BR122019018071B1 - Molécula de dna recombinante e processo para expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a moléculas de dna e construções, incluindo suas sequências de nucleotídeos, úteis para a modulação da expressão gênica em plantas e células vegetais. plantas transgênicas, células vegetais, partes da planta, sementes e produtos consumíveis que compreendem as moléculas de dna ligadas de forma operacional a polinucleotídeos que podem ser transcritos heterólogos também são fornecidos, assim como são os processos para uso dos mesmos.

Description

[001] Dividido do BR112013029185-0, depositado em 11.05.2012.

REFERÊNCIA A PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS

[002] Este pedido de patente reivindica benefício do pedido depatente U.S. N° 61/485.876 depositado em 13 de maio de 2011 e é incorporado aqui como referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] A listagem de sequências que está contida no arquivo chamado “MONS304WO.txt”, que possui 463 kilobytes (que é medido no Microsoft Windows®) e foi criado em 09 de maio de 2012, é depositada aqui por submissão eletrônica e é incorporada aqui como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[004] A invenção refere-se ao campo de biologia molecular deplantas e de engenharia genética de plantas e moléculas de DNA úteis para a modulação da expressão gênica em plantas.

FUNDAMENTO

[005] Os elementos reguladores são elementos genéticos queregulam a atividade gênica através da modulação da transcrição de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional. Tais elementos incluem promotores, líderes, íntrons e regiões não traduzidas a 3’ e são úteis no campo de biologia molecular de plantas e de engenharia genética de plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção fornece novos elementos reguladoresde genes tais como promotores, líderes e íntrons derivados de Cucu- mis melo, uma espécie vegetal comumente referida como melão al- miscarado, para uso em plantas. A presente invenção fornece ainda construtos de DNA, células vegetais, plantas e sementes transgênicas que compreendem os elementos reguladores. As sequências podem ser fornecidas ligadas de forma operacional a uma molécula de polinu- cleotídeo que pode ser transcrita que pode ser heteróloga em relação a uma sequência reguladora fornecida aqui. A presente invenção fornece ainda métodos de produção e uso dos elementos reguladores, das construtos de DNA que compreendem os elementos reguladores e das células vegetais, plantas e sementes transgênicas que compreendem os elementos reguladores ligados de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita.

[007] Assim, em um aspecto, a presente invenção fornece umamolécula de DNA, tal como um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição ou promotor ou líder ou íntron, que compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste de: a) uma sequência com pelo menos 85 porcento de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; b) uma sequências que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212 que exibe atividade reguladora do gene, em que a referida molécula de DNA está ligada de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga. Em modalidades específicas, um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição ou promotor ou líder ou íntron é pelo menos 90 porcento, pelo menos 95 porcento, pelo menos 98 porcento ou pelo menos 99 porcento idêntico em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212. Em modalidades particulares, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga compreende um gene de interesse agronômico, um gene capaz de fornecer resistência a herbicidas em plantas ou um gene capaz de fornecer resistência a pragas de planta em plantas.

[008] A invenção fornece ainda uma célula vegetal transgênicaque contém uma molécula de DNA tal como um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição ou promotor ou líder ou íntron, que compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste de: a) uma sequência com pelo menos 85 porcento de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; b) uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212 que exibe atividade reguladora do gene, em que a referida molécula de DNA está ligada de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga. Ainda, o grupo de elemento de expressão regulador da transcrição ou promotor ou líder ou íntron regula a expressão de um gene. A célula vegetal transgênica pode ser uma célula vegetal mono- cotiledônea ou dicotiledônea.

[009] É adicionalmente fornecida pela invenção uma plantatransgênica ou parte da planta transgênica que contém uma molécula de DNA tal como um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição ou promotor ou líder ou íntron, que compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste de: a) uma sequência com pelo menos 85 porcento de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; b) uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212 que exibe atividade reguladora do gene, em que a referida molécula de DNA está ligada de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga. Em modalidades específicas, a planta transgênica pode ser uma pro- gênie de planta de qualquer geração que contenha o grupo de elemento de expressão regulador da transcrição ou promotor ou líder ou ín- tron.

