CN1451754A - 水稻黄单胞hrf1基因重组载体及转基因植物育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明水稻黄单胞hrf1基因重组载体及转基因植物育种方法属于生物技术领域。以hrf1基因作为目的基因构建在植物表达的Ti－质粒双元载体pBI121上，获得基因重组载体，将构建的重组载体pBI121∷hrf1转化于EHA105中；转化植物细胞，外植体在植物再生培养基中筛选被转化的再生植株(T₀代)，检测转化株系。hrf1基因转基因植物增强了植物广谱抗病虫能力并改善植物其他生产性状。图为35S∷hrf1基因重组载体构建图。

Description

水稻黄单胞hrf1基因重组载体及转基因植物育种方法

(一)技术领域

本发明“水稻黄单胞hrf1基因重组载体及转基因植物育种方法”属于生物技术领域，专用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。

(二)技术背景

1.基因hrf存在于水稻黄单胞(Xanthomonas oryzae)两个致病变种(pv.oryzae和pv.oryzicola)和其他黄单胞细菌(Xanthomonas spp.)中，属于过敏反应和致病性(hypersensitive response andpathogenicity，hrp)基因簇成员。大多数革兰氏阴性植物病原细菌都有hrp基因簇，其中编码诱导植物产生过敏反应的蛋白质(Harpin)的基因各不相同。目前已对革兰氏阴性4个属植物病原细菌中的hrp基因簇进行了全序列测定，并依据基因簇的结构，操纵子的组成和调节基因的共线性关系等特征将已知的4种类型hrp基因簇分为两组。第I组包括梨火疫欧文氏菌(E.amylovora)和丁香假单胞(Pseudomonas syringae pv.syringae)；第II组包括青枯拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和甘兰黑腐黄单胞(Xanthomonas campestris pv.campestris)。关于编码harpins的基因，在梨火疫病菌中是hrpN，在丁香假单胞中是hrpZ，在青枯拉尔氏菌中是pop1，在水稻白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)中是hrf1。不同植物病原细菌来源的编码Harpins基因的序列比较发现，获得hrf1基因的代表菌株为水稻黄单胞白叶枯致病变种的JXOIII，这一菌株为公知公用菌株(陈功友等.2001，水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究，植物病理学报.31(3)：199～207)。

作为hrp基因簇成员hrf1对致病性有调节作用，但体外表达的蛋白质产物具有诱导抗病性、抗虫性和促进植物生长等有益效应。Hrf1基因编码的蛋白质HarpinXo具有Harpin蛋白家族的特征：蛋白质亲水性，对热稳定，等电点为酸性4.3左右。与报道的Harpins蛋白家族成员Harpin_Ea和Harpin_Pss不同之处在于Haprin_Xo含有一个半胱氨酸，氨基酸残基中有GGG-GG重复单元，3～5μg/ml可诱导植物产生细胞编程死亡(PCD)。本课题组的前一个发明“一种编码植物生长调节剂的基因表达产物及其用途”(专利申请号00135403.5；公开号CV 1300547A)已对从水稻黄单胞白叶枯致病变种(X.oryzae pv.oryzae)中获得的hrf1基因及其表达产物Harpin_Xoo在体外直接应用即以制剂形式进行浸种、拌种、蘸根和叶面喷雾以及用hrf1基因构建重组微生物的应用进行了专利保护。

以hrf1基因的表达产物Harpin_Xoo作为制剂在植物体外直接喷雾后，可以激活植物防卫反应相关酶，如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(PO)和多酚氧化酶(PPO)的活性，同时诱导病程相关蛋白基因如PR-1b和PR-1a基因的表达。其中PR-1b基因受茉莉酸分子的调控，PR-1a受水杨酸分子的调控(Eyal et al.，1993，Ohshima et al.，1990)。其中茉莉酸和水杨酸作为信号分子在诱导植物抗虫、抗病性中起作用。另外，在番茄上使用时，还能启动pto介导的信号反应，其中pti4/5/6和效应基因PR-1a1、PR-1b1、NP24、Pin2在不同时间有不同程度的增强表达。

