EA022359B1

EA022359B1 - Активность катионных каналов

Info

Publication number: EA022359B1
Application number: EA201270459A
Authority: EA
Inventors: Марк Альфред Тестер; Брент Кайзер; Скотт Энтони Уилльям Картер; Моник Ширер; Даррен Крейг Плетт; Стюарт Джон Рой; Оливье Котсафтис; Стефан Тьерман; Мамору Окамото
Original assignee: Острэйлиан Сентр Фор Плант Фанкшенл Дженомикс Пти Лтд.
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2010-09-24
Publication date: 2015-12-30
Also published as: EA201270459A1; US20130042373A1; AU2010300093B2; CN102656269A; WO2011035386A1; AU2010300093A1; CN102656269B

Abstract

Изобретение относится, частично, к функциональной характеристике мембраносвязанных белков, которые способствуют катионному потоку через биологические мембраны. Согласно данному изобретению было определено, что, по меньшей мере, некоторые полипептиды с повторами PQ-петель способствуют потоку катионов через биологические мембраны.

Description

Заявление о приоритете

Заявка на данный патент испрашивает приоритет согласно австралийской предварительной заявки на патент 2009904675, поданной 25 сентября 2009 г., содержание которой включено посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к функциональной характеристике мембраносвязанных белков, которые способствуют катионному потоку через биологические мембраны.

Уровень техники

Потенциалонечувствительные неселективные катионные каналы (νίΝδϋϋ) наблюдаются во многих живых системах, например растениях, животных и дрожжах. Этот класс катионного канала описан как имеющий относительно низкую способность различения между одновалентными катионами (например, Να'. К', ΝΗ·|'. Ы⁺ и т.д.) и ингибируемый двухвалентными катионами, такими как Са²' и Мд²'.

Потенциалонечувствительность не является строго применяемым термином. Белок, обнаруживающий некоторую чувствительность к потенциалу (напряжению), может все еще рассматриваться в пределах класса νίΝδί'Ό Вследствие этого, хотя эти белки обнаруживают некоторую слабую потенциалозависимость, их все еще называют νίΝ^Ο

Обширные данные были получены о белках νίΝδΟΟ посредством применения электрофизиологии. Считается, что νίΝδΟΟ являются вескими кандидатами, превосходящими наблюдаемые потоки катионов низкой аффинности в биологических системах. Они включают быстрое поступление Να', наблюдаемое в растениях, подвергнутых действию условий засоленной почвы, и поступление ΝΗ₄ ⁺ в растения при подвергании их корневых систем действию физиологически высоких концентраций ΝΗ₄ ⁺.

В то время как соленость является основным термином, относящимся ко всем солям в почве, наиболее релевантной солью для большинства систем земледелия является №С1. Засоленность может влиять на приспособляемость растений через вызывание изменений в осмотической среде и через ионную токсичность. Первичный поток Να' в растение облегчается неизвестным белком. Быстрое накапливание Να' наблюдали в побегах растений, когда корни подвергали действию условий засоления. Были получены корреляции между накапливанием Να' в побегах и симптомами Να'-токсичности.

Этот поток является результатом облегченного движения Να' через клеточные мембраны. В то время как многие белки, облегчающие поток Να' через мембраны растений, были описаны, молекулярная идентичность белка, который делает возможным поток Να' способом, наблюдаемым в экспериментах с накапливанием Να', остается неизвестной.

Таким образом, желательной была бы идентификация и характеристика мембраносвязанных белков, которые способствуют потоку Να' или другого катиона через биологические мембраны.

Ссылка на любой известный уровень техники в этом описании не является признанием и не должна считаться признанием или любой формой предположения, что этот известный уровень образует часть обычного общего знания в любой стране.

Сущность изобретения

Данное изобретение основано, частично, на функциональной характеристике мембраносвязанных белков, которые способствуют катионному потоку через биологические мембраны.

Таким образом, в первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ модуляции скорости, уровня или паттерна потока катионов через мембрану клетки, предусматривающий модуляцию экспрессии полипептида с повторами РО-петель в клетке, содержащей клеточную мембрану.

В некоторых вариантах осуществления этот полипептид с повторами РО-петель включает УЭЯ352\\-подобный полипептид с повторами РО-петель.

В другом варианте осуществления этот полипептид с повторами РО-петель включает УОБ092\\подобный полипептид с повторами РО-петель.

Обычно полипептиды с повторами РО-петель, рассматриваемые для применения в соответствии с данным изобретением, включают полипептиды с повторами РО-петель, которые определяют потенциалонечувствительный неселективный катионный канал (νίΝδίΥ). В свете вышесказанного в некоторых вариантах осуществления полипептид с повторами РО-петель включает транспортер одновалентных катионов. В других дополнительных вариантах осуществления транспорт одновалентных катионов при помощи полипептида с повторами РО-петель может ингибироваться поливалентным катионом.

В некоторых вариантах осуществления модуляция скорости, уровня или паттерна потока катионов через клеточную мембрану этой клетки модулирует толерантность или чувствительность к катионам этой клетки. В одном конкретном варианте осуществления этот способ может быть использован для увеличения толерантности клетки, такой как клетка растения, к Να'-катионам.

Во втором аспекте данное изобретение обеспечивает клетку с модулированными скоростью, уровнем или паттерном катионного потока через мембрану этой клетки, где указанная модуляция является результатом модулированной экспрессии полипептида с повторами РО-петель в этой клетке.

В некоторых вариантах осуществления клетку второго аспекта этого изобретения получают в соответствии со способом первого аспекта этого изобретения.

В третьем аспекте данное изобретение обеспечивает многоклеточную структуру, содержащую одну или более клеток второго аспекта этого изобретения.

- 1 022359

В четвертом аспекте данное изобретение обеспечивает конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту РРБ. В некоторых вариантах осуществления эта конструкция является экспрессионной конструкцией, которая может быть использована для действия на экспрессию полипептида с повторами РР-петель в клетке, как описано со ссылкой на первый аспект этого изобретения.

В пятом аспекте данное изобретение обеспечивает генетически модифицированную клетку, содержащую конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор четвертого аспекта этого изобретения.

Кроме того, в шестом аспекте данное изобретение обеспечивает многоклеточную структуру, содержащую одну или более клеток пятого аспекта этого изобретения.

В седьмом аспекте данное изобретение обеспечивает способ выяснения чувствительности или толерантности организма к катионам, предусматривающий определение экспрессии полипептида с повторами РР-петель в одной или более клетках этого организма. В некоторых вариантах осуществления относительно высокий уровень экспрессии ассоциируется с чувствительностью к катионам в этом организме. В другом варианте осуществления относительно низкий уровень экспрессии ассоциируется с толерантностью к катионам в этом организме.

Следует понимать, что на протяжении этого описания, если контекст не требует иного, слово содержат или вариации, такие как содержит или содержащий, обозначают включение указанного элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел, но не исключение любого другого элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности называют здесь по номеру-идентификатору последовательности (8ЕР ГО N0:). 8ЕР ГО N0: соответствует в цифрах идентификаторам последовательностей <400> 1 (ХЕР ГО N0:1), <400> 2 (ХЕР ГО N0:2) и т.д. Суммирование идентификаторов последовательностей обеспечено в табл. 1. Список последовательностей обеспечен в конце этого описания.

Таблица 1

Суммирование идентификаторов последовательностей

Идентификатор последовательности	Последовательность
3Εζ> ΙΌ N0:1	Аминокислотный мотив ΚΕΡζΠΧΧΝ
ЗЕО ΙΌ N0:2	Аминокислотный мотив УХЪЗ
5Е0 Ю N0:3	Консенсусная аминокислотная последовательность ΥϋΡ352ν-подобного полипептида
ЗЕО ΙΏ N0:4	Аминокислотная последовательность

- 2 022359

	полипептида ΥΟΚ352»
ЭЕО ГО N0:5	Аминокислотный мотив ΡζιΙΧΧΝΡ
2Е<2 ГО N0:6	Аминокислотный мотив СЮ1РЫЬ
ЗЕ<2 ГО N0:7	Аминокислотный мотив ΡΟΙΧΕΝΧΚΕ
5Ε<2 ГО N0:8	Консенсусная аминокислотная последовательность УОЬ092и7-подобного полипептида
ΞΕζ3 ГО N0:9	Аминокислотная последовательность полипептида УОЬ092и
3Εζ) ГО N0:10	Нуклеотидная последовательность обратного праймера АЬРОЫ
5ЕС ГО N0:11	Нуклеотидная последовательность обратного праймера АСРГ)Ы
3Εβ ГО N0:12	Нуклеотидная последовательность прямого праймера А1РГ)Ь2
ЗЕ<2 ГО N0:13	Нуклеотидная последовательность обратного праймера Α1Ρζ)Ε2
ЗЕГ) ГО N0:14	Нуклеотидная последовательность прямого праймера АбРОЬЗ
5Е<2 ГО N0:15	Нуклеотидная последовательность обратного праймера АбРОЬЗ
ЗЕ<2 ГО N0:16	Нуклеотидная последовательность прямого праймера ОзРфЫ
5Е<2 ГО N0:17	Нуклеотидная последовательность обратного праймера ОзР0Ъ1
ЗЕО ГО N0:18	Нуклеотидная последовательность праймера I πιίκ-з
ЗЕГ) ГО N0:19	Нуклеотидная последовательность праймера II κιϊΕ-а
3Εζ) ГО N0:20	Нуклеотидная последовательность праймера III πιίΚ*Ξ
ЗЕ(3 ГО N0:21	Нуклеотидная последовательность праймера IV ш1К*а
ЗЕС ГО N0:22	Нуклеотидная последовательность праймера I ΙίΐΐΕ-δ

- 3 022359

3Εζ) ΙΌ МО: 23	Нуклеотидная последовательность праймера ΙΙπιίΕ-а
3Ε<2 ΙΟ НО:24	Нуклеотидная последовательность праймера ИХ πιίΚ.*Ξ
3Εζ) Ю N0:25	Нуклеотидная последовательность праймера IV пй.К*а
3Ε<2 ΙΏ N0:26	Нуклеотидная последовательность праймера I πιίΕ-з
5Ε<3 Ю N0:27	Нуклеотидная последовательность праймера ИтаЕ-а
5Ε<5 ΙΟ N0:28	Нуклеотидная последовательность праймера III Ш1Е*3
3Ε(3 Ю N0:29	Нуклеотидная последовательность праймера IV т1Е*а
3Ε(5 Ю N0:30	Нуклеотидная последовательность праймера I ιηίΕ-з
3Εζ) ΙΌ N0:31	Нуклеотидная последовательность праймера Ит1Е-а
5Εζ) ΙΌ N0:32	Нуклеотидная последовательность праймера III π>ίΕ*3
5Ε(3 Ιϋ N0:33	Нуклеотидная последовательность праймера IV т1Е*а
5Ε<3 Ιϋ N0:34	Нуклеотидная последовательность праймера I ιηίΕ-з
3Ε<2 Ю N0:35	Нуклеотидная последовательность праймера ΙΙπιίΕ-а
3Ε<2 ΙΟ N0:36	Нуклеотидная последовательность праймера III ιηίΒ*8
ΞΕζ) Ю N0:37	Нуклеотидная последовательность праймера IV т1Е*а
5Εζ) ΙΟ N0:38	Нуклеотидная последовательность праймера I Π1ΪΕ-3
3Ε0 ΙΏ N0:39	Нуклеотидная последовательность праймера ΙΙπιίΕ-а

- 4 022359

ЗЕГ) ГО N0:40	Нуклеотидная последовательность праймера III ιηίΚ*Ξ
ЗЕО ГО N0:41	Нуклеотидная последовательность праймера IV пи.К*а
ЗЕО ГО N0:42	Нуклеотидная последовательность праймера I 1ΠΪΕ-Ξ
ЗЕО ГО N0:43	Нуклеотидная последовательность праймера ΙΙιηίΕ-а
5Е0 ГО N0:44	Нуклеотидная последовательность праймера III ιηϊΕ*3
ЗЕО ГО N0:45	Нуклеотидная последовательность праймера IV пп.Е*а
ЗЕО ГО N0:46	Нуклеотидная последовательность праймера I ιηίΕ-д
ЗЕО ГО N0:47	Нуклеотидная последовательность праймера ΙΙιηίΕ-а
ЗЕО ГО N0:48	Нуклеотидная последовательность праймера III ш1Е*з
ЗЕО ГО N0:49	Нуклеотидная последовательность праймера IV га1Е*а
ЗЕО ГО N0:50	Нуклеотидная последовательность мишени ΐιηίΗΝΑ А1Р0Ы&2 #1
ЗЕО ГО N0:51	Нуклеотидная последовательность мишени 3ΐηίΕΝΑ А£Р0Ь1&2 #2
ЗЕО ГО ΝΟ:52	Нуклеотидная последовательность мишени θπιίΕΝΑ АЪРОЫ&З #1
ЗЕО ГО N0:53	Нуклеотидная последовательность мишени ΗΐηίΕΝΑ АДРОЫ&З #2
ЗЕО ГО N0:54	Нуклеотидная последовательность мишени атхЕЫА АДРрЬ2&3 #1
ЗЕО ГО N0:55	Нуклеотидная последовательность мишени аттЕИА АСР0Е2&3 #2
ЗЕО ГО N0:56	Нуклеотидная последовательность мишени аштЕНА А1Р0Ы, 2&3 #1

ЗЕО ГО N0:57

Нуклеотидная последовательность мишени βκιίΕΝΑ АЬРОЫ, 2&3 #2

Описание примерных вариантов осуществления

Должно быть понятно, что следующее описание приведено только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначено для ограничения в отношении приведенного выше описания.

Как представлено выше, данное изобретение основано, частично, на функциональной характеристике мембраносвязанных белков, которые способствуют катионному потоку через биологические мембраны. В соответствии с данным изобретением было определено, что, по меньшей мере, некоторые из полипептидов с повторами РО-петель способствуют катионному потоку через биологические мембраны.

Полипептиды с повторами РО-петель, рассматриваемые здесь, характеризуются повторами остатков пролина и глутамина (РО) перед внемембранной петлей. Этот мотив называют здесь мотивом РОпетель. Обычно полипептид с повторами РО-петель содержит 1, 2, 3, 4 или 5 мотивов с повторами РОпетель. Должно быть понятно, что в некоторых вариантах осуществления термин полипептид с повто- 5 022359 рами РР-петель включает полипептид, содержащий один или два мотива петель Рр.

В некоторых вариантах осуществления полипептид с повторами РР-петель содержит Υ06092νподобный полипептид с повторами РР-петель.

В некоторых вариантах осуществления УОЬ092'№-подобный полипептид с повторами РР-петель может содержать один или более аминокислотных мотивов, выбранных из списка, состоящего из

РР1ХХМР (8ЕР ГО N0:5) где остаток 3 (I) может быть заменен Ь или V, остатки 4 и 5 (X), каждый, могут быть любым аминокислотным остатком или каждый или оба могут отсутствовать и остаток 7 (Р) может быть заменен Υ;

или

СИНЕМ. (8ЕС) ГО N0:6) где остаток 3 (I) может быть заменен V или Р и остаток 6 (Ь) может быть заменен V; или

РРЕМЛХкК (8ЕР ΙΌ N0:7) где остаток 3 (I) может быть заменен А, остаток 4 (X) может быть любым аминокислотным остатком или может отсутствовать, остаток 5 (Ь) может быть заменен Κ или М, остаток 7 (X) может быть любым аминокислотным остатком или может отсутствовать, остаток 8 (Κ) может быть заменен К и остаток 9 (К) может быть заменен А.

В некоторых вариантах осуществления У0Е092\у-подобный полипептид с повторами РР-петель может содержать аминокислотные мотивы, представленные в 8ЕР ГО N0:5 и 8ЕР ГО N0:6;

аминокислотные мотивы, представленные в 8ЕР ГО N0:5 и 8ЕР ГО N0:7;

аминокислотные мотивы, представленные в 8ЕР ГО N0:6 и 8ЕР ГО N0:7; или аминокислотные мотивы, представленные в 8ЕР ГО N0:5, 8ЕР ГО N0:6 и 8ЕР ГО N0:7.

В дополнительных вариантах осуществления У0Е092\у-подобный полипептид с повторами РРпетель может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична консенсусной последовательности У0Е092\у-подобного полипептида с повторами РР-петель. представленной в 8ЕР ГО N0:8.

Еще в одном дополнительном варианте осуществления У0Е092\у-подобный полипептид с повторами РР-петель может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична аминокислотной последовательности полипептида Υ0Ε092\ν с повторами Рр-петель, представленной в 8ЕР ГО N0:9.

Должно быть понятно, что ссылка в настоящем описании на по меньшей мере 20% идентичность включает также уровни идентичности, более высокие чем 20%, в том числе, например, по меньшей мере 30% идентичность, по меньшей мере 40% идентичность, по меньшей мере 50% идентичность, по меньшей мере 60% идентичность, по меньшей мере 70% идентичность, по меньшей мере 80% идентичность, по меньшей мере 90% идентичность или по меньшей мере 95% идентичность.

При сравнении аминокислотных последовательностей сравниваемые последовательности должны сравниваться на протяжении окна сравнения по меньшей мере 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 аминокислотных остатков, по меньшей мере 300 аминокислотных остатков или на протяжении полной длины 8ЕР ГО N0:8 или 8ЕР ГО N0:9. Окно сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) приблизительно 20% или менее в сравнении со ссылочной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может проводиться компьютеризованными внедрениями алгоритмов, таких как семейство программ ВЬЛ§Т, таких как программы, описанные, например, Л115сйп1 е! а1. (№с1. Λείάδ Кек. 25: 3389-3402, 1997). Подробное обсуждение анализа последовательностей может быть найдено в ИпИ 19. 3 ЛикиЬе1 е! а1. (Сиггеп! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду 1обп АНеу & §опк 1пс, 1994-1998, Сбар1ег 15, 1998).

Термин 'У0Ь092'№-подобный полипептид с повторами РР-петель относится также к функциональным гомологам полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕР ГО N0:9. Функциональные гомологи включают любой полипептид с повторами Рр-петель, который способен модулировать скорость, уровень или паттерн потока катионов через мембрану клетки.

Несмотря на вышесказанное, этот функциональный гомолог может содержать, например, полипептид, который имеет одну или более инсерций, делеций или замен аминокислот относительно полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕР ГО N0:9; мутантную форму или аллельный вариант полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕР ГО N0:9; ортолог полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕР ГО N0:9; аналог полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕР ГО N0:9; и т.п.

Примеры У0Е092\у-подобных полипептидов с повторами РР-петель включают полипептиды, имеющие следующие номера доступа: Ж_014549 (Зассбаготусек сегеу1к1ае Υ06092ν), ЕРЖ>4758 (8ассбаготусек сегеугкгае Υ1Μ789), №_009705 (Зассбаготусек сегеугкгае ΥΒΚ147ν), №_594596 (§1т1

- 6 022359

8П|/о8асПаготусе8 ротЬе), АгаЬ14ор818 (ПаПапа Л!4д20100, ЛгаЫ4ор818 (ПаПапа Л!4д36850, ААК76703 (АгаЫ4ор818 ШаПапа), АгаЫ4ор818 (ПаПапа А(2д41050, АтаЬМор818 (ПаПапа А!5д59470, АгаЫ4ор818 (ПаПапа А15д40б70. АгаЬМор818 (ПаПапа А(4д07390. Огу/а зайуа 0§01д1б170, Огу/а заПуа Оз07д29610, Огу/а заПуа 0δ12§18110, Огу/а зайуа Θδ01§0266800, ХР_001753587 (РЬу8сотПге11а ра(еп8), РПузсотПтеПа ра(епз Рр174957, РПузсотйгеПа ра(епз Рр182799, РПузсотПтеПа ра(епз Рр217317 и РПузсотПтеПа ра(епз Рр210671.

В некоторых вариантах осуществления УОЬ092'№-подобный полипептид с повторами РЦ-петель содержит по меньшей мере 5 трансмембранных доменов. В некоторых вариантах осуществления УОЬ092'№-подобный полипептид с повторами РЦ-петель содержит по меньшей мере 7 трансмембранных доменов. В дополнительных вариантах осуществления УОЬ092'№-подобный полипептид с повторами РОпетель содержит 7 трансмембранных доменов вместе с цитоплазматической петлей, соединяющей трансмембранные домены 3 и 4.

В некоторых вариантах осуществления полипептид с повторами РЦ-петель содержит ΥΏΚ352γподобный полипептид с повторами РЦ-петель.

В некоторых вариантах осуществления Υ^Β352\γ-ηодобный полипептид с повторами РЦ-петель может содержать один или более аминокислотных мотивов, выбранных из списка, состоящего из

КЬРРГСХЫ (8ЕО ГО ЫО:1) где остаток 2 (Ь) может быть заменен I, остаток 5 (I) может быть заменен V, Р или Ь, остатки 6 и 7 (Х), каждый, могут быть любым аминокислотным остатком или каждый или оба могут отсутствовать и остаток 8 (Ν) может быть заменен С или I;

или

ΥΧΕ8 (8ЕО ГО Ш:2) где остаток 1 (Υ) может быть заменен К, остаток 2 (X) может быть любым аминокислотным остатком или может отсутствовать, остаток 3 (Ь) может быть заменен Р или I и остаток 4 (8) может быть заменен Т.

В некоторых вариантах осуществления Υ^К352γ-подобный полипептид с повторами РЦ-петель может содержать, каждый, аминокислотные мотивы, представленные в 8Е0 ГО NО:1 и 8Е0 ГО NО:2.

В дополнительных вариантах осуществления Υ^К352γ-подобный полипептид с повторами Р0петель может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична консенсусной последовательности Υ^К352γ-подобного полипептида с повторами РЦ-петель, представленной в 8Е0 ГО NО:3.

В другом дополнительном варианте осуществления Υ^К352γ-подобный полипептид с повторами РЦ-петель может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична аминокислотной последовательности Υ^К352γ-подобного полипептида с повторами РОпетель, представленной в 8ЕО ГО NО:4.

Ссылка в настоящем описании на по меньшей мере 20% идентичность включает также уровни идентичности, более высокие чем 20%, в том числе, например, по меньшей мере 30% идентичность, по меньшей мере 40% идентичность, по меньшей мере 50% идентичность, по меньшей мере 60% идентичность, по меньшей мере 70% идентичность, по меньшей мере 80% идентичность, по меньшей мере 90% идентичность или по меньшей мере 95% идентичность.