[0010] É ainda adicionalmente fornecida uma semente transgênicaque contém uma molécula de DNA tal como um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição ou promotor ou líder ou íntron, que compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste de: a) uma sequência com pelo menos 85 porcento de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; b) uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212 que exibe atividade reguladora do gene, em que a referida molécula de DNA está ligada de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga.

[0011] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um método deprodução de um produto consumível proveniente da planta transgêni- ca, parte da planta transgênica ou semente transgênica que contém uma molécula de DNA tal como um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição ou promotor ou líder ou íntron, que compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste de: a) uma sequência com pelo menos 85 porcento de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1199, 211 e 212; b) uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212 que exibe atividade reguladora do gene, em que a referida molécula de DNA está ligada de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita hete- róloga. Em uma modalidade, o produto consumível é concentrado de proteína, isolado de proteína, grão, amido, sementes, farinha grossa, farinha, biomassa ou óleo de semente.

[0012] Em outro aspecto, a invenção fornece um produto consu- mível que compreende uma molécula de DNA tal como um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição ou promotor ou líder ou íntron, que compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste de: a) uma sequência com pelo menos 85 porcento de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; b) uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212 que exibe atividade reguladora do gene, em que a referida molécula de DNA está ligada de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga.

[0013] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um método deexpressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita em uma planta transgênica utilizando uma molécula de DNA tal como um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição ou promotor ou líder ou íntron que possui uma sequência de DNA que é pelo menos 85 porcento idêntica àquela de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212 ou contém qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212 ou consiste de um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212; e o cultivo da planta transgênica.BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0014] SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139,140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 159, 162, 167, 168, 172, 175, 176, 177, 178, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 211 e 212 são grupos de elemento de expressão regulador da transcrição ou sequências EXP de Cucumis que são compreendidos de um elemento promotor, ligado de forma operacional a um elemento líder; ou um elemento promotor, ligado de forma operacional a um elemento líder e um elemento intrônico ou um elemento promotor, ligado de forma operacional a um elemento líder, ligado de forma operacional a um elemento intrônico, ligado de forma operacional a um elemento líder.

[0015] SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 163 e 169 são elementos promotores.

[0016] SEQ ID NOs: 3, 164, 166 e 170 são sequências líderes.

[0017] SEQ ID NOs: 4, 165 e 171 são sequências intrônicas.

[0018] SEQ ID NOs: 157, 160, 173, 179 e 186 são sequências emque um promotor está ligado de forma operacional a um elemento líder.

[0019] SEQ ID NOs: 158, 161, 174, 180 e 187 são sequências emque um íntron está ligado de forma operacional a um elemento líder. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] As FIGS. 1a- 1f representam o alinhamento de segmentosvariantes do promotor correspondentes aos elementos promotores isolados de Cucumis melo. Em particular, as Figs. 1a-1f mostram o alinhamento da sequência promotora de 2068 pb P-CUCme.Ubq1-1:1:15 (SEQ ID NO: 2), encontrada no grupo de elemento de expressão regulador da transcrição EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), vs. sequências promotoras derivadas de deleções a 5’ do promotor, P- CUCme.Ubq1-1:1:15. Deleção, por exemplo, da extremidade a 5’ de P-CUCme.Ubq1-1:1:15, produziu os promotores, P-CUCme.Ubq1- 1:1:16 (SEQ ID NO: 6) um promotor de 1459 pb que é encontrado den- tro de EXP-CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5); P-CUCme.Ubq1-1:1:17 (SEQ ID NO: 8), uma sequência de 964 pb compreendida dentro de EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7); P-CUCme.Ubq1-1:1:18 (SEQ ID NO: 10), uma sequência de 479 pb compreendida dentro de EXP- CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9); e P-CUCme.Ubq1-1:1:19 (SEQ ID NO: 12), uma sequência de 173 pb compreendida dentro de EXP- CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0021] A invenção divulgada aqui fornece moléculas de polinucleo-tídeo obtida de Cucumis melo que possui atividade reguladora do gene benéfica. O planejamento, a construto e o uso destas moléculas de polinucleotídeo são descritos. As sequências de nucleotídeos destas moléculas de polinucleotídeo são fornecidas entre as SEQ ID NOs: 1199, 211 e 212. Estas moléculas de polinucleotídeo são, por exemplo, capazes de afetar a expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional em tecidos vegetais e, portanto, de regular seletivamente a expressão ou a atividade gênica de um produto gênico codificado, em plantas transgênicas. A presente invenção fornece ainda métodos de modificação, produção e utilização das mesmas. A invenção fornece ainda composições, células hospedeiras transformadas, plantas transgênicas e sementes contendo os promotores e/ou outras sequências de nucleotídeos divulgadas e métodos para a preparação e para a utilização das mesmas.

