JP2001178468A

JP2001178468A - イネ由来のジベレリン２β水酸化酵素遺伝子およびその利用

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Publication number: JP2001178468A
Application number: JP36589999A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Tanaka; 宥司田中; Toshiaki Kayano; 暁明萱野; Makoto Matsuoka; 信松岡; Masatomo Kobayashi; 正智小林
Original assignee: NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RE; NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RE; NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1999-12-24
Filing date: 1999-12-24
Publication date: 2001-07-03
Anticipated expiration: 2019-12-24
Also published as: US20030159179A1; EP1245680A1; EP1245680B1; KR20020064964A; WO2001048215A1; DE60034897D1; US7057088B2; AU2398301A; EP1245680A4; JP3829157B2; AU778133B2; CA2394807A1; CN1425070A

Abstract

(57)【要約】【課題】イネ由来の新規なGA2β-ヒドロキシラーゼ遺
伝子を提供し、さらに、該遺伝子を利用して植物のGA含
量を調節することにより植物の草型を改変することを課
題とする。【解決手段】イネから新規なGA2β-ヒドロキシラーゼ
遺伝子を単離することに成功すると共に、これら遺伝子
を利用して野生型植物体と比較して草型が改変された植
物体を作出することに成功した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ジベレリン生合成
に関与する植物遺伝子およびその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】ジベレリン(GA)類は、ent-ジベレランと
称される基本構造を有する四員環ジテルペノイドカルボ
ン酸（図1A）の巨大なファミリーを作っており、正常な
植物の成長および発育に通常不可欠であるような高等植
物の生活環の多くの過程を調節している(Graebe,J.E.
(1987) Annu.Rev.Plant Physiol.,38,419-465；Hooley,
R.(1994) Plant Mol.Biol.,26,1529-1555)。GA₁などの
生物学的活性のあるGA類は、色素体中のシクラーゼ、小
胞体の膜結合型モノオキシゲナーゼ、および細胞質に局
在した可溶性2-オキソグルタル酸-依存型ジオキシゲナ
ーゼの連続作用により、trans-ゲラニルゲラニルニリン
酸から生成される(Hedden,P.and Kamiya,Y.(1997) Ann
u.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,48,431-460；La
nge,T.(1998)Planta,204,409-419において検証)。現在G
Aの生合成経路は概ね確立されている(図1B)。2-オキソ
グルタル酸-依存型ジオキシゲナーゼは、この生合成経
路の後工程であるGA20-オキシダーゼによるC-20の除去
およびGA 3β-ヒドロキシラーゼによる3β-ヒドロキシ
ル基の導入を含む工程を触媒し、生物学的に活性のある
GAを生成する。第三のジオキシゲナーゼであるGA2β-ヒ
ドロキシラーゼは、2β-ヒドロキシル基を導入し、活性
型に転換できない生物学的に不活性なGAを生成する。

【０００３】ここ数年間に、GA生合成酵素をコードして
いるcDNAおよびゲノムクローンが、様々な植物種から単
離されている(Hedden,P.and Kamiya,Y.(1997) Annu.Re
v.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,48,431-460；Lange,
T.(1998) Planta,204,409-419)。これらのクローンの利
用可能性は、GA生合成の調節に関する新たな知見をもた
らしている。例えば、GA 20-オキシダーゼは植物の発育
を通じて示差的に調節されるいくつかの遺伝子によって
コードされているということが示された(Phillips,A.L.
et al.(1995) Plant Physiol.,108,1049-1057；Garcia-
Martinez,J.L.et al.(1997) Plant Mol.Biol.,33,1073-
1084)。GA2β-ヒドロキシラーゼは、生理活性GAの内在
濃度の決定において重要な役割を果たすにもかかわら
ず、これらの酵素の遺伝子はごく最近まで単離されてい
なかった。GA2β-ヒドロキシラーゼ遺伝子は、ベニバナ
インゲンとシロイヌナズナ(Arabidopsis)の機能的スク
リーニング法により最初に単離された(Thomas,S.G.et a
l.(1999) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,4698-4703)。

【０００４】GA類は、発芽、茎伸長、花成、果実の成長
を含む多くの発育過程に関与している。従って、これら
の過程をGA含量を変更するような化学物質を適用するこ
とによって修飾することは、農業・園芸の分野において
広く行なわれている。例えば、GA3は、種無しブドウの
栽培において漿果の成長を刺激するために使用され(Chr
istadoulou,A.J.et al.(1968) Proc.Am.Soc.Hort.Sci.,
92,301-310)、GA生合成阻害剤は、か穀類や鑑賞植物の
高さを調節するための成長抑制剤として使用されている
(Hedden,P.and Hoad,G. (1994) New York: Marcel Dekk
er, pp.173-198)。化学物質を外来適用する別法は、GA
の生合成を遺伝子操作することによりGAの内在含量を変
更することである。最近のGA生合成に関連したいくつか
の遺伝子クローニングは、この方法の実行可能性を試験
する手段となる。特に、GA 2β-ヒドロキシラーゼをコ
ードしている遺伝子の単離は、トランスジェニック植物
において生理活性GA含量を制御するための強力な手段に
なると考えられる。

【０００５】多くのGA-感受性突然変異体が、トウモロ
コシ、マメ、トマト、シロイヌナズナおよびイネのよう
な様々な植物種から単離されている(Phinney,B.O.(195
6) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,42,185-189；Koornneef,M.
(1978) Arabidopsis Ins.Serv.,15,17-20；Koornneef,
M.et al.(1990) Theor.Appl.Genet.,80,852-857；Reid,
J.B.and Ross,J.J.(1993) Int.J.Plant Sci.,154,22-3
4；Murakami,Y.(1972) Plant Growth Substances 1970.
(Carr,D.J., ed.). Berlin:Splinger-Verlag,pp.166-17
4)。シロイヌナズナの自然突然変異におけるGA生成の減
少によって引き起こされた表現型は、茎伸長と花成にお
けるGAの役割を暗示している (Koornneef,M.and van de
r Veen,J.H.(1980) Theor.Appl.Genet.,58,257-263；Sp
onsel,V.M.et al.(1997) Plant Physiol.,115,1009-102
0)。GA1は、コパリル-ニリン酸シンターゼ(CPS)をコー
ドし、この座のヌル突然変異は、抽だいのない花成を生
じるような長日条件において茎伸長を阻害し、かつ短日
条件において茎伸長と花成の両方を阻害する(Wilson,R.
N.et al.(1992) Plant Physiol.,100,403-408；Sun,T.-
P.and Kamiya,Y.(1994) Plant Cell,6,1509-1518)。GA4
はGA 3β-ヒドロキシラーゼをコードし(Chiang,H.-H.et
al.(1995) Plant Cell,7,195-2015；Williams,J.et a
l.(1998) Plant Physiol.,117,559-563)、GA5およびGA6
は、2個の異なるGA20-オキシダーゼをコードしている(X
u,Y.L.et al.(1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,92,6640
-6644；Sponsel,V.M.et al.(1997) Plant Physiol.,11
5,1009-1020)。GA4とGA5の両方のヌル突然変異は、花の
発育は正常な半矮性を生じるのに対して、GA6の機能喪
失は、短い花序、稔性低下および短い長角果を生じる(S
ponsel,V.M.et al.(1997) Plant Physiol.,115,1009-10
20)。