При сравнении аминокислотных последовательностей сравниваемые последовательности должны сравниваться на протяжении окна сравнения по меньшей мере 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 аминокислотных остатков, по меньшей мере 300 аминокислотных остатков или на протяжении полной длины 8ЕО ГО NО:3 или 8ЕО ГО NО:4. Окно сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) приблизительно 20% или менее в сравнении со ссылочной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может проводиться компьютеризованными внедрениями алгоритмов, таких как семейство программ ВЬА8Т, таких как программы, описанные, например, Л1(8с1ш1 е( а1. (№с1. АсМз Кез. 25: 3389-3402, 1997). Подробное обсуждение анализа последовательностей может быть найдено в Иий 19. 3 Аи8иЬе1 е( а1. (Сштеп! Рго(осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1оПп \Уйеу & 8опз Шс, 1994-1998, СПар(ег 15, 1998).

Термин 'УО352\г-подобный полипептид с повторами РЦ-петель включает также функциональные гомологи полипептида, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО NО:4. Функциональные гомологи включают любой полипептид с повторами РЦ-петель, который способен модулировать скорость, уровень или паттерн потока катионов через мембрану клетки.

Несмотря на вышесказанное, этот функциональный гомолог может содержать, например, полипептид, который имеет одну или более инсерций, делеций или замен аминокислот относительно полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО NО:4; мутантную форму или аллельный вариант полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО NО:4; ортолог полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО NО:4; аналог полипептида, содержащего аминокислотную последователь- 7 022359 ность, представленную в δΕΟ ГО N0:4; и т.п.

Примеры УОР352\\-подобных полипептидов с повторами РО-петель включают полипептиды, имеющие следующие номера доступа:

дл. 1151942326 ЗассЬаготусез сегеутзтае УЛМ789, дл. |167389211 ЗассЬаготусее сегеухелае ΥΟΕ3 52ν/, дл. |114554372 Раза (лгод1оду(лез, дл. |92110021 Ното вартепз, дл. |34526924 Ното зараепв, дл. 1168002094 РЪузсотл.бге11а рабепз, дл. 1119615288 Ното зараепз, дл. 1153791811 Ното зарлепз, да1119599108 Ното зархепз, дл. 147077705 Ното зараепз и Оз7д29610.

Обычно полипептиды с повторами РО-петель. рассматриваемые для применения в соответствии с данным изобретением, включают полипептиды с повторами РО-петель. которые определяют Потенциалонечувствительный неселективный катионный канал (νίΝδΟΟ).

Как указано в настоящем описании, потенциалонечувствительным неселективным катионным каналом или νίΝδΟΟ называют полипептид катионного канала, имеющий относительно низкую способность различения между одновалентными катионами (например, Να', К', ΝΗ₄', Ы⁺). В некоторых вариантах осуществления νίΝδΟΟ может также ингибироваться поливалентными катионами, такими как Са²' и Мд²'. Термин потенциалонечувствительность не является строго применяемым термином при использовании со ссылкой на νίΝδΟΟ. Как таковой, полипептид, обнаруживающий некоторую чувствительность к потенциалу, все еще считается находящимся в пределах класса νίΝδΟΟ (например, см. Эауепрой апй Те51ет, Р1аи1 РЬу8ю1. 122: 823-834, 2000). Таким образом, хотя полипептид с повторами РОпетель может обнаруживать некоторую слабую потенциалочувствительность, он может все еще рассматриваться как νίΝδΟΟ в пределах данного изобретения. В соответствии с вышесказанным, νίΝδΟΟ может также называться ΝδΟΟ, и для целей этого описания эти два термина должны считаться синонимичными и взаимозаменяемыми.

В свете вышесказанного, в некоторых вариантах осуществления полипептид с повторами РО-петель содержит транспортер одновалентных катионов. В дополнительных вариантах осуществления этот одновалентный катион включает один или более из Να', К+, ΝΗ₄+, метиламмония, ТпС или холина'.

В других дополнительных вариантах осуществления транспорт одновалентного катиона полипептидом с повторами РО-петель может быть ингибирован поливалентным катионом.

Примеры поливалентных катионов, которые могут ингибировать транспорт одновалентных катионов белком с повторами РО-петель, включают двухвалентные катионы, включающие Ве²', Мд²', Са²', δτ²', Ва²⁺ и Ка²', а также двухвалентные ионы металлов переходного ряда, такие как Ζη²', Ре²⁺ и т.п. В некоторых вариантах осуществления этим двухвалентным катионом может быть Са^2'.

В некоторых вариантах осуществления поливалентный катион может быть трехвалентным катионом, таким как Ьа³⁺.

Как установлено выше, данное изобретение обеспечивает способ модуляции скорости, уровня или паттерна потока катионов через мембрану клетки.

В данном контексте клеточной мембраной может быть любая мембрана клетки, через которую может быть желательной модуляция скорости, уровня или паттерна потока катионов. Примеры таких клеточных мембран включают, например, плазматическую мембрану или мембраны органелл, такие как мембраны хлоропластов, мембраны тилакоидов, митохондриальные мембраны (внутренняя или наружная), эндоплазматический ретикулум, мембраны аппарата Гольджи, вакуолярные мембраны, ядерные мембраны, акросомные мембраны, аутофагосомные мембраны, гликосомные мембраны, глиоксисомные мембраны, гидрогеносомные мембраны, лизосомные мембраны, меланосомные мембраны, митосомные мембраны, пероксисомные мембраны, мембраны пузырьков и т.п.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ модуляции скорости, уровня и паттерна потока катионов через плазматическую мембрану клетки.

Клетки, рассматриваемые данным изобретением, могут включать любую клетку, содержащую мембрану, как обсуждалось выше. Таким образом, эта клетка может быть клеткой животного, в том числе клеткой млекопитающего, клеткой человека, клеткой птицы, клеткой насекомого, клеткой пресмыкающегося и т.п.; растительной клеткой, в том числе покрытосеменных или голосеменных высших растений, а также низших растений, таких как мохообразные, папоротниковые и хвощи; грибной клеткой, такой как дрожжи или мицелиальный гриб и т.п. Альтернативно, этой клеткой может быть также прокариотическая клетка, такая как бактериальная клетка (например, клетка Е. сой) или клетка архебактерии.

В некоторых вариантах осуществления этой клеткой может быть, например, растительная клетка, клетка сосудистого растения, в том числе клетка однодольного или двудольного покрытосеменного растения или клетка голосеменного растения. В некоторых вариантах осуществления этой растительной клеткой может быть клетка однодольного растения. В некоторых вариантах осуществления этой клеткой может быть растительная клетка зерновой культуры.

В данном контексте термин зерновое культурное растение включает членов Роасеае (семейство

- 8 022359 травянистых растений), которые продуцируют годное в пищу зерно для пищи человека и животных. Примеры зерновых культурных растений Роасеае включают ячмень, пшеницу, рис, кукурузу, просо, сорго, рожь, тритикале, овес, тэфф (полевичку абиссинскую), дикий рис, спельту (пшеничку) и т.п. Однако должно быть понятно, что термин зерновое культурное растение включает ряд видов, не принадлежащих к семейству Роасеае, которые также продуцируют годное в пищу зерно и известны как псевдозерновые, такие как амарант, гречиха и лебеда квиноа.

В дополнительных вариантах осуществления этим растением может быть двудольное растение, в том числе, например, бобовые, такие как соя (О1усше крр.), различные виды гороха и клевера, другие двудольные масличные сельскохозяйственные культуры, такие как Вга881са 8рр., и культурные растения семейства 8о1апасеае, такие как томаты, перец, перец стручковый, картофель, баклажан и т.п.

В некоторых вариантах осуществления модуляция скорости, уровня или паттерна потока катионов через клеточную мембрану клетки модулирует толерантность или чувствительность клетки к катионам.

Например, в некоторых вариантах осуществления полипептид с повторами Ρβ-петель в клетке может понижающим образом регулироваться для уменьшения потока конкретного катиона через плазматическую мембрану и, следовательно, или снижать чувствительность этой клетки к данному катиону, и/или увеличивать толерантность этой клетки к катионам окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления этот катион может быть одновалентным катионом. В других вариантах осуществления этот катион может содержать любой один или более из Ν;·ι'. К'. ΝΗ₄+, метиламмония, Тг18⁺ или холина'. В некоторых вариантах осуществления этот способ может быть использован для увеличения толерантности клетки, такой как растительная клетка, к №⁺-катионам.

Напротив, данное изобретение рассматривает также увеличение потока катиона через клеточную мембрану. В этих вариантах осуществления экспрессия полипептида с повторами Ρβ-петель может быть увеличена в клетке. Как описано далее в примерах, увеличение мембранного потока катиона конститутивно во всех клетках организма может увеличивать толерантность этого организма в целом к этому катиону.

Как установлено выше, данное изобретение основано, частично, на модуляции экспрессии полипептида с повторами Ρβ-петель в клетке.

В данном контексте модуляция экспрессии полипептида с повторами Ρβ-петель включает модуляцию уровня и/или активности этого полипептида.

Должно быть понятно, что модуляция уровня полипептида включает увеличение или уменьшение уровня или количества полипептида с повторами Ρβ-петель в клетке или конкретной части клетки. Подобным образом, должно быть понятно, что модуляция активности полипептида с повторами Ρβпетель включает увеличение или уменьшение, например, общей активности, конкретной активности, времени полужизни и/или стабильности полипептида в этой клетке.

Под увеличением имеется в виду, например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 2-кратное, 5-кратное, 10-кратное, 20-кратное, 50-кратное, 100-кратное увеличение в уровне активности полипептида с повторами Ρβ-петель в клетке. Под уменьшением имеется в виду, например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% уменьшение в уровне или активности полипептида с повторами Ρβ-петель в клетке.

Должно быть также понятно, что модуляция включает введение конкретного полипептида с повторами Ρβ-петель в клетку, которая в норме не экспрессирует вводимый полипептид, или по существу полное ингибирование активности полипептида с повторами Ρβ-петель в клетке, которая в норме экспрессирует такой полипептид.

Данное изобретение рассматривает любые средства, посредством которых может быть модулирована экспрессия полипептида с повторами Ρβ-петель в клетке. Это включает, например, такие способы, как применение агентов, которые модулируют активность полипептида с повторами Ρβ-петель в клетке, в том числе применение агонистов или антагонистов; применение агентов, которые имитируют активность полипептида с повторами Ρβ-петель в клетке; модуляция экспрессии нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид с повторами Ρβ-петель в этой клетке; выполнение экспрессии измененной или мутированной нуклеиновой кислоты в клетке, так что полипептид с повторами Ρβ-петель экспрессируется клеткой с увеличенной или уменьшенной специфической активностью, временем полужизни и/или стабильностью экспрессируется этой клеткой; или модуляция паттерна экспрессии и/или нацеливания полипептида с повторами Ρβ-петель в клетке, например, через модификацию регуляторной последовательности транскрипции и/или сигнального полипептида, ассоциированного с полипептидом с повторами Ρβ-петель.

В некоторых вариантах осуществления экспрессия этого полипептида модулируется модуляцией экспрессии нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид с повторами Ρβ-петель, в этой клетке.

В данном контексте нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид с повторами Ρβ-петель (нуклеиновой кислотой ΡβΕ), называют любую нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид с повторами Ρβ-петель или функциональный активный фрагмент или вариант такого полипептида. Конкретные примеры нуклеиновых кислот ΡβΕ включают нуклеиновые кислоты, которые кодируют описанные здесь выше полипептиды с повторами Ρβ-петель.

- 9 022359

Нуклеиновые кислоты РОЬ данного изобретения могут быть получены из любого источника. Например, нуклеиновые кислоты РОЬ могут быть получены из такого организма, как растение, животное или гриб. Альтернативно, нуклеиновая кислота РОЬ может быть синтетической нуклеиновой кислотой.

Нуклеиновые кислоты РОЕ рассматриваемые данным изобретением, могут также содержать один или более нетранслируемых областей, таких как 3'- и 5'-нетранслируемые области и/или интроны.

Нуклеиновые кислоты РОЕ рассматриваемые данным изобретением, могут содержать, например, последовательности мРНК, последовательности кДНК или геномные нуклеотидные последовательности.

Термин модуляция в отношении экспрессии нуклеиновой кислоты РОЬ может включать увеличение или уменьшение транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты РРЬ в клетке.

Под увеличением имеется в виду, например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 2-кратное, 5-кратное, 10-кратное, 20-кратное, 50-кратное, 100-кратное или большее увеличение транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты РОЕ Под уменьшением имеется в виду, например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% уменьшение транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты РОЕ Модуляция включает также введение экспрессии РОГ. в норме не обнаруживаемой в конкретной клетке; или по существу полное ингибирование (например, нокаут) экспрессии нуклеиновой кислоты РОЬ в клетке, которая в норме имеет такую активность.

Данное изобретение рассматривает любые средства, посредством которых может модулироваться экспрессия нуклеиновой кислоты РОЕ Например, примерные способы модуляции экспрессии нуклеиновой кислоты РОЬ включают, например, генетическую модификацию клетки для повышающей регуляции или понижающей регуляции эндогенной экспрессии нуклеиновой кислоты РОЕ генетическую модификацию посредством трансформации нуклеиновой кислотой РОЕ генетическую модификацию для увеличения копийности нуклеиновой кислоты РОЬ в клетке; введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, которая модулирует экспрессию эндогенной нуклеиновой кислоты РОЬ в этой клетке; и т.п.

В некоторых вариантах осуществления экспрессия нуклеиновой кислоты РОЬ модулируется генетической модификацией клетки. Термин генетически модифицированная в данном контексте должен пониматься как включение любой генетической модификации, которая производит изменение в экспрессии нуклеиновой кислоты РОЬ в генетически модифицированной клетке относительно не модифицированной генетически формы этой клетки. Примерные типы генетической модификации включают неспецифический мутагенез, такой как транспозонный, химический, УФ- и фаговый мутагенез, вместе с отбором мутантов, которые сверхэкспрессируют или недостаточно экспрессируют эндогенную нуклеиновую кислоту РОЕ транзиторное или стабильное введение одной или более молекул нуклеиновых кислот в клетку, которые управляют экспрессией и/или сверхэкспрессией нуклеиновой кислоты РОЬ в клетке; модуляцию эндогенного полипептида с повторами РО-петель сайт-направленным мутагенезом эндогенной нуклеиновой кислоты РОЕ введение одной или более молекул нуклеиновых кислот, которые ингибируют экспрессию эндогенной нуклеиновой кислоты РОЬ в клетке, например, косупрессионной конструкции или ΚΝΑί-конструкции; и т.п.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение рассматривает увеличение уровня полипептида с повторами РО-петель в клетке введением экспрессии нуклеиновой кислоты РОЬ в клетку, повышающей регуляцией экспрессии нуклеиновой кислоты РОЬ в этой клетке и/или увеличением копийности нуклеиновой кислоты РОЬ в этой клетке.

Способы трансформации и экспрессии введенной нуклеотидной последовательности в различных типах клеток хорошо известны в данной области, и данное изобретение рассматривает применение любого подходящего способа.

Однако в качестве примера относительно трансформации клеток растений делается ссылка на Ζΐιαο е! а1. (Мо1. ВгееФпд ΌΟΙ 10.1007/511032-006-9005-6, 2006), Ка!5иЪага е! а1. (Р1ап! Се11 РЬузю1. 44(12): 13781383, 2003), ОЫа е! а1. (РЕВ8 Ье!!ег5 532: 279-282, 2002) и Уи е! а1. (Р1ап! 8с1епсе 169: 65-73, 2005).

В следующих вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает также способы понижающей регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты РОЬ в клетке. Например, с идентификацией последовательностей нуклеиновых кислот РОЕ данное изобретение способствует также таким способам, как нокаут или нокдаун нуклеиновой кислоты РОЬ в клетке с использованием способов, включающих, например:

(ί) инсерционный мутагенез, включающий нокаут или нокдаун нуклеиновой кислоты в клетке гомологичной рекомбинацией с нокаут-конструкцией (в отношении разрушения гена-мишени см. Тегаба е! а1., №!. Вю!есЬпо1. 20: 1030-1034, 2002);

(ίί) посттранскрипционый сайленсинг гена (РТО8) или ΚΝΑί нуклеиновой кислоты в клетке (в отношении обзора РТО8 и ΚΝΑί см. 8Ьагр, Оепек Оеу. 15(5): 485-490, 2001; и Наппоп, №йиге 418: 244-51, 2002);

(ίίί) трансформацию клетки антисмысловой конструкцией, направленной против нуклеиновой кислоты (в отношении антисмысловой супрессии см. уап бег Кго1 е! а1., №!иге 333: 866-869; уап бег Кго1 е! а1., ВюТесЬшдиек 6: 958-967; и уап бег Кго1 е! а1., Оеп. Оепе!. 220: 204-212);

(ίν) трансформацию клетки косупрессионной конструкцией, направленной против нуклеиновой кислоты (в отношении примера косупрессии см. νаη бег Кго1 е! а1., Р1ап! Се11 2(4): 291-299);

- 10 022359 (ν) трансформацию клетки конструкцией, кодирующей двухцепочечную РНК, направленной против нуклеиновой кислоты (в отношении примера бкР/ИЛ-опосредованного сайленсинга генов см. Аа1егНоике е! а1., Ргос. №И. Асай. δοΐ. И8А 95: 13959-13964, 1998);

(νί) трансформацию клетки конструкцией, кодирующей 5|КУА или шпилечную РНК, направленной против нуклеиновой кислоты (в отношении примера опосредованного 51КЛА или шпилечной РНК сайленсинга генов см. Ьи е! а1., №с1. Ααάδ Кек. 32(21): е171; йок10.1093/паг/дпЫ70, 2004); и (νίί) инсертирование тЖЫА последовательности-мишени таким образом, что она находится в функциональной связи с нуклеиновой кислотой (в отношении примера пиКУА-опосредованного сайленсинга генов см. Вго\\п е! а1., В1оой 110(13): 4144-4152, 2007).

Данное изобретение облегчает также понижающую регуляцию нуклеиновой кислоты РРЬ в клетке посредством применения синтетических олигонуклеотидов, например, кГКЫА или микроРНК, направленных против нуклеиновой кислоты РРЬ (в отношении примеров опосредованного синтетической κίΚNΑ сайленсинга см. Сар1еп е! а1., Ргос. №И. Асай. δα. И8А 98: 9742-9747, 2001; Е1ЬакЫг е! а1., Сепек Эее. 15: 188-200, 2001; Е1ЬакЫг е! а1., МПиге 411: 494-498, 2001; Е1ЬакПг е! а1., ЕМВ0 1. 20: 6877-6888, 2001; и Е1ЬакЫг е! а1., МеШойк 26: 199-213, 2002).

Наряду с примерами, описанными выше, вводимая нуклеиновая кислота может также содержать нуклеотидную последовательность, которая не относится непосредственно к нуклеиновой кислоте РРЕ но тем не менее может прямо или опосредованно модулировать экспрессию нуклеиновой кислоты РРЬ в клетке. Примеры включают молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют факторы транскрипции или другие белки, которые стимулируют или подавляют экспрессию эндогенной молекулы нуклеиновой кислоты РРЬ в клетке; и другие нетранслируемые РНК, которые прямо или опосредованно стимулируют или подавляют экспрессию эндогенного полипептида с повторами РР-петель. и т.п.

Для осуществления экспрессии введенной нуклеиновой кислоты в генетически модифицированной клетке, в случае необходимости, вводимая нуклеиновая кислота может быть функционально соединена с одной или более регуляторными последовательностями и/или промоторами, такими как природный промотор нуклеиновой кислоты РРЬ или гетерологичный промотор.

Должно быть понятно, что термин регуляторная последовательность транскрипции должен пониматься как включение любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая осуществляет транскрипцию функционально присоединенной нуклеиновой кислоты. Регуляторная последовательность транскрипции может включать, например, лидер, последовательность полиаденилирования, промотор, энхансер или повышающим образом активирующую последовательность и терминатор транскрипции. Обычно регуляторная последовательность транскрипции включает, по меньшей мере, промотор. Термин промотор описывает в данном контексте любую нуклеиновую кислоту, которая придает, активирует или усиливает экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в клетке.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна регуляторная последовательность транскрипции функционально соединена с нуклеиновой кислотой РРЕ Для целей данного изобретения регуляторная последовательность транскрипции рассматривается как функционально связанная с конкретным геном или другой нуклеотидной последовательностью, когда эта регуляторная последовательность транскрипции способна стимулировать, ингибировать или иным образом модулировать транскрипцию этого гена или другой нуклеотидной последовательности.

Промотор может регулировать экспрессию функционально связанной нуклеотидной последовательности конститутивно, или дифференциально, в отношении клетки, ткани, органа или стадии развития, в которой имеет место экспрессия, в ответ на наружные стимулы, такие как физиологический стресс, патогены или ионы металлов, среди прочих, или в ответ на один или более активаторов транскрипции. Как таковой, промотор, используемый в соответствии со способами данного изобретения, может включать, например, конститутивный промотор, индуцируемый промотор, тканеспецифический промотор или активируемый промотор.

Данное изобретение рассматривает применение любого промотора, который является активным в представляющей интерес клетке. Таким образом, множество промоторов, которые являются активными в любых бактериях, грибах, клетках животных или растительных клетках могут быть легко определены квалифицированным в данной области специалистом.

Однако в некоторых вариантах осуществления могут быть использованы растительные клетки. Таким образом, в этих вариантах осуществления могут быть использованы активные в растении конститутивные, индуцируемые, тканеспецифические или активируемые промоторы.

Конститутивные промоторы растений обычно управляют экспрессией почти во всех тканях растения и являются в значительной степени независимыми от условий среды и факторов развития. Примеры конститутивных промоторов, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, включают полученные из растительного вируса промоторы, такие как промоторы Вируса Мозаики Цветной капусты 35δ и 19δ (СаМУ 35δ и СаМУ 19δ); полученные из бактериального патогена растений промоторы, такие как опиновые промоторы, полученные из АдгоЬас!егшт крр., например, полученный из АдгоЬас!егшт промотор нопалинсинтазы (пок); и полученные из растений промоторы, такие как промотор гена малой субъединицы гиЫксо (гЬс8), промотор убиквитина человека (РиЫ) и промотор актина ри- 11 022359 са (Рас!).

Индуцируемые промоторы включают, но не ограничиваются ими, химически индуцируемые промоторы и физически индуцируемые промоторы. Химически индуцируемые промоторы включают промоторы, которые имеют активность, которая регулируется химическими соединениями, такими как спирты, антибиотики, стероиды, ионы металлов или другие соединения. Примеры химически индуцируемых промоторов включают регулируемые спиртом промоторы (см., например, европейский патент 637339); регулируемые тетрациклином промоторы (см., например, патент США 5851796 и патент США 5464758); реагирующие на стероиды промоторы, такие как промоторы рецептора глюкокортикоидов (например, см. патент США 5512483), промоторы рецептора эстрогена (см., например, заявку на европейский патент 1232273), промоторы рецептора экдизона (например, см. патент США 6379945) и т.п.; отвечающие на металл промоторы, такие как промоторы металлотионеина (например, см. патент США 4940661, патент США 4579821 и патент США 4601978); и связанные с патогенезом промоторы, такие как промоторы хитиназы или лизоцима (например, см. патент США 5654414) или промоторы белка РР (например, см. патент США 5689044, патент США 5789214, Австралийский патент 708850, патент США 6429362).