[0022] As definições e os métodos a seguir são fornecidos paradefinir melhor a presente invenção e para guiar os peritos comuns na arte na prática da presente invenção. A não ser que seja citado o contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos peritos comuns na arte relevante.

Moléculas de DNA

[0023] Como utilizado aqui, o termo “DNA” ou “molécula de DNA” refere-se a uma molécula de DNA de filamento duplo de origem ge- nômica ou sintética, isto é, um polímero de bases de desoxirribonucle- otídeo ou uma molécula de polinucleotídeo, lida desde a extremidade a 5’ (a montante) para a extremidade a 3’ (a jusante). Como utilizado aqui, o termo “sequência de DNA” refere-se à sequência de nucleotí- deos de uma molécula de DNA.

[0024] Como utilizado aqui, o termo “molécula de DNA isolada”refere-se a uma molécula de DNA pelo menos parcialmente separada de outras moléculas normalmente associadas com a mesma em seu estado nativo ou natural. Em uma modalidade, o termo “isolada” refere-se a uma molécula de DNA que está pelo menos parcialmente separada de alguns dos ácidos nucleicos que normalmente flanqueiam a molécula de DNA em seu estado nativo ou natural. Assim, moléculas de DNA fundidas a sequências reguladoras ou codificadoras com as quais não estão normalmente associadas, por exemplo, como o resultado de técnicas recombinantes, são consideradas aqui como isoladas. Tais moléculas são consideradas isoladas quando integradas no cromossomo de uma célula hospedeira ou presente em uma solução de ácido nucléico com outras moléculas de DNA, pelo fato de que não estão em seu estado nativo.

[0025] Muitos números de métodos são conhecidos para isolar emanipular uma molécula de DNA ou fragmento da mesma, divulgados na presente invenção. Por exemplo, a tecnologia de PCR (reação em cadeia da polimerase) pode ser utilizada para amplificar qualquer molécula de DNA de partida e/ou para produzir variantes da molécula original. As moléculas de DNA ou fragmentos das mesmas, também podem ser obtidos através de outras técnicas tal como a síntese diretamente do fragmento através de meios químicos, como é comumente praticado através da utilização de um sintetizador de oligonucleotídeos automatizado.

[0026] Como utilizado aqui, o termo “identidade de sequência” refere-se à extensão até a qual duas sequências de polinucleotídeo alinhadas de forma ótima ou sequências de polipeptídeos alinhadas de forma ótima são idênticas. Um alinhamento ótimo de sequências é criado através do alinhamento manual de duas sequências, por exemplo, uma sequência de referência e outra sequência, para maximizar o número de combinações de nucleotídeos no alinhamento de sequências com inserções, deleções ou espaços de nucleotídeos internos apropriados. Como utilizado aqui, o termo “sequência de referência” refere-se a uma sequência fornecida na forma das sequências de polinucleotí- deo das SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212.