【０００６】GA-欠失突然変異体も、イネから単離され
ている(dx:d35およびdy:dl8)。このイネ矮性突然変異体
は、農業において重要であると思われる。例えば、sd-1
突然変異体は、高い収量、半矮性変種の遺伝的基盤であ
るため、イネの育種(bleeding)において特に重要であ
る。イネのdl8突然変異体は、GA感受性矮性であり、か
つ複数の対立遺伝子が同定されている。例えば、豊雪矮
性(dl8^h)、秋晴れ矮性(dl8-AD)、小竹玉錦(dl8^K)、およ
び矮稲C(dl8-w)が、様々な親生態型から単離されてい
る。dl8突然変異体におけるGA中間体の分析を基に、こ
れらの突然変異体においては、3β-ヒドロキシGA類への
転換が阻害され、その結果、内在GA₂₀レベルが上昇し、
かつ生理活性のあるGA₁含量の劇的低下がもたらされる
ことが実証されている(Kobayashi M. et al., (1989) P
lant Cell Physiol. 30(7): 963-969、Kobayashi M. et
al., (1994) Plant Physiol. 106: 1367-1372、Choi Y
-H. et al., (1995) Plant Cell Physiol.36(6): 997-1
001)。これらの知見は、d18遺伝子が、GA3β-ヒドロキ
シラーゼをコードし、かつ低下したGA₁レベルが突然変
異体植物における茎伸長を抑制することを強力に示唆し
ている。

【０００７】矮性の草丈(stature)は、高い植栽密度、
効率的光摂取、風害の減少および農作業の軽減を可能に
すると予想されるため、これは果樹を含む農作物および
園芸作物の育種にとって最も価値のある特徴である。ト
ランスジェニック植物において、生理活性のあるGA類の
内在含量を減少するいくつかの方法が可能である。例え
ば、シロイヌナズナGA 20-オキシダーゼ遺伝子およびタ
バコGA 3β-ヒドロキシラーゼ遺伝子のアンチセンス発
現は、生理活性GA類のレベルを低下させ、半-矮性表現
型を生じた(Coles et al.,(1999) Plant.J.17,547-55
6、Itoh et al.,(1999) Plant.J.20,15-24)。しかしな
がら、この活性型GA生成酵素の遺伝子のアンチセンス発
現による矮性植物の作出法は、同一種内に存在するホモ
ログ遺伝子の発現を抑制できない可能性が高く、また不
活性化ステップの酵素をコードする2βヒドロキシダー
ゼ遺伝子のホメオティックな発現制御の効果により活性
型ジベレリンの半減期が延伸されるため、GAの内生レベ
ルを予測し調節することが困難であり、かつアンチセン
ス構築物が導入されるものと同じ植物種から対応するcD
NAを単離することが必要であるという2つの大きな欠点
がある。

【０００８】これとは対照的に、GA失活酵素の基質であ
る活性型GAの構造は他の植物においても保存されている
ため、GA2β-ヒドロキシラーゼ遺伝子のようなGA失活酵
素の遺伝子の過剰発現は、異種の植物種においておそら
く有効であり、更には導入遺伝子発現の修飾により、望
ましいレベルの活性GA含量の調節を容易に行うことがで
きると考えられる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このように
植物のGA含量の調節において、GA失活酵素を標的とする
ことの利点に鑑みてなされたものであり、その第一の目
的は、植物由来の新規なGA2β-ヒドロキシラーゼ遺伝
子、特にイネ由来の遺伝子を提供することにある。さら
に本発明は、該遺伝子を利用して植物のGA含量を調節す
ることにより植物の草型を改変することをも目的とす
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】ジベレリン(GA)類の主要
代謝経路は、可溶性2-オキソグルタル酸-依存型ジオキ
シゲナーゼによって触媒された反応である、2β-ヒドロ
キシル化により始まる。本発明者等は、GA含量の調節に
よる草型の改変された植物体の作出のために、イネから
GA 2β-ヒドロキシラーゼ遺伝子を単離し、その特徴付
けを行なった。

【００１１】まず、イネ由来のGA２β-ヒドロキシラー
ゼ遺伝子を単離するために、イネのGA2βヒドロキシラ
ーゼ遺伝子、Marah macrocarpusジオキシゲナーゼmRN
A、イネGA20-オキシダーゼ遺伝子、２種のイネのGA 3β
-ヒドロキシラーゼ遺伝子、ならびに他の2-オキソグル
タル酸-依存型ジオキシゲナーゼ遺伝子の推定アミノ酸
配列を比較して設計した縮重プライマーを用いて、イネ
のゲノムDNAを鋳型にPCRを行ない、複数のクローンを得
た。得られたクローンの中からGA2β-ヒドロキシラーゼ
をコードすることが予想されるクローンを選択し、その
配列情報を利用してデーターベース検索を行ない、1つ
のイネESTクローンを得た。次いで、このESTクローンの
配列情報を基に設計したプライマーを利用してイネゲノ
ムDNAを鋳型にPCRを行ない、さらに、これにより得られ
た増幅断片をプローブとしてイネのcDNAライブラリーお
よびゲノムDNAライブラリーのスクリーニングを行なっ
た。その結果、イネGA２β-ヒドロキシラーゼをコード
するゲノムDNAおよびcDNAを単離することに成功した
（イネGA2β-ヒドロキシラーゼをコードするクローンを
「OsGA2ox1」と命名した）。次いで、本発明者等は、得
られたOsGA2ox1 cDNAを大腸菌において発現させて得た
組換えタンパク質の活性の検討を行ない、これら組換え
タンパク質が、C₁₉-GAおよびC₂₀-GAを、対応する2β-ヒ
ドロキシ生成物に転換するGA 2β-ヒドロキシラーゼ活
性を有することを確認した。イネにおけるOsGA2ox1の発
現を解析した結果、その発現は、分化した葉原基、表
皮、および糊粉層の基底領域に局在化していた。さら
に、本発明者等は、OsGA2ox1 cDNAを発現するトランス
ジェニックイネ植物体の作出を行なった結果、これら植
物体が対照の植物体と比較して矮性化することを見出し
た。

【００１２】即ち、本発明者等は、イネから新規なGA2
β-ヒドロキシラーゼ遺伝子を単離することに成功する
と共に、これら遺伝子を利用して野生型植物体と比較し
て草型が改変された植物体を作出することに成功し、本
発明を完成するに至った。

【００１３】従って、本発明は、イネ由来の新規なGA２
β-ヒドロキシラーゼ遺伝子およびその利用、特に草型
が改変された植物体の作出のための該遺伝子の利用に関
し、より詳しくは、（１）ジベレリン２β水酸化酵素活性を有するタンパ
ク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに
記載のDNA、（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするDNA。（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含
むDNA。（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において1若
しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／また
は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
するDNA。（２）矮性化した植物体を作出するために用いる、
（１）に記載のDNA、（３）植物細胞内において内因性の（１）に記載のDN
Aの発現を抑制するために用いる、下記（ａ）から
（ｃ）のいずれかに記載のDNA、（ａ）（１）に記載のDNAまたはその転写産物と相補的
なアンチセンスRNAをコードするDNA。（ｂ）（１）に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂す
るリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。（ｃ）共抑制効果により、内因性の（１）に記載のDNA
の発現を抑制するRNAをコードするDNAであって、配列番
号：２に記載の塩基配列からなるDNAと70％以上の相同
性を有するDNA。（４）（１）から（３）のいずれかに記載のDNAを含
むベクター、（５）（１）から（３）のいずれかに記載のDNAを発
現可能に保持する形質転換植物細胞、（６）（５）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転
換植物体、（７）（６）に記載の形質転換植物体の繁殖材料、（８）（１）に記載のDNAによりコードされるタンパ
ク質、（９）（１）に記載のDNAを発現可能に保持する形質
転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から発現
させたタンパク質を回収する工程を含む、（８）に記載
のタンパク質の製造方法、（１０）植物細胞内において（１）に記載のDNAの発
現量を調節することを特徴とする、植物の生長を改変す
る方法、（１１）植物細胞内において（１）に記載のDNAの発
現量を調節することを特徴とする、植物の草型を改変す
る方法、（１２）植物細胞内で（１）から（３）のいずれかに
記載のDNAを発現させる、（１０）または（１１）に記
載の方法、を提供するものである。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明は、イネから単離された、
新規なGA２β-ヒドロキシラーゼおよび該酵素をコード
するDNAを提供する。本発明のDNAに含まれる、本発明者
らにより単離されたOsGA2ox1 cDNAの塩基配列をぞれぞ
れ配列番号：２に、OsGA2ox1タンパク質のアミノ酸配列
をそれぞれ配列番号：１に示す。