Индуцируемый промотор может быть также физически регулируемым промотором, который регулируется не химическими факторами окружающей среды, такими как температура (как теплота, так и холод), свет и т.п. Примеры физически регулируемых промоторов включают промоторы теплового шока (например, см. патент США 5447858, Австралийский патент 732872, заявку на патент Канады 1324097); индуцируемые холодом промоторы (см., например, патент США 6479260, патент США 6184443 и патент США 5847102); индуцируемые светом промоторы (например, см. патент США 5750385 и патент Канады 1321563); подавляемые светом промоторы (см., например, патент Новой Зеландии 508103 и патент США 5639952).

Тканеспецифические промоторы включают промоторы, которые преимущественно или специфически экспрессируются в одной или более конкретных клетках, тканях или органах в организме и/или в одной или более стадиях развития организма. Должно быть понятно, что тканеспецифический промотор также является конститутивным или индуцируемым.

Примеры тканеспецифических промоторов включают специфические для корней промоторы, такие как промоторы, описанные в заявке на патент США 2001047525; специфические для плодов промоторы, в том числе специфические для завязи и специфические для цветоложа тканеспецифические промоторы, такие как промоторы, описанные в европейском патенте 316441, патенте США 5753475 и заявке на европейский патент 973922; и семеноспецифические промоторы, такие как промоторы, описанные в австралийском патенте 612326 и заявке на европейский патент 0781849 и австралийском патенте 746032.

Промотор может быть также промотором, который является активируемым одним или более активаторами транскрипции, называемым в настоящем описании активируемым промотором. Например, этот активируемый промотор может содержать минимальный промотор, соединенный с повышающим образом активирующей последовательностью (ИА8), который содержит, 1п1сг аПа. ДНК-связывающий сайт для одной или более транскрипционных активностей.

Должно быть понятно, что данном контексте термин минимальный промотор включает, по меньшей мере, сайт связывания РНК-полимеразы и необязательно ТАТА-бокс и сайт инициации транскрипции и/или один или более сайтов СААТ. В некоторых вариантах осуществления, где этой клеткой является растительная клетка, минимальный промотор может быть получен из промотора Вируса Мозаики Цветной капусты 358 (СаМУ 358). Полученный из СаМУ 358 минимальный промотор может содержать, например, последовательность, которая по существу совпадает с положениями -90 - +1 (сайтом инициации транскрипции) промотора СаМУ 358 (также называемая как минимальный промотор -90 СаМУ 358), -60 -+1 промотора СаМУ 358 (также называемая как минимальный промотор -60 СаМУ 358) или -45 - +1 промотора СаМУ 358 (также называемая как минимальный промотор -45 СаМУ 358).

Как установлено выше, активируемый промотор может содержать минимальный промотор, слитый с повышающим образом активирующей последовательностью (ИА8). Эта ИА8 может быть любой последовательностью, которая может связывать активатор транскрипции для активации минимального промотора. Примерные активаторы промоторов включают, например, полученные из дрожжей активаторы транскрипции, такие как Са14, Рбг1, Сси4 и Асе1; полученный из вируса активатор транскрипции, УР16; Нар1 (Насй е! а1., 1. Βΐο1. Сйет. 278: 248-254, 2000); СаП (Ное е! а1., Сеие 215(2): 319-328, 1998); Е2Р (А1Ьаш е! а1., 1. Βΐο1. Сйет. 275: 19258-19267, 2000); ΙΙΆΝΌ2 (Цш аиб Скег]ек1, 1. Βΐο1. Сйет. 277: 12604-12612, 2002); ΝΚΒ-1 и ЕАС (Нетд е! а1., 1. Се11 8ш 113: 4263-4273, 2000); Р/САР (ЦоЬ е! а1., Хис1 Ас1бк Рек 28: 4291-4298, 2000); МаРА (Ка!аока е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 277: 49903-49910, 2002); активирующий транскрипцию фактор 4 человека (Ыаид аиб Нар 1. Βίο1. Сйет. 272: 24088-24095, 1997); Вс110 (Ыи е! а1., Вюсйет Вюрйук Рек Сотт 320(1): 1-6, 2004); СРЕВ-Н (Отоп е! а1., №с1. Ашбк. Рек. 29: 21542162, 2001); АРР1 и АРР2 (8ака1 е! а1., Р1ап! 1. 24(6): 703-711, 2000); Рок (δζώδ аиб Ι&ιιζ, Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 97: 5351-5356, 2000); Н8Р4 (ТаиаЬе е! а1., 1. Вю1. Сйет. 274: 27845-27856, 1999); МАМЬ1 (Аи е! а1., №1 Сеие! 26: 484-489, 2000).

В некоторых вариантах осуществления ИА8 содержит нуклеотидную последовательность, которая способна связываться, по меньшей мере, с ДНК-связывающим доменом активатора транскрипции САЬ4.

- 12 022359

Регуляторная последовательность может также включать терминатор. Термин терминатор относится к ДНК-последовательности на конце транскрипционной единицы, которая передает сигнал терминации транскрипции. Терминаторы являются 3'-нетранслируемыми ДНК-последовательностями, обычно содержащими сигнал полиаденилирования, который способствует добавлению полиаденилатных последовательностей к 3'-концу первичного транскрипта. Как и в случае последовательностей промотора, терминатор может быть любой терминаторной последовательностью, которая является функциональной в клетках, тканях или органах, в которых она должна быть использована. Примеры подходящих терминаторных последовательностей, которые могут быть применимы в растительных клетках, включают терминатор нопалинсинтазы (пок), терминатор СаМУ 358, терминатор октопинсинтазы (оск), терминаторы гена ингибитора протеиназы картофеля (ρίη), такие как ρίηΙΙ и ρίηΙΙΙ и т.п.

Во втором аспекте данное изобретение обеспечивает клетку с модулированной скоростью или модулированным паттерном потока катионов через мембрану этой клетки, где указанная модуляция является результатом модулированной экспрессии полипептида с повторами Рф-петель в этой клетке.

Должно быть понятно, что термин клетка в данном контексте включает любой тип клеток, в том числе бактерии, архебактерии и эукариотические клетки, в том числе, например, животные, растительные и грибные клетки. В некоторых вариантах осуществления эти клетки могут включать, например, клетку растения, клетку однодольного растения или растительную клетку зерновой культуры.

В некоторых вариантах осуществления клетку второго аспекта этого изобретения получают в соответствии со способом первого аспекта этого изобретения. В следующих вариантах осуществления, эта клетка второго аспекта этого изобретения является генетически модифицированной, как описано выше, со ссылкой на второй аспект этого изобретения.

В данном аспекте термин генетически модифицированная клетка включает клетку, которая является генетически модифицированной относительно дикого типа этой клетки. Таким образом, генетически модифицированная клетка может быть клеткой, которая сама была генетически модифицирована, и/или потомством такой клетки, которое сохраняет модификацию относительно дикого типа этой клетки.

В данном контексте многоклеточная структура включает любую агрегацию одной или более клеток. Таким образом, многоклеточная структура конкретно включает ткани, органы, целые организмы и их части. Кроме того, должно быть понятно, что многоклеточная структура включает многоклеточные агрегации культивируемых клеток, такие как колонии, каллусы растений, жидкие или суспензионные культуры и т.п.

Как упоминалось выше, в некоторых вариантах осуществления эта клетка является растительной клеткой и, следовательно, это изобретение включает целое растение, ткань растения, орган растения, часть растения, репродуктивный материал или культивируемую ткань растения (например, каллус или суспензионную культуру), содержащие одну или более растительных клеток, в соответствии с третьим аспектом этого изобретения. В следующих вариантах осуществления эта клетка является однодольной клеткой или клеткой зерновой культуры и, следовательно, данное изобретение также включает конкретно целое растение, ткань растения, орган растения, часть растения, репродуктивный материал или культивируемую ткань растения (например, каллус или суспензионную культуру), содержащие одну или более клеток однодольных или зерновых культурных растений.

В четвертом аспекте данное изобретение обеспечивает конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор, содержащие нуклеиновую кислоту РфЬ, как описано здесь ранее.

Конструкция нуклеиновой кислоты или вектор данного изобретения может состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, который может быть немодифицированной РНК или ДНК или модифицированной РНК или ДНК. Например, эта конструкция или вектор может состоять из одно- и двухцепочечной ДНК, ДНК, которая является смесью одно-и двухцепочечных областей, одноили двухцепочечной РНК и ΚΝΆ, которая является смесью одно- и двухцепочечных областей, гибридных молекул, содержащих ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, более типично, двухцепочечными, или смесью одно- и двухцепочечных областей. Кроме того, эта конструкция или вектор может содержать трехцепочечные области, содержащие РНК или ДНК или как РНК, так и ДНК. Эта конструкция или вектор может также содержать одно или более модифицированных оснований или ДНК- или РНК-скелетов (макромолекул), модифицированных в отношении стабильности или в отношении других причин. Модифицированные основания включают, например, тритилированные (или иным образом меченные) основания и необычные основания, такие как инозин. Различные модификации могут быть произведены в отношении ДНК и РНК; таким образом, термин нуклеиновая кислота включает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы.

В некоторых вариантах осуществления эта конструкция является экспрессионной конструкцией, которая может быть использована для осуществления экспрессии полипептида с повторами Рф-петель в клетке, как описано со ссылкой на первый аспект этого изобретения.

Таким образом, этот вектор или эта конструкция может содержать одно или более из следующего: сайт инициации репликации для одного или более хозяев; ген селектируемого маркера, который является

- 13 022359 активным в одном или более хозяевах; и/или одну или более регуляторных последовательностей транскрипции.

В данном контексте термин ген селектируемого маркера включает любой ген, который придает клетке, в которой он экспрессируется, фенотип для облегчения идентификации и/или отбора клеток, которые трансфицированы или трансформированы генетической конструкцией.

Некоторый диапазон нуклеотидных последовательностей, кодирующих подходящие селектируемые маркеры, известен в данной области. Примерные нуклеотидные последовательности, которые кодируют селектируемые маркеры, включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как гены устойчивости к ампициллину, гены устойчивости к тетрациклину, гены устойчивости к канамицину, ген ΑϋΜ-С, который придает устойчивость к антибиотику ауреобазидину А, гены неомицинфосфотрансферазы (например, прИ и ирШ) и гены гигромицинфосфотрансферазы (например, Нр1); гены устойчивости к гербицидам, включающие гены устойчивости к глюфосинату, фосфинотрицину или биалафосу, такие как кодирующие фосфотрицинацетилтрансферазу гены (например, Ьаг), гены устойчивости к глифосату, включающие кодирующие 3-еноилпирувилшикимат-5-фосфатсинтазу гены (например, агоА), гены устойчивости к бромикснилу, включающие кодирующие бромикснилнитрилазу гены, гены устойчивости к сульфонамиду, включающие кодирующие дигидроптератсинтазу гены (например, 8и1) и гены устойчивости к сульфонилмочевине, включающие кодирующие ацетолактатсинтазу гены; кодирующие фермент репортерные гены, такие как кодирующие Ουδ и хлорамфениколацетилтрансферазу (САТ) гены; флуоресцентные репортерные гены, такие как ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок; и репортерные гены на основе люминесценции, такие как ген люциферазы, среди прочих.

Кроме того, следует отметить, что этот ген селектируемого маркера может быть отдельной рамкой считывания в этой конструкции или может экспрессироваться в виде слитого с другим полипептидом белка (например, полипептидом с повторами РО-петель).

Как установлено выше, конструкция нуклеиновой кислоты или вектор может также содержать одну или более регуляторных последовательностей транскрипции, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна регуляторная последовательность транскрипции функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты первого аспекта этого изобретения, как описано здесь выше.

Как упоминалось выше, эти регуляторные последовательности могут также включать терминатор, как описано здесь выше.

Эта конструкция может дополнительно включать нуклеотидные последовательности, предназначенные для поддержания и/или репликации этой генетической конструкции в прокариотах или эукариотах, и/или интеграции этой генетической конструкции или ее части в геноме эукариотической или прокариотической клетки.

В некоторых вариантах осуществления этот вектор или конструкцию адаптируют, по меньшей мере, для частичного переноса в растительную клетку посредством АдгоЬас1егшт-опосредованной трансформации. Согласно некоторым вариантам осуществления эта конструкция может содержать левую и/или правую окаймляющие последовательности Т-ДНК.

Подходящие окаймляющие последовательности Т-ДНК могут быть легко определены квалифицированным в данной области специалистом. Однако должно быть понятно, что термин окаймляющие последовательности Т-ДНК включает, например, любые по существу гомологичные или по существу непосредственно повторяемые нуклеотидные последовательности, которые определяют границу молекулы нуклеиновой кислоты, которая переносится из клетки АдгоЬас1егшт 8р. в растительную клетку, восприимчивую к АдгоЬас1егшт-опосредуемой трансформации. В качестве примера делается ссылка на статью РегаЙа апД Кеат (Ргос. Ыа11. АсаД. δει. υδΑ, 82(15): 5112-5116, 1985) и обзор ОеМи (М1сгоЬю1оду апД Мо1еси1аг Вю1оду Ке\1е\У5. 67(1): 16-37, 2003).

В некоторых вариантах осуществления этот вектор или эту конструкцию адаптируют для перенесения в растение посредством АдгоЬас1егшт-опосредуемой трансформации. Однако данное изобретение рассматривает также любые подходящие модификации в отношении генетической конструкции, которая облегчает опосредуемое бактериями инсертирование в растительную клетку посредством бактерий, отличных от АдгоЬас1егшт 8р., например, как описано в Вгоо1йаей8 е! а1. (Ыа1иге 433: 629-633, 2005).

Квалифицированным в данной области специалистам будет известно, как получать описанные здесь конструкции, и будут известны требования для получения их экспрессии в конкретной клетке или конкретном типе клеток. Генетические манипуляции, необходимые для осуществления данного изобретения, могут потребовать размножения описанной здесь генетической конструкции или ее производного в прокариотической клетке, такой как клетка Е. сой, или растительная клетка, или клетка животного.

Нуклеиновая кислота может вводиться с использованием любого способа, известного в данной области, который подходит для используемого типа клеток.

В вариантах, в которых эта клетка является растительной клеткой, подходящие способы для введения молекулы нуклеиновой кислоты могут включать, например, АдгоЬас1егшт-опосредуемую трансфор- 14 022359 мацию, опосредуемую другими бактериями трансформацию (см. ВтооШаейз е( а1., 2005, выше), способы трансформации на основе бомбардировки микрочастицами (баллистической трансформации) и способы на основе прямого поглощения ДНК. Роа-Ройпдие/ е( а1. (АдгоЪас1етшт-теЙ1а1ей 1гапзГогтаОоп о£ р1айз, 3'¹ Ей. СЛМВ1Л 1п1е11ес1иа1 РгореПу Кезоигсе, СапЪегга, АизйаНа, 2003) рассматривают множество подходящих ЛдгоЪас!егшт-опосредованных способов трансформации растений для широкого диапазона видов растений. Баллистическая трансформация может быть также использована для трансформации тканей растений и способов трансформации растений, в частности зерновых растений, и такие способы рассматриваются Сазаз е( а1. (Р1ап! Втеейшд Кеу. 13: 235-264, 1995). Протоколы прямого поглощения ДНК, такие как трансформация протопластов и электропорация, описаны подробно в Са1Ътайй е( а1. (ейз.), МеОюйз ίη Се11 Вю1оду Уо1. 50, Лсайетю Ргезз, 8ап О1едо, 1995). Наряду с вышеупомянутыми способами может быть использован также некоторый диапазон других протоколов трансформации. Они включают инфильтрацию, электропорацию клеток и тканей, электропорацию зародышей, микроинъекцию, путь с использованием пыльцевых трубок, опосредованную карбидом кремния и липосомами трансформацию. Подобные способы рассматриваются в обзоре Ракос/у-Тго)апо\Узка (Се11. Мо1. Вю1. БеИ. 7: 849-858, 2002). Определенный диапазон других способов трансформации растений может быть очевидным квалифицированным в данной области специалистам.

Вышеупомянутые конструкция или вектор могут сохраняться в клетке в виде молекулы ДНК, в виде части эписомы (например, плазмиды, космиды, искусственной хромосомы или т.п.) или они могут быть интегрированы в геномную ДНК клетки.

Должно быть понятно, что в данном контексте термин геномная ДНК в его самом широком смысле включает любую и всю ДНК, которая составляет генетический комплемент клетки. Таким образом, должно быть понятно, что геномная ДНК клетки включает хромосомы, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, хлоропластную ДНК, эндогенную плазмидную ДНК и т.п. Таким образом, термин геномно интегрированная предполагает хромосомную интеграцию, интеграцию митохондриальной ДНК, интеграцию пластидной ДНК, интеграцию хлоропластной ДНК, эндогенную плазмидную интеграцию, и т.п.

Должно быть понятно, что термин клетка в данном контексте включает любой тип клетки, в том числе бактерии, архебактерии и эукариотические клетки, включающие, например, клетки животного, растения и грибные клетки. В некоторых вариантах осуществления эта клетка может включать растительную клетку, клетку однодольного растения или клетку зернового культурного растения.

Как упоминалось выше, в некоторых вариантах осуществления эта клетка является растительной клеткой и, следовательно, данное изобретение включает целое растение, ткань растения, орган растения, часть растения, репродуктивный материал или культивируемую ткань растения (например, каллус или суспензионную культуру), содержащие одну или более растительных клеток, в соответствии с пятым аспектом этого изобретения. В следующих вариантах осуществления эта клетка является однодольной клеткой или клеткой зерновой культуры и, следовательно, данное изобретение включает конкретно целое растение, ткань растения, орган растения, часть растения, репродуктивный материал или культивируемую ткань растения (например, каллус или суспензионную культуру), содержащие одну или более клеток однодольных или зерновых культурных растений.

В седьмом аспекте данное изобретение обеспечивает способ установления чувствительности или толерантности организма к катионам, предусматривающий определение экспрессии полипептида с повторами РЦ-петель в одной или более клетках этого организма.

В некоторых вариантах осуществления относительно высокий уровень экспрессии ассоциирован с чувствительностью к катионам в этом организме.

В некоторых вариантах осуществления относительно высокий уровень экспрессии во всех клетках этого организма ассоциирован с толерантностью к катионам в этом организме.

В другом варианте осуществления относительно низкий уровень экспрессии ассоциирован с толерантностью к катионам в этом организме.

В данном контексте определение экспрессии полипептида с повторами РЦ-петель включает определение уровня и/или активности самого полипептида с повторами РЦ-петель и/или уровня, активности, транскрипции или трансляции нуклеиновой кислоты РЦЬ.

Способы определения уровня и/или паттерна экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида известны в данной области.

Примерные способы детектирования экспрессии РНК включают такие способы, как количественная или полуколичественная ПЦР с использованием обратной транскриптазы (например, см. Вийоп е1 а1., Р1аШ РЬузю1оду 134: 224-236, 2004), ш-зйи-гибридизация (см., например, Ьшпез1ай е1 а1., Р1ап( РЬузю1оду 118: 1169-1180, 1998); нозерн-блоттинг (например, см. Μί/ипо е1 а1., Р1аШ РЬузю1оду 132: 1989-1997, 2003); и т.п. Примерные способы определения экспрессии полипептидов включают Вестерн-блоттинг (например, см. Нйо е1 а1., МеОюйз Мо1 Вю1. 49: 423-37, 1995); ЕЬ1§Л (например, см. СепШоГГ е1 а1., Р1аШ Мо1еси1аг Вю1оду 14: 575-583); иммуномикроскопию (например, см. Аздкат е1 а1., Рто1ор1азта 177: 87-94,

- 15 022359

1994) и т.п. В другом варианте осуществления экспрессия нуклеиновой кислоты РОБ может определяться определением количества нуклеиновых кислот РОЕ присутствующих в геномной ДНК одной или более клеток этого организма.

В некоторых вариантах осуществления способ седьмого аспекта этого изобретения адаптируют для установления чувствительности или толерантности к катионам растения. В следующих вариантах осуществления способ седьмого аспекта этого изобретения адаптируют для установления чувствительности или толерантности. например. однодольного растения или зернового культурного растения.

В дополнительных вариантах осуществления способ седьмого аспекта этого изобретения может быть использован для установления чувствительности или толерантности организма к катионам и затем отбора отдельных организмов на основе установленного уровня чувствительности или толерантности к катионам. Например. в случае растений. растения. имеющие увеличенную толерантность к катионам. могут быть отобраны для посева в почвах с высоким уровнем катионов или могут быть отобраны для программ селекции для получения толерантных к катионам сортов этого растения.

Наконец, делается ссылка на стандартные руководства по молекулярной биологии, которые содержат способы проведения основных методик. включенных в это изобретение. включающих рестрикцию и лигирование ДНК для генерирования различных описанных здесь генетических конструкций. См., например, Машабк е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Νον Уогк, 1982) и 8атЬгоок е! а1. (2000, выше).

Данное изобретение описывается далее следующими неограничивающими примерами:

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает ¹⁴С-меченный поток МА в штамме 8. сегеуыае 31019Ь, сверхэкспрессирующем ΥΏΚ352ν, ΥΟΕ092ν, или рУЕ83-контроле. Штамм 8. сегеуыае 31019Ь (тер1Д, тер2Д, терЗД, игаЗД) (Мапт е! а1., ЕМВО 1. 13: 3456-3463, 2000) трансформировали рУЕ83-ОЕ8Т (8тйй е! а1., Ргосеебшдк оГ 1йе Ыа!юпа1 Асабету оГ 8шепсек 92: 9373-9377, 1995, с модификацией по М. 8йе1беп (неопубликованной)), либо содержащей ΥΏΚ352ν, ΥΟΕ092ν, либо не имеющей инсерции. Клетки выращивали и ресуспендировали в 20 мМ КРО₄ ^--буфере при рН 7,0. 50 мМ ¹⁴С-меченный МА добавляли при Т=0 и клетки собирали фильтрованием через мембрану 0,45 мкм. Содержание МА определяли относительно общего клеточного белка. Значимость данных определяли посредством двухфакторного ΑΝΟνΑ, и указанная значимость является величиной относительно контроля с пустым вектором. ΥΏΚ352ν и ΥΟΕ092ν значимо различаются только после 30 мин потока (п=5). (* = величина Р<0,005; ** = величина Р<0,001; *** = величина Р<0,0001).