[0027] Como utilizado aqui, o termo “porcentagem de identidadede sequência” ou “porcentagem de identidade” ou “% de identidade” é a fração de identidade vezes 100. A “fração de identidade” para uma sequência alinhada de forma ótima com uma sequência de referência é o número de combinações de nucleotídeos no alinhamento ótimo, dividido pelo número total de nucleotídeos na sequência de referência, por exemplo, o número total de nucleotídeos no comprimento completo da sequência de referência inteira. Assim, uma modalidade da invenção é uma molécula de DNA que compreende uma sequência que quando alinhada de forma ótima com uma sequência de referência, fornecida aqui como as SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212, possui pelo menos aproximadamente 85 porcento de identidade pelo menos apro-ximadamente 90 porcento de identidade pelo menos aproximadamente 95 porcento de identidade, pelo menos aproximadamente 96 porcento de identidade, pelo menos aproximadamente 97 porcento de identidade, pelo menos aproximadamente 98 porcento de identidade ou pelo menos aproximadamente 99 porcento de identidade com a sequência de referência. Em modalidades particulares tais sequências podem ser definidas como possuindo atividade reguladora do gene ou codificando um peptídeo que funciona para localizar um polipeptídeo ligado de forma operacional dentro de uma célula.

Elementos Reguladores

[0028] Um elemento regulador é uma molécula de DNA que possuiatividade reguladora do gene, isto é, uma que possui a capacidade de afetar a transcrição e/ou a tradução de uma molécula de polinucleotí- deo que pode ser transcrita ligada de forma operacional. O termo “atividade reguladora do gene” refere-se assim à capacidade de afetar o padrão de expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional afetando a transcrição e/ou a tradução de tal molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional. Como utilizado aqui, um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição (EXP) pode ser compreendido de elementos de expressão, tais como intensificadores, promotores, líderes e íntrons, ligados de forma operacional. Assim um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição pode ser compreendido, por exemplo, de um promotor ligado de forma operacional a 5’ a uma sequência líder, que por sua vez está ligada de forma opercio- nal a 5’ a uma sequência intrônica. A sequência intrônica pode ser compreendida de uma sequência que começa no ponto da primeira junção de processamento de íntron/éxon da sequência nativa e ainda pode ser compreendida de um pequeno fragmento líder que compreende a segunda junção de processamento de íntron/éxon de forma a fornecer o processamento de íntron/éxon apropriado para facilitar a transcrição e o processamento apropriado do produto de transcrição resultante. Os líderes e os íntrons podem afetar positivamente a transcrição de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional bem como a tradução do RNA transcrito resultante. A molécula de RNA pré-processada compreende líderes e íntrons, que podem afetar o processamento pós-transcrição do RNA transcrito e/ou transporte para fora da molécula de RNA transcrita do núcleo para dentro do citoplasma. Após o processamento pós- transcrição da molécula de RNA transcrita, a sequência líder pode ser mantida como parte do RNA mensageiro final e pode afetar positivamente a tradução da molécula de RNA mensageiro.

[0029] Elementos reguladores tais como promotores, líderes, ín-trons e regiões de término da transcrição são moléculas de DNA que possuem atividade reguladora do gene e desempenham um papel integral na expressão geral dos genes de células vivas. O termo “elemento regulador” refere-se a uma molécula de DNA que possui atividade reguladora do gene, isto é, uma que possui a capacidade de afetar a transcrição e/ou a tradução de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional. Elementos reguladores isolados, tais como promotores e líderes que funcionam em plantas são, portanto, úteis para a modificação dos fenótipos das plantas através dos métodos de engenharia genética.

[0030] Os elementos reguladores podem ser caracterizados porseus efeitos sobre o padrão de expressão (qualitativamente e/ou quan-titativamente), por exemplo, efeitos positivos ou negativos e/ou efeitos constitutivos ou outros tal como seu padrão de expressão que responde de forma temporal, espacial, ao desenvolvimento, ao tecido, ao ambiente, fisiológico, patológico, ao ciclo celular e/ou quimicamente e qualquer combinação dos mesmos, bem como através de indicações quantitativas ou qualitativas. Um promotor é