CN104894130B - 一种花生组成型启动子的克隆和应用 - Google Patents

Abstract

一种花生组成型启动子的克隆和应用。本发明属于生物技术领域，从花生中克隆获得了一个花生AhLEC1B基因的组成型启动子，其基因序列如Seq ID No:1所示，该启动子通过GUS组织化学染色证实其驱动基因在植物根、茎、叶、花和种胚等器官中呈组成型高效表达，发明人基于该启动子的上述功能，构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥，证实该启动子对于GUS基因的驱动功效与CaMV35S近似，且该启动子片段大小适中，利于构建，适于实验室和工业应用。

Description

一种花生组成型启动子的克隆和应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及了一个新的花生组成型启动子的克隆和应用。

背景技术

启动子是位于结构基因5′端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子决定着转录的方向和转录的效率，同时对所使用的RNA聚合酶类型也起着决定性作用，是理解基因表达和转录调控机制的关键，是植物基因转录调控的中心。按作用方式和功能，可将启动子分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。目前在植物基因工程研究中，组成型启动子的应用最早、最为广泛。在转基因育种或用于研究基因功能时，为了充分发挥外源基因表达产物的功能一般都使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。

在双子叶转基因植物中使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子。单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和水稻的ActinI启动子，另外还有来自章鱼碱合成酶基因Ocs启动子和根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因Nos启动子。有研究表明内源型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效稳定表达中比外源启动子更具有优势。此外在植物基因工程中应用从病毒中克隆出来的启动子序列，可能存在潜在的生物不安全性。并且，重复使用同一种组成型启动子驱动两个或两个以上的外源基因表达可能会引起基因沉默或共抑制现象。因此，寻找双子叶植物组成型启动子，对于双子叶植物的遗传改良具有重要应用价值。

近年来，国内外多个实验室开展了花生抗逆和籽粒储藏物质积累相关基因启动子的克隆与研究，旨在充分了解基因的表达调控特征，为作物遗传改良提供依据。花生籽粒中多个主要储藏蛋白—过敏原Arah1、2、3和6基因的启动子已被克隆和鉴定(Viquez等,2003；2004；Zhong等,2006；Bhattacharya等,2012)，花生Arah2启动子驱动GUS在种胚中特异表达，且强度高于35S启动子，而在种皮中基本无表达；花生Arah 6启动子驱动GUS在子叶中表达，而在真叶中表达较弱。花生油体蛋白基因AhOleo17.8、AhOleo18.5启动子(Li et al.,2009)和脂肪酸合成与油脂积累相关的基因如AhDGAT3(唐桂英等,2013)、AhACP(单雷等，2014)启动子，也相继获得克隆与分析。干旱胁迫下花生中调控脱落酸生物合成的AhNCED1基因启动子(梁建华等,2007)、抵御外来病害相关的ARAhPR10基因启动子(温世杰等,2012)也已被克隆研究。

发明内容

基于上述现有技术，本发明的发明人经过深入研究，从花生中克隆获得了一个新的花生组成型启动子，该启动子来源于花生AhLEC1B基因，该启动子基因序列如Seq ID No:1所示，包括5′端非翻译区52bp和其上游555bp区段具有高效驱动功能。本发明构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。实验表明，自起始密码起-32～-638调控区的启动子驱动的GUS基因在转基因植株的根、茎、叶、花、种胚中均能高效表达，且驱动效率与CaMV35S近似。

该启动子是在通过染色体步移技术获得AhLEC1B基因5′端上游1289bp序列(其核苷酸序列如Seq ID No:2所示)的基础上，设计特异引物进行扩增得到的607bp AhLEC1B基因5′端上游序列，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示。经转录起始位点分析发现，花生AhLEC1B基因转录起始位点位于翻译起始密码ATG上游-83nt处，通过PlantCARE和PLACE软件对该启动子进行顺式调控元件分析，该序列除包含启动子中心元件TATA BOX，还包含莲座叶、根中高表达调控元件RAV1A AT(CAACA)和ROOT MOTIF(ATATT)、叶肉表达调控元件CACTFT PPCA1(YACT)，胚表达调控元件SEF4MOTIF(RTTTTTR)(GTGA)、花粉中表达调控元件GTGA Motif(GTGA)，另外，还包含细胞分裂素、赤霉素、乙烯等植物激素响应调控元件CPBSequence(TATTAG)、ARR1AT(NGATT)WRKY71OS(TGAC)、ERE Motif(AWTTCAAA)及光响应调控元件GATA BOX(GATA)、GT1CONSENSUS(GRWAAW)、I BOX CORE(GATAA)SORLIP1AT(GCCAC)。存在的启动子调控元件的位置如图2所示。