Фиг. 2 показывает зависимый от концентрации поток ¹⁴С-меченного МА. Штамм 8. сегеуыае 31019Ь (тер1Д, тер2Д, тер3Д, ига3Д) (Мапш е! а1., выше) трансформировали рУЕ83 (8тйй е! а1., 1995, выше), либо содержащей ΥΌΚ352ν, ΥΟΕ092ν, либо не содержащей инсерции. Клетки выращивали и ресуспендировали в 20 мМ КРО₄ ^--буфере при рН 7,0. ¹⁴С-меченный МА добавляли при различных концентрациях и клетки собирали фильтрованием через мембрану 0,45 мкм. Содержание МА определяли относительно общего клеточного белка. Значимость данных определяли посредством двухфакторного ΑΝΟνΑ, и указанная значимость является величиной относительно контроля с пустым вектором (п=6).

Фиг. 3 показывает данные зависимого от времени потока ²²Ыа в штамм 8ассйаготусек сегеуыае 31019Ь. Штамм 8. сегеуыае 31019Ь (тер1,2,3Д, ига3А) (Мапш е! а1., 2000, выше) трансформировали рУЕ83 (8тйй е! а1., 1995, выше), либо содержащей ΥΏΚ352ν, ΥΟΕ092ν, либо не содержащей инсерции. Панель А показывает общие данные, тогда как панель В показывает ^'-накапливание выше контроля пустого вектора, рассчитанное вычитанием величин пустого вектора из величин дрожжей, экспрессирующих белки с повторами РО-петель. Клетки выращивали и ресуспендировали в 20 мМ ΚΡΟ^-буфере при рН 7,0. 50 мМ ²²Ыа-меченный №С1 добавляли при Т=0 и клетки собирали фильтрованием через мембрану 0,45 мкм. Содержание МА определяли относительно общего клеточного белка. Значимость данных определяли посредством двухфакторного ΑΝΟνΑ, и указанная значимость является величиной относительно контроля с пустым вектором. Наиболее вероятно, более высокое варьирование существует в этих данных вследствие нативных проводящих №)' белков.

Фиг. 4 показывает оптимизацию растворов ванны для анализа потока катионов в ооцитах Хепорик 1аеу18, экспрессирующих ΥΏΚ352ν. Ооциты Хепорик 1ае\ак инъецировали либо кРНК ΥΏΚ352ν, либо не содержащей нуклеаз Η₂Ο. Ооциты подвергали стандартному потенциал-протоколу в различных растворах ванн. А) 100 мМ Холин С1, 2 мМ М§С1₂, 1 мМ СаС1₂, 5 мМ МЕ8/Тпк рН 6,5; В) 200 мМ маннит, 2 мМ М§С1₂, 1 мМ СаС1₂, рН 7,0 Тпк; С) 200 мМ маннит, 2 мМ М§С1₂, 2 мМ ВаС1₂, рН 7,0 Тпк; Ό) 200 мМ маннит, 5 мМ МЕ8/Тпк рН 7,0. Буфер Ό) не показал наличия Са²+-активированного канала С1^-, и его использовали в качестве фона (базового буфера) для дальнейших экспериментов (п = минимально 4).

Фиг. 5А-С показывают влияние концентрации наружного №Г на проводимость тока ооцитов, экспрессирующих белки с повторами РО-петель 8. сегеуыае. Ооциты, инъецированные кРНК из ΥΏΚ352ν или ΥΟΕ092ν, сравнивали с ооцитами, инъецированными не содержащей нуклеаз водой на протяжении диапазона концентраций №)'. Концентрации были 100 мМ №С1 (А), 10 мМ №С1 (В) и 1 мМ ΝπΟ (С), в каждом случае в стандартном буфере, описанном в примере 7. При увеличении концентраций №)' Е_геу

- 16 022359 смещается в направлении теоретического Ε_Να в отличие от Е_С1, подтверждая, что Να' является протекающим ионом (п=5).

Фиг. 5Ό и Е показывают сравнение индуцированных токов в ооцитах Хепорш Ιαονίδ, экспрессирующих белки с повторами РО-петель δ. сегеуыае, в виде функции концентрации наружного Να'. Отношение Ι/ν между ооцитами, экспрессирующими УЭЕ352\У (А) или УОЬ092те (В) в ваннах с буферами, содержащими разные концентрации Να'. Буферами являются буферы на основе маннит/ΜΕδ с №С1, добавляемым в случае необходимости. При увеличении концентраций наружного Να' Е_геу смещается вправо, в направлении рассчитанной величины Ε_Να. Это подтверждает, что переносимым ионом является Να', в отличие от С1^-, который может заставить Е_Кеу смещаться влево по мере увеличения концентраций (п=5).

Фиг. 6 показывает действие ТЕА' на поток Να' через УЭР352\У и УОЬ092те. Исследовали влияние блокатора канала К' ТЕА' на УЭР352\у и УОЬ092^. Присутствие ТЕА (Буфер (А): 10 мМ ТЕА-ОН, 90 мМ №С1, 5 мМ ΜΕδ/Ττίδ рН 7,0) показывало более сильный ток в сравнении с этими ооцитами в присутствии только 90 мМ ΝαΟ (буфер (В): 90 мМ №С1, 5 мМ ΜΕδ/Ττίδ). Это может быть обусловлено потоком ТЕА^' через эти белки или является результатом действия ТЕА^' в качестве агониста в отношении природных Νδί'Ό

Фиг. 7А показывает активность Νδί'Τ.' для ооцитов Хепорик 1аеу15, экспрессирующих УЭЕ352\у или УОЬ092те. Отношение Ι/ν УОи)92\у (А) или УЭЕ352\у (В), экспрессируемых в ооцитах, находящихся в ваннах в буферах с разными катионами. Раствор ванны был основой 200 мМ маннита и 5 мМ ΜΕδ/Ττίδ при рН 7,0 с катионами, добавляемыми, как описано выше.

Фиг. 7В показывает активность Νδί'Τ.' в сравнении с инъецированным Н₂О контролем. Сравнение токов катионов через ооциты, инъецированные кРНК УЭЕ352\у или УОЬ092'№, или инъецированные Н₂О контроли. Данные для растворов ванн, содержащих 100 мМ Να' (А), 100 мМ ΝΗ₄' (С) и 100 мМ холин' (Ό) являются значимо отличающимися от инъецированного водой контроля. Данные для ооцитов в ваннах со 100 мМ К^' (В) не являются значимо отличающимися от инъецированного водой контроля вследствие большой величины активности нативных ооцитов Хепорик (п=5 для (А), (В) и (Ό). Для (С) п=2).

Фиг. 8 показывает, что изменение аниона с С1^- на δО4^2-влияет на траектории тока. Замена раствора ванны 100 мМ ΝαΟ (буфер (А): 100 мМ №С1, 5 мМ ΜΕδ/Ττίδ рН 7,0) раствором ванны 50 мМ №УО4 (буфер (В): 50 мМ №-^О₄, 5 мМ ΜΕδ/Ττίδ рН 7,0) слегка влияла на поток Να' через УОЬ092№, но не влияла на поток, катализируемый экспрессией УЭЕ352\у. Ингибирование потока УОи)92\у в (В) может быть результатом измененного потока δО₄ ^2-через мембраны (п=5).

Панели А, В и С фиг. 9 показывают влияние различных наружных концентраций Са²' на Να'проводимость через УЭР352\у или УОЬ092'№, экспрессируемых в ооцитах Хепорик. Индуцируемый в результате Να'-потока ток уменьшался присутствием Са²' в растворе ванны. Ток при 0 мМ Са²' (кривая Ι/ν (А): 100 мМ №С1, 5 мМ ΜΕδ/Ττίδ рН 7,0) уменьшался на приблизительно 50% после замены раствора ванны 2 мМ Са²'-буфером (кривая Ι/ν (В): 100 мМ №С1, 2 мМ СаС12, 5 мМ ΜΕδ/Ττίδ рН 7,0). Замена раствора ванны 10 мМ Са²'-буфером (кривая Ι/ν (С): 100 мМ №С1, 10 мМ СаС12, 5 мМ ΜΕδ/Ττίδ) уменьшает ток еще на приблизительно 20%. В целом 60% начального 0 мМ Са^2'-потока элиминируются добавлением 10 мМ СаС1₂. Во всех графиках кривая Ι/ν для экспрессирующих полипептид с повторами РО-петель ооцитов является значимо отличающейся от инъецированного Н₂О контроля, п=5.

Панели Ό, Е и Р фиг. 9 показывают действие концентрации Са²' на поток Να' через УЭР352\у и УОЬ092№, экспрессируемые в ооцитах Хепорш. Поток Να' через ооциты Хепорш, экспрессирующие либо УЭР352\у (А), либо УОи)92\у (В), измеряли фиксацией напряжения (вольт-кламп-способом) в 100 мМ ΝαΟ-растворе для ванны с различными концентрациями Са²'. Να' поток был наибольшим в отсутствие Са²' и прогрессирующим образом уменьшался с добавлением буферов, содержащих 2 мМ СαС1₂ или 10 мМ СαС1₂. Обратные смещения потенциала в направлении положительных потенциалов вместе с увеличенными концентрациями Са²', в направлении теоретического БС вместе с предыдущей индукцией Са^2'-активируемого С1^--канала предполагают, что Са^2'-ингибирование потока Να^' может быть функцией транспортируемого Са^2' (п=5).

Фиг. 10 показывает репрезентативные траектории для данных, показанных на фиг. 4. Репрезентативные траектории тока регистрировали в ооцитах, инъецированных кРНК УЭЕ352\у (А, В, С и Ό) или не содержащей нуклеаз Н₂О (Е, Р, О и Н). Траектории согласуются с кривыми Ι/ν предыдущей фигуры с А и Е для буфера А фиг. 4, В и Р для буфера В, С и О для буфера С и Ό и Н для буфера Ό.

Фиг. 11А показывает МА'-токсичность и поглощение в штамме δ. се^еν^δ^αе 31019Ь, трансформированном пустым вектором рΥΕδ3. Штамм δ. се^еν^δ^αе 31019Ь трансформировали пустым вектором рΥΕδ3-^ΕδΤ и клетки выращивали и высевали. Минимальную среду Гренсона (Отешоп, ВОсНшис;·! е1 Вюр^^ Ас!ц 127: 339-346, 1966) дополняли 0,1% Ь-пролином, 100 мМ МА и 2% галактозой с Са²' и рН, модулируемыми следующим образом: 1) 10 мМ Са²' рН 6,5; 2) 0,2 мМ Са²' рН 6,5; 3) 10 мМ Са²' рН 7, 0, 4) 0,2 мМ Са²' рН 7,0; 5) ΥΝΒ ' 2% глюкоза в качестве контрольной загрузки.

Фиг. 11В показывает МА'-токсичность и поглощение в штамме δ. се^еν^δ^αе 31019Ь, трансформированном ΥΏΚ352№ в галактоза-индуцируемом векторе ВО1805. Штамм δ. се^еν^δ^αе 31019Ь трансформировали дрожжевым вектором ВО1805, содержащим ΥΩΒ352\\·. (А) Клетки выращивали и высевали. Ми- 17 022359 нимальную среду Гренсона (Огепкоп, 1966, выше) дополняли 0,1% Ь-пролином, 100 мМ МА и 2% галактозой с Са²+ и рН, модулируемыми следующим образом: 1) 10 мМ Са²+ рН 6,5; 2) 0,2 мМ Са²+ рН 6,5; 3) 10 мМ Са²+ рН 7,0, 4) 0,2 мМ Са²+ рН 7,0; 5) ΥΝΒ + 2% глюкоза в качестве контрольной загрузки. (В) Трансформированные клетки 31019Ь инкубировали в реакционном буфере, содержащем 0,5 мМ ¹⁴С-МА, 20 мМ КРО₄ ^- и 2% Ό-галактозу при рН 7,0. Результирующее поглощение ¹⁴С-МА измеряли в собранных клетках с использованием сцинтилляционного счетчика после 20 мин инкубирования. Данные представлены в виде среднего ± 8Е (п=10).

Фиг. 11С показывает МА+-токсичность и поглощение в штамме 8. сегетыае 31019Ь, трансформированном ΥΟΌ)92\γ в галактоза-индуцируемом векторе ΒΟ1805. Штамм 8. сегеуыае 31019Ь трансформировали дрожжевым вектором ΒΟ1805, содержащим ΥΟΌ)92\γ. (А) Клетки выращивали и высевали. Минимальную среду Гренсона (Огепкоп, 1966, выше) дополняли 0,1% Ь-пролином, 100 мМ МА и 2% галактозой с Са²+ и рН, модулируемыми следующим образом: 1) 10 мМ Са²+ рН 6,5; 2) 0,2 мМ Са²+ рН 6,5; 3) 10 мМ Са²+ рН 7,0, 4) 0,2 мМ Са²+ рН 7,0; 5) ΥΝΒ + 2% глюкоза в качестве контрольной загрузки. (В) Трансформированные клетки 31019Ь инкубировали в реакционном буфере, содержащем 0,5 мМ ¹⁴С-МА, 20 мМ КРО₄ ^- и 2% Ό-галактозу при рН 7,0. Результирующее поглощение ¹⁴С-МА измеряли в собранных клетках с использованием сцинтилляционного счетчика после 20 мин инкубирования. Данные представлены в виде среднего ± 8Е (п=10).

Фиг. 12 показывает протокол напряжения для описанных здесь электрофизиологических данных.

Фиг. 13 показывает сопоставление СЕЕ8ТАБ-0 ΥΌΒ352\γ. ΥΟΌ092^ и ΥΒΒ147\γ с повторами РРпетель 8. сегеуыае, и предположительные представляющие интерес области отмечены. Аминокислотные последовательности ΥΌΚ352№, ΥΟΌ092^ и очень сходного ΥΒΚ147^ сопоставляли с использованием алгоритма СЬи8ТАЬ-^. Имеется высокая степень консервативности последовательности, особенно в трансмембранных доменах и РР петля-областях. Предположительные О-белоксвязывающие области предсказаны из СЬипд е1 а1. (1. ΒίοΙ. СЬет. 276: 40190-40201, 2001). Трансмембранные домены предсказывали с использованием адаптированного Оепе3О ШисЬап е1 а1., Оепоте Ке8. 12: 503-514, 2002) в 8ΟΌ.

Фиг. 14 показывает филогенетическую схему (кладограмму) белков АгаЫйорк15 ШаПапа, 8ассЬаготусек сетеу151ае, Огу/а кайуа, ТпОсит аекйуит, 8сЬ|/окассЬаготусе5 ротЬе и Ното 5ар1еик, которые обнаруживают сходство последовательности с ΥΌΡ352\γ. Последовательность белка ΥΌΡ352\γ сравнивали с базами данных белковых последовательностей посредством алгоритма ЕБА8Т с использованием стандартных параметров для NСΒI. Были найдены также дополнительные белковые последовательности аннотированных содержащих повторы РР-петель белков. Последовательности белков сопоставляли с использованием алгоритма СЕи8ТАБ-0 и создавали филогенетическую схему (Мас УесЮг И8А).

Фиг. 15 показывает репрезентативные зависимые от времени профили тока ооцитов, инъецированных кРНК ΥΌΚ352^ (А, В, С), кРНК ΥΟΡ)92\γ (Ό, Е, Р) или Н₂О (О, Н, I). Ооциты помещали в баню в базовый буфер (см. способы этой главы) с добавлением 1 мМ №С1 (А, Ό, О), 10 мМ №С1 (В, Е, Н) или 100 мМ №С1 (С, Р, I).

Фиг. 16 показывает репрезентативные зависимые от времени профили тока ооцитов, инъецированных кРНК ΥΌΚ352^ (А, В), кРНК ΥΟΡ)92\γ (С, Ό) или Н₂О (Е, Р). Ооциты помещали в баню в базовый буфер (см. способы этой главы) с добавлением 100 мМ Ν;·ιΟ (А, С, Е) или 50 мМ №-ь8О₄ (В, Ό, Р).

Фиг. 17 показывает филогенетическую схему белков, которые обнаруживают некоторую степень сходства с ΥΌΡ352\γ и ΥΟΡ)92\γ при сравнении с публично доступными геномными базами данных.

Фиг. 18 показывает кладограмму белковых последовательностей двух дрожжей (Уо1092\\р и Υάτ352^ρ), шести АтаЫйор515 (А1РрЬ1-6), трех белковых последовательностей риса (Ок01д16170, Ок07§29610 и Ок12д18110), шести РЬуксотЪтеИа ра1епк (Рр174957, Рр182799, Рр217317, Рр210671, Рр159185 и Рр160065) и двух бактериальных (Р1РРБ и ирРрЬ) белков с повторами РР-петель (для закрепления схемы). Белки с повторами РР-петель высших растений подразделяются на клады I, II и III.

Фиг. 19 является диаграммой, показывающей предсказанную топологию белков с РР-петлями из дрожжей - Уо1092\\р (верхняя левая панель) и АтаЫйор515 - А1РрЬ1, 2 и 3 (верхняя правая, нижняя левая, нижняя правая панели соответственно).

Фиг. 20 иллюстрирует результаты анализа солечувствительности 8ассЬатотусек сетеу151ае, трансформированного А1РрЬ1, А1РРБ2 или А1РРБ3. Десятикратные серийные разведения наносили в виде пятен на 8И-урацил-среду, дополненную 500 мМ ΝπΟ и/или 10 мМ СаС1₂. Чашки инкубировали при 30°С в течение 2 дней. Дрожжи, экспрессирующие А1РРБЕ обнаруживают уменьшенную скорость роста в сравнении с контролем, которая восстанавливалась добавлением 10 мМ СаС1₂. Дрожжи, экспрессирующие А1РрЬ2, обнаруживали также увеличенную солечувствительность в сравнении с контролем. Опять, эта чувствительность могла быть восстановлена 10 мМ СаС1₂, что указывает на то, что Са²⁺ может взаимодействовать с А1РРБ2.

Фиг. 21 является диаграммой, показывающей рост 8. сетеу151ае трансформированного А1РРБЕ А1РРБ2 или А1РРБ3. Клетки росли в 8И-урацил-среде, дополненной либо 0 мМ СаС1₂, либо 10 мМ СаС12. Рост выражен в виде процента выше максимального роста контроля (п=3). Дрожжи, экспрессирующие А1РРБЕ обнаруживают уменьшенную скорость роста в сравнении с контролем, которая восста- 18 022359 навливается добавлением 10 мМ СаС1₂.

Фиг. 22 является диаграммой, показывающей уменьшение роста 8. сегеу181ае, трансформированного Л1РЦЬ1, Л1РрЬ2 или АкРЦЬЗ. Клетки росли в δΌ-урацил-среде, дополненной 500 мМ ЫаС1 и либо 0 мМ СаС1₂, либо 10 мМ СаС1₂. Рост выражен в виде процента выше максимального роста контроля (п=3). Дрожжи, экспрессирующие АкРЦЫ, обнаруживают увеличение солечувствительности в сравнении с контролем. Эта чувствительность могла быть восстановлена 10 мМ СаС1₂.

Фиг. 23А является диаграммой, показывающей накапливание биомассы выращиваемых в условиях гидропоники растений без добавления ЫаС1. К.О = линии с нокаутом гена, атЖЯА = линии с нокдауном гена, 358 = сверхэкспрессирующие линии. Трансгенные линии являются расщепляющимися и, следовательно, содержат нули. Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Фиг. 23В является диаграммой, показывающей накапливание биомассы выращиваемых в условиях гидропоники растений после 3 дней добавления 50 мМ ИаС1. К.О = линии с нокаутом гена, атЖИА = линии с нокдауном гена, 358 = сверхэкспрессирующие линии. Трансгенные линии являются расщепляющимися и, следовательно, содержат нули. Результаты представлены как среднее ±стандартная ошибка среднего.

Фиг. 24 является диаграммой, показывающей солевыносливость выращиваемых в условиях гидропоники растений. Процент солевыносливости рассчитывали делением средней биомассы каждой линии, испытывающей стресс, вызванный засолением, на среднюю биомассу той же самой линии, находящейся в контрольных условиях. К.О = линии с нокаутом гена, атЖЫА = линии с нокдауном гена, 358 = сверхэкспрессирующие линии. Трансгенные линии являются расщепляющимися и, следовательно, содержат нули.

Фиг. 25 показывает концентрации натрия в расщепляющихся Т₂ 358::О8РрЬ1 растениях риса, которые росли в условиях гидропоники в течение 2 недель перед добавлением 75 мМ ИаС1 в течение 12 дней. Пламенная фотометрия 3-го полностью распустившегося листа определила, что растения из обеих линий имели значимо более низкий Иа' в побегах, чем растения №рропЪаге дикого типа (АТ) (п=12). 358ОкРЦЬ-А и 358-О5РОБ-В являются независимыми трансформантами каллусов риса, трансформированных той же самой конструкцией 358::О8РЦЬ.

Фиг. 26 показывает локализацию АкРЦЫ в эпидермальных клетках табака. ДНК-конструкции с зеленым флуоресцентным белком (СРР), слитым с белком АкРЦЫ, были любезно предоставлены доктором Анной Антман (Университет Глазго) и были трансформированы в эпидермальные клетки табака. Локализацию СРР визуализировали с использованием конфокальной микроскопии.

Пример 1.

Белки с повторами РЦ-петель в качестве предположительных νίΝ8ίΥ в 8ассЬаготусе§ сегеуыае.

Для идентификации предположительных νίΝ8ί'.'ί'.' был разработан скрининг на основе 8асскаготусе8 сегеуыае. Этот скрининг зависел от потока ИН₄+-аналога метиламмония (МА) через νίΝ8ί'.'ί'.' для получения фенотипа токсичности в дрожжах. Посредством изменения концентрации Са²' и рН среды для выращивания авторы изобретения смогли выполнять отбор на белки, проявляющие фенотипы, ожидаемые от сверхэкспрессируемых νίΝ8ίΥ.

Этот скрининг идентифицировал два белка класса с повторами РЦ-петель, которые обнаруживали фенотипическую реакцию, проявляемую сверхэкспрессирующимися νίΝ8ί'.'ί'.' в дрожжах (фиг. 11А, В и С). Была разработана серия экспериментов для подтверждения, что эти белки ведут себя как νίΝ8ί'.'ί'.'.

Пример 2.

Поток катионов в 8ассЬаготусе§ сегеуыае. сверхэкспрессирующем УИВ352\у или УОБ092у.

УИВ352\у и УОБ092\у отбирали на основе их способности придавать фенотип токсичности в клетках штамма 8. сегеуыае 31019Ъ в присутствии токсических концентраций МА. Этот штамм не имеет функциональной экспрессии всех трех из его нативных высокоаффинных ΝΗ.-ι'/ΜΛ-транспортеров, что позволяет ему выживать на средах, содержащих высокие концентрации МА.