【００１５】OsGA2ox1 cDNAは、アミノ酸382残基からな
るタンパク質をコードする1,146bpのオープンリーディ
ングフレームを含む。該cDNAによりコードされるタンパ
ク質は、GA生合成に関与するジオキシゲナーゼに保存さ
れたアミノ酸配列（図2A参照）を有し、また、活性部位
でFeに結合しているアミノ酸残基を保持していた。ま
た、他のGA 2β-ヒドロキシラーゼとその配列において
有意な相同性を示した。さらに、該cDNAによりコードさ
れるタンパク質は、広範なC19-GA類から2β-ヒドロキシ
生成物を生じさせる活性を有していた。従って、本発明
者等により単離されたOsGA2ox1 cDNAは、GA2β-ヒドロ
キシラーゼをコードしていると考えられる。

【００１６】GA2β-ヒドロキシラーゼは、GA₁やGA₄のよ
うな活性のある3β-ヒドロキシル化されたGA類のレベ
ル、およびGA₂₀ やGA₉のようなそれらの直前の前駆体の
レベルを直接調節して、生物不活性な2β-ヒドロキシ化
されたGAを生成する。実際、本発明者等が単離したOsGA
2ox1 cDNAがコードする組換えタンパク質は、広範なC19
-GA類を対応する2β-ヒドロキシ生成物へ転換する活性
を有していた。従って、本発明のGA2β-ヒドロキシラー
ゼおよび該酵素をコードするDNAは、生物不活性GAの製
造に利用することが可能である。

【００１７】また、GA-欠失突然変異体の研究と、植物
への外来GAおよび／またはGA生合成阻害剤の適用の作用
から、GA類が植物の生長にとって必須かつ強力なレギュ
レーターであることが明らかとなっている。これらは、
比較的草丈の高い植物の生長における広範な事象に影響
を及ぼし、茎伸長の刺激にも関与している。実際に、本
発明のOsGA2ox1 cDNAを発現させた植物体は、重度に矮
小化された。従って、本発明のGA 2β-ヒドロキシラー
ゼおよび該酵素をコードするDNAは、植物の生長を改変
させ、例えば、野生型とは異なる草型の植物体を作出す
ることに利用することも可能である。植物の草型の改
変、殊に、矮性化には、高い植栽密度、効率的光摂取、
風害の減少、農作業の軽減など様々な利点が存在し、こ
のことは果樹を含む農作物および園芸作物の育種にとっ
て最も価値のある特徴である。

【００１８】本発明のGA2β-ヒドロキシラーゼは、当業
者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、ま
た天然のタンパク質として調製することができる。組み
換えタンパク質は、後述するが、例えば、本発明のGA2
β-ヒドロキシラーゼをコードするDNA（例えば、配列番
号：２）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを
適当な細胞に導入し、該形質転換細胞から精製すること
により調製することが可能である。また、天然のタンパ
ク質は、例えば、調製した組み換えタンパク質若しくは
その部分ペプチドを適当な免疫動物に免疫することによ
り調製した抗体を結合したアフィニティーカラムに、本
発明のタンパク質を発現しているイネの組織などから調
製した抽出液を接触させて、該カラムに結合するタンパ
ク質を精製することにより調製することができる。

【００１９】本発明のGA2β-ヒドロキシラーゼには、野
生型タンパク質（配列番号：１）の機能を保持したま
ま、その一部のアミノ酸を改変したタンパク質が含まれ
る。このようなタンパク質を調製するための当業者によ
く知られた方法としては、例えば、site-directed muta
genesis法（Kramer, W.and Fritz,H.-J. Methods in En
zymology, 154: 350-367, 1987）が挙げられる。また、
アミノ酸の変異は自然界において生じることもある。本
発明のGA２β-ヒドロキシラーゼには、このように天然
型のタンパク質のGA2β-ヒドロキシラーゼ活性を保持し
たまま、そのアミノ酸配列において1もしくは複数のア
ミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたタ
ンパク質が含まれる。タンパク質におけるアミノ酸の改
変部位および改変個数は、改変後のタンパク質がGA2β-
ヒドロキシラーゼ活性を有する限り、特に制限はない。
アミノ酸の改変は、一般的には、50アミノ酸以内であ
り、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましく
は10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸
以内であると考えられる。

【００２０】本発明において「GA2β-ヒドロキシラーゼ
活性」とは、反応基質であるC₁₉-GA類（例えば、GA₁、G
A₄、GA₉、GA₂₀）を与えた際に、対応する2β-ヒドロキ
シ生成物を反応生成物として合成する活性を指す。該活
性は、一般的には、発現ベクターに得られたcDNAを挿入
し、融合タンパク質として大腸菌内で過剰発現させ、そ
の結果得られる細胞抽出液を酵素液として、反応基質で
あるC₁₉-GA類、および補因子である鉄イオン、2オキソ
グルタル酸の存在下で反応をin vitroで行なわせ、最終
的に反応生成物（2β-ヒドロキシ生成物）をGC-MSによ
って確認することにより検出することができる。

【００２１】本発明は、また、本発明のGA2β-ヒドロキ
シラーゼをコードするDNAを提供する。このDNAには、本
発明のGA2β-ヒドロキシラーゼをコードしうる限り、cD
NAおよびゲノムDNAの双方が含まれる。OsGA2ox1タンパ
ク質をコードするDNAは、cDNAであれば、例えば、配列
番号：２に記載の塩基配列情報を基に設計したプライマ
ーを用い、イネから単離した全RNA（例えば、花序由来
の全RNA）を鋳型とした逆転写PCRを行なうことにより調
製することができる。また、ゲノムDNAは、例えば、配
列番号：２に記載の塩基配列情報を基に設計したプライ
マーを用い、イネのゲノムDNAを鋳型にPCRを行なうこと
により調製することができる。

【００２２】これら本発明のGA2β-ヒドロキシラーゼを
コードするDNAは、例えば、組換えタンパク質の製造に
用いることができる。組換えタンパク質の製造は、例え
ば、下記のようにして行なうことができる。まず、pMAL
-c2発現ベクター（NEB社）のマルチクローニングサイト
に対し、予め制限酵素サイトを設けたプライマーを用い
てRT-PCRにより合成した全長cDNAをサブクローニングす
る。この構築物を、定法により、BL21（プロテアーゼ欠
失株）に形質転換する。これにより得られる形質転換体
を用いてタンパク質の誘導を行う。大腸菌は、2ｘYT、
0.2%グルコースの培地で37℃振とう培養する。OD₆₀₀が
0.6前後になったところで、IPTGを最終濃度1mMとなるよ
うに加え、更に18℃で24時間培養する。酵素液の抽出に
関しては、培養後、集菌し、これをsuspend buffer(50m
M Tris-HCl, pH8.0, 10%グリセロール, 2mM DTT, 1mg/m
l リゾチーム)に溶かす。懸濁液を４℃にて30分放置
後、-80℃にて、凍結するまでインキュベートする。凍
結した懸濁液を解凍し、SONICATOR(HEAT SYSTEMS-ULTRA
SONICS,INC.MODEL W-225R)を用いて、MAXレベルにて、3
0秒間、５分のインターバルをおき、2回超音波処理を行
う。処理した懸濁液を遠心（15,000rpm, 4℃, 20分）
し、その上清を粗酵素液とすることができる。

【００２３】また、精製タンパク質の調製は、例えば、
本発明のGA2β-ヒドロキシラーゼをヒスチジンタグ、マ
ルトース結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフ
ェラーゼ（GST）と融合した形態で大腸菌などで発現さ
せ、これをそれぞれニッケルカラム、アミロースカラ
ム、GST-グルタチオンカラムにて精製することにより行
なうことができる。さらに、精製後は、必要に応じて、
スロンビンやファクターXaなどの制限プロテアーゼを利
用して上記タグを切り離すこともできる。

