白相互作用的位点。对于可能涉及这些蛋白的任何信号传导级联，这是特别重要的。在可获得的基因组数据库的YDR352w的BLAST检索揭示多种相似的蛋白(图17)，除了之前提及的那些之外。它们中大部分还没有被注解。

通过SGD可以获得关于酵母ORFs的表达模式数据。这些数据的研究可以产生对蛋白功能的一些了解。所有三种目的基因的转录受酵母营养状况的影响。具体地，对于充分进入静止生长期、孢子形成、N耗竭和Ca²⁺/Na⁺/钙依赖磷酸酶(calcineurin)反应的酵母记录到强变化。这些反应表明在细胞内与离子感应或离子转运的可能的联系。

实施例10

材料和方法-过表达候选基因的酿酒酵母菌株31019b在固体培养基上 的生长表型

具有候选基因的载体来源于Open Biosystems Yeast ORF Collection。它们由克隆到载体BG1805中的单个酵母ORFs组成。每个ORF在高表达Gal1启动子下表达，并且去除其终止密码子来结合C端HA蛋白标签(Gelperin等，Genes and Development(基因和发育)19：2816-2826，2005)。使用醋酸锂/聚乙二醇法(Gietz等，Yeast(酵母)11：355-360，1995)将每个克隆转化到31019b中(Marini等，Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)17：4282-4293，1997)，并且在YNB极限培养基上选择转化体。将转化的菌株单个在液体酵母营养基质(BD biosciences(BD生物科学)，San Jose，USA；0.67％(w/v)，D-葡萄糖2％(w/v)pH 6.5)中生长过夜至对数晚期。将细胞沉淀下来，并且在无菌milliQ水中洗涤两次，并且重悬至OD₆₀₀为0.3。将培养物连续稀释至最终OD₆₀₀为0.003，并且将5μL的每种稀释液放置在固体酵母极限培养基上(Grenson，Biochimica et Biophysica Acta 127：339-346，1966)，所述培养基pH为7.0，具有0.1M MA，0.1％(w/v)L-脯氨酸，2％(w/v)D-半乳糖，具有0.2mM Ca²⁺或10mM Ca²⁺。将平板在28℃温育5-7天，并且监测生长表型。将在表达时诱导指示细胞中增加的MA⁺毒性的表型的质粒选择出来并且进行进一步的分析。

实施例11

植物PQLs-材料和方法

为了研究对茎干Na⁺积聚的影响，在拟南芥中组成型表达AtPQL1(At4g20100)，AtPQL2(At2g41050)和AtPQL3(At4g36850)(表2)。为了研究对茎干Na⁺积聚的影响，在水稻中组成型表达OsPQL1(Os01g16170)(表2)。还在酵母中异源表达AtPQL1、AtPQQL2和AtPQL3。

表2-拟南芥和水稻PQL蛋白的名称和登记号

DNA和RNA提取以及cDNA合成

使用Edwards等的方法(Nucleic Acids Research(核酸研究)19：1349，1991)从拟南芥的幼叶中提取基因组DNA。简言之，将植物的茎干或根组织在液氮中快速冷冻，并且使用研钵和研棒研磨成细小的粉末。向粉末中加入400μl Edwards缓冲液(200mM Tris pH 8，25mM EDTA，250mMNaCl和0.5％SDS)，并且将样品在室温下放置1小时。将样品以13,000g离心2分钟，并且取出上清。加入300μl100％的异丙醇，将样品在室温下温育2分钟，然后以13,000g离心5分钟，而沉淀DNA。将DNA沉淀物用70％乙醇洗涤，并且允许空气干燥，然后重悬在100μl TE缓冲液中。

使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，按照(Chomczynski，BioTechniques(生物技术)15：532-537，1993)所述的流程提取总RNA。使用Ambion’s DNA-free(Ambion，Madison，WI，USA)去除基因组DNA污染物，并且使用2μg的总RNA利用Superscript III(Invitrogen)来合成cDNA。在拟南芥中过表达AtPQL1至3

从英国格拉斯哥大学(University of Glasgow)的Anna Amtmann博士那里获得利用35S启动子组成型表达基因AtPQL1、AtPQL2和AtPQL3的转基因拟南芥植物。使用AtPQL1，2或3完整基因正向引物和AtPQL1，2或3完整基因反向引物(表3)，将来自拟南芥Col-0基因组DNA的完整基因克隆到pCR8 Gateway允许进入的载体(pCR8 Gateway enabled entryvector)中。质粒的限制性消化和测序用来验证基因在载体中的方向，并且确保在所克隆的基因的编码序列中没有错误。为了拟南芥转化，使用Gateway反应将基因然后转移到pGWB2目标载体中，并且转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101中。