作为与hrpN同类，但其蛋白质产物明显不同的水稻黄单胞编码Harpin_Xo的基因hrpA可能在植物基因工程中作为目的基因有应用价值。植物基因工程是以具有明确功能的外源基因作为目的基因，通过一定的技术路线转化植物后，随机整合到植物基因组中，使其在植物体内表达，来改善植物的抗病、抗虫和其他有益性状。如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫蛋白(ICP)可以作为生物制剂喷洒植物进行害虫防治，基因转化棉花后，转基因棉花对棉铃虫也有抗性(A 01N63/02 CN 95113498.1A)；抗菌肽(Cecropin)基因转化烟草、马铃薯和水稻后，转基因植物表现对这些植物上的细菌病害有抗性(贾士荣，1993)。通过转基因技术还可以改善作物品质如耐贮性、耐盐性、氨基酸品质和植物脂质等。作为Harpin基因家族的一个成员，来自梨火疫病菌(Erwinia amylovora)的编码Harpin_Ea的基因hrpN已在美国研发生物农药Messenger中成功应用，作为目的基因用于转基因马铃薯和苹果，分别对马铃薯晚疫病(Phytophthora infestans)和梨火疫病(Erwinia amylovora)的抗病性有不同程度的改善。但是hrf1基因还没有在植物转基因育种工程技术中的得到应用。目前也没有有关以hrf基因为目的基因的hrf基因转基因育种方法的报道。

(三)发明内容

技术问题  本发明的目的是针对hrf1基因还没有在植物转基因育种工程技术中的得到应用的现状，提供一种水稻黄单胞hrf1基因重组载体及转基因植物育种方法，将hrf1基因构建在植物表达的转化质粒，转化水稻、烟草获得转基因植株。其基因重组载体作为商业用途的品种、品系或作为基因资源在生产上直接使用或进行农业生物育种和转基因植物以提高作物抗病、抗虫性状和改善农作物其他生产性状。

技术方案

本发明所提供的一种水稻黄单胞hrf1基因重组载体是通过以下方法构建而成：

1)hrf1基因序列：如序列表SEQ ID NO.1所示

2)hrf1基因作为目的基因构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pBI121上：用于构建双元转化—表达载体的质粒的是由T-DNA改造而来，其中除T-DNA 25bp重复序列(LB和RB)，胭脂碱合成酶基因的启动子(P-nos)和终止子(T-nos)外，还有在原核生物(细菌)中作为选择标记使用的nptI和在真核生物(植物)中作为选择标记使用的nptII，用于选择的抗生素均为Km和G-418；另外在pBI121中还有在真核生物表达的花椰菜花叶病毒的启动子35S(p35S)和β-葡糖醛酸酶(Gus)基因uidA；作为目的基因使用的hrf1基因插入在pBI121质粒的p35S和uid之间的多酶切克隆位点上，所用内切酶为XbaI和BamHI，即为重组载体。

本发明所提供的水稻黄单胞hrf1基因重组载体的转基因植物育种方法为：

3)构建的双元转化重组载体质粒pBI121∷hrf1，可以直接转化于含vir区辅助质粒不带Km抗性的pTiBo542衍生质粒的感受态根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中；也可以用含pBI121∷hrf1的大肠杆菌DH5α，在帮助质粒pRK2013存在情况下，通过三亲交配转移到EHA105中。EHA105是EHA101(C58/pTiBo542)的Km敏感衍生株。

4)同时含有辅助质粒pTiBo542(Km^s)和转化质粒(pBI121∷hrf1)的根癌土壤杆菌EHA105用于植物细胞的转化，重组根癌土壤杆菌转化植物细胞的方法用叶碟法、胚转化法或花粉管导入方法。

5)外植体在含Km的植物再生培养基中筛选被转化的再生植株(T₀代)：T₁代种子催芽时用Km(150μg/ml)浸泡12小时进行筛选转化植株，对T₁代植株按株系检测转化频率以及植株中hrf1基因的表达。

6)转化株系的检测方法：用PCR和Southern印迹杂交法检测转化植株叶片中hrf1基因和P-35S启动子，hrf1基因的表达用定量RT-PCR方法检测植株叶片中hrf1基因的RNA的积累。

根癌土壤杆菌EHA105为公知公用菌株，基因重组转化和转化细胞的植株再生方法为转基因植物的常规方法(Sambrook J，Russell D.W.，2001，Molelcular cloning，A LaboratoryManual(3^rd ed)，Spring Harbor Laboratory Press；闻伟刚、王金生，2001，水稻白叶枯病菌harpin基因的克隆与表达，植物病理学报，31(4)：295～300)。

有益效果  本发明提供了一种水稻黄单胞hrf1基因重组载体及转基因植物育种方法，突破了hrf1基因还没有在植物转基因育种工程技术中的得到应用的现状，首次将hrf基因构建在植物表达的转化质粒，以双元转化—表达载体pBI121∷hrf1转化植物及hrf1基因在转基因植物中的表达根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的方法，转化水稻、烟草获得了转基因植株。在温室和大田鉴定转基因植株的抗病性对植物上的真菌病害、细菌病害和病毒病害的抗病性均有明显增强。试验表明，hrf1基因转基因水稻的T1代对稻瘟病免疫和高抗的单株各占20％，对水稻白叶枯病表现中抗的单株约占15％，与对照相比，防病效果分别达到80～100％和70～80％。水稻的转Harpin基因植株还表现耐弱光、耐低温、株型矮化、多分蘖等优良生产性状。hrf1基因转基因烟草的T1代植株90％以上表现出抗烟草花叶病毒(TMV)，烟草青枯病细菌(Ralstonia solanacearum)和烟草赤星病菌(Alternaria alternata)3种病害，达到高抗和中抗水平，效果分别为84％、70％和54％。在转基因植物株系可以检测到GST1、PR-1a、PR-1b等防卫相关基因的表达，而在亲本品系中不表达。已获得hrf1转基因棉花、小麦、玉米和番茄，并检测到hrf1基因和相关防卫基因的表达。