【００２４】上記したように、本発明者等により単離さ
れた遺伝子は、生物不活性GAの生産を通じて植物の生長
に関係していると考えられ、従って、これら遺伝子の発
現を調節することにより、植物の生長を制御することが
できると言える。特に、これら遺伝子は、植物の節間の
生長に関与していると考えられるため、植物の草丈の制
御などに利用することができる。植物の草丈を制御する
ことには、産業上の種々の利点が存在する。例えば、植
物体内における本発明の遺伝子の発現を増加させて、草
丈を減少させることにより、植物を倒れにくくすること
ができ、その結果、子実重量を増加させることが可能と
なる。また、草丈を減少させ、1株あたりの植物体の形
をよりコンパクトにすることにより、単位面積あたりに
作付できる植物体の個体数を増加させることができる。
このことは、特に、イネをはじめ、ムギ、トウモロコシ
などの農作物の生産において大きな意義を有する。また
本発明のGA２β-ヒドロキシラーゼをコードするDNAは、
矮性花卉などへの応用、矮性果樹などへの応用も考えら
れる。一方、植物体内における本発明の遺伝子の発現を
抑制させて、草丈を増加させることにより、植物体全体
の収量を増加させることも考えられる。このことは、例
えば、飼料用作物全体の収穫量を向上させる上で有意義
である。

【００２５】本発明において、植物の生長を制御するた
めに、本発明の遺伝子の発現を抑制する方法としては、
当業者に公知の種々の方法を用いることができる。ここ
で「遺伝子の発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制、
タンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、遺伝子発
現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。

【００２６】植物における特定の内在性遺伝子の発現を
抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方
法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけ
るアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現
法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが
植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて
実証した(J.R.EckerおよびR.W.Davis, Proc.Natl.Acad.
USA.83:5372,1986)。その後、タバコやペチュニアにお
いても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の
発現を低下させる例が報告されており(A.R.van der Kro
lら Nature 333:866,1988)、現在では植物における遺伝
子発現を抑制させる手段として確立している。

【００２７】アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑
制する作用としては、以下のような複数の要因が存在す
る。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポ
リメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられ
た部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進
みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、
イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成
によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位
とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNA
とのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑
制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリ
ッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合
部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コ
ドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成に
よる翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位と
のハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、およ
び核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド
形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転
写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標
的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学
実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会
編,東京化学同人,pp.319-347,1993)。

【００２８】本発明で用いられるアンチセンス配列は、
上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよ
い。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非
翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺
伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域
もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得
る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領
域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利
用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアン
チセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結さ
れ、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連
結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方
法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNA
の配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子（若し
くはその相同遺伝子）またはその一部と相補的な配列で
あることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害でき
る限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNA
は、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90
％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。ア
ンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を
阻害するには、アンチセンスDNA の長さは、少なくとも
15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さ
らに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられる
アンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.
5kbよりも短い。

【００２９】内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボ
ザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能であ
る。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことを
いう。リボザイムには種々の活性を有するものがある
が、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研
究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザ
イムの設計が可能となった。リボザイムには、グループ
Ｉイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400
ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘ
ッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活
性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子,
タンパク質核酸酵素,35:2191,1990)。

【００３０】例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自
己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断する
が、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重
要とされ、15位の塩基はCの他にＡまたはUでも切断され
ることが示されている(M.Koizumiら,FEBS Lett.228:22
5,1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA
配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のU
C、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切
断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumi
ら,FEBS Lett. 239:285,1988, 小泉誠および大塚栄子,
タンパク質核酸酵素,35:2191,1990, M.Koizumiら, Nucl
eic Acids Res. 17:7059,1989)。本発明者等により単離
されたOsGA2ox1遺伝子（配列番号：２）中にはリボザイ
ムの標的となりうる部位が多数存在する。

【００３１】また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の
目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例
えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAの
マイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,
1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こ
すように設計できることが示されている(Y.Kikuchiおよ
びN.Sasaki Nucleic Acids Res. 19:6751,1992, 菊池
洋,化学と生物 30:112,1992)。

【００３２】標的を切断できるよう設計されたリボザイ
ムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザ
イクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターお
よび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写
されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されて
いるとリボザイムの活性が失われてしまうことがある。
このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAから
リボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイ
ム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに
働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能
である(K.Tairaら, Protein Eng. 3:733,1990, A.M.Dzi
anottおよびJ.J.Bujarski Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 8
6:4823,1989, C.A.GrosshansおよびR.T.Cech Nucleic A
cids Res.19:3875, 1991, K.Tairaら Nucleic Acids Re
s. 19:5125, 1991)。また、このような構成単位をタン
デムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるよ
うにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyamaら
Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,1992)。このよ
うなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転
写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制するこ
とができる。

【００３３】内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標
的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNA
の形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成
されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と
同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換に
より導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性
遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共
抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においては
しばしば観察される(Curr.Biol.7:R793,1997,Curr.Bio
l.6:810,1996)。例えば、本発明の遺伝子が共抑制され
た植物体を得るためには、本発明の遺伝子若しくはこれ
と類似した配列を有するDNAを発現できるように作製し
たベクターDNAを目的の植物へ形質転換すればよい。共
抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である
必要はないが、好ましくは70％以上、さらに好ましくは
80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以
上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、FASTA
検索（Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988)Proc. Na
tl. Acad. Sci.USA. 85:2444-2448）やBLAST検索により
決定することができる。

【００３４】本発明のGA2β-ヒドロキシラーゼをコード
するDNAまたはその発現を抑制する機能を有するDNAを利
用して、植物の生長を改変するためには、該DNAを適当
なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これ
により得られた形質転換植物細胞を再生させればよい。
用いられるベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子
を発現させることが可能なものであれば特に制限はな
い。植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプ
ロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの
35Sプロモーター）を有するベクターを用いることが可
能である。また、植物の組織特異的なプロモーターを用
いれば、植物の特定の組織、例えば、葉や花、実などを
特異的に改変させることが可能であるかもしれない。組
織特異的プロモーターとしては、種子特異的プロモータ
ーとしてインゲンマメのβーファセオリン（Bustosら
(1991) EMBO J. 10:1469-1479）やダイズのグリシニン
（Lelievreら (1992) Plant Physiol. 98:387-391）、
葉特異的プロモーターとしてはエンドウのRbcS遺伝子
（Lam and Chua (1990) Science 248:471-474）やコム
ギのCab1遺伝子（Gotornら (1993) Plant J. 3:509-51
8）、根特異的なプロモーターとしてはタバコのTobRB7
遺伝子（Yamamotoら (1991) Plant Cell 3:371-382）や
アグロバクテリウム・リゾゲネスのrolD遺伝子（Elmaya
n and Tepfer (1995) Transgenic Res 4:388-396）が
挙げられる。また、外的な刺激により誘導的に活性化さ
れるプロモーターを有するベクターを用いることも可能
である。ベクターを挿入する植物細胞としては、導入す
る遺伝子の由来と同一の植物であることが好ましいが、
それに制限されない。実際、本発明者等は、シロイヌナ
ズナ由来の遺伝子を導入したタバコ植物体が矮性化する
ことを実証している。なお、ここでいう「植物細胞」に
は、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プ
ロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。植物
細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール
法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロ
バクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当
業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転
換植物細胞からの植物体の再生は公知の方法により行な
うことが可能である。これにより形質転換植物体が作出
されれば、該植物体からその繁殖媒体（例えば、種子、
塊茎、切穂など）を得て、これを基に本発明の形質転換
植物体を量産することも可能である。

【００３５】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものでは
ない。

【００３６】なお、下記実施例における植物材料の調製
においては、イネ種子(Oryza sativa、ジャポニカ型栽
培品種：日本晴)を、1％NaClO中で1時間不稔化し、寒天
培地に移植した。実生苗は、温室で、30℃（明期）およ
び24℃(暗期)で生育させた。また、下記実施例における
ヌクレオチド配列の決定は、自動シークエンシングシス
テム(ABI377)を用い、ジデオキシヌクレオチド・チェー
ン・ターミネーション法により行なった。cDNAおよびゲ
ノムクローンは、大きいイントロンを含む両方の鎖にお
いて完全に配列決定した。cDNAとアミノ酸配列の分析
は、コンピュータソフトウェアLASERGENE(DNASTAR, In
c., Madison, WI)を用いて実施した。