表3-用于扩增AtPQL1，2和3以及OsPQL1的完整基因的引物对的序列

SALK T-DNA敲除

通过诺丁汉拟南芥种子中心(Nottingham Arabidopsis Stock Centre)(NASC，Nottingham，UK)从SALK库获得所有T-DNA敲除的突变体。为了选择纯合子，将植物单个生长在土壤上，并且通过基因组DNA分离和PCR检测它们的配型(zygosity)，所述PCR使用Signal iSect工具(signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)设计的引物来检测T-DNA插入物。通过半定量反转录PCR检验敲除株系pql1-1(SALK_108796)和pql3-1(SALK_044346)的转录水平。

amiRNA敲降

由于AtPQL1至3共有高同源性，因此在基因家族中存在冗余性可能是可能的。为了检验这一点，设计amiRNA突变体来同时敲降AtPQL1-3基因中的2种或3种。利用WMD 2-Web MicroRNA Designer(http://wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl)来鉴定两种21个碱基的序列，对其可以设计两种独立的amiRNA构建体，所述amiRNA构建体将减少AtPQL1&2，AtPQL1&3，AtPQL2&3，或AtPQL1，2&3的表达。按照http://wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl？page＝7的流程，将包含产生21bp的amiRNAs所必需的序列的引物(表4)结合在amiRNA载体MIR319a中，并且将完整的amiRNA构建体克隆到pCR8中。测序后，为了检验任何序列错误并且确定序列的正确方向，进行Gateway LR，以将amiRNA构建体转移到pTOOL2载体中，所述载体将使用35S启动子来驱动amiRNA的表达。

表4-amiRNA靶序列和引物

拟南芥转化

使用根癌农杆菌菌株GV3101，用包含35S过表达或amiRNA构建体的pGWB2或TOOL2载体，通过花浸法(Clough & Bent，The Plant Journal(植物杂志)16：735-743，1998)转化拟南芥Col-0生态型。从转化的植物收集种子，并且在人工土壤培养基(3.6L珍珠岩-培养基级别，3.6L coira和0.25L河土)上萌发并且喷洒100mg L^-1BASTA(AgrEvo，Düsseldorf，Germany)来鉴定推定的T₁转化体。将转化体转移到土壤中，每周用300ml营养液(2mM Ca(NO₃)，15mM KNO₃，0.5mM MgSO₄，0.5mM NaH₂PO₄，15mM NH₄NO₃，2.5μM NaFeEDTA，200μM H₃BO₃，0.2μM Na₂MoO₄，0.2μM NiCl₂，1μM ZnSO₄，2μM MnCl₂，2μM CuSO₄and 0.2μM CoCl₂)浇水，并且生长至开花，以收集T₂种子。

拟南芥盐胁迫测定

将来自突变株系的种子(上述35S，T-DNA KO，或amiRNA)通过在70％乙醇中浸泡2分钟然后在无菌milli-Q水中5次润洗而表面除菌，然后将单个种子种植在装满具有0.8％Bactoagar的pH 5.6的拟南芥萌发溶液(表5)的1.5ml微量离心管盖中。将该盖放置在坐落在拟南芥萌发溶液中的萌发托盘中。将种子在4℃春化2天，然后转移到生长室中，生长室的光周期为10小时光照/14小时黑暗，辐照度为150μmol m^-2s^-1，并且恒温21℃。在萌发托盘中2-3周后，将植物转移到包含拟南芥水栽培溶液(表5)的不断通气的水栽培箱中。监测水栽培溶液的pH并且保持在pH5.6。在放置在水栽培箱中后1周，通过以每4小时增加25mM而加入50mM NaCl应用盐胁迫。在每次盐应用时，通过加入正确量的钙(如使用Visual Minteq Version 2.3(US Environmental Protection Agency，USA)计算的)，将生长培养基中的钙活性维持在0.3mM。

盐处理3天后，收获植物。切下对照和盐处理的植物的完整的茎干，记录鲜重。取下最后完全展开的叶片，称重，并且在Hot Block(Environmental Express，Mt Pleasant，South Carolina，USA)中在85℃在1％硝酸中消化过夜。使用420型火焰光度计(Sherwood，UK)测量该叶片中的Na⁺和K⁺浓度。