(四)附图说明

图1  35S∷hrf1基因重组载体构建图H：HindIII；S：SphI；P：PstI；X：XbaI；B：BamHI；Sm：SmaI；Sa：SacI；E：EcoRI

(五)具体实施方式1.在植物中表达hrf1基因的双元转化—表达载体pBIH(pBI121∷hrf1)的构建

用于构建双元转化—表达载体的质粒的是由T-DNA改造而来，其中除T-DNA 25bp重复序列(LB和RB)，胭脂碱合成酶基因的启动子(P-nos)和终止子(T-nos)外，还有在原核生物(细菌)中作为选择标记使用的nptI和在真核生物(植物)中作为选择标记使用的nptII，用于选择的抗生素均为Km和G-418。另外在pBI121中还有在真核生物表达的花椰菜花叶病毒的启动子35S(p35S)和β-葡糖醛酸酶(Gus)基因uidA。作为目的基因使用的hrf1基因插入在pBI121质粒的p35S和uid之间的多酶切克隆位点上(图3)，本发明所用内切酶为XbaI和BamHI。双元载体pBI121为公知公用载体(Jefferson，R.A.，Kavanash，T.A.&Bevan，1987，M.W.EMBO J.，6，3901-3907)。

双元转化—表达载体pBI121∷hrf1转化植物及hrf1基因在转基因植物中的表达：

构建的双元转化载体质粒pBI121∷hrf1，可以直接转化含vir区辅助质粒不带Km抗性的pTiBo542衍生质粒的感受态根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。EHA105是EHA101(C58/pTiBo542)的Km敏感衍生株。也可以用含pBI121∷hrf1的大肠杆菌DH5α，在帮助质粒pRK2013存在情况下，通过三亲交配转移到EHA105中。同时含有辅助质粒pTiBo542(Km^s)和转化质粒(pBI121∷hrf1)的根癌土壤杆菌EHA105用于植物细胞的转化。重组根癌土壤杆菌转化植物细胞的方法用叶碟法、胚转化法或花粉管导入方法。外植体在含Km的植物再生培养基中筛选被转化的再生植株(T₀代)。T₁代种子催芽时用Km(150μg/ml)浸泡12小时进行筛选转化植株。

对T₁代植株按株系检测转化频率以及植株中hrf1基因的表达。转化株系的检测方法是用PCR和Southern印迹杂交法检测转化植株叶片中hrf1基因和P-35S启动子，hrf1基因的表达用定量RT-PCR方法检测植株叶片中hrf1基因的RNA的积累。

根癌土壤杆菌EHA105为公知公用菌株，基因转化和转化细胞的植株再生方法为转基因植物的常规方法。(Clark MS，1997，Plant Molecular Biology，A Laboratory Manual，Springer，Berlin Germany)。2.hrf1基因转基因水稻的表型特征

将1所得到的hrf1基因转基因水稻的T1代种子分别播种在温室和病害流行区隔离田块中，用人工接种和诱发行感染法测定hrf1基因转基因水稻株系对稻瘟病(Magnaporthe grisea)和水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)的抗病型。人工接种法用常规喷雾(稻瘟病菌)和剪叶接种法(白叶枯病菌)。诱发行感染法是用稻瘟病菌人工喷雾接种感病品种籼优63，发病后移栽到病害鉴定圃的四周及畦间。畦面宽1.8米，株行距均为15厘米。诱发行水稻中病斑上的孢子可以随风雨均匀随机传播。感病株系和出发品种100％被感染发病。通过34个转基因水稻株系约3000个单株的鉴定结果，对稻瘟病免疫和高抗的单株各占20％，对水稻白叶枯病表现中抗的单株约占15％，与对照相比，防病效果分别达到80～100％和70～80％。用于转基因的亲本水稻品种有优质粳稻R109，籼稻3103和杂交稻恢复系明恢63。除抗病表型有明显改善外，转基因株系还表现明显的耐弱光、耐低温和株型矮化等特点。转基因水稻品系命名为转hrp基因抗优稻(Harice)。