【００３７】[実施例１] イネからのGA 2β-ヒドロキ
シラーゼ遺伝子の単離イネ(Oryza sativa 、ジャポニカ型栽培品種：日本晴)
由来のゲノムDNAを増幅するために、推定上のシロイヌ
ナズナ GA 2β-ヒドロキシラーゼ遺伝子(AtGA2ox3)（DD
BJアクセション番号C72618に対するcDNA）、Marah macr
ocarpaのジオキシゲナーゼのmRNA(寄託番号Y09113；Mac
Millan,J.et al.(1997) Plant Physiol.,113,1369-137
7)、イネGA 20-オキシダーゼ遺伝子(寄託番号U50333；T
oyomasu,T.et al.(1997) Physiol.Plant.,99,111-11
8)、イネGA 3β-ヒドロキシラーゼ遺伝子、および別の2
-オキソグルタル酸-依存型ジオキシゲナーゼ遺伝子の保
存領域から設計された2個の縮重オリゴヌクレオチドプ
ライマーを作製した(フォワードプライマー、5'-GGNTTY
GGNGARCAYWCNGAYCC-3'／配列番号：３；およびリバース
プライマー、5'-GGISHISCRAARTADATIRTISWIA-3'／配列
番号：４)。イネのゲノムDNAを鋳型としてPCR反応を行
ない、これにより増幅された断片(約80bp)を、pCRII(In
vitrogen, Carlsbad, CA)にクローニングし、かつそれ
らの配列を確認した。64種の個別のクローン中の1種
は、新規の2-オキソグルタル酸-依存型ジオキシゲナー
ゼ-様アミノ酸を含み、イネのGA 2β-ヒドロキシラーゼ
遺伝子をコードしていると予想された。この部分的アミ
ノ酸配列を用いて、DDBJヌクレオチド配列データベース
を検索し、イネのGA 2β-ヒドロキシラーゼ遺伝子をコ
ードしていると予想され、かつ花成段階の穂に由来する
1種のイネESTクローンを得た(寄託番号C72618)。このES
Tクローン配列を基にオリゴヌクレオチドプライマーを
設計し(フォワードプライマー、5'-GCGGCGTTCTTCGCG-3'
／配列番号：５；および、リバースプライマー、5'-CTA
TTGTGAATGAGTACATT-3'／配列番号：６)、かつ鋳型とし
てイネゲノムDNAと共にPCRにおいて使用した。増幅した
断片をpCRII(Invitrogen, Carlsbad, CA)にクローニン
グし、かつその配列を確認した。この230bp断片をプロ
ーブとして用い、更にcDNAとゲノムクローンをスクリー
ニングした。

【００３８】具体的には、イネの未成熟種子のmRNAから
構築されたcDNAライブラリーおよびSau3AIにより部分消
化されたイネゲノムDNAから構築されたゲノムライブラ
リーを、前述のように調製したプローブを用いてスクリ
ーニングした。ハイブリダイゼーションを、5×SSC(1×
SSCは0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム)、5×デン
ハート液(1×デンハート液は、0.02％Ficoll、0.02％PV
P、0.02％BSAを含む。)、0.5％[w/v]SDS、および20mg/L
サケ精巣DNA中で、65℃で14時間行い、かつフィルター
を2×SSC、O.1％[w/v]SDSにより室温で洗浄した。

【００３９】これにより得られたcDNAを「OsGA2oxl」と
命名した。このcDNAは、アミノ酸382残基からなるタン
パク質をコードする1,146bpのオープンリーディングフ
レームを含んでいた(配列番号：２)。これは、GA生合成
のジオキシゲナーゼにおいて保存された配列を有し、前
述のようにHis-241、Asp-243、およびHis-302(番号はOs
GA2ox1アミノ酸配列上の位置である)を含んでいる。こ
のアミノ酸配列をベニバナインゲンおよびシロイヌナズ
ナ(Thomas,S.G.et al.(1999) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
96,4698-4703)、およびエンドウ(Lester et al.,(1999)
Plant J.19:65-73)から得られたGA 2β-ヒドロキシラ
ーゼcDNAのアミノ酸配列と並置したところ、OsGA2ox1が
GA 2β-ヒドロキシラーゼの一員に属すことが示された
(図2A)。しかしながら、これらのジオキシゲナーゼ間の
系統的関係は、双子葉植物由来のGA2β-ヒドロキシラー
ゼcDNA類は、互いのアミノ酸同一性が比較的高い(49-68
％)が、OsGA2ox1とは相同性が有意に低い（36％未満）
ことが明らかになった(図2B)。

【００４０】さらにOsGA2ox1コード領域を完全にカバー
している対応するゲノムDNAもクローニングした。この
ゲノムDNA配列とcDNA配列を比較することによって、OsG
A2ox1は、3個のエクソンと2個のイントロンからなるこ
とが明らかにされた。このエクソン／イントロン構造
も、AtGA2ox3コード配列において保存されている。

【００４１】[実施例２] 組換えGA 2β-ヒドロキシラ
ーゼの機能イネのGA 2β-ヒドロキシラーゼの完全な長さのcDNA
を、pMAL-c2発現ベクター(New England Biolabs, Bever
ly, MA)へと翻訳融合体としてセンス方向で挿入した。
得られた構築物pMAL- OsGA2ox1を、大腸菌株JM109内で
発現させた。細菌細胞を、0.2％[w/v]グルコースおよび
100mg/Lアンピシリンを含有する2×YT培地上で一晩37℃
で培養した。一晩培養した後、培養物を新鮮な培地で50
0倍希釈し、30℃で振盪培養した。増殖がCD₆₀₀で0.7に
達した時点で、IPTGを最終濃度1mMとなるように添加
し、17℃で更に24時間再度培養した。これらの細菌細胞
を収集し、洗浄バッファー(50mM Tris、pH 8.0、10％[w
/v]グリセロール、2mM DTT)で洗浄し、1g/Lリゾチーム
を含有する洗浄バッファー中に再懸濁し、かつ氷上で30
分間静置した。

【００４２】これにより得られた溶解液を超音波処理し
て遠心し、その上清をSDS-PAGEにかけ、融合タンパク質
の発現を確認した。この上清を用いて、広範なC₁₉-GA
類、GA ₁、GA₄、GA₉およびGA₂₀からなるGA基質の²H-標識
物と共にインキュベーションし、GC/MSによって同定し
た。その結果、C₁₉-GA類の各々は、OsGA2ox1タンパク質
によって、対応する2β-ヒドロキシ生成物に転換された
(図3)。GA₁₉とGA₅₃の転換はOsGA2ox1タンパク質によっ
て生じず、これらは両方共開環したラクトン型を有する
ことが判明した。

【００４３】[実施例３] イネにおけるGA 2β-ヒドロ
キシラーゼ遺伝子の発現（１）RNAゲルブロット分析 RNAゲルブロット分析のために、イネ由来の全RNAを様々
な組織（栄養期の茎頂、幼若葉、茎、葉身、葉鞘、根、
花序茎頂、苞穎、および花軸）から個別に調製した。各
RNA調製物10μgを、1.2％アガロースゲル上で電気泳動
し、その後Hybond N+メンブレン(Amersham, Buckingham
shire, England)上に転写し、プローブとしてHindIII-E
coRV断片（OsGA2ox1 cDNAの230bp断片）を用い、ハイブ
リダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション
は、5×SSC、5×デンハート液、0.5％[w/v]SDS、および
20mg/Lサケ精子DNA中で、65℃で14時間実施した。この
フィルターを、2×SSC、0.1％[w/v]SDS中で65℃で洗浄
し、更に0.2×SSC、0.1％[w/v]SDSで65℃で洗浄した。
その結果、全ての器官から得たRNAにおいて、1本の濃い
バンドが検出された(図4)。バンドのサイズは、約1.6kb
であり、cDNAクローンとほぼ同じサイズであった。