表5-拟南芥萌发和水栽培溶液

水稻转化

将来自野生型Nipponbare水稻植物的全长OsPQL1克隆到pCR8Gateway允许进入的载体中。质粒的限制性消化和测序用来验证该基因再载体中的方向并且确保在所克隆的基因的编码序列中没有错误。为了水稻转化，使用Gateway反应，将基因然后转移到pMDC32目标载体中。将该质粒寄往法国蒙彼利埃的CIRAD(CIRAD，Montpellier，France)用于水稻转化。

水稻盐胁迫测定

将35S::OsPQL1和野生型Nipponbare水稻种子在潮湿的滤纸上在28℃/25℃日/夜，80％/60％日/夜湿度和600μmol m^-2s^-1光照下用12小时光照/12小时黑夜的光暗周期萌发5天。将幼苗从滤纸上取下，并且放置在1.5ml微量离心管中，该微量离心管已经去除其底部，从而允许根从管中伸出来。将每个微量离心管小心地放置在充满ACPFG水稻营养液(5mM NH₄NO₃，5.0KNO₃，2mM Ca(NO₃)₂，2.0mM MgSO₄，0.1mMKH₂PO₄，50μM NaFe(III)EDTA，10μM H₃BO₃，5μM MnCl₂，5μM ZnSO₄，0.5μM CuSO₄and 0.1μM Na₂MoO₃)的10L箱子上的支持物上，允许幼苗的根接近培养基。将幼苗在28℃/25℃日/夜，80％/60％日/夜湿度和600μmol m^-2s^-1光照下用12小时光照/12小时黑夜的光暗周期生长两周，每5天更换营养液。萌发后14天，将一半的幼苗转移到包含75mM NaCl、补充了0.24mM CaCl₂的营养液中。为了不刺激植物，盐的应用以三次12小时应用25mM NaCl和0.8mM CaCl₂进行。在收获之前允许植物进一步生长12天。从每株植物上取下第3片完全展开的叶片，记录其鲜重，然后在65℃温育48小时，从而获得干燥的组织用于干重测量。一旦获得重量测量，将该组织在1％硝酸中在85℃消化过夜。通过火焰光度测量确定每片叶片的Na⁺和K⁺测量。

酵母转化

使用AtPQL1，2或3完整基因正向引物和AtPQL1，2or 3完整基因反向引物(表3，同上)，将来自拟南芥基因组DNA的完整基因克隆到pCR8Gateway允许进入的载体中。质粒的限制性消化和测序用来验证基因在载体中的方向，并且确保在所克隆的基因的编码序列中没有错误。使用醋酸锂/聚乙二醇法(Gietz等，Yeast(酵母)11：355-360，1995)将每种基因转化到酿酒酵母中，并且在SD极限培养基(0.67％(w.v)不含氨基酸的Difco酵母氮基质，1g/L组氨酸)，(-尿嘧啶)上选择转化体。将转化的细胞单个在SD极限培养基(-尿嘧啶)，2％(w/v)D-半乳糖中生长过夜至对数晚期。

平板测定

将细胞沉淀下来，并且重悬至OD₆₀₀为0.3。将培养物连续稀释至最终OD₆₀₀为0.0003，并且将10μL的每种稀释液放置在具有0mM NaCl+0mM CaCl，0mM NaCl+10mM CaCl，500mM NaCl+0mM CaCl，或500mM NaCl+10mM CaCl的SD极限培养基(-尿嘧啶)，2％(w/v)D-半乳糖，2％(w/v)琼脂上。将平板在30℃温育2-3天，并且监测生长表型。

液体培养物测定

将细胞添加到10ml液体培养物中以达到起始OD₆₀₀为0.1。每10ml培养物包含具有0mM NaCl+0mM CaCl，0mM NaCl+10mM CaCl，500mM NaCl+0mM CaCl，或500mM NaCl+10mM CaCl的SD极限培养基(-尿嘧啶)，2％(w/v)D-半乳糖。每24小时(直至4天)采取200μl样品，以用于OD₆₀₀测量。