Сверхэкспрессия УЭК352у и УОБ092\у приводила к фенотипу токсичности, который ослаблялся увеличенным Са^2' (фиг. 11А, В и С). Для подтверждения этого фенотипа измеряли результат увеличенного поступления МА, потока ¹⁴С-меченого МА при наружной концентрации 0,5 мМ МА. Клетки, сверхэкспрессирующие либо УОК352у, либо УОБ092у, приводили к увеличенному накапливанию МА на протяжении времени при сравнении с пустым вектором-контролем. Поглощение осуществлялось согласно арифметической регрессии и имело скорость накапливания в 2,5-3 раза большую, чем скорость накапливания пустого вектора-контроля, при 30 минутах (фиг. 1). Исследовали также зависимый от концентрации поток через эти белки (фиг. 2). Поглощение МА осуществлялось с ненасыщаемым профилем, значимо более высоким, чем пустой вектор-контроль. Клетки, сверхэкспрессирующие УОК352у, обнаруживают более высокую способность потока МА, чем клетки, сверхэкспрессирующие УОР092\у, хотя каждый из них обнаруживает значимую активность ЬАТ8 относительно пустого вектора-контроля.

Исследование ионоселективности в клетках, экспрессирующих либо УОК352у, либо УОБ092у, проводили с использованием анализа ²²Ыа-потока (фиг. 3А и В) Ыа⁺-поток был значимо большим в клетках, сверхэкспрессирующих УЭК352у и УОБ092у, в сравнении с клетками с пустым вектором- 19 022359 контролем.

Пример 3.

Характеристика УЭК352\\- и УОЬ092у-опосредованного потока посредством экспрессии в ооцитах Хепори8 1аеу18.

Ооциты Хепори8 1аеу18 применимы для исследования электрофизиологии мембраносвязанных белков. кРНК УОК352у использовали для оптимизации условий для анализа потока катионов через белки с повторами Ρβ-петель. Первоначальные эксперименты использовали холин-С1 в качестве преобладающего катиона в растворе ванны. Это позволяет получить хорошее протекание электрического тока без его транспорта вследствие его размера. Эти эксперименты выявили сильную индукцию тока в ооцитах, инъецированных кДНК УОК352у, при фиксации напряжения при гиперполяризующих потенциалах (фиг. 4, панель А и фиг. 10, панель А). Это является показателем нативного Са²⁺-активированного С1^--канала Хепори8. Индукция этого тока предполагает, что либо экспрессируемый белок индуцирует нативный Са²+-активируемый С1^--канал, либо УОК352у облегчает поток Са²+ в ооциты и возбуждает ток этого Са^2'-активируемого С1^--канала. Этот ток будет препятствовать наблюдению входящего положительного тока и, следовательно, должен быть минимизирован. Для уменьшения потенциальных источников варьирования использовали минималистический раствор ванны, 200 мМ маннит, забуференный до рН 7,0, с минимальным количеством Тп8-С1. С 1 мМ СаС1₂ и 2 мМ М§С1₂ в этом базовом буфере (фиг. 4, панель В и фиг. 10, панель В) присутствовали токи, сходные с Са^2'-активируемым С1^--каналом, хотя гораздо меньшие в сравнении с траекториями с базовым буфером на основе холин-С1. Это указывает на то, что либо более высокая концентрация наружного С1^- индуцировала Са^2'-активируемый С1^- канал, либо сам холин протекал через этот белок и способствовал общему потоку при отрицательных потенциалах мембраны, либо, возможно, на комбинацию обоих вариантов. Замена Са²+ на Ва²+ дополнительно уменьшала различие между инъецированными УОК352у ооцитами и инъецированными водой ооцитами (фиг. 4, панель С и фиг. 10, панель С), что предполагает, что присутствие Са^2' индуцировало протекание электрического тока. Удаление всех двухвалентных катионов с оставлением только 5 мМ МЕ8/ТП8 эффективно элиминировало входящий положительный/выходящий отрицательный ионный поток при отрицательных потенциалах (фиг. 4, панель Ό и фиг. 10, панель Ό). Вследствие низкого протекания электрического тока, наблюдаемого при отрицательных мембранных потенциалах, условиях, при которых может наблюдаться входящий поток катионов, этот буфер был выбран в качестве основы (базового буфера) для дальнейших экспериментов.

Пример 4.

Характеристика потока катионов в ооцитах Хепори8 1аеу18, экспрессирующих УОК352у и УОЬ092у.

Характеристика транспортеров/каналов в электрофизиологии обычно включает анализ аффинности молекулярных частиц и идентификации блокаторов. УОК352у и УОЬ092А исследовали с использованием таких способов. Поток №', холина' и Са²+ увеличивался в ооцитах X. 1аеу18, инъецированных кРНК либо УОК352у, либо УОЬ092у, в сравнении с инъецированными водой контролями. Предварительные эксперименты также позволяют предположить, что поток МА^', ΝΗ₄ ^' и К^' также модифицируется при экспрессии этих белков.

Из катионов, используемых для тестирования экспрессии в X. 1аеу18, №)' оказался наиболее применимым. Природные токи в инъецированных водой контролях были относительно малыми, и испытанные белки вызывали большие индуцируемые Иа⁺ токи. Для гарантии, что наблюдаемые токи обусловлены вхождением №', а не оттоком С1^-, использовали буферы, включающие ряд буферов с различающимися концентрациями №С1 (фиг. 5, панели А, В и С). По мере увеличений концентрации №)' потенциал реверсии (Е_геу) построенной кривой Ι/ν становился более положительным (фиг. 5, панели Ό и Е) в соответствии с притоком катиона в противоположность оттоку аниона С1^-.

Значимо более высокий поток регистрировали как для поступления, так и для вытекания катионов в сравнении с инъецированным водой контролем для всех исследованных концентраций Νπ' (фиг. 5, фиг. 15). В то время как было установлено, что направленный внутрь поток (входящий поток) является результатом Νπ', отток катионов, наблюдаемый при положительном мембранном потенциале, не может быть следствием притока №)'. Наиболее вероятно, что этот наблюдаемый поток является следствием перемещения К', так как он является доминантным одновалентным катионом в ооците. Подобный увеличенный направленный наружу поток наблюдается в инъецированных УОК352у ооцитах, когда фиксация напряжения наблюдается при положительных потенциалах в базовом буфере (фиг. 4, панель Ό и фиг. 10, панель Ό). Это согласуется с тем, что белки с повторами Ρβ-петель способствуют бинаправленному потоку катионов.

К^' часто является доминантным катионом, участвующим в катионных потоках в экспрессионных системах дрожжей и ооцитов Хепори8, и может иногда способствовать потоку других катионов. Таким образом, он является релевантным для исследования влияния природных К'-транспортных систем на поток, регистрируемый из белков с повторами Ρβ-петель. Для этой цели использовали ТЕА⁺ в его роли в качестве блокатора К⁺-каналов. Добавление 10 мМ ТЕА⁺ к раствору ванны, содержащей 90 мМ ИаС1, не изменяло общих тенденций потока, но действительно влияло на величину электрического тока (фиг. 6).

- 20 022359

Эти данные предполагают, что либо ТЕА' переносится У0Ь092те и УБК352№, либо ТЕА' действует в качестве агониста в отношении №СС-индуцируемых траекторий, увеличивая их способность переноса

Потенциалы реверсии не изменяются значимо добавлением ТЕА', что предполагает, что ТЕА' сам не переносится. Возможно, что любое различие в Е_ге,, затмевается присутствием гораздо более высоких внутренних концентраций №' и К'. Возможный поток ТЕА' является интригующим при условии структурных сходств между ТЕА', МА и ΝΗ₄' и наблюдаемых характеристик потоков МА и ΝΗ₄' (фиг. 1, 2 и 7).

Влияние С1^- на наблюдаемые токи исследовали с заменой Νπί'.Ί на Ν;·ι2δ04 (фиг. 8). Токи были неизменными для ооцитов, экспрессирующих УБК352№, что позволяет предполагать, что на эти макроскопические токи не влияла наружная концентрация С1^-. Токи для У0Ь092те уменьшались заменой С1^- на δ04^2'. Это может быть обусловлено либо уменьшением С1-^-индуцируемого действия, либо реакцией на добавленный δ04^2'.

Анализ селективности катионов предполагает, что белки с повторами РО-петель имеют слабую способность различения между одновалентными катионами. Поток холина', №', К' и ΝΗ₄' увеличивается в ооцитах, экспрессирующих УЭР352\у или У0Ь092те (фиг. 7).

Контрольные ооциты обнаруживали высокую степень потока К^', который маскировал любой потенциальный поток К' через испытанные белки с повторами РО-петель. ΝΗ₄' измеряли в ооцитах, инъецированных УЭР352\у и только Η₂0. С этими доступными данными можно с большой уверенностью предположить, что УЭР352\у способствует потоку ΝΗ₄'.

Исследовали также действие различных концентраций Са²' на поток №' в ооцитах, экспрессирующих УБК352у и/или У0Б092у (фиг. 9). Значимое уменьшение как во входящем, так и в выходящем токе регистрировали с добавлением 2 мМ СаС12 и, еще большее, с добавлением 10 мМ СаС12.

Пример 5.

Анализ потока ¹⁴С-меченного МА и потока ²²№-меченного №'.

Вектор ρΌ0ΝΚ (1^йтодеп), содержащий либо УЭК352у, либо У0Ь092А, использовали для рекомбинации представляющего интерес инсерта в вектор ρΥΕδ2-ΌΕδΤ с использованием реакции ЬКклоназы (1пу|1годеп). Клетки, содержащие ΥΩΡ352\\· или Υ0Ε092\\· в ρΥΕδ3-ΌΕδΤ, или пустой вектор, выращивали до насыщения в жидкой ΥΝΒ, дополненной 2% Б-глюкозой (мас./об.), собирали центрифугированием при 4000хд в течение 4 мин и использовали для инокуляции жидкой среды Гренсона при рН 6,5 с 0,1% Ь-пролином и 2% Б-галактозой (мас./об.) до 0Б₆₀₀=0,1. Клетки инокулировали в течение ночи при 28°С со встряхиванием при 200 об/мин и собирали при 0Б₆₀₀=0,4-0,7 центрифугированием при 4000хд, промывали дважды в воде МННО и ресуспендировали в 20 мМ КР0₄ ^--буфере рН 6,5 с 2% (мас./об.) Б-галактозой с получением 0Б₆₀₀ ~4-6. Исходный раствор 1 М МАС1 или Ν;·ιί'.Ί добавляли к 20 мМ КР0₄ ^--буферу с рН 7,0 до требуемой концентрации и метили либо ¹⁴С МА (АтетзЬат), либо ²²Νπ (АтетзЬат). Полученный раствор добавляли к равному объему ресуспендированных клеток при 1=0 и встряхивали непрерывно на протяжении эксперимента с анализом потоков. В указанное время брали пробы, пропускали их через нитроцеллюлозный фильтр 0,45 мкМ (АЬа1тап) и промывали 10 мл охлажденного на льду 20 мМ КР04^--буфера для прекращения потока. Мембраны собирали, помещали в сцинтилляционные флаконы на 7 мл (Ъагз1ей1) и добавляли 4 мл сцинтилляционной жидкости (Регкш Е1тег). Пробы считали в жидкостном сцинтилляционном счетчике (Раскатй). Счет преобразовывали в эквивалентное количество МА' или №' и пробы нормализовали в отношении общего белка, полученного с использованием модифицированного способа Лоури (Ре1егзоп, Апа1уйса1 ВюсЬеппзйу 83: 346-356, 1977).

Пример 6.

Синтез кРНК и инъекция в ооциты X. 1ае\1з.

Ооциты Хепорик 1ае\аз получали, как в стандартных протоколах (Ζΐκιιι е1 а1., Р1ап1, Се11 & Епупоптеп1 30: 1566-1577, 2007) с применением раствора Са1сшт Ртод Кшдетз (96 мМ №С1, 2 мМ КС1, 5 мМ МдС1₂, 5 мМ ΗΕΕΕδ, 0,6 мМ СаС1₂) плюс 8% лошадиная сыворотка, 0,1 мг/мл тетрациклин, пенициллин 1000 единиц/мл и стрептомицин 0,1 мг/мл). Вектор ρΩ0ΝΡ (Iην^1^одеη), содержащий либо УЭК352у, либо Υ0Ε092\\; использовали для рекомбинации представляющего интерес инсерта в вектор ρΟΕΜΗΕ с использованием реакции ЬК-клоназы (Iην^1^одеη). Вектор ρΟΕΜΗΕ, содержащий представляющий интерес ген, расщепляли в течение ночи δρ11 (ΝΕΒ) для линеаризации этой ДНК. Набор для транскрипции тМеззаде тМасЫпе 5'-кэппированной РНК (АтЪюп) использовали в соответствии с протоколом изготовителя для синтеза кРНК для представляющего интерес гена. Концентрацию кРНК нормализовали относительно 1 мкг/мкл и 46 нл инъецировали в каждый ооцит с использованием микроинъектора (Бтиттопй №шо|ес1 II аи1отайс папоШге ш_)ес1ог, Бтиттопй δ^ΜίΚί^ Вгоота11, РА, υδΛ). Контрольные ооциты инъецировали 46 нл не содержащей нуклеаз Н₂О. Инъецированные ооциты инкубировали при 16°С в растворе Са1сшт Ргод Ктдетз в течение 3 дней перед использованием.

Пример 7.

Электрофизиология белков с повторами РО-петель δ. се^еν^з^ае, экспрессируемых в ооцитах Xеηоρиз 1ае\аз.

Если нет иных указаний, фиксацию напряжения (вольт-кламп-способ) выполняли при 25°С в базо- 21 022359 вом буфере, состоящем из 5 мМ МЕ8/Тпк при рН 7,0, с добавленными представляющими интерес ионами. Для поддержания осмолярности 200 мОсм использовали маннит. Сигнал усиливали с использованием усилителя Оепе С1атр 500 уоИаде с1атр атрЬйег (Αχοη ΙηΠπιιηοηΚ Мо1еси1аг Όβνίοβδ, 8иппууа1е, СА, и8А) и изображали с использованием С1атрех 8.2 (Ахоп йЮгитеШк). Ооциты прокалывали стеклянными капиллярами, заполненными 3 М КС1. Электроды, ответственные за поддержание фиксации напряжения и протекание электрического тока, помещали в этот раствор 3 М КС1. Используемым протоколом напряжения был протокол, показанный на фиг. 12.

Пример 8.

Обсуждение.

Первоначально считалось, что потенциалонечувствительные №8С'С являются токами утечки при наблюдении их в экспериментах с пэтч-клампом. Наблюдение опосредованного каналом тока через эти белки часто требует низкой концентрации наружного Са²'. и, следовательно, считалось, что этот ток является результатом потери целостности мембраны. Детальное исследование установило, что поток одновалентных катионов превосходил поток двухвалентных катионов и, следовательно, расшифровало присутствие этих белков.

С момента открытия этих белков проводился поиск генетической идентичности потенциалонечувствительных №8С'С. Токи со свойствами ν^N8СС были зарегистрированы в клетках пейсмекера синусно-предсердного (синусного) узла сердец кроликов и могут играть важную роль в регуляции сердцебиения. Сходные токи были зарегистрированы также, например, в ооцитах Хетрик, многих видах растений и дрожжах.

Поскольку эти белки катализируют поток одновалентных катионов высокой эффективности, они имеют потенциал значимого влияния на функцию клеток. Именно этот потенциал делает \з№8С'С сильными кандидатами для большого потока №а', наблюдаемого в растениях при подвергании их действию условий засоления.

До сих пор молекулярные идентичности ν^N8СС не были известными. Это обусловлено, вероятно, трудностями в использовании гетерологичных скринингов, так как \з№8С'С пассивно катализируют ионный поток и, следовательно, обнаруживают трудно уловимые фенотипы.

Поток как ¹⁴С-меченного МА+, так и ²²№а+-меченный поток позволяли предположить, что УЭЙ352\у и УОи)92\у были каналами катионов. Поток ¹⁴С-меченного МА обнаруживал стойко более высокую скорость потока МА в диапазоне для сверхэкспрессирующих УЭЙ352\у и УОи)92\у клеток в сравнении с пустым вектором в качестве контроля (фиг. 1). Профиль концентраций обнаружил, что эти белки проявляют ненасыщаемую кинетику поглощения МА в диапазон ЬАТ8 дрожжей (фиг. 2). Эксперименты с ²²№а+-потоком отображали данные потока МА+, показывая увеличенную скорость вхождения №а' в клетки, сверхэкспрессирующие УЭЙ352\у или УОЬ092№, в сравнении с трансформированными пустым вектором контрольными клетками (фиг. 3А и В).

Увеличенная способность притока катионов, наблюдаемая в клетках, сверхэкспрессирующих как УЭК352№, так и УОЬ092№, согласуется с увеличенной способностью, ожидаемой для сверхэкспрессируемых ν^N8СС. Поток как при 50 мМ МА+, так и при 50 мМ №а' был большим, чем поток пустого вектора в качестве контроля. Поток становится значимо отличающимся от контроля-пустого вектора только после 5 мин потока с 50 мМ МА' (фиг. 1) или после 15 мин с 50 мМ №аС1 (фиг. 3 А и В). Подобным образом, разрешение между пустым вектором в качестве контроля и кандидатными белками в профилях концентрации МА было получено только при 25 мМ для УЭЙ352\у и 50 мМ для УОи)92\у. Природные белки дрожжей, которые имеют поток либо МА, либо №а+ (либо обоих), являются активными в этом штамме. Они включают УЭЙ352\у и УОЬ092'№, кандидатные №8С'С авторов этого изобретения. Таким образом, контроли с пустым вектором будут вести себя подобно клеткам, трансформированным кандидатными генами, причем различием является сверхэкспрессия кандидатного белка в этих трансформированных клетках. В результате ожидается и наблюдается слабое разрешение, особенно для потока №а', так как все еще присутствуют транспортеры №а'. Разрешение для потока МА является, вероятно, лучшим, чем для №1', так как природные МЕР были делетированы из этого штамма. Тем не менее, значимые различия в профилях потока МА и №а' наблюдаются в трансформированных кандидатным геном клетках в сравнении с контрольными клетками.

Экспрессия кРНК УЭЙ352\у и УОи)92\у в Хетрик значимо увеличивала протекание электрического тока в ооцитах в содержащем №а' растворе ванны. На величину тока влияла концентрация №а' с более высоким током, наблюдаемым при более высоких концентрациях №а' (фиг. 5). Чем более высокой была концентрация №а+, тем больше смещался положительно Ε_Γ6ν. Это подтверждает, что регистрируемый ток был результатом потока №а' в противоположность С1^-. Подтверждение этого признака достигалось посредством замены 100 мМ №аС1 50 мМ №а₂8О₄ (фиг. 8), обнаруживающим малое различие в Ε_Γ6ν.

Как УЭК352№, так и УОи)92\у обнаруживают сходную физиологию как при сверхэкспрессии в дрожжах, так и при экспрессии в ооцитах Хетрик. Это не является неожиданным, так как они имеют много общих последовательностей и предсказанных структурных признаков. Трудно уловимые различия являются очевидными в этих данных, что предполагает дискретные роли для каждого белка. Эти белки обнаруживают различия, находясь в гиперполяризованной мембране. Отношение сила тока/напряжение

- 22 022359 является в не содержащем Са²' растворе ванны с №Е приемлемо линейным для обоих белков в диапазоне исследованных потенциалов. Однако Υ06092ν обнаруживает потерю линейности при потенциалах -70 мВ и менее, отражая реакцию, показанную в инъецированных водой контрольных ооцитах.

Наблюдаемые токи обнаруживали различные степени временной зависимости. В целом токи, возбуждаемые через ΥΌΚ352\ν, обнаруживали малую зависимость от времени (фиг. 10, панели А, В и С и фиг. 15, панели А, В и С). Некоторую временную зависимость наблюдали при низких мембранных потенциалах при использовании 80₄ ^2- в качестве связанного с №Е аниона (фиг. 16, панели А и В). Поскольку этого не наблюдали, когда противоионом является С1^-, и различия также наблюдали как в инъецированных Υ06092ν (фиг. 16, панели С и И), так и в инъецированных водой ооцитах (фиг. 16, панели Е и Р), это может быть артефактом присутствия 80₄ ^2- в растворе ванны. У0Ь092'№-возбуждаемые токи были наиболее независимыми от времени, за исключением случая, когда 100 мМ №£ присутствовал в растворе ванны (фиг. 15, панели И, Е и Р). При этих условиях токи, полученные при потенциалах -90 мВ и менее, обнаруживают зависимое от времени уменьшение, пока не достигается стационарное состояние после приблизительно 1,5 с. Измерения силы тока для генерирования кривых Ι/ν брали в качестве среднего тока от 1,2 до 1,6 с в вольт-кламп-способе.

Изменения в активности Са²' влияли на ток вследствие потока №Е и слабо изменяли Е_геу (фиг. 9). Слабый положительный сдвиг Е_геу присутствует с увеличением концентрации Са²' в растворе ванны, что позволяет предположить, что Са^2' может проходить через эти белки. Наблюдаемая активация Са^2'активируемого С1^- в ооцитах, экспрессирующих ΥΌΡ352\ν (фиг. 4, панель А и фиг. 10, панель А), также позволяет предположить, что поток Са^2' увеличивается. Ток уменьшался на приблизительно 50% во всех записях после перехода от содержащего 0 мМ Са^2' раствора ванны к 2 мМ Са^2'-содержащему раствору ванны. Ток уменьшался дополнительно на 20% при увеличении концентрации Са²' с 2 мМ до 10 мМ. В целом добавление 10 мМ Са^2' к ранее не содержащему Са^2' раствору ванны уменьшает ток приблизительно на 60%.

Слабая дискриминация между одновалентными катионами является определяющей характеристикой У1ЖСС. ΥΌΡ352\ν и Υ06092ν исследовали в отношении селективности их каналов одновалентных катионов при экспрессии в ооцитах Хепорик 1аеу15 (фиг. 7А и В). Поток холина' и №£ катализируется присутствием либо ΥΌΚ352\ν, либо Υ06092ν. Предварительные данные в сильной степени предполагают, что потоки Κ', N4/ и МА' также увеличиваются при экспрессии этих генов (фиг. 1, 2 и 7). Индукция Са²+-активируемого С1^--канала, объединенная с ингибирующим действием Са²⁺ на поток также предполагает, что поток Са^2' также облегчается этими белками.

Пример 9.

Характеристика белков с повторами РР-петель.

Фенотипы роста на твердой среде (фиг. 11, панели А, В и С) и данные потока ¹⁴С-меченного МА⁺(фиг. 1 и 2) предполагают, что ΥΌΡ352\ν и Υ06092ν являются предположительными У1^СС. Оба эти белка относятся к классу белков с повторами РР-петель. Таким образом, белки с повторами РР-петель дрожжей являются наиболее вероятными кандидатами у1№СС. ΥΌΡ352\ν и У0Б092\у, а также очень сходный ΥΒΚ147ν не имеют известной биологической или молекулярной функции в базе данных генома 8ассбаготусек (8СИ). ΥΒΚ147ν не был выбран поиском в базе данных генома, так как не было предсказано, что он является связанным с мембраной. Это, по-видимому, является ошибочным вследствие его сходства с другими белками с повторами РР-петель.