【００４４】（２）in situハイブリダイゼーションイネにおけるOsGA2ox1の発現の場所的パターンをより詳
細に決定するために、プローブとしてジゴキシゲニンで
標識したOSGA2ox1アンチセンス鎖RNAを用いて、in situ
ハイブリダイゼーション実験を行った。植物材料は、0.
1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)を溶媒とした4％
[w/v]パラホルムアルデヒドおよび0.25％[w/v]グルタル
アルデヒド中で、4℃で一晩固定し、段階的エタノール
シリーズおよびt-ブタノールシリーズを用いて脱水し(S
ass,A.E.(1958) Botanical Micro Technique,3rd ed.Io
wa State University Press.)、かつ最終的にParaplast
Plus(Sherwood Medical)中に包埋した。ミクロトーム切
片(厚さ7-10μm)を、スライドガラスに載せ、Vectabond
(Vector Laboratory,)で処理した。ジゴキシゲニンで標
識したセンスおよびアンチセンスRNAによるハイブリダ
イゼーション、およびハイブリダイゼーションされたプ
ローブの免疫学的検出は、 KouchiおよびHataの方法(Ko
uchi,H.and Hata,S.(1993) Mol.Gen.Genet.,238,106-11
9)に従って行った。これにより検出された発芽中のイネ
種子におけるOsGA2ox1の発現パターンを図5に示した。O
sGA2ox1 mRNAの存在を示す紫色の染色が、茎頂端分裂組
織の葉の着生点、表皮、および糊粉層に、輪状に認めら
れた。

【００４５】図5Aは、発芽しているイネ種子の茎頂を通
るほぼ中央の縦方向の切片を示している。OsGA2ox1の発
現は、茎頂端分裂組織の反対側隣接部上のシグナル対の
ようにも見える(図5B)。点状の発現も、分化した葉原基
の基底領域に認められた。別の胚の領域において、OsGA
2ox1発現は、胚盤の最外層、表皮および糊粉層に認めら
れた(図5C)。しかしながら、センス鎖RNAプローブでハ
イブリダイゼーションした対照切片は、バックグラウン
ド染色以上のシグナルは示さなかった(図5D)。

【００４６】図5Eは、イネの栄養期の茎頂の縦方向切片
を示している。パネルEの線1、2、3、および4は、各
々、図5F、4G、4Hおよび4Iに示された横断面のおおよそ
の面を示している。一連の断面(図5F、4G、4Hおよび4I)
において認められたOsGA2ox1発現を重ねることによっ
て、縦方向の切片において茎頂端分裂組織と第一葉原基
の境界に局在したOsGA2ox1の点状の発現(図5Bおよび4E)
が輪の形状であることが明らかになった。同様に、分化
した葉原基の基底領域における点状の発現も、太い維管
束系の周囲に局在化したシグナルに対応していた(図5
F、5G、5Hおよび5I)。

【００４７】茎頂端分裂組織の葉の着生点、表皮、およ
び糊粉層は、それぞれ、葉の成長および広がり(expanti
on)のため、および発芽時に胚乳の貯蔵デンプンを加水
分解するα-アミラーゼ遺伝子発現の誘発のためには、
高レベルの生理活性のあるGA₁を必要とする。その結
果、分化した葉原基の基底領域、表皮および糊粉層にお
けるOsGA2ox1の発現は、これらの組織における急激なGA
₁の蓄積を調節する際に重要な役割を果たすと考えられ
る。OsGA2ox1は、この部位でGA₁を失活し、過剰なGA₁が
発育プログラムの混乱を引き起こすような外側組織へと
生理活性GAが外部流出することを防ぐと考えられる。

【００４８】さらにOsGA2ox1は、茎頂端分裂組織と第一
葉原基の境界領域で、輪状の発現パターンとして発現さ
れる。このような発現パターンは、生理活性GA含量の調
節を通じて、OsGA2ox1が、植物のホメオボックス遺伝子
の可能性のある機能において提唱されているフィトマー
(phytomer)と称される植物体の分節単位(segmental uni
t)を規定する事象形成の初期パターンに関与するか、も
しくは、応答することを示している(Schneeberger,R.G.
et al.(1995) Genes Devel.,9,2292-2304；Sato,Y.et a
l.(1998) Plant Mol.Biol.,38,983-998)。あるいは、Os
GA2ox1発現とその結果生じるGA1含量の減少は、後胚発
生段階において将来の節間に印をつける。このことは、
OsGA2ox1の輪状発現が、茎頂端分裂組織の周囲の葉の着
生点の直下に認められ、ここではあらゆる可視できる節
または節間の分化が認められるようになる前は、節間は
遅れて発育するという事実を示唆している。

【００４９】[実施例４] トランスジェニック植物にお
けるイネGA 2β-ヒドロキシラーゼ遺伝子の過剰発現 OsGA2ox1遺伝子産物のin vivo活性、およびGA 2β-ヒド
ロキシラーゼ遺伝子発現の遺伝子操作によるトランスジ
ェニック植物中のGA内在含量を変更する可能性を評価す
るために、そのcDNAクローンをトランスジェニックイネ
植物において過剰発現した。イネGA 2β-ヒドロキシラ
ーゼの完全長cDNAを、XbaI-EcoRV断片として切断し、か
つイネアクチンプロモーターとハイグロマイシン耐性バ
イナリーベクターpAct-Hm2のノパリンシンターゼ(NOS)
ポリアデニル化シグナルの間に挿入した。このベクター
は、pBI-H1の変形であり(Ohta,S.et al.(1990) Plant C
ell Physiol.,31,805-813)、アクチンプロモーターを含
んでいる。得られた構築物を「pAct-OsGA2ox1」と称し
た。対照ベクターとして使用した「pAct-GUS」は、アク
チンプロモーターとpAct-Hm2のNOSターミネーターの間
へβ−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を導入することに
より作製した。「pAct-OsGA2ox1」および「pAct-GUS」
を、電気穿孔法により、Agrobacteriumtumefaciens株EH
A101に導入した。Agrobacteriumを媒介したイネ(Oryza
sativaL. cv. Nippon-bare)の形質転換を、Tanakaらの
方法（特願平11-206922）に従い、カルスを用いて行っ
た。トランスジェニックイネ植物を、50mg/Lハイグロマ
イシン含有培地上で選択した。ハイグロマイシン耐性植
物を、土壌に移植し、30℃(昼間)および24℃(夜間)の16
時間明期／8時間暗期のサイクルで成長させた。

【００５０】この実験の結果、40種以上の個別のトラン
スジェニックイネ植物が作製された。予想されたよう
に、OsGA2ox1 cDNAを過剰発現している全ての形質転換
体は、矮性表現型を示した(図6)。p35S::AtGA2ox3トラ
ンスジェニックタバコ植物とは対照的に、pAct::OsGA2o
x1で形質転換された複数のイネ植物は、同じ表現型を示
さなかったが、異なる形質転換体における様々な導入遺
伝子発現レベルによって主に引き起こされた現象である
茎伸長の阻害の幅を有した(図6A)。軽度に矮小化された
植物は約50cmに成長したが(図6C)、極度に矮小化された
植物は最終的な高さが15cm未満であり(図6E)、これは野
生型イネの高さのほぼ半分であった(図6B)。他のトラン
スジェニックイネ植物の草丈は、この範囲で変化した
(図6D)。葉身の長さも、矮性の草丈に相関して短くなっ
た。