为了完成该启动子的初步功能分析，本发明以pCAMBIA3301为出发载体构建了含有上述花生AhLEC1B组成型基因启动子驱动的GUS基因植物表达载体，即用花生AhLEC1B基因启动子片段取代pCAMBIA3301中驱动GUS基因表达的35S启动子，获得的植物表达载体转化农杆菌后，用花序浸染法转化拟南芥，即待拟南芥繁殖开花时，配制浸染液，用农杆菌浸染将要开放的花序。

本发明分别取转基因拟南芥的根、茎、叶、花和种胚，通过现有的方法检测GUS基因的表达情况。本发明所提供的启动子区域，包括5′端非翻译区52bp和其上游启动子555bp区段，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，可驱动GUS基因在根、茎、叶、花和种胚中高效表达。由此可见本发明克隆的花生AhLEC1B基因的启动子组成型表达特性。

通过上述实验，发明人证实了，在本发明提供的607bp 5′端上游调控区包括非翻译区52bp和其上游启动子555bp区段具有高效组成型表达特性，可以应用在植物遗传工程，构建该启动子和相关基因的表达载体，通过转基因手段定向改变植物性状，如增强植物耐受生物或非生物胁迫能力、提高植物对除草剂抗性、改善粮食营养组分等。因此，该启动子的克隆对植物转基因技术领域启动子的研究也具有重要意义。

附图说明

图1为扩增的花生AhLEC1B基因607bp 5′端上游序列扩增的电泳图，

图中M为Trans2K DNA Marker；P为扩增的目的启动子片段；由图中结合实施例可知，扩增得到的序列为607bp，包括555bp的启动子序列、52bp 5′非编码区序列；

图2为本发明花生组成型启动子区域可能的顺式作用元件；

图3为扩增花生AhLEC1B基因1289bp 5′端上游序列扩增的电泳图，

图中M为Trans2K DNA Marker，LD、LE、LP和LS为不同基因组文库扩增结果，LP泳道箭头所指为扩增的目的启动子片段；

图4为花生AhLEC1B基因启动子序列与GUS基因的融合表达载体的构建流程图；

图5为本发明所提供的包括52bp5′非编码区序列和555bp的启动子序列区段驱动的GUS基因表达结构转基因拟南芥根、茎、叶、花和种胚GUS活性组织化学检测图；

图中自上而下为拟南芥根和叶、茎、花和种胚；CK-P为转基因阳性对照，CK-N为未转基因阴性对照，AhLEC1B-P为本发明启动子；

由图可见转基因拟南芥AhLEC1B-P整个植株染色较深，与阳性对照CK-P染色程度近似，而阴性对照CK-N为无色，说明该启动子驱动GUS基因在转基因植株根、茎、叶、花和种胚中均有高水平表达，且与35S具有近似的驱动效率。

具体实施方式

本发明的实施步骤是根据花生AhLEC1B基因的基因组DNA序列用染色体步移的方法克隆得到该基因的启动子序列→启动子顺式作用元件分析及功能预测→设计带有酶切位点HindⅢ和NcoⅠ的引物从启动子DNA上扩增目的启动子序列→用同样的酶HindⅢ和NcoⅠ酶切载体pCAMBIA3301→目的片段连接到酶切的pCAMBIA3301载体上→含植物表达载体的农杆菌转化拟南芥→转基因拟南芥鉴定和筛选纯合体转基因株系→GUS组织化学染色检测GUS表达部位及强度，分析启动子功能。本实施例中的其他技术均采用已有技术。

实施例1花生AhLEC1B基因启动子的克隆

1.1花生基因组DNA的提取

用植物DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)提供的方法提取花生幼叶的DNA，溶解于适量TE(pH8.0)缓冲液中；

1.2花生AhLEC1B基因启动子的克隆

分别取2.5μg花生基因组DNA经DraI、EcoRV、PvuII、StuI内切酶酶切、苯酚抽提纯化后，溶解于20μl TE(pH 7.5)缓冲液中。分别取4μl酶切完全的DNA，按照BD GenomeWalkerUniversal Kit的要求连接上Adaptor(序列：5'GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT 3'，如Seq ID No:3所示)，构建4个花生基因组DNA文库(LD、LE、LP、LS)。根据已获得的花生AhLEC1B基因的基因组序列，设计该基因的2个嵌套的3′端特异性引物LEC1BGSP2-1(5'CCTTGTTCCCATGTAAAACCATGAAAGCA3'，如Seq ID No:4所示)和LEC1BGSP2-2(5'AGGTAAAGCAGCCGCTAATCTAGTTAGT 3'，如Seq IDNo:5所示)。以AP1(5′端接头引物：5'GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'，如Seq ID No:6所示)和LEC1BGSP2-1为引物进行第一轮扩增，扩增体系为25μl，模板量为1μl，扩增条件为：94℃25sec，72℃3min，7个循环；94℃25sec，67℃3min，32个循环；最后67℃继续延伸7min。第二轮巢式PCR模板为1μl第一轮PCR产物10倍稀释液，引物为5′端巢式接头引物AP2(5'ACTATAGGGCACGCGTGGT 3'如Seq ID No:7所示)和LEC1BGSP2-2，扩增体系与第一轮PCR相同，扩增条件94℃25sec，72℃3min，5个循环；94℃25sec，67℃3min，20个循环；最后67℃继续延伸7min。1％琼脂糖电泳检测PCR结果；

挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。

1.3RNA提取和转录起始位点确定

用CTAB法提取不同发育时期种子的总RNA，经琼脂糖电泳检测RNA质量和分光光度计定量后，等量混合储存于–80℃冰箱备用。为防止RNA酶污染,研钵、研锤、药匙均以180℃烘烤6h,所用塑料制品用0.1％的DEPC水浸泡,于室温下过夜后,高温灭菌处理。

用Invitrogen公司GeneRacer^TM Kit提供的方法和试剂，取5μg混合好的LH14种子总RNA，按照说明书要求用碱性磷酸酶(CIP)将截断的mRNA或其他非mRNA5′端去磷酸化，然后将抽提纯化并沉淀的全长mRNA脱去帽子结构，并连接上RNA接头(GeneRacer RNA Oligo：5'CGACUGGAGCACGAGGACACUGA CAUGGACUGAAGGAGUAGAAA 3'，如Seq ID No:8所示)；以此RNA为模板，用试剂盒提供的随机引物和SurperScript^TMⅢRT酶反转录合成cDNA；最终将合成的cDNA克隆至载体pCR4-TOPO中，获得LH14不同发育时期种子全长cDNA文库，用于随后转录起始位点扩增。根据已获得的花生AhLEC1B基因的cDNA序列，设计2个该基因的3′端特异性引物，引物序列为：TSS GSP1-15'TCTTTTGCGTCGTCGGAGATTTTAGC 3'，如Seq ID No:9所示，TSSGSP2与LEC1BGSP2-2相同。以构建的cDNA文库为模板，分别以TSS GSP1-1引物与GeneRacer^TM5'Primer(5'CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 3'，如Seq ID No:10所示)进行第一轮PCR扩增，PCR体系参照BD Advantage^TM2PCR Kit要求，扩增条件为：94℃预变性2min；94℃30sec，72℃30sec，5个循环；94℃30sec，70℃30sec，5个循环；94℃30sec，63℃30sec，68℃30sec，20-25个循环；最后68℃继续延伸10min。第一轮PCR产物经电泳检测后，用缓冲液稀释50倍，用于第二轮巢式PCR。取1μl第一轮PCR产物，以TSS GSP2和GeneRacer^TM 5'Nested Primer(5'GGACACTGACATGG ACTGAAGGAGTA 3'，如Seq ID No:11所示)进行第二轮PCR，扩增条件为：94℃预变性2min；94℃30sec，65℃30sec，68℃10sec，35个循环；最后68℃继续延伸10min。1.5％琼脂糖电泳检测PCR结果。

挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。

1.4启动子序列分析

应用在线植物转录元件分析工具PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)、PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对花生AhLEC1B启动子序列进行分析。

1.5目标启动子片段的扩增

设计带有酶切位点的引物F1和R1，序列如Seq ID No:12和13所示，下划线部分为酶切位点，以已克隆的含有花生AhLEC1B基因1289bp启动子的重组质粒为模板，扩增607bp启动子片段，如图1所示；

PCR扩增体系为20μl：包括10×PCR buffer 2μl，dNTP mixure(各2.5mM)1μl，上、下游引物各0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.25μl，加ddH₂O补足20μl。反应程序为：预变性94℃2min；变性94℃30sec，退火55℃30sec，延伸72℃40sec，30个循环；最后72℃继续延伸10min。

扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小正确，回收目的片段，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。

表1.AhLEC1B基因启动子功能分析引物

实施例2植物表达载体的构建与转化

2.1花生AhLEC1B基因启动子序列与GUS报告基因的融合

选择pCAMBIA3301作为植物表达载体，将测序正确的连有目的片段的克隆载体酶切，电泳并胶回收目的片段。同时用限制性内切酶HindⅢ和NcoⅠ酶切表达载体，并回收载体片段。连接启动子片段与载体片段，经质粒酶切图谱鉴定筛选含不同长度启动子的pCAMBIA3301-AhLEC1B启动子重组载体。具体过程可参考附图4：

1.用带有酶切位点的引物F1和R1扩增花生AhLEC1B基因的启动子区段，并凝胶电泳分离和回收目的片段，克隆至pEASY-T3载体，测序。

2.用HindⅢ和NcoⅠ双酶切回收目的片段和植物表达载体pCAMBIA3301。

3.回收：进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有AhLEC1B启动子序列的DNA片段和pCAMBIA3301载体片段。