Белки с повторами РР-петель характеризуются повторами пролина и глутамина (РР) перед внемембранной петлей (фиг. 13). Они являются в значительной степени неаннотированными. Примерами охарактеризованных белков с повторами РР-петель являются СТЖ и МРИИ1 человека, ЕК81 8. сегеУ151ае и 51т1' из 8с1й/о5ассабготусе5 ротЬе. СТЖ и ЕК81 транспортируют Ь-цистин через биологические мембраны. Делеционные мутанты ЕК81 в дрожжах предположительно участвуют в нарушении удерживания белков в ЕК. НкМРИШ был ассоциирован с механизмом флиппазы, включающим липидсвязанные олигонуклеотиды. Было показано, что 8!т1 взаимодействует с О-белком и после этого обозначается как связанный с О-белком рецептор.

Некоторая структурная информация была получена из исследованных белков с повторами РРпетель (фиг. 13). Петля 2 мотива РР-петли может быть важной в локализации белка, как показано с НкСТЖ. ОРР-локализация других белков с повторами РР-петель показала, что они интегрированы во множество мембран, причем показано, что петля 2 является жизненно важной для коррекции направленной миграции белков. Предсказано, что третий предсказанный домен 81т1 является сайтом взаимодействия О-белка. Это является особенно важным для любых каскадов передачи сигналов, в которых могут участвовать эти белки. ВЬЛ8Т-поиски ΥΌΡ352\ν по всем доступным базам данных геномов выявил много сходных белков (фиг. 17), большинство из которых также являются неаннотированными, за исключением упомянутых ранее.

Информация о профилях экспрессии доступна для 0КР дрожжей через 8ОИ. Исследование этих данных может дать некоторые представления о функции этих белков. На транскрипцию всех трех представляющих интерес генов влияет питательный статус дрожжей. Конкретно, сильные изменения регистрируются для дрожжей, которые находятся в стационарной фазе роста, множественного деления, N

- 23 022359 элиминации и Са²⁺/№а⁺/кальциневрин-реакций. Эти реакции указывают на возможную связь с чувствительностью к ионам или транспортом ионов в клетке.

Пример 10.

Материалы и способы - фенотипы роста на твердых средах штамма 8. сетеу181ае 31019Ь, сверхэкспрессирующего кандидатные гены.

Векторы с кандидатными генами получали из Ореп Вю8У81егп8 УеаЧ ОКЕ Со11ес!юп. Они состоят из отдельных ОКБ дрожжей, клонированных в вектор ВО1805. Каждая ОКЕ экспрессируется под контролем промотора Оа11 для высокой экспрессии, и она имеет стоп-кодон, удаляемый для включения метки в виде С-концевого белка НА (Ое1ретш е! а1., Оепе8 апб Эеуе1ортеп1 19: 2816-2826, 2005). Каждый клон трансформировали в 31019Ь (Мапт е! а1., Мо1. Се11 Вю1. 17: 4282-4293, 1997) с использованием способа с ацетатом лития/полиэтиленгликолем (С1е1/ е! а1., УеаЧ 11: 355-360, 1995) и трансформанты отбирали на минимальной среде ΥΝΒ. Трансформированные штаммы выращивали по отдельности в течение ночи в жидкой питательной базовой среде для дрожжей (ΒΌ Ью8аепсе8, 8ап 1о8е, И8А; 0,67% (мас./об.), Όглюкоза 2% (мас./об.) рН 6,5) до поздней 1од-фазы. Клетки осаждали и промывали дважды в стерильной воде ιηί11ίθ и ресуспендировали до ΘΌ₆₀₀ 0,3. Культуры серийно разводили до конечной ΘΌ₆₀₀ 0,003 и 5 мкл каждого разведения помещали на твердую минимальную среду для дрожжей (Отепкоп, ВюсНшнса е! Вюрйу8юа Ас!а 127: 339-346, 1966) с 0,1 М МА, 0,1% (мас./об.) Ь-пролином, 2% (мас./об.) Ό-галактозой при рН 7,0 либо с 0,2 мМ Са²+, либо с 10 мМ Са²+. Чашки инкубировали при 28°С в течение 5-7 дней и фенотипы роста подвергали мониторингу. Плазмиды, которые при экспрессии индуцировали фенотипы, показывающие увеличенную МА'-токсичность в клетках, отбирали и анализировали дополнительно.

Пример 11.

Растительные РОТ - материалы и способы.

Для исследования действия на №а+-накапливание в побегах А1РОТ1 (А!4д20100), А1РОТ2 (А!2д41050) и А1РОТ3 (А!4д36850) конститутивно экспрессировали в АгаЫбормк (табл. 2). Для исследования действия на №Г-накапливание в побегах О8Р0Ы (О801д16170) конститутивно экспрессировали в рисе (табл. 2). А1РОТ1, А1РОТ2 и А1РОТ3 экспрессировали также гетерологично в дрожжах.

Таблица 2

Названия и номера доступа РОТ-белков АтаЬгборага и риса

Название	Доступ	ΜΡγοΙ доступ	Номера аминокислотных остатков	Положение 1-ой Рб-петли	Положение 2-ой РО-петлн
ΑίΡΟί,ί	Α(4$20100	049437	288	3-69	187-242
ΛίΡ(2Ζ2	Αΐ2β41050	Ο8ΚΧΎ4	376	8-74	268-332
ΑίΡβΐ3	Α14&36850	023198	374	30-96	255-321
ΑίΡβΙΑ	Αΐ5§59470	Ο9ίΤΙ3	239	27-93	150-205
ΑΙΡβΙί	Α15§40670	Ρ57758	270	9-75	151-213
А1Р(}16	Α14807390	Ο8νΥ63	234	27-93	150-205
ΟίΡζΙΙ,Ι	0501£16170	Ο5ΝΒΜ2	421
ОзРсзьг	Οβ07β29610	07X990	244
ο$ρ<2ΐ3	0812818110	Ο2ΟΤΎ6	274

Экстракции ДНК и РНК и синтез кДНК.

Геномную ДНК экстрагировали из молодых листьев АгаЫбор818 (НаПапа с использованием методологии Еб^атбк е! а1. (№ис1ею Аабк КекеагсН 19: 1349, 1991). Вкратце, ткани побегов или корней растений мгновенно замораживали в жидком азоте и измельчали до тонкого порошка с использованием ступки и пестика. К этому порошку добавляли 400 мкл буфера Эдвардса (200 мМ Тп8 рН 8, 25 мМ ЭДТА, 250 мМ №10 и 0,5% ДСН) и эти пробы оставляли при комнатной температуре и выдерживали в течение 1 ч. Пробы центрифугировали при 13000хд в течение 2 мин и супернатант удаляли. ДНК осаждали добавлением 300 мкл 100% изопропанола, инкубированием этих проб при комнатной температуре в течение 2 мин перед центрифугированием при 13000хд в течение 5 мин. Осадки ДНК промывали 70% этанолом и давали высыхать на воздухе перед ресуспендированием в 100 мкл ТЕ-буфера.

Общую РНК экстрагировали с использованием реагента ТР1/о1 (1пуйтодеп, СатПЬаб, СА, И8А), согласно протоколу, описанному в Оютсхупккк ВюТес11пк|ие8 15: 532-537, 1993. ДНК-загрязнение удаляли с использованием не содержащего ДНК АтЬюп (АтЬюп, Маб18оп, ^1, И8А) и 2 мкг общей РНК использовали для синтеза кДНК с использованием 8ирег8спр! III (1пуйтодеп).

Сверхэкспрессия А1РОТ1-3 в АтаЫбор818.

Трансгенные растения АтаЫбор818, конститутивно экспрессирующие гены ΛίΡΟΠ, А1РОТ2 и А1РОТ3, использующие промотор 358, получали от доктора Анны Амтман, Ишуегейу о£ О1а8до\у, ИК. С использованием прямых праймеров целых генов А1РОГ1, 2 или 3 и обратных праймеров целых генов АРОМ, 2 или 3 (табл. 3), этот полный ген клонировали из геномной ДНК АгаЬ1бор818 Со1-0 в исходный

- 24 022359 вектор рСК8 Са1е\уау. Расщепление рестриктазами и секвенирование этой плазмиды использовали для подтверждения ориентации этого гена в данном векторе и для гарантии того, что нет ошибок в кодирующей последовательности клонированного гена. Затем для трансформации АгаЬМор515 этот ген переносили в целевой вектор рСАВ2, с использованием реакции Са1е\\ау и трансформировали в АдгоЬас!егшт !ите£ас1еп5, штамм СУ3101.

Таблица 3

Последовательности пар праймеров, используемые для амплификации полного гена АЖЦЫ, 2 и 3 и 05РЦЬ1

Ген	Пряной	Обратный
ΑίΡβΡΙ	АТСАТТСЕАЕАТЕАТТТЕТС (5Е<2 Ю ΝΟ: 10)	ТТАЕАСАССТТСТТСАССЕЕ (5Ε0Ι0ΝΟ11)
ΑίΡΰί2	АТЕТТТСТССАСАССАСТТТ (5Ε<2Π?ΝΟ: 12)	ТТАСАСАЕСТТСТСССЕТТ (5Е<2Ю N013)
ΑίΡζ)ί3	АТЕЕАТТАТСТАЕЕААТСЕА (3ΕΟΙΟΝΟ. 14)	ТСАААТСТТТТТАСТТТТСА (5Е0ГО N015)
ΟΒΡβίΙ	АТ 5СЕСАТС Т ТСАСТЕСАСС (5Е0ГОМО16)	ТТАААСТТТАТСАЕСАСТЕТС (5ΕΟΙΟΝΟ. 17)

§АЬК Т-ДНК нокаут.

Все мутанты с нокаутом Т-ДНК получали из коллекции §АЬК через Nо!!^η§Ьат АгаЫйор515 §!оск Сеп!ге (ИА§С, Nо!!^п§Ьат, ИК). Для отбора гомозигот растения выращивали индивидуально на почве и их зиготность испытывали выделением геномной ДНК и ПЦР с использованием праймеров, сконструированных §1дпа1 1§ес! !оо1 (5щпа1.5а1к.е0и/10парптег5.2.1Пт1) для детектирования инсерта Т-ДНК. Уровни транскрипта линий с нокаутом рс.]11-1 (§АЬК_1108796) и рц13-1 (§АЬК_044346) проверяли при помощи полуколичественной ПЦР с обратной транскрипцией.

Нокдауны апиКУА.

Поскольку А1РЦЬ1-3 имеют высокую гомологию, возможно, что имеется избыточность в этом семействе генов. Для проверки этого, амиРНК-мутанты конструировали для нокдауна 2 или 3 генов А1РЦЬ1-3 одновременно. АМЭ 2 - АеЬ М1сгоКИА Эекщпег (11ир://\ут02луе1де1\уог10.огд/сд1.Ьт/тппа1оо15.р1) использовали для идентификации двух содержащих 21 основание последовательностей, к которым могли быть сконструированы две независимые ат^КNΑконструкции, которые могли уменьшать экспрессию А1РЦЬ1&2, А1РЦЬ1&3, А1РЦЬ2&3 или А£РрЬ1,2&3. Праймеры (табл. 4), содержащие необходимые последовательности для генерирования содержащих 21 пару нуклеотидов атЖ/ЫА, включали в атЖМА-вектор М1К319а и цельные ат^КNΑконструкции клонировали в рСК8, в соответствии с протоколом в 11ир://\ут02луе1де1\уог10.огд/сд1.Ьт/тппа1оо15.р1?раде=7. После секвенирования, для проверки на любые ошибки последовательности и для определения правильной ориентации этой последовательности выполняли Са1е\уау ЬК для переноса этих атЖИА-конструкций в векторы рТ00Ь2, которые могут использовать промотор 35δ для запуска экспрессии этих ат^КNΑ.

Таблица 4

Последовательности-мишени и праймеры атЖNΑ

Название	Последовател ьностьнишень ΑίΡΟί	Название праймера	Последовательность
βπϋΚΝΑ А(Р&1&2 91	ТАТТААТЕЕАТТСТАТС ССТС (5Е<2 ГО ΝΟ: 50)	1 пшК-8	ЕАТАТТААТСЕАТТСТАТСССТСТСТСТСТ ТТТЕТАТТСС (5Е<2 ГО ΝΟ 18)
ПтЕК-а	ЕАбАвЕЕАТАЕААТССАТТААТАТСАААЕА ЕААТСААТЕА (5Е<Э ГО ΝΟ 19)
III τηϊΚ*$	ЕАЕААОЕАТАЕААТСЕАТТААТТТСАСАЕЕ ТССТСАТАТС (5Е<2 ГО ΝΟ: 20)
IV ш1Е*а	ЕАААТТААТССАТТСТАТССТТСТСТАСАТ АТАТАТТССТ (5Ε<3ΙΟΝΟ:21)
ΒΓπίΚΝΑ	ТАЕТТАСТСАТААТСТА СЕЕТ (5ЕЦ ГО ΝΟ:	I ΠΐίΚ-8	ЕАТАЕТТАЕТСАТААТСТАСЕОТТСТСТСТ ТТТЕТАТТСС (5ЕЦ ГО ΝΟ 22)

- 25 022359

ΑΙΡζ)1Λ&2 #2	51)	ΙΙΐϊύΚ.-4	СААСССТАСАТТАТСАСТААСТАТСАААСА СААТСААТСА (5Е0 ГО ΝΟ: 23)
ΠΙ тЖ*£	СААСАСТАСАТТАТСТСТААСТТТСАСА56 тсстелтАте (5ΕΟΐϋΝθ:24)
IV тЖ*а	6АААСТТАСАСАТААТСТАСТСТТСТАСАТ АТАТАТТССТ (5ЕОГО ΝΟ: 25)
ίιπυΚΝΑ ΛίΡΟί.103 #1	ТС6СССАТСТАААТССС СССС (3ΕΟ ГО ΝΟ: 52)	I ГПЖ-8	САтсесссдтетАААтсессбсстстстст ТТТСТАТТСС (ЗЕО ГО ΝΟ: 26)
ΙΙηύΚ-а	САСССССССЛТТТАСАТСССССАТСАААСА 6ААТСААТ6А (ЗЕ<3 ГО ΝΟ: 27)
III тЖ*5	САСОАССССАТТТАСТТабСССТТСАСАСб ТССТСАТАТб (5Е<3 ГО ΝΟ: 28)
IV тЖ*а	СААСССССААСТАААТССССТССТСТАСАТ АТАТАТТССТ (5Е<3 ГО ΝΟ: 29)
агтЕУЧА ШРОЫ&З #2	ТСССССАТССТАААТСС ССССС (5Έ<2 ΙΟ ΝΟ: 53)	[πιίΚ-5	еАТСбСССАТСТАААТССССбССТСТСТСТ ТТТСТАТТСС (5ЕО ГО ΝΟ: 30)
ΠιηίΚ-а	САС6СССССАТТТАСАТСС6ССАТСАААСА СААТСААТ6А (ЗЕ<2 ГО ΝΟ: 31)
П1тЖ*5	САССАСбССАТТТАСТТССОССТТСАСАСС ТССТСАТАТБ (ЗЕО ГО ΝΟ: 32)
IV тЖ*а	СААСССССААСТАААТССССТССТСТАСАТ АТАТАТТССТ (8Е<3 ГО ΝΟ: 33)
βπύΚΝΑ А(Р(ЗЬ2&3 «1	ТАТСАСТССАТТСАААС ССТС (5Ε<2 ГО ΝΟ: 54)	I πιΐΕ-э	САТАТСАСТСЕАТТСАААСОСТСТСТСТСТ тттстаттсс (ЗЕО ГО ΝΟ: 34)
ΙΙηϊϊΚ-а	САС АСС СТТТ СААТССАС ТСАТ АТСАААС А ЕААТСААТЕА (5Εζ> ГО ΝΟ: 35)
Ш тЖ*з	САСААССТТТСААТССАСТСАТТТСАСАСС ТССТСАТАТС (5ЕО ГО ΝΟ: 36)
IV тЖ*а	САААТСАСТС В АТТСАААССТIСТСТАСАТ АТАТАТТССТ (5ЕО ГО ΝΟ: 37)
3πύΚΝΑ ΑίΡζ212&3 »2	ТАТСААТССАТТСААТА ССТС (5ΕΟ ГО ΝΟ: 55)	ΙιτύΚ-8	САТАТСААТССАТТСААТАССТСТСТСТСТ ТТТСТАТТСС (5Е<Э ГО ΝΟ: 38)
ПтЖ-а	САСАССТАТТСААТССАТТСАТАТСАААСА СААТСААТСА (5Е<2 ГО ΝΟ: 39)
111 юЖ*5	САССССТАТТСААТССАТТСАТАТСАСАСС

- 26 022359

			ТССТСАТАТС (5ЕО ΙΟ ΝΟ: 40)
IV т!К*а	САТАТСААТССАТТСААТАССССТСТАСАТ АТАТАГТССТ (8Р<2 ГО ΝΟ: 41)
βιηϊΚΝΑ ΛίΡβίΡ 2&ϊ#1	ТАТСААТСЙАТТСАААС ССТС (5ΕΟΙΟ ΝΟ: 56)	I ΠΐίΚ-8	САТАТСААТСеАТТСАААСССТСТСТСТСТ ТТТСТАТТСС (5Ες>ΙΟΝΟ:42)
ПтЖ-а	еАСАСССТТТСААТССАТТСАТАТСАААСА СААТСААТСА (5Е<3 ΙΟ ΝΟ: 43)
ШпйК*$	САбААССТТТСААТССАТТСАТТТСАСАСС ТССТСАТАТС (5Е<2 ГО ΝΟ: 44)
IV гтР’а	САААТСААТССАТТСАААССТТСТСТАСАТ АТАТАТТССТ (5Е<2 ГО ΝΟ: 45)
агтиШ\1А ΛίΡβΡΙ, 20-3 ¢2	ТАТСААТС6АТТСААТС СТТС (5Е<2 ΙΟ ΝΟ: 37)	I ΓηίΚ-ч	САТАТСААТССАТТСААТССТТСТСТСТСТ ТТТСТАТТСС (5Е<2 ГО ΝΟ: 46)
ИпйК-а	6АСААССАТТ6ААТССАТТСАТАТСАААСА СААТСААТСА (3ΕΟΙϋΝΟ:47)
ШтЖ’в	САСАСССАТТСААТССАТТСАТТТСАСАСС ТССТСАТАТС (ЗЕО ГО ΝΟ: 48)
IV гтК*а	6АААТСААТСОАТТСААТСС6ТСТСТАСАТ АТАТАГТССТ (5Ε€>ΙΟΝΟ:49)

Трансформации АгаЫйор818.

Экотип АгаЫ4ор818 Со1-0 трансформировали посредством способа погружения цветков (С1оидП & Вепр ТПе Р1ап( 1оигпа1 16: 735-743, 1998), с использованием АдгоЬас1егшт 1итеРас1еп8, штамма Ον3101, с векторами рС\УВ2 или ТООЬ2, содержащими либо сверхэкспрессию 358, либо конструкции ат^КNЛ. Из трансформированных растений собирали семена и проращивали на искусственной почвенной среде (3,6 л перлита для сред, 3,6 л кокосового волокна и 0,25 л речного песка) и опрыскивали 100 мг/л ВА8ТА (АдгЕуо, Ои88е10огР Оегтапу) для идентификации предположительных ТКтрансформантов. Трансформанты переносили в почву, поливали один раз в неделю 300 мл питательного раствора (2 мМ Са^О₃), 15 мМ ^О₃, 0,5 мМ Мд8О₄, 0,5 мМ NаΗ₂РО₄, 15 мМ NΗ₄NО₃, 2,5 мкМ NаРе-ЭДТА, 200 мкМ Н₃ВО₃, 0,2 мкМ №₂МоО₄, 0,2 мкМ №С1₂, 1 мкМ 2п8О₄, 2 мкМ МпС1₂, 2 мкМ Си8О₄ и 0,2 мкМ СоС1₂) и выращивали до цветения для сбора Т₂-семян.

Анализы стресса АгаЬМор818, вызванного засолением.

Семена из мутантных линий (358, Т-ДНК КО, или ат^КNЛ, описанные выше) стерилизовали на поверхности замачиванием в 70% этаноле в течение 2 мин с последующими 5 промываниями в стерильной воде тДИ-Ц, перед посевом отдельных семян в крышках микрофужных пробирок на 1,5 мл, заполненных раствором для проращивания АгаЬМор818 (табл. 5) с 0,8% Бактоагаром, рН 5,6. Эти крышки помещали в подносы для проращивания, находящиеся в растворе для проращивания АгаЬМор818. Эти семена яровизировали в течение 2 дней при 4°С и затем переносили в камеру роста с фотопериодом 10 ч света/14 ч темноты, освещением 150 мкмоль/м² в секунду, и постоянной температурой 21°С. После 2-3 недель в подносах для проращивания растения переносили в постоянно аэрируемую емкость для гидропоники, содержащую раствор для гидропоники для АгаЬМор818 (табл. 5). рН питательного раствора для гидропоники подвергали мониторингу и поддерживали при рН 5,6. Стресс, вызываемый засолением, применяли спустя 1 неделю после помещения в резервуары для гидропоники добавлением 50 мМ Ν;·ιΟ с 4-часовыми пополнениями 25 мМ. Активность кальция в среде для выращивания поддерживали при 0,3 мМ при каждом внесении соли добавлением правильного количества кальция, рассчитанного с использованием νί8иа1 МиПес.] Vе^8^оη 2.3 (И8 Епупоптеп1а1 Рго(есПоп Адепсу, И8А).

Растения собирали после 3 дней солевой обработки. Последний полностью раскрывшийся лист удаляли, взвешивали и расщепляли 1% азотной кислотой в течение ночи при 85°С в Но! В1оск (Епупоптеп(а1 Ехрге88, М( Р1еа8ап(, 8ои(П СагоНпа, И8А). Концентрации №Р и К+ в этом листе измеряли с использованием модели 420 пламенного фотометра (8Пег\уоой ИК).

- 27 022359

Таблица 5

Проращивание АгаЫборык и растворы для гидропоники

Растворы для проращивания	Питательный раствор для гидропоники
Макронутриент	Концентрация (ыМ)	Макронутриент	Концентрация (мМ)
СаСР	0,75	ΚΝΟ>	1,25
ка	1,0	Са0ОЩ-4№О	0,5
Са(ЫОз)2-4Н1О	0,25	М85О*-7№О	0,5
М₈50ч-7№0	1,0	РеИаБОТА	0,0425
КНгРСи	0,2	КНгРСЬ	0,0625
Микронутриент	Концентрация (мкМ)	Микронутриент	Концентрация (мкМ)
№Ре(1П)ЕОТА	50	СийОгЗНгО	0,16
НзВОз	50	Ζη5Οι·7ΙΕΟ	0,38
МпСЬЧНгО	5	МпЗОгНгО	1.8
Ζϊ»5Οί· 7ΗϊΟ	10	НзВО	45
Οι3θ4·5Η2θ	0,5	(ΝΗ4>Μ07Ομ · 4НЮ	0,015
ΝίιίΜοΟϊ	.01	СоОгбИг)	04)1

Трансформация риса.