【００５１】

【発明の効果】本発明により、植物のジベレリンの不活
性化に関与する新規な酵素および遺伝子、並びに該遺伝
子の発現を調節することにより植物体内におけるジベレ
リン活性が改変された植物が提供された。本発明によ
り、植物体内のジベレリン活性化を改変させ、植物の草
型を人為的に改変することが可能となった。植物体内の
ジベレリンの不活性化により、特に伸長生長の抑制によ
って引き起こされる植物の矮性を誘起できる。このた
め、例えば、イネにおいては多肥料によって生育を促し
ても背丈が伸びすぎて倒伏してしまうこともなくなる。
また、葉の受光量の効率が上昇するため収量の大幅な増
加が期待できる。さらに収穫や生育管理の作業の効率化
も図ることが可能である。また、植物体内における本発
明の遺伝子の発現を抑制して、植物体内のジベレリン活
性化を促進することにより、植物体全体の収量を増加さ
せることも考えられる。このことは、特に、飼料用作物
全体の収穫量を向上させる上で有意義である。

【００５２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Agrobiological Resources. The Institute of Physical and Chemical Research <120> Rice gibberellin 2β-hydroxylase genes and their use <130> MOA-106 <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 382 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 1 Met Val Val Pro Ser Ala Thr Thr Pro Ala Arg Gln Glu Thr Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ser Gly Val Val Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Val Thr Ile Ala Thr Val Asp Met Ser Ala Glu Arg Gly Ala 35 40 45 Val Ala Arg Gln Val Ala Thr Ala Cys Ala Ala His Gly Phe Phe Arg 50 55 60 Cys Val Gly His Gly Val Pro Ala Ala Ala Pro Val Ala Ala Arg Leu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Ala Ala Phe Phe Ala Met Ala Pro Ala Glu Lys Gln 85 90 95 Arg Ala Gly Pro Ala Ser Pro Leu Gly Tyr Gly Cys Arg Ser Ile Gly 100 105 110 Phe Asn Gly Asp Val Gly Glu Leu Glu Tyr Leu Leu Leu His Ala Asn 115 120 125 Pro Ala Ala Val Ala His Arg Ala Arg Thr Ile Asp Ala Met Asp Pro 130 135 140 Ser Arg Phe Ser Ala Ile Val Asn Glu Tyr Ile Glu Ala Met Lys Lys 145 150 155 160 Leu Ala Cys Glu Ile Leu Asp Leu Leu Gly Glu Gly Leu Gly Leu Lys 165 170 175 Asp Pro Arg Tyr Phe Ser Lys Leu Thr Thr Asn Ala Asp Ser Asp Cys 180 185 190 Leu Leu Arg Ile Asn His Tyr Pro Pro Ser Cys Asn Ile His Lys Leu 195 200 205 Asp His Asp Asp Gln Cys Asn Ile Lys Ser Leu Val Ser Thr Lys Ala 210 215 220 Ser Asn Gly Gly Asn Leu Met Ala Gly Gly Arg Ile Gly Phe Gly Glu 225 230 235 240 His Ser Asp Pro Gln Ile Leu Ser Leu Leu Arg Ala Asn Asp Val Glu 245 250 255 Gly Leu Gln Val Phe Val Pro Asp His Glu Gly Lys Glu Met Trp Val 260 265 270 Gln Val Pro Ser Asp Pro Ser Ala Ile Phe Val Asn Val Gly Asp Val 275 280 285 Leu Gln Ala Leu Thr Asn Gly Arg Leu Ile Ser Ile Arg His Arg Val 290 295 300 Ile Ala Thr Ala Cys Arg Pro Arg Leu Ser Thr Ile Tyr Phe Ala Ser 305 310 315 320 Pro Pro Leu His Ala Arg Ile Ser Ala Leu Pro Glu Thr Ile Thr Ala 325 330 335 Ser Ser Pro Arg Arg Tyr Arg Ser Phe Thr Trp Ala Glu Tyr Lys Thr 340 345 350 Thr Met Tyr Ser Leu Arg Leu Ser His Ser Arg Leu Glu Leu Phe Lys 355 360 365 Ile Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asn Ala Ser Glu Gly Lys Ala 370 375 380 <210> 2 <211> 1562 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (54)..(1199) <400> 2 ggcacgagcc attccggccg cgcattctcc cgctctcgat cgatcgatcg atc atg 56 Met 1 gtg gtg cct tcc gcg acg acg cca gcg agg cag gag acg gtg gtg gcg 104 Val Val Pro Ser Ala Thr Thr Pro Ala Arg Gln Glu Thr Val Val Ala 5 10 15 gcg gcg ccg cca gct gcg gcg gcg tcc ggt gtc gtc ggc ggc ggc ggc 152 Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ser Gly Val Val Gly Gly Gly Gly 20 25 30 ggc gtg acg ata gcg acg gtg gac atg tcg gcg gag cgc ggc gcg gtg 200 Gly Val Thr Ile Ala Thr Val Asp Met Ser Ala Glu Arg Gly Ala Val 35 40 45 gcg agg cag gtg gcg acg gcg tgc gcg gcg cac ggg ttc ttc cgg tgc 248 Ala Arg Gln Val Ala Thr Ala Cys Ala Ala His Gly Phe Phe Arg Cys 50 55 60 65 gtc ggg cac ggc gtg ccg gcg gcg gcg ccc gtc gcg gcg agg ctg gac 296 Val Gly His Gly Val Pro Ala Ala Ala Pro Val Ala Ala Arg Leu Asp 70 75 80 gcc gcg acg gcg gcg ttc ttc gcg atg gcg ccg gcg gag aag cag cgc 344 Ala Ala Thr Ala Ala Phe Phe Ala Met Ala Pro Ala Glu Lys Gln Arg 85 90 95 gcc ggg ccg gcg agc ccg ctc ggg tac ggc tgc cgg agc atc ggg ttc 392 Ala Gly Pro Ala Ser Pro Leu Gly Tyr Gly Cys Arg Ser Ile Gly Phe 100 105 110 aac ggc gac gtc ggc gag ctg gag tac ctg ctc ctc cac gcc aac ccc 440 Asn Gly Asp Val Gly Glu Leu Glu Tyr Leu Leu Leu His Ala Asn Pro 115 120 125 gcc gcc gtc gcg cac cgg gcc agg acc atc gac gcc atg gac ccc tct 488 Ala Ala Val Ala His Arg Ala Arg Thr Ile Asp Ala Met Asp Pro Ser 130 135 140 145 cgc ttc agt gct att gtg aat gag tac att gaa gcc atg aag aag ctc 536 Arg Phe Ser Ala Ile Val Asn Glu Tyr Ile Glu Ala Met Lys Lys Leu 150 155 160 gca tgt gag atc ctg gac ctg tta gga gag ggg cta ggt ctc aag gac 584 Ala Cys Glu Ile Leu Asp Leu Leu Gly Glu Gly Leu Gly Leu Lys Asp 165 170 175 ccc aga tac ttc agc aag ctt acc aca aac gct gac agt gac tgc ctc 632 Pro Arg Tyr Phe Ser Lys Leu Thr Thr Asn Ala Asp Ser Asp Cys Leu 180 185 190 ctg agg atc aac cac tac cct cca tca tgc aac att cac aaa ctt gac 680 Leu Arg Ile Asn His Tyr Pro Pro Ser Cys Asn Ile His Lys Leu Asp 195 200 205 cat gat gac caa tgc aat atc aag agc ctt gtt agc acc aag gct agc 728 His Asp Asp Gln Cys Asn Ile Lys Ser Leu Val Ser Thr Lys Ala Ser 210 215 220 225 aat ggt ggg aat ctg atg gca ggt ggg cgc att ggg ttc ggc gag cac 776 Asn Gly Gly Asn Leu Met Ala Gly Gly Arg Ile Gly Phe Gly Glu His 230 235 240 tct gac ccg cag atc ctt agc ttg ctc cga gca aac gat gtg gaa ggg 824 Ser Asp Pro Gln Ile Leu Ser Leu Leu Arg Ala Asn Asp Val Glu Gly 245 250 255 cta cag gtg ttt gtg ccg gac cac gag ggc aag gag atg tgg gtt cag 872 Leu Gln Val Phe Val Pro Asp His Glu Gly Lys Glu Met Trp Val Gln 260 265 270 gtg cca tcg gac cca tcg gcc att ttc gtc aat gtt ggt gat gtc ctc 920 Val Pro Ser Asp Pro Ser Ala Ile Phe Val Asn Val Gly Asp Val Leu 275 280 285 cag gct ctg aca aat ggg agg ctg ata agt atc cgg cac agg gta att 968 Gln Ala Leu Thr Asn Gly Arg Leu Ile Ser Ile Arg His Arg Val Ile 290 295 300 305 gca acc gcc tgc agg cca agg ctg tcc aca ata tac ttc gca tca cca 1016 Ala Thr Ala Cys Arg Pro Arg Leu Ser Thr Ile Tyr Phe Ala Ser Pro 310 315 320 ccc ctg cat gca cga atc tcg gca ctc cca gag aca atc aca gcc agc 1064 Pro Leu His Ala Arg Ile Ser Ala Leu Pro Glu Thr Ile Thr Ala Ser 325 330 335 agc cca cgc cga tac cga tca ttc acc tgg gct gag tac aag acg aca 1112 Ser Pro Arg Arg Tyr Arg Ser Phe Thr Trp Ala Glu Tyr Lys Thr Thr 340 345 350 atg tac tca ctc cgc ctg agc cac agc cgc cta gaa ctc ttc aaa att 1160 Met Tyr Ser Leu Arg Leu Ser His Ser Arg Leu Glu Leu Phe Lys Ile 355 360 365 gac gat gat gac agc gac aat gcc agt gag gga aaa gca taggaattgc 1209 Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asn Ala Ser Glu Gly Lys Ala 370 375 380 tggttaaatt gcagacgatg cctatggacc agtggggatt aggaagctga aactgtcccc 1269 aaaattttgg ctctctggca gtctggctac tatcgtcaga tatctcacta ttatgatggt 1329 gtagtgccta agttgacggg tgtgtaatat cgttagcagt ctacagaagc tatggttgta 1389 cggaagtaat gtactgtcgc cttttcagct aactatccat gttctctctt atatgtaatg 1449 agttagttga cggatgtgta atattgctag cattgtatat aagctatggt tgtatggaag 1509 tatgtaatat agccttttca gctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1562 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 3 ggnttyggng arcaywcnga ycc 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <220> <221> modified_base <222> (3) <223> i <220> <221> modified_base <222> (6) <223> i <220> <221> modified_base <222> (18) <223> i <220> <221> modified_base <222> (21) <223> i <220> <221> modified_base <222> (24) <223> i <400> 4 ggnshnscra artadatnrt nswna 25 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 5 gcggcgttct tcgcg 15 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 6 ctattgtgaa tgagtacatt 20