实施例12

植物中的PQ环基因

通过拟南芥、水稻和小立碗藓的基因组数据库检索，明显地，在所有三种基因组中，特别是对于酵母基因Yol092wp，存在来自酵母的PQ环基因(这样命名是因为在每种序列中发现两个保守的脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)氨基酸对)的同源物。拟南芥和立碗藓属(Physcomitrella)包含六种PQ环基因，而水稻仅包含三种同源物。有趣地，这些基因分离成三种不同的进化枝(图18)。拟南芥基因组包含进化枝I中的三种基因、进化枝II中的两种基因和进化枝III中的一种基因。水稻基因组包含每种进化枝中的一种基因。立碗藓属基因组包含进化枝I中的一种基因、进化枝II中的两种、进化枝III中的一种和与第二种酵母基因(Ydr352wp)更密切相关的两种，即未在高等植物中发现的一组。因此，对于发现高等植物中的viNSCC基因，与酵母基因Yol092wp最密切相关的那些是最相关的。进化枝I的基因与Yol092wp最接近相关，因此是最合乎逻辑的候选物。

另外，来自酵母和植物的PQ环蛋白的推定蛋白结构的拓扑学分析(使用几种预测程序的一致性进行，所述预测程序包括HMMTOP，PRED-TMR和Kyte-Doolittle绘图)揭示在Yol092w和在进化枝I中发现的植物成员之间的相似性比Yol092w与在进化枝II和II中的那些之间的相似性强得多。进化枝I蛋白具有7个跨膜结构域(TMD)和一个大的未知功能的连接TMDs 3和4的胞质环(图19)。这与仅具有5个TMDs的进化枝II蛋白和在TMDs之间仅具有非常小的环的进化枝III蛋白形成对比。

由于拟南芥包含进化枝I中的三种基因，因此在该进化枝中潜在存在某种水平的冗余性，这表明当致力于阐明在该进化枝中的基因的功能时，观察表型可能必须分析多基因敲降和/或敲除。此外，存在这样一种可能性：该进化枝中的蛋白将组装成多聚体，并且如果这些是异聚体，则表型分析可能需要多基因敲降。

猜测PQL蛋白编码在植物细胞质膜上发现的非选择性阳离子通道。认为这些通道促进Na⁺流入细胞中。怀疑其在根细胞中表达，可能在外侧根细胞中表达。怀疑其参与初始的Na⁺向植物根中的流入。

当与用载体对照转化的酵母(wt)相比时，表达AtPQL1基因的酵母在0mM NaCl上生长时表现出略微的生长减少(图20和21)。表达AtPQL1基因的酵母在500mM NaCl上生长时表现出显著的生长减少，这表明该基因编码促进Na⁺进入到细胞中的蛋白(图20和22)。这种生长的减少显著大于载体对照酵母(wt)。这种影响通过加入10mM CaCl₂而被部分恢复，这表明所涉及的蛋白是非选择性阳离子通道(NSCC)。NSCC活性可以通过加入Ca²⁺而被抑制(图20，21和22)。

由于假定PQL蛋白可能参与初始的Na⁺向根部的流入，并且从这里Na⁺被转运到茎干，获得AtPQL基因的amiRNA敲降和T-DNA敲除，来研究这些基因表达的减少是否可能减少茎干部的Na⁺积聚。确定多个AtPQL基因的amiRNA敲降和单个AtPQL基因的T-DNA敲除导致减少的茎干部Na⁺积聚，这表明它们确实负责初始的Na⁺向植物根细胞的流入。

在0mM NaCl，具有单个PQL基因敲除、多个PQL基因敲降或单个PQL基因过表达的转基因植物具有比野生型对照植物略高的生物量(图23A)。唯一的例外似乎是AtPQL3的敲除。

当将株系暴露于50mM NaCl3天时，所有敲除的、敲降的和过表达的株系都产生比野生型对照高的生物量(图23B)。确定多个AtPQL基因的amiRNA敲降和单个AtPQL基因的T-DNA敲除均导致增加的茎干部生物量积聚，这表明它们确实负责初始的Na⁺向植物根细胞的流入，并且通过减少这些基因的表达，进入植物中的Na⁺的量减少，这允许植物增加更多的生物量(图23B)。令人感兴趣的是，在拟南芥植物的每个细胞中组成型过量表达AtPQL1也增加茎干部生物量积聚(图23B)，这同样表明所编码的蛋白确实参与Na⁺转运。这种明显矛盾的结果可能归因于基因在植物的每个细胞中表达(而amiRNA敲降和T-DNA敲除减少天然基因表达，怀疑其是细胞类型和组织特异性的)。这种组成型表达可能导致PQL基因在植物通常不表达该基因的有益细胞类型中的表达，或已经在植物中导致其天然Na⁺转运蛋白中的一些的上调，从而补偿PQL基因的更多的表达。过去，使用如AtHKT1；1的基因已经观察到相似的结果，其中T-DNA敲除植物和35S::AtHKT1；1组成型表达均具有增加的茎干部Na⁺浓度。