Полноразмерный ОкРЦШ клонировали из растений риса №рроиЬаге дикого типа в исходный вектор рСР8 Са!е^ау. Расщепление рестриктазами и секвенирование этой плазмиды использовали для подтверждения ориентации этого гена в данном векторе и для гарантии того, что нет ошибок в кодирующей последовательности клонированного гена. Затем для трансформации риса этот ген переносили в целевой вектор рМОС32, с использованием реакции Са!е^ау. Эту плазмиду отсылали в С1РАО, Мои!реШег, Ргапсе, для трансформации риса.

Анализы стресса риса, вызванного засолением.

Семена риса 358::ОкРЦЬ1 и №рроиЬаге дикого типа проращивали в течение 5 дней на увлажненной фильтровальной бумаге при 28°С/25°С день/ночь, влажности 80%/60% день/ночь и свете 600 мкмоль/м² в секунду с циклом свет/темнота 12 ч света/12 ч ночи. Проростки удаляли с фильтровальной бумаги и помещали в микрофужные пробирки на 1,5 мл, у которых были удалены нижние части для создания возможности выхода корней из пробирки. Каждую микрофужную пробирку осторожно помещали в штатив над 10-литровым резервуаром, наполненным питательным раствором АСРРС для риса (5 мМ ΝΠ4ΝΟ3, 5,0 ΚΝΟ3, 2 мМ Са^О3)2, 2,0 мМ М§8О4, 0,1 мМ К2НРО4, 50 мкм NаРе(III) ЭДТА, 10 мкМ Н3ВО3, 5 мкМ МиС12, 5 мкМ 2и8О4, 0,5 мкМ Си8О4 и 0,1 мкМ №2МоО3), делая возможным доступ корней проростков к среде. Проростки выращивали в течение двух недель при 28°С/25°С день/ночь, влажности 80%/60% день/ночь и свете 600 мкмоль/м² в секунду с циклом свет/темнота 12 ч света/12 ч ночи, с питательным раствором, сменяемым каждые 5 дней. Спустя 14 дней после проращивания, половину этих проростков переносили в питательный раствор, содержащий 75 мМ №С1, дополненный 0,24 мМ СаС12. Чтобы не создать стресс для этих растений, внесение соли производили в виде трех 12-часовых внесений 25 мМ Ν;·ιΟ и 0,8 мМ СаС1₂. Растениям давали расти в течение дополнительных 12 дней перед сбором. 3-й полностью раскрывшийся лист удаляли из каждого растения, его сырую массу регистрировали и затем его инкубировали при 65°С в течение 48 ч с получением высушенной ткани для измерений сухой массы. После получения измерений массы эту ткань расщепляли в 1% азотной кислоте в течение ночи при 85°С. Измерения №+ и К+ для каждого листа определяли пламенной фотометрией.

Трансформация дрожжей.

С использованием прямых праймеров целых генов АРРЦЫ, 2 или 3 и обратных праймеров целых генов А1РрЬ1, 2 или 3 (табл. 3, выше), этот полный ген клонировали из геномной ДНК АгаЫборык Со1-0 в исходный вектор рСР8 Са!е^ау. Расщепление рестриктазами и секвенирование этой плазмиды использовали для подтверждения ориентации этого гена в данном векторе и для гарантии того, что нет ошибок в кодирующей последовательности клонированного гена. Затем каждый ген трансформировали в 8. сегеУ1К1ае способом с использованием ацетата лития/полиэтиленгликоля. (0е^ е! а1., Уеак! 11: 355-360, 1995) и трансформанты отбирали на минимальной среде 8Ό (0,67% (мас./об.) ОРсо Уеак! ийгодеи Ьаке без аминокислот, 1 г/л гистидин), (-урацил). Трансформированные клетки выращивали по отдельности в течение ночи в минимальной среде 8Ό (-урацил), 2% (мас./об.) Ό-галактоза до поздней 1од-фазы.

- 28 022359

Анализы чашек.

Клетки осаждали и ресуспендировали до ΘΌ₆₀₀ 0,3. Культуры серийно разводили до конечного ΘΌ₆₀₀ 0,0003 и 10 мкл каждого разведения помещали на минимальную среду δΌ (-урацил), 2% (мас./об.) Ό-галактоза, 2% (мас./об.) агар, с 0 мМ ЫаС1 + 0 мМ СаС1₂, 0 мМ ЫаС1 + 10 мМ СаС1₂, 500 мМ ЫаС1 + 0 мМ СаС1₂ или 500 мМ ЫаС1 + 10 мМ СаС1₂. Чашки инкубировали при 30°С в течение 2-3 дней и фенотипы роста подвергали мониторингу.

Анализы жидких культур.

Клетки добавляли к жидким культурам для достижения ΘΌ₆₀₀ 0,1. Каждые 10 мл культуры содержали минимальную среду δΌ (-урацил), 2% (мас./об.) Ό-галактозу, с 0 мМ ЫаС1 + 0 мМ СаС1₂, 0 мМ ЫаС1 + 10 мМ СаС1₂, 500 мМ ЫаС1 + 0 мМ СаС1₂, или 500 мМ ЫаС1 + 10 мМ СаС1₂. Пробы 200 мкл брали каждые 24 часа в течение до 4 дней для использования для измерений ΘΌ₆₀₀.

Пример 12.

Гены РО-петель в растениях.

В результате поисков в базе данных геномов АгаЫДор818, риса и Рйу8сотйге11а ра!еп8 очевидно, что гомологии для генов РО-петель (называемых так двух консервативных пар аминокислот пролина (Р) и глутамина (О) в каждой последовательности) из дрожжей существуют во всех трех геномах, в частности, для гена дрожжей, Уо1092\\р. АгаЫДор818 и Рйу8сотйге11а содержат шесть генов РО-петель, тогда как рис содержит только три гомологии. Интересно, что эти гены подразделяются на три отдельных клада (фиг. 18). Геном АгаЫДор818 содержит три гена в кладе I, два гена в кладе II и единственный ген в кладе III. Геном риса содержит единственный ген в каждом кладе. Геном Рйу8сотйге11а содержит один ген в кладе I, два в кладе II, один в кладе III и два, которые являются более близкородственными со вторым геном дрожжей (УДг352\\р), группой, которая не обнаружена в высших растениях. Таким образом, для обнаружения генов νίΝδί','ί'.' в высших растениях, гены, наиболее близкородственные в отношении гена дрожжей Уо 1092тер, являются наиболее подходящими. Гены клада I являются наиболее близкородственными Уо1092\\р и, следовательно, являются наиболее логичными кандидатами.

Дополнительно, топологический анализ (использующий консенсус из нескольких предсказывающих программ, в том числе НММТОР, РКЕИ-ТМК и Ку1е-Эоо1|Ц1е р1о!) предположительных белковых структур белков с РО-петлями из дрожжей и растений выявил гораздо большее сходство между Уо1092\у и членами растений, обнаруженными в кладах II и III. Белки клада I имеют 7 трансмембранных доменов (ТМЭ) и одну большую цитоплазматическую петлю неизвестной функции, которая соединяет ТМЭ 3 и 4 (фиг. 19).

Это противоречит белкам клада II, которые имеют только 5 ТМИ, и белкам клада III, которые имеют только очень малые петли между этими ТМЭ.

Поскольку АгаЫДор818 содержит три гена в кладе I, потенциально имеется некоторый уровень избыточности в этом кладе, которая указывает на то, что анализ множественных нокаутов и/или нокдаунов генов могут быть необходимы для наблюдения фенотипа при работе по выяснению функции этих генов в этом кладе. Существует также вероятность того, что белки этого клада будут собираться в мультимеры, и, если они являются гетеромерными, может потребоваться фенотипический анализ множественных нокдаунов генов.

Предположительно, белки РОБ кодируют неселективный катионный канал, обнаруживаемый на плазматической мембране растительной клетки. Предполагается, что эти каналы облегчают приток Иа⁺ в клетки. Предполагается что они экспрессируются в клетках корней, возможно, в наружных клетках корней. Предполагается, что они участвуют в первоначальном притоке Иа⁺ в корни растений.

Дрожжи, экспрессирующие ген А1Р0Б1, демонстрируют небольшое уменьшение роста при выращивании на 0 мМ №С1 в сравнении с дрожжами, трансформированными вектором-контролем (те!) (фиг. 20 и 21). Дрожжи, экспрессирующие ген А1Р0Б1, демонстрируют значимое уменьшение роста при выращивании на 500 мМ №С1, наводя на мысль о том, что этот ген кодирует белок, который облегчает вхождение Иа⁺ в клетку (фиг. 20 и 22). Это уменьшение в росте является значимо большим, чем в дрожжах с вектором-контролем (те!). Это действие частично элиминируется добавлением 10 мМ СаС1₂, что позволяет предположить, что этот белок участвует в неселективном катионном канале (ΝδΟΟ). Νδί'.'ί'.'активность может быть ингибирована добавлением Са²+ (фиг. 20-22).

Поскольку было предположено, что белки РОБ могут участвовать в первоначальном вхождении Иа⁺ в корень и оттуда этот Иа⁺ перемещается в побег, атгКИА-нокдауны и Т-ДНК-нокауты генов А1Р0Б получали для исследования, может ли уменьшение экспрессии этих генов уменьшать накапливание Иа⁺ в побеге. Было определено, что как атгКИА-нокдаун множественных генов А1Р0Б, так и Т-ДНК-нокауты отдельных генов А1Р0Б приводили к уменьшению накапливания Иа⁺ в побеге, что позволяет предположить, что они действительно являются ответственными за первоначальное вхождение Иа⁺ в клетки корня растения.

При 0 мМ №С1 трансгенные растения с нокаутом отдельных генов РОБ, с нокаутом множественных генов или со сверхэкспрессией отдельных генов РОБ имеют слегка более высокую биомассу, чем биомасса контрольных растений дикого типа (фиг. 23А). Единственным исключением является, повидимому, нокаут А1Р0Б3.

- 29 022359

При повергании этих линий действию 50 мМ ЫаС1 в течение 3 дней все линии с нокаутом, нокдауном или сверхэкспрессирующие линии продуцируют более высокую биомассу, чем контроли дикого типа (фиг. 23В). Было определено, что как ат1КЫА-нокдаун множественных генов А£РЦЬ, так и Т-ДНКнокауты отдельных генов АБРЦЬ приводили к увеличенному накаливанию биомассы побегов, что позволяет предположить, что они действительно являются ответственными за первоначальное вхождение №Б в клетки корня растения, и посредством уменьшения экспрессии этих генов количество Ν;·ι' в растении уменьшается, что позволяет растению накапливать больше биомассы (фиг. 23В). Интересно, что конститутивная сверхэкспрессия АБРЦЫ в любой клетке растения АгаЫйорз13 также увеличивала накапливание биомассы побегов (фиг. 23В), опять наводя на мысль, что этот кодируемый белок действительно участвует в транспорте Ν;·ι'. Этот явно противоречивый результат может быть приписан гену, экспрессирующемуся в любой клетке растения (где нокдауны ηιηίΚΝΛ и нокауты Т-ДНК уменьшают природную экспрессию генов, которая, предположительно, является специфической для типа клетки и тканеспецифической). Эта конститутивная экспрессия, возможно, приводила к экспрессии генов РЦЬ в имеющих преимущество типах клеток, где это растение обычно не экспрессирует этот ген, или приводила к повышающей регуляции некоторых природных Ыа+-транспортеров для компенсации более высокой экспрессии генов РОБ. Подобные результаты наблюдали в прошлом с генами, подобными АБИКТ1;1, где как растения с нокаутом Т-ДНК, так и растения с конститутивной экспрессией 35§::АБИКТ1;1 имеют увеличенные концентрации Ν;·ι+ в побегах.

Если рассчитывать солеустойчивость трансгенных линий делением средней биомассы этой линии при 50 мМ солевом стрессе на среднюю биомассу этой линии в отсутствие солевого стресса, можно наблюдать, что линии с нокаутом АБРЦЫ и А1Р0Б3 имеют высокую солеустойчивость в сравнении с растениями дикого типа (120-180% солеустойчивость в линиях с нокаутом в противоположность 70% в растениях дикого типа). атЖИА-нокдауны, хотя они и не являются такими же солеустойчивыми, как и полные нокауты, все еще являются более солеустойчивыми, чем растения дикого типа (80-85% солеустойчивость в атБК.ЫА линиях против 70% солеустойчивости в растениях дикого типа). Линии, конститутивно экспрессирующие гены АБРЦЕ, являются сходными по солеустойчивости с растениями дикого типа (фиг. 24).

Как и в случае АгаЫйорз13, конститутивная сверхэкспрессия ОзРЦЫ в каждой клетке растения риса также значимо уменьшала накапливание №Б в побегах (фиг. 25), что позволяет предположить, что этот кодируемый рисом белок также участвует в транспорте №Б.

Пример 13.

Локализация АБРЦЫ в эпидермальных клетках табака.

Слияния АЖЦЫ-ОРР транзиторно экспрессировали в эпидермальных клетках табака с использованием способа агроинфильтрации, как описано Тапд е( а1. (8аепсе 274: 2060-2063, 1996). Инфильтрированные растения возвращали в камеру для выращивания за 3 дня перед наблюдением. Затем инфильтрированные зоны листа собирали вырезанием площади листа (приблизительно 1 см²) лезвием бритвы. Для уменьшения фоновой флуоресценции вследствие воздушных пакетов, вырезанные пробы листьев вакуум-инфильтрировали дистиллированной водой. Микроскоп 2е1зз СБ8М510-БУ с объективом х20 Р1ап Аросйгота! использовали для просмотра листовых дисков. ОРР-флуоресценцию возбуждали при 488 нм аргоновым лазером. Дихроичный фильтр МРТ545 использовали для расщепления испускаемого флуоресцентного света между двумя каналами, с полосовым фильтром 505-530 нм для ОРР и с полосовым фильтром 560-615 для аутофлуоресценции хлоропластов.

Как показано на фиг. 26, визуализация флуоресценции ОРР конфокальной микроскопией позволяет предположить, что белок АЖЦЫ локализован в мембране в этой клетке. Вследствие местоположения клеточных органелл, предполагается, что АБРЦЫ локализован на плазматической мембране.

Специалистам в данной области будет понятно, что описанное здесь изобретение доступно для вариаций и модификаций, иных, чем вариации и модификации, конкретно описанные здесь. Должно быть понятно, что это изобретение включает все подобные вариации и модификации. Это изобретение включает также все стадии, признаки, композиции и соединения, которые называются или указываются в этом описании, по отдельности или вместе, и любые и все комбинации любых двух или более стадий или признаков.

Следует также отметить, что в данном контексте формы единственного числа включают и множественные аспекты, если контекст уже не диктует иное.

Claims

1. Способ модуляции скорости, уровня или паттерна потока катионов через мембрану клетки, предусматривающий модуляцию экспрессии полипептида с повторами Ρβ-петель в клетке, содержащей эту клеточную мембрану, где полипептид с повторами Ρβ-петель содержит (ί) аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9; или (ίί) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична 8ЕЦ ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9 на протяжении полной длины 8ЕО ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9 и которая содержит один или более мотивов аминокислотной последовательности, представленных в 8ЕЦ ГО ЫО:1, 2, 5, 6 и 7, и который способен модулировать скорость, уровень или паттерн потока катионов через клеточную мембрану.

2. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид с повторами Ρβ-петель, где полипептид с повторами Ρβ-петель содержит (ί) аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9; или (ίί) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична 8ЕЦ ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9 на протяжении полной длины 8ЕО ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9 и которая содержит один или более мотивов аминокислотной последовательности, представленных в 8ЕЦ ГО ЫО:1, 2, 5, 6 и 7, и который способен модулировать скорость, уровень или паттерн потока катионов через клеточную мембрану.

3. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.2, где этот полипептид с повторами Ρβ-петель содержит потенциалонечувствительный неселективный катионный канал.

4. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.2 или 3, где этот полипептид с повторами Ρβ-петель содержит транспортер одновалентных катионов.

5. Способ установления чувствительности или толерантности к катиону организма, предусматривающий определение экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с повторами Ρβпетель, в одной или более клетках этого организма, где полипептид с повторами Ρβ-петель содержит (ί) аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9; или (ίί) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична 8ЕЦ ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ΝΌ:9 на протяжении полной длины 8ЕЦ ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9 и которая содержит один или более мотивов аминокислотной последовательности, представленных в 8ЕЦ ГО ЫО:1, 2, 5, 6 и 7, и который способен модулировать скорость, уровень или паттерн потока катионов через клеточную мембрану.

6. Способ по п.1 или 5, где этот полипептид с повторами Ρβ-петель содержит потенциалонечувствительный неселективный катионный канал.

7. Способ по любому из пп.1, 5 или 6, где этот полипептид с повторами Ρβ-петель содержит транспортер одновалентных катионов.

8. Способ по п.7, где этот одновалентный катион включает один или более из Ν;Ε, К⁺, ΝΗ₄ ⁺, метиламмония, Тг18⁺ или холина'.

9. Способ по п.7, где транспорт одновалентного катиона этим полипептидом может ингибироваться поливалентным катионом.

10. Способ по п.9, где этим поливалентным катионом является Са²'.

11. Способ по п.1 или по любому из пп.5-10, где эта клеточная мембрана является клеточной плазматической мембраной.

12. Способ по п.1 или по любому из пп.5-11, где модуляция скорости, уровня или паттерна потока катионов через клеточную мембрану клетки модулирует толерантность или чувствительность к катионам этой клетки.

13. Способ по п.1 или по любому из пп.5-12, где экспрессия этого полипептида модулируется модуляцией экспрессии нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид с повторами Ρβ-петель в этой клетке.

14. Клетка с модулированными скоростью, уровнем или паттерном потока катионов через мембрану этой клетки, где указанная модуляция является результатом модулированной экспрессии полипептида с повторами Ρβ-петель в этой клетке, где полипептид с повторами Ρβ-петель содержит (ί) аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9; или (ίί) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична 8ЕЦ ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9 на протяжении полной длины 8ЕО ГО ЫО:4 или 8ЕЦ ГО ЫО:9 и которая содержит один или более мотивов аминокислотной последовательности, представленных в 8ЕЦ ГО ЫО:1, 2, 5, 6 и 7, и который способен модулировать скорость, уровень или паттерн потока катионов через клеточную мембрану.

15. Клетка по п.14, где скорость, уровень или паттерн потока катионов через мембрану этой клетки модулируется способом по п.1 или по любому из пп.5-13.

16. Генетически модифицированная клетка, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.2-4 или геномно интегрированную форму указанной конструкции.

17. Многоклеточная структура, содержащая одну или более клеток по любому из пп.14-16.

- 31 022359

Фиг. 1

Фиг. 2

- 32 022359

Фиг. 3

- 33 022359

- 34 022359

Фиг. 5

- 35 022359

Фиг. 6

- 36 022359

Фиг. 7А

- 37 022359

Н;О Υ0Κ352» ΥΟί092'Λ Фиг. 7В

- 38 022359

Фиг. 8

- 39 022359

Фиг. 9

- 40 022359

Фиг. 10

- 41 022359

Фиг. 11А ρΥΕΜ УПК352»

Фиг. 11В

- 42 022359

Время (мс)

Фиг. 12

- 43 022359

Фиг. 13

- 44 022359

Способ Νβιρϊιΐχ* ЦО1П(пд Вез! Тгее, Фе ЬгеаЕаЮ = Зуз1ел1а1ю Расстояние Абсолютное (количестве различий), гопы распределены пропорционально §»{6809и 35 $1ηιί |$сЫго>;дссЬаготусс« р<ннЪе| Υ01Λ92* (Ьасс&агогаусе^еегеуЩа*!

ΥδΗ14;ν» ($ассЬагрпгусе!»<егс\н»ае| АЫСЗбЗЗФРад белок |АгаЬм1<ф$ке тЬ«Ьапа{ А(4О2О1ООР0Ь белок | АгзЬнЬрш 1ЬаБапа| θ5ϋ1₈Ο2ύ68Ο0 |0Г}И ««пз|

А(2С410$$ рад белок |АгаЬк1о|м« Ааизяа( $>|11$4Э216 [Тгйкитм а«а(п ип>{

ЕК8) [ЗагсЬалотусез сега4ияе{ |МОДМЛОД 1Нопн>,чя|»п»| £<{119943117 СТХ$ вариант 1 {Нота χ»ρ>ι«{ 0р19ММ1»СТ>& вариант 2 |»1<нт>4зрйч8[ £<{9696911 {ΤπίΚΗΐη ϊκΜίΙίνηπ»]

РО-летли содержащий 1 (Нота зар1впз] £<{31368567 [ТгИк«тлеа1п»«п| £<{11446861 (Тпбснт ам1пи<п|

У1Ж352* (ЯассЬмхнпусек <-мх¹\«<лс{ £<{20299830; |ТЖк-иеи агслкда)

РО-летли содержащая 2 иэофарма 1 [Нолю еарюпз] РО-летли содержащая 2 изоформа 2 [Нолю зарюпз] УМНОЮ* (КагсЬзготусеч «ге*»<ае| 1.ОС15207Я |Нйвм>?ар№й$[

Фиг. 14

Фиг. 15

- 45 022359

Фиг. 16

- 46 022359

Способ МездЬЬог Лвгагзд Без! Тгее, Ье ЬгеаМпд = ЗуЦетаЬс Расстояние Абсолютное (количества различий), толы распределены пропорционально

-Жк.