进行抗病性鉴定的水稻白叶枯病菌和稻瘟病菌均为公知公用。转基因亲本水稻品种R109、3103和明恢63是生产上使用的品种，公知公用。

3.hrf1基因转基因烟草的表型特征

将1所得到的hrf1基因转基因烟草的T1代种子，播种在温室盆钵中，2叶期单株移栽至直径20厘米的盆钵中，4～5片真叶时人工接种烟草花叶病毒(TMV)，烟草青枯病细菌(Ralstonia solanacearum)和烟草赤星病菌(Alternaria alternata)。TMV接种用叶面摩擦接种，青枯病用细菌悬浮液茎注射法，赤星病菌用孢子悬浮液液滴法叶面接种。转基因烟草株系T1代种子经Km(150μg/ml)筛选后的植株90％以上表现出抗以上3种病害，达到高抗和中抗水平，效果分别为84％、70％和54％。但其他性状与亲本烟草品种Xanthi(nc)相同。转Harpin基因烟草品系命名为转Hrp基因抗优烟(Hartob)。

进行烟草抗病性鉴定的烟草花叶病毒、青枯病细菌和赤星病菌在田间经常发生，为公知公用。

表达hrf1基因的转基因植物品系启动植物防卫反应的特征：

从水稻T1代植株中有约70％的单株，烟草T1植株中有95％的单株可以用PCR和Southern印迹杂交方法检测到hrf1基因的全长插入序列和外源p35S启动子。hrf1基因转基因水稻和烟草的转基因品系T1代植株均不表现细胞编程死亡(PCD)现象。用定量RT-PCR方法测定hrf1基因和抗病防卫相关基因表达，PCR、Southern印迹杂交和RT-PCR方法是分子生物学常规研究方法。在转基因植物株系可以检测到GST1、PR-1a、PR-1b等防卫相关基因的表达，而在亲本品系中不表达。

运用相同方法，已获得hrf1转基因棉花、小麦、玉米和番茄，并检测到hrf1基因和相关防卫基因的表达。

双元载体pBI121和根癌土壤菌EHA105，水稻品种R109，明恢63，烟草品种Xanthi(nc)；公知公用。

作为目的基因使用的hrf1基因来源菌株JXOIII公知公用(陈功友等，2001，水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究，植物病理学报，31(3)：199～207)。

Claims (4)

1、一种水稻黄单胞hrf1基因重组载体是通过以下方法构建而成：

(1)hrf1基因序列：如序列表SEQ ID NO.1所示

(2)以hrf1基因作为目的基因构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pBI121上：用于构建双元转化—表达载体的质粒的是由T-DNA改造而来，其中除T-DNA 25bp重复序列(LB和RB)，胭脂碱合成酶基因的启动子P-nos和终止子T-nos外，还有在原核生物(细菌)中作为选择标记使用的nptI和在真核生物(植物)中作为选择标记使用的nptII，用于选择的抗生素均为Km和G-418；另外在pBI121中还有在真核生物表达的花椰菜花叶病毒的启动子35S(p35S)和β-葡糖醛酸酶(Gus)基因uidA；作为目的基因使用的hrf1基因插入在pBI121质粒的p35S和uid之间的多酶切克隆位点上，所用内切酶为XbaI和BamHI，即获得基因重组载体。

2、根据权利要求1所述的水稻黄单胞hrf1基因重组载体，其特征在于，Ti-质粒双元载体指的是Ti-质粒双元载体pBI121。

3、根据权利要求1或2所述的水稻黄单胞hrf1基因重组载体，其转基因植物育种的方法为：将构建的双元转化重组载体质粒pBI121∷hrf1直接转化于含vir区辅助质粒、不带卡那霉素抗性的pTiBo542衍生质粒的感受态根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中；也可以用含pBI121∷hrf1的大肠杆菌DH5α，在帮助质粒pRK2013存在情况下，通过三亲交配转移到EHA105中；

1)转化植物细胞：同时含有辅助质粒pTiBo542(Km^s)和转化质粒(pBI121∷hrf1)的根癌土壤杆菌EHA105用于植物细胞的转化，方法为叶碟法、胚转化法或花粉管导入方法；

2)外植体在植物再生培养基中筛选被转化的再生植株(T₀代)：T₁代种子催芽时用150μg/ml Km浸泡12小时进行筛选转化植株，对T₁代植株按株系检测转化频率以及植株中hrf1基因的表达筛选被转化的再生植株；

3)转化株系的检测：用PCR和Southern印迹杂交法检测转化植株叶片中hrf1基因和P-35S启动子，hrf1基因的表达用定量RT-PCR方法检测植株叶片中hrf1基因的RNA的积累，即获得转化株系。

4.根据权利要求3所述的水稻黄单胞hrf1基因重组载体转基因植物育种的方法，其特征在于：用农杆菌介导感染法或花粉管导入法获得转基因品系。