如果通过将在50mM盐胁迫下的平均生物量除以株系在没有盐胁迫下的平均生物量而计算转基因株系的耐盐性，则可以观察到，当与野生型植物相比时，AtPQL1和AtPQL3的敲除株系是高度耐盐性的(在敲除株系中有120-180％的耐盐性，相比之下，在野生型植物中为70％)。amiRNA敲降，尽管不是与完整的敲除一样是耐盐性的，仍然比野生型植物更耐盐(在amiRNA株系中有80-85％的耐盐性，相比之下，在野生型植物中有70％的耐盐性)。组成型表达AtPQL基因的株系在耐盐性上与野生型植物相似(图24)。

如同拟南芥，在水稻植物的每个细胞中组成型过表达OsPQL1也显著地减少茎干部Na⁺积聚(图25)，这表明所编码的水稻蛋白也参与Na⁺转运。

实施例13

AtPQL1在烟草表皮细胞中的定位

使用如Tang等(Science(科学)274：2060-2063，1996)所述的农杆菌渗入法(agroinfiltration method)，在烟草表皮细胞中瞬时表达AtPQL1-GFP融合体。将渗入的植物放回到生长室3天，然后进行观察。然后通过用刀片切下一定面积的叶片(约1cm²)收集叶片的渗透面积。为了减少由于气袋产生的背景荧光，将切下的叶片样品用蒸馏水真空过滤。使用具有x20Plan Apochromat物镜的Zeiss CLSM510-UV显微镜显现叶片。用氩激光在488nm激发GFP荧光。使用NFT545二色性滤光镜来分开在两个通道之间发射的荧光，其中505-530nm带通滤光镜用于GFP，560-615nm带通滤光镜用于叶绿体的自发荧光。

如在图26中所示，通过共聚焦显微镜显现GFP荧光表明AtPQL1蛋白位于细胞的膜上。由于细胞的细胞器的位置，怀疑AtPQL1位于质膜上。

本领域技术人员应该理解，本文所述的本发明容许除具体描述的那些之外的变化和修改。应该理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还单独或集中地包括本说明书中引用或所示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两种或多种步骤或特征的任意组合和所有组合。

此外，必须注意到，用在本文中时，单数形式“一个(“a”，“an”)”和“所述(“the”)”包括复数方面，除非上下文已经另外指明。

Claims (6)

1.用于调节穿过细胞膜的单价阳离子流动的速率或水平的方法，所述方法包括调节PQ环重复多肽在包括细胞膜的细胞中的表达，其中所述PQ环重复多肽由以下组成：(i)SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；或(ii)由以下氨基酸序列组成的SEQ ID NO：9的功能同源物，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：9全长上与SEQ ID NO：9具有至少20％同一性并且包括一个或多个SEQ ID NO：1、2、5、6和7所示的氨基酸序列基序，并且所述功能同源物调节穿过细胞膜的单价阳离子流动的速率或水平，

其中所述功能同源物选自由UniProt登记号为O49437的AtPQL1，UniProt登记号为O23198的AtPQL3和UniProt登记号为Q5NBM2的OsPQL1组成的组，其中所述单价阳离子包括Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、甲铵、Tris⁺或胆碱⁺中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述多肽的单价阳离子转运被多价阳离子抑制，其中所述多价阳离子是Ca²⁺。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞膜是细胞质膜。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中调节穿过细胞的细胞膜的单价阳离子流动的速率或水平调节所述细胞的单价阳离子耐受性或敏感性。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多肽的表达通过调节编码所述多肽的核酸在细胞中的表达进行调节。

6.用于确定生物体的单价阳离子敏感性或耐受性的方法，所述方法包括确定编码PQ环重复多肽的核酸在所述生物体的一个或多个细胞中的表达，其中所述PQ环重复多肽由以下组成：(i)SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；或(ii)由以下氨基酸序列组成的SEQ ID NO：9的功能同源物，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：9全长上与SEQ ID NO：9具有至少20％同一性并且包括一个或多个SEQ ID NO：1、2、5、6和7所示的氨基酸序列基序，并且所述功能同源物调节穿过所述生物体的细胞膜的单价阳离子流动的速率或水平，其中所述功能同源物选自由UniProt登记号为O49437的AtPQL1，UniProt登记号为O23198的AtPQL3和UniProt登记号为Q5NBM2的OsPQL1组成的组，其中所述单价阳离子包括Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、甲铵、Tris⁺或胆碱+中的一种或多种。