дозоедйвч «Доа рсш-змс я»»чцнос»».мое »р. рнзеятгчи рунлерьз» е»

ДОРИЗИН УалеМ» Вечерей» дотОДНС Теурмеееаае ст*«

ДО141У»* Титееееч* *г*Я »Т1Ч««1»Ч,£> КсМа (ей№3 доае/1оч/ Самим «змшм доадоедо Ьевиезеядом ч#·

ДОРН4И7Д РаДОззее» *р ДОС* ИН! В«0»?»ув<лу£в1 МА»»

ДОГНАН! МеАеарв гчлз«ы<* рлгшш) им^дю «дом ρι|’»»η>ί· 0«АН4С6«0» ер; докрМЯ» ыяемындов йй ДОН1КММ СеоНайДО» амДОе ДОИНПИ» ВЧееДОРсемгейм Р-ИЛАМее дои«»«9 иэдячйы »

ДОИЩИ ЬавМДОе г*. зеикьоеооет СеОДнемй «о дошм! лемр» доервв дозгэетг 5«<ь»пж>><«» <«»«»«* -пного» ЦНЗОЗОМЗ} К>»уте,ожу»»» Икс» дтнвоягр·» «нм«п»й*р» р»мсм дочмгмв! ш-еРв/нзись»»· *#*№»е рчзогегя? сдоме ^«ми*е* дом+ϊϊΡϊί Ркийзеечалз *»

ДО«7ЛЖ ЭчиярМй «айоаДОЗе дИРеДОНМ йюевДОм яынвеерееМ д;ЗЛ0Ч1О<73 ФемЬдозрнойМ еаазймв (ЙПЙЗМЯРЛ *п(«а оиуиДОз* доплат вевч» дом до|»ие«» о»<4>» «езидн ДО»ШЙ72 е<Хя1ма«№е майепмю

Л*е«<И*ДОА+чМ»(· »Л

Фиг. 17

- 47 022359

Фиг. 17 (продолжение)

- 48 022359

Фиг. 17 (продолжение)

- 49 022359

Фиг. 17 (продолжение)

- 50 022359

Фиг. 17 (продолжение)

- 51 022359 лг&ИХ» 'МД0017150*351 Лгйаяхм» »«»)!«» закглгио еми*в«и ж.

¢457479045 1»1*т«еЬ» *Ч>.

1-0Й15П4747О ¥1М* *;«Μν*

Д|->1Л1Μ55041 Ск»г» «и;»

Ο- 0013552531« «ИР» *«*β {— 041*40051*1 Λ>Η·ΜΒίΙ«Η* ρΜ«η» ρ- >«1517*4155 С«**ОЛМЛ«!» ».

|г 807174*0«» ?Г)ф»Ю»т« », *—04(1334*005» КЗДвздим *ρ·

-805М47И4 «1« «**1Л ι— )0109207491 РуклорЪвг» яр.

Ί— 0014901 511» РЬ»4ОЦ4М»1» »р, г- д«$2М«11 Сгугнесюссь» ле-оГмст»»

О— 80мгеа*»( сптт^ее»* л*м»<«»*» 801*141602» ТИЫо φ»Ηι»ή ¢¢153711011 Мило мдо»

8411411 ¢428 СгУ44*9<>сс*» И*в1впв*а* «ИДОЛ149 Я*<М*кП» ДОМ· 00143*75043 ЗММтеЙИВ «1ГЖ»Г*е» 0014349*07* Гмитм^ия «ШИй» 1-00132097561 040 1*ЙП» ызР- 00147872425 ЖММ а*»*ДО*

Щ_1-»415в28Л17 АлорЬве» ДОМ»

- О_ ¢0183050000 ДОй«И» ¢¢1)41

Д^0Й1»115709 ««МкмммИммиум* «*г*4*41»

]]-001155»»1М ИМ» «ДО» £1— 0В«Э*77«30 СюДО »1Ыс»Л»

1-0843477271 СяпДО ЫМ»»

-0451013577 ЛИяеКыв «ш*»»» 0415713*15* 10415 «йНм»

Фиг. 17 (продолжение)

- 52 022359

Фиг. 19

Фиг. 20

160 -! _

1 0 мМ №С1

140-1 г 0 мМ ЦаС| +10мМСаС1 . 1^-—I ’Л'- ΑΐΡΟίΙ А1РСЦ2 А1РЦ1.3

Фиг. 21

- 53 022359

Фиг. 22 мгРМ мг РМ

120

Фиг. 23А

120 ,

Фиг. 23В

- 54 022359 % солевыносливость (50 мМ №С1 ΡΝ/0 мМ Ν-аС! ΡΥΥ)

200

180

160

140

120

100

К О, РОИ К.О. РСЖЗ апц-рИА Р(Х ат!НЫА ΡΟΙ_ δπιίΡΝΑ Р(Х 355-РОИ 355-РО13 МТ

1&3 2&3 2&3

Фиг. 24 ννΐ 355-ΟδΡφΙ-Α 355-О5РСН.-В

Фиг. 25

Фиг. 26

- 55 022359

Список последовательностей <ιΐΰ> ΑυετΕΑΤίΑΝ сеытке гое рьлмт гимстюмль СЕЫОИ1С5 рту ьть <120> АКТИВНОСТЬ КАТИОННЫХ КАНАЛОВ <130> САТЮЫ СНАЫЫЕЬ ΑΟΤίνίΤΥ <150> АО 2009904675 <151> 2009-09-25 <160> 57 <170> РаСепЫп уегзгоп 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>

<223> аминокислотный мотив

<220> <221> ВАРИАНТ <222> (2)..(2) <223> Ь может быть заменен I <220> <221> ВАРИАНТ <222> (5)..(5) <223> I может быть заменен V, Р ИЛИ Ь <220> <221> ВАРИАНТ <222> (6)..(7) <223> X может быть заменен любым аминокислотным остатком или может отсутствовать

<220>

<221> ВАРИАНТ <222> (8)..(8) <223> N может быть заменен С или I <400> 1

Агд Ьеи Рго αίτι Не Хаа Хаа Азп 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ВАРИАНТ <222> (1)..(1) <223> У может быть заменен К

- 56 022359 <220>

<221> ВАРИАНТ <222> (2)..(2) <223> X может быть заменен любым аминокислотным остатком или может отсутствовать <220>

<221> ВАРИАНТ <222> (3)..(3) <22 3> Ь может быть заменен I <220>

<221> ВАРИАНТ <222> (4)..(4) <223> 3 может быть заменен Т <400> 2

Туг Хаа Ьеи Зег <210> 3 <211> 353 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>

<223> УПК352»-подобная консенсусная последовательность <400> 3

Неб Рго Авр Суз Суз Азп Авр ТЬг А1а Суз Уа1 Зег \Га1 Т’пг А1а ТЬг 15 10 15

Уа1 Ьеи А1а Агд Уа1 Уа1 ТЬг Агд Тгр Зег Нгз С1у Рго Ьеи А/а1 Агд 20 25 30

Агд Зег Ьеи Аер Бег Ьеи Туг ТЬг Агд Суз Рго Агд РЬе ьеи А1а С1у 35 40 45

Рго А1а Ьеи Ьеи Рго С1у 11е Неб Уа1 Тгр Ьуз Ьуз Ьеи С1у Зег Агд 50 55 60

Азп РЬе Зег Зег Суз Рго С1у Зег Не С1п Тгр Не Тгр Азр Уа1 Ьеи 65 70 75 80

С1у Суз Азр С1у Тгр Азр Зег Ьеи О1у Ьеи 11е Зег Не Ьеи А1а А1а 85 90 95

Зег РЬе Рго С1п РЬе Не Ьуз Туг Ьуз ТЬг Азр А1а Ьеи Зег Тгр РЬе 100 105 110

Ьеи Ьеи Тгр С1у С1у Азр Азп Ьеи Не С1у ьеи Азр С1п Ьеи С1п ТЬг 115 120 125

- 57 022359

ТЬг А1а Туг Уа1 Ьеи А1а Азр МеЬ Ьеи ТЬг Ьеи Туг РЬе Туг Туг Ьуз 130 135 140

Рго Зег РЬе Рго (31и Ьуз С1и Рго Агд Шз Зег ТЬг 01и Ьуз Азр Рго 145 150 155 160

С1у МеС ТЬг С1и С1у Ьуз Ьеи Аер \7а1 Уа1 Туг Агд Ьеи Уа1 Зег Рго 165 170 175

Рго Зег 01у Ьеи Зег 61у Агд С1у Ьуз Ьуз РЬе Агд ТЬг Агд Рго Зег 180 185 190

Ьеи Ьеи Зег А1а Рго Не Азп Зег Уа1 1>еи Ьеи Ьеи С1у Зег Рго Рго 195 200 205

Азр Ьеи ТЬг А1а Зег ТЬг Зег Рго Зег Ьеи Азп Агд С1и Ьеи Агд А1а 210 215 220

Агд Ьеи Ьеи 61у Ьуз С1у Рго Ьеи Агд Ьуз Шз Агд Ьуз Туг Уа1 С1у 225 230 235 240

11е А1а А1а 11е А1а Зег \/а1 Уа1 Суз Ьеи С1у А1а ТЬг А1а Ьеи Зег 245 250 255

Ьеи 61у Зег С1у Азп О1п Зег А1а Уа1 Зег Уа1 Уа1 С1у Зег Зег Ьеи 260 265 270

Рго Рго 11е С1у РЬе Уа1 11е С1у 11е Зег Зег Уа1 Ьеи Туг Ьеи Ьеи 275 280 285

Зег Агд Ьеи Рго С1п 11е Азп РЬе Ьеи Агд Ьуз Зег ТЬг С1у 11е Зег 290 295 300

Ьеи РЬе А1а Ьеи С1у Азп Туг 01у Ьеи Зег О1у С1п Зег 61и С1у Зег 305 310 315 320

Туг Ьеи Ьеи Шз Н1з Ьеи Рго Тгр Ьеи Уа1 С1у Зег Ьеи О1у Уа1 Ьеи 325 330 335

Ьеи Ьеи Азр 11е С1п Туг Агд 61и Рго Ьеи Ьеи Рго Зег Ьеи Ьеи 11е 340 345 350

Ьуз <210> 4 <211> 317 <212> БЕЛОК <213> ЗассЬаготусез ΟθΓενίΞίθθ

- 58 022359

- 59 022359

РЬе Не РЬе С1у Зег А1а С1у ТЬг 11е А1а РЬе Азр Ьеи 11е Туг РЬе 260 265 270

Туг С1п Туг Туг Не Ьеи Туг А1а ТЬг Азр Кеб С1п Ьеи Агд С1и Ьеи 275 280 285

С1и Агд 01 и Ьеи Туг Зег Рго С1и С1и Азр Зег А1а А1а С1п Ьеи Уа1 290 295 300

ТЬг С1и Агд ТЬг Зег Ьеи Ьеи Зег С1у С1и ТЬг С1п ТЬг 305 310 315 <210> 5 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>

<223> аминокислотный мотив

<220> <221> <222> <223> ВАРИАНТ (3) . . (3) I может быть заменен Ь или V <220> <221> ВАРИАНТ <222> (4)..(5) <223> X может быть заменен любым аминокислотным остатком или может отсутствовать

<220>

<221> ВАРИАНТ <222> (7)..(7) <223> Р может быть заменен У <400> 5

Рго <31п IIе Хаа Хаа Аеп РЬе 1 5 <210> 6 <211» 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220» <223> аминокислотный мотив <220>

<221» ВАРИАНТ <222> (3)..(3) <223> I может быть заменен V или Г <220>

<221> ВАРИАНТ <222> (6)..(6)

- 60 022359 <223> I. может быть заменен V <400> 6

61у Азр Не РНе Абп Ьеи 1 5 <210> 7 <211=· 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>

<223> аминокислотный мотив

<220> <221> <222> <223> ВАРИАНТ (3) . . (3) I может быть заменен А <220> <221> ВАРИАНТ <222> (4) ..(4) <223> X может быть заменен отсутствовать любым аминокислотным остатком или может

<220> <221> ВАРИАНТ <222=· (5) ..(5) <223> Ь может быть заменен К или М <220> <221> ВАРИАНТ <222> (7)..(7) <223> X может быть заменен любым аминокислотным остатком или может отсутствовать <220> <221> ВАРИАНТ <222> (8)..(8) <223> К может быть заменен к <220> <221> ВАРИАНТ <222> (9)..(9) <223> К может быть заменен А <400> 7

Рго С1п Не Ха а Ьеи Αξ η Хаа Ьуз Агд 1 5 <2ΐο> а <211> 198 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>

<223> УОЬ092«-подобная консенсусная последовательность <400> 8

- 61 022359

МеГ С1у 11е РЬе Зег С1у МеС '7а 1 Зег Ьеи Ьуз Суз Агд Тгр Уа1 Не 15 10 15

Азр Ьеи Зег Ьеи С1у Зег Тгр \Га1 А1а С1и Рго С1п Не ТЬг Азп РЬе 20 25 30

Ьуз Зег О1и С1у Ьеи Зег Ьеи РЬе Ьеи Тгр <31у Азр 11е РЬе Азп Ьеи 35 40 45

С1у Суз С1и Рго А1а Ьеи Рго ТЬг С1п РЬе Туг А1а Ьеи Туг ТЬг '/а1 50 55 60

ТЬг 11е Ьеи С1п Туг Туг Азр Ьуз Агд Ьуз Рго Ьуз С1у Рго Ьуз 7а 1 65 70 75 80

11е 61у С1и Не Агд Азп Азп Зег Шз ТЬг 11е Рго <31у Азр Зег Зег 85 90 95

Агд С1и Туг Туг ТЬг А1а Агд О1и С1у Зег Туг Зег Суз Ьуз РЬе Ьеи 100 105 110

Зег Агд 7а1 РЬе Уа1 7а1 Агд А1а Агд Ьуз ьеи Зег С1у Ьеи С1у Тгр 115 120 125

Мек А1а 11е Туг МеЬ С1у С1у Агд Не Рго С1п Не Ьеи Азп Ьуз Агд 130 135 140

61у Зег С1и С1у Ьеи Азп Рго Ьеи Мек РЬе РЬе А1а Ьеи О1у Азп ТЬг 145 150 155 160

Туг \7а1 Зег 11е Ьеи 7а1 Азр Зег Тгр Рго Азп ьеи Рго тгр ьеи Азр 165 170 175

А1а 01у Суз 7а1 Ьеи Азр Не С1п РЬе Туг Ьуз С1и 7а1 Ьуз ТЬг РЬе 180 185 190

7а 1 Зег <31и Азр Зег 7а1 195 <210> 9 <211> 308 <212> БЕЛОК <213> ЗассЬагогиусез οβΓενί5Ϊ3β <400> 9

МеБ С1п Ьеи 7а1 Рго Ьеи С1и Ьеи Азп Агд Зег ТЬг Ьеи Зег О1у 11е 15 10 15

Зег 61у Зег Не Зег Не Зег Суз Тгр Не 11е 7а1 РЬе Уа1 Рго 01п

- 62 022359

Не Туг <31и Азп РЬе Туг Агд Ьуз Зег Зег Азр С1у Ьеи Зег Ьеи Ьеи 35 40 45

РЬе 7д1 7а 1 Ьеи Тгр Ьеи А1а С1у Азр 7а1 РЬе Азп Ьеи Меб С1у А1а 50 55 60

Уа1 Меб С1п Нгз Ьеи Ьеи Зег ТЬг Меб Не Не Ьеи А1а А1а Туг Туг 65 70 75 ЭО

ТЬг 7а1 А1а Азр Не 11е Ьеи Ьеи С1у С1п Суз Ьеи Тгр Туг Азр Азп 65 90 95

С1и С1и Ьуз Рго А1а Уа1 Азр Рго 11е Нгз Ьеи Зег Рго А1а Азп Рго 100 105 110

11е Азп С1и Азп Уа1 Ьеи Ηιβ Азр \Га1 РЬе Азп С1и С1п <31п Рго Ьеи 115 120 125

Ьеи Азп Зег С1п 61у 61п Рго Азп Агд Не Азр С1и С1и Меб А1а А1а 130 135 140

Рго Зег Зег Азр С1у Азп А1а С1у Азр Азр Азп Ьеи Агд С1и Уа1 Азп 145 150 155 160

Зег Агд Азп Ьеи 11е Ьуз Азр Не РЬе 11е Уа1 Зег 01у ’7а1 Уа1 РЬе 165 170 175

Уа1 С1у РЬе 11е Зег Тгр Туг 17а1 ТЬг Туг Суз б’а1 Азп Туг ТЬг С1п 180 185 190

Рго Рго Рго 17а1 Е1и Азр Рго Бег Ьеи Рго Уа1 Рго С1и Ьеи С1п 11е 195 200 205

Азп Тгр Меб А1а С1п Не РЬе С1у Туг Ьеи Зег А1а Ьеи Ьеи Туг Ьеи 210 215 220 б1у Зег Агд Не Рго С1п Не Ьеи Ьеи Азп РЬе Ьуз Агд Ьуз Зег Суз 225 230 235 240

С1и С1у Не Зег РЬе Ьеи РЬе РЬе Ьеи РЬе А1а Суз Ьеи <31у Азп ТЬг 245 250 255

ТЬг РЬе Не РЬе Зег 7а± Не 7а1 Не Зег Ьеи Азр Тгр Ьуз Туг Ьеи 260 265 270

Не Меб Азп А1а Зег Тгр Ьеи Уа1 С1у Зег 11е О1у ТЬг Ьеи РЬе Меб

- 63 022359

275 280 285

Азр РЬе Уа1 Не РЬе Зег С1п РЬе РЬе 11е Туг Ьуз Агд Азп Ьуз Ьуз 290 295 300

РЬе 11е Ьеи Азп 305 <210> 10 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223 > праймер <400> 10 аьдаьссдад аСдаЬЬЬдЬс 20 <210> 11 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 11

РСадасадсС ссессассдд 20 <210> 12 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 12 аЬдЬЬЬсЬсс асадсадЬЬЬ 20 <210> 13 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 13

ЬЬадасадсЬ ЬсЬдсддЬЬ 19 <210> 14 <211> 20 <212 > ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 64 022359 <223> праймер <400> 14 аРддаЬЬаЬс ЬаддааРсда 20 <210> 15 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223 > праймер <400> 15

РдаааЬсЬЬС ЬСасЬССЬса 20 <210> 16 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 16 аЬдддсаЪсР ЬсадСддадс 20 <210> 17 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 17

ЬЬааасСЬЬа ЬсадсасЬдЬ с 21 <210> 18 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 18 даЬаЬЬааЬд даЬЬсЬаЬсс сЬсЬсЬсЬсЬ ЬЬЬдЬаЬЬсс 40 <210> 19 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 19 дададддаса дааьссасьа аЬаЬсааада дааСсааСда 40

- 65 022359 <210> 20 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 20 дадааддаДа дааДсдаДЬа аЫХсасадд ДсдЬдаРаЬд 40 <210> 21 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 21 даааДДааЬс даЬЬсЪаРсс ЬДсРсСасаД аСаСаРСссС 40 <210> 22 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> праймер <400> 22 даьадддаде саСааСсбас ддессЬсбсб ЬЬСдЪаССсс 40 <210> 23 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 23 даассдСада ССабдасбаа сЬабсааада дааДсаабда 40 <210> 24 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 24 даасадДада ДДаСдСсбаа сССДсасадд СсдСдаЬаЬд 40 <210> 25 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 66 022359 <220>

<22 3> праймер <400> 25 дааадССада сабааЬсбас бддСсбасаб абаСаСЬссС 40 <210> 26 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223 > праймер <400> 26 даСсдсссаС д+ааа+сдсд дссЬсбсбсб ЬЬСдСасбсс 40 <210> 27 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223 > праймер <400> 27 даддссдсда ЬЁЬасаЬддд сда8сааада дааСсаабда 40 <210> 28 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 28 даддасдсда бСбасСбддд сдбСсасадд СсдСдаСаДд 40 <210> 29 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 29 даасдсссаа дбааабсдсд ЬссЬсЬасаЬ абаТтаЬ+сс^ 40 <210> 30 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 30

- 67 022359 дабсдсссаб дбааабдссд дссбсбсбсб бббдбаббсс 40 <210> 31 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 31 даддссддса Ьббасабддд сдабсааада даабсаабда 40 <210> 32 <211» 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 32 даддасддса бббасббддд сдббсасадд бсдбдабабд 40 <210> 33 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> праймер <400> 33 даасдсссаа дбааабдссд Ьссбсбасаб абабаббссб 40 <210> 34 <211> 40 , <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 34 дабабсадбд даббсааасд сбсбсбсбсб ЕССдСаССсс 40 <210> 35 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 35 дададсдббб даабссасбд абабсааада даабсаабда 40 <210» 36

- 68 022359 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> праймер <400> 36 дадаасдсЬЬ дааЬсдасДд аДДЬсасадд ДсдДдаДаЬд 40 <210> 37 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 37 дааабсадСс даДЬсааасд ДЬс^сЬасаД аДаЬаДЬссЬ 40 <210> 38 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 38 даЬассааЬд даЬЬсааЪас сЬсЬсЬсЬсЬ ЬЬЪдЬаЬЬсс 40 <210> 39 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 39 дададдсаьс дааДссаСДд аСаСсааада дааьсааьда 40 <210> 40 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 40 дадсддЪаЬЛ дааЬдсаЬЬд аЬаЬсасадд ДсдЬдаЬаСд 40 <210> 41 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 69 022359 <223> праймер <400> 41 даРаСсаабд саРРсааРас сдсРсРасаР аРаРаРРссР 40 <210> 42 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 42 даРаРсааРд даРРсааасс сРсРсРсРсР РРРдРаРРсс 40 <210> 43 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 43 дададддррр дааРссаРРд аРаРсааада дааРсааРда 40 <210> 44 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 44 дадааддРРР дааРсдаРРд аРРРсасадд РсдРдаРаРд 40 <210> 45 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> праймер <400> 45 даааРсааРс даРРсааасс РРсРсРасаР аРаРаРРссР 40 <210> 46 <211> 40 <212ь ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 46 даРаРсааРд даРРсааРсс РЬсРсРсРсР РРРдРаРРсс 40

- 70 022359 <210> 47 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> праймер <400> 47 дадааддаДД дааДссаДДд аДаДсааада дааДсааЬда 40 <210> 48 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 48 дадасддаСД дааДсдаЬСд аДССсасадд ЬсдСдаСаДд 40 <210> 49 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 49 даааДсааДс даДДсааЬсс дДсДсСасаС аСаДасДссД 40 <210> 50 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> атхΚΝΑ последовательность-мишень <400> 50

ДасДааДдда ДДсДаДсссД с 21 <210> 51 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ашгЕЫА последовательность-мишень <400> 51

ДадДДадДса ДааДсДасдд Д 21 <210> 52 <211> 21

- 71 022359 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аттйКМА последовательность-мишень <400> 52

ЬсдсссабдЬ аааЪсдсддс с 21 <210> 53 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> алйРЛА последовательность-мишень <400> 53

ДсдсссаСдс саааЬдссдд сс 22 <210> 54 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22 0>

<223> ашаКЫА последовательность-мишень <400> 54

ЬабсадЬдда ЬЬсааасдсб с 21 <210> 55 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22 0>

<223> ашаКЫА последовательность-мишень <400> 55

ЬаДсааЪдда ЬЬсааЬассЬ с 21 <210> 56 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аттКИА последовательность-мишень <400> 56

ДабсааДдда ЬЬсааасссС с 21 <210> 57

- 72 022359 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> атаЯЫА последовательность-мишень <400> 57

ЬаСсааДдда ССсааЬссВЬ с 21