【図面の簡単な説明】

【図１】a：ジベレリン（エント・ジベレラン）の一般
構造を示す。 b：高等植物における主要なGA生合成経路を示す。

【図２】OsGA2ox1の配列の解析結果を示す図である。 A:イネ(OsGA2ox1)、シロイヌナズナ(AtGA2ox1, AtGA2ox
2及びAtGA2ox3)、ベニバナインゲン(PcGA2ox1)、及びエ
ンドウ(PsGA2ox1及びPsGA2ox2)の推定アミノ酸配列を整
列した図である。 B：GA 2β-ヒドロキシラーゼに関する系統学的な関係を
示した図である。

【図３】組換えOsGA2ox1タンパク質による代謝を示す図
である。組換えOsGA2ox1タンパク質を、³Hで標識したGA
₁,GA₄,GA₉,GA₂₀,GA₄₄及びGA₅₃とインキュベーションし
た。産物はHPLCにより分離し、GC/MSにより同定した。

【図４】RNAゲルブロット分析による野生イネの様々な
器官におけるOsGA2ox1の発現を示す図である。栄養期の
茎頂（レーン１）、幼若葉（レーン２）、茎（レーン
３）、葉身（レーン４）、葉鞘（レーン５）、根（レー
ン６）、花序茎頂（レーン７）、苞穎（レーン８）、及
び花軸（レーン９）から全RNAを抽出し、OsGA2ox1cDNA
断片を用いてハイブリダイズした。

【図５】発芽中のイネ種子および栄養期の茎頂端分裂組
織におけるin situ mRNAの局在性を示す図である。紫色
の染色は、OsGA2ox1 mRNAの存在を示している。（A）播種３日目のイネ胚を中央縦方向に切断（B）茎頂端分裂組織隣接部を拡大（C）表皮細胞及び糊粉層隣接部を拡大（D）対照としてセンス鎖RNAプローブを用いて、イネ胚
を中央縦方向に切断（E）イネの栄養期の茎頂端分裂組織を縦方向に切断。
線１、２、３及び４は、それぞれパネルF、G、H及びIに
示された横断面のおおよその面を示す。（F）（G）（H）及び（I）は、パネル（E）のイネ栄養
期の茎頂端分裂組織を順に切断したものである。

【図６】OsGA2ox1 cDNAを過剰発現しているトランスジ
ェニックイネ植物の表現型を示す図である。（A）栄養期の野生型イネ（ｃ）及びAct::OsGA2ox1（1
〜５）トランスジェニックイネの全形態（B）花成期の野生型イネ（C）軽度に矮小化されたAct::OsGA2ox1トランスジェニ
ックイネの表現型（D）中間的な矮小性を示すAct::OsGA2ox1トランスジェ
ニックイネの表現型（E）極度に矮小化されたAct::OsGA2ox1トランスジェニ
ックイネの表現型（B）から（E）に表示されているバーの大きさは、10cm
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/02 ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｄ 9/02 21/02 ＣＣ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/02 5/00 ＣＡ (72)発明者萱野暁明茨城県つくば市観音台２丁目１−２農林水産省農業生物資源研究所内 (72)発明者松岡信愛知県名古屋市千種区不老町名古屋大学生物分子応答研究センター内 (72)発明者小林正智茨城県つくば市高野台３−１−１理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター内Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD06 CA06 CA17 CA19 CB02 CD02 CD03 CD07 CD09 CD10 CD14 CD15 CD17 CD21 CG01 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 4B050 CC03 DD09 LL10 4B064 AE59 AG01 AH03 CA19 CC24 DA11 4B065 AA01X AA57X AA87X AA88X AA89Y AB01 AC14 BA02 CA10 CA24 CA53 4H045 AA10 AA20 BA10 CA31 DA89 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ジベレリン２β水酸化酵素活性を有する
タンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいず
れかに記載のDNA。（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするDNA。（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含
むDNA。（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において1若
しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／また
は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
するDNA。
【請求項２】矮性化した植物体を作出するために用い
る、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】植物細胞内において内因性の請求項１に
記載のDNAの発現を抑制するために用いる、下記（ａ）
から（ｃ）のいずれかに記載のDNA。（ａ）請求項１に記載のDNAまたはその転写産物と相補
的なアンチセンスRNAをコードするDNA。（ｂ）請求項１に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂
するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。（ｃ）共抑制効果により、内因性の請求項１に記載のDN
Aの発現を抑制するRNAをコードするDNAであって、配列
番号：２に記載の塩基配列からなるDNAと70％以上の相
同性を有するDNA。
【請求項４】請求項１から３のいずれかに記載のDNA
を含むベクター。
【請求項５】請求項１から３のいずれかに記載のDNA
を発現可能に保持する形質転換植物細胞。
【請求項６】請求項５に記載の形質転換植物細胞を含
む形質転換植物体。
【請求項７】請求項６に記載の形質転換植物体の繁殖
材料。
【請求項８】請求項１に記載のDNAによりコードされ
るタンパク質。
【請求項９】請求項１に記載のDNAを発現可能に保持
する形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清
から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求
項８に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１０】植物細胞内において請求項１に記載の
DNAの発現量を調節することを特徴とする、植物の生長
を改変する方法。
【請求項１１】植物細胞内において請求項１に記載の
DNAの発現量を調節することを特徴とする、植物の草型
を改変する方法。
【請求項１２】植物細胞内で請求項１から３のいずれ
かに記載のDNAを発現させる、請求項１０または１１に
記載の方法。