4.连接，连接体系如下：

混匀后16℃连接过夜。

5.转化：取5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉素的固体培养基平板上。

6.重组子的筛选：对长出的菌落进行重组质粒酶切图谱鉴定。

2.2农杆菌感受态细胞的制备

1.挑取单菌落GV3101，接种于5ml加有50mg利福平(Rifampicin)的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜培养。

2.取2ml培养物至100ml液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.8左右。将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min。

3.弃上清。用10ml 0.1mol/L冷的NaCl悬浮菌体；4℃，5000rpm，离心5min。

4.弃上清。用1ml 20mmol/L冷的CaCl₂悬浮菌体，分装成50μl/管，液氮中速冻后，-80℃保存。

2.3冻融法转化农杆菌

1.冰上融化农杆菌GV3101感受态细胞，加入1μl带有目的片段的pCAMBIA3301质粒，冰浴30min，液氮中冷冻1min，然后在37℃水浴5min。

2.加入1ml无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养3h。

3.10,000rpm离心1min收集菌体，用100μlYEP液体培养基重悬菌体。

4.将重悬的菌体涂布于附加50mg/L卡那霉素(Kanamycin sulfate)和100mg/L利福平的固体YEP培养基上，28℃下培养2-3天。

5.酶切及PCR鉴定阳性克隆。

2.4农杆菌介导转化拟南芥

1.农杆菌的培养：从-80℃冰箱中取出所需要的菌种，在冰浴中融化。分别取30μl的农杆菌接种于5ml的YEP培养基(含100mg/L利福平，50mg/L卡那霉素)，28℃，200rpm，振荡培养过夜。然后在附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固体YEP培养基上划板培养，已挑选单菌落。

2.花序浸染液的配制：配制50ml浸染液，需加入2.5g蔗糖(终浓度5％)和15μlSilwet L-77(终浓度0.03％)。

3.花序浸染：将拟南芥种子表面消毒后播种于MS固体培养基平板上，待种子萌发长出子叶后，移入蛭石中培养至拟南芥开花，期间浇营养液维持幼苗健壮生长。浸染前，提前准备菌液。挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落接种于含100mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP培养基中，28℃，200rpm，振荡培养至对数生长期(约48h)；将菌液用MS液体培养基稀释10倍备用。将摇好的菌液转入离心管中5000rpm离心10min；去上清，用适量浸染液重悬菌体，轻微振荡混匀。去掉开过的花，将整个花序浸入菌液中30s，然后用保鲜膜包裹花序，至黑暗中平放2天后，转至光下培养。

2.5转基因植株的鉴定

待浸染后的拟南芥接种后，将种子在4℃春化10天，然后播种于含10mg/L的除草剂的MS培养基中筛选，能在含除草剂培养基中萌发生长的拟南芥，可初步确定为转基因的拟南芥。种子萌发长出子叶后，移入蛭石中生长。为进一步鉴定抗除草剂植株为转入目的启动子片段的转基因植株，取每个植株的一片小叶提取基因组DNA，通过PCR的方法进行目的片段鉴定。所用引物和程序如扩增启动子时所用的引物和程序。得到目的片段，经测序证明所得植株中确实转入了该发明所克隆的不同长度的启动子片段。

3.1GUS活性组织化学染色的方法：

1.样品放入冰水混合物冰浴2min；

2.样品用滤纸吸干后放入离心管中，加入90％丙酮浸泡样品10min；

3.用GUS染色buffer迅速清洗一遍样品后，加入GUS染色液浸染5min，倒掉染液；

4.加入适量染液浸没样品，抽气2次，每次5min；

5.37℃恒温保存过夜；

6.加入无水乙醇脱色，然后转移至水中。肉眼或解剖镜下观察、照相。

3.2GUS染色buffer配方：

100ml buffer

ddH₂O定容至100ml。

3.3GUS染色液配方

用800μl DMSO溶解100mg X-Gluc，加入GUS染色buffer定容至100ml。

3.4对转基因植株不同组织和不同发育时期的种子进行GUS活性组织化学染色

分别取各转基因株系营养生长期的根和叶、茎，以及繁殖期刚刚开放的花和种胚进行GUS活性组织化学染色，如图5所示，发现转基因植株AhLEC1B-P根、茎、叶、花和种胚均有染色，且染色程度与阳性对照CK-P近似，而转基因阴性对照CK-N则为无色。说明本发明提供的AhLEC1B组成型启动子片段能高效驱动GUS基因在各器官组成型表达。

Claims (2)

1.一种花生组成型启动子，其特征在于：其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，该启动子能驱动GUS基因主要在花生各器官高效组成型表达。

2.如权利要求1所述启动子在驱动GUS基因在花生各器官高效组成型表达上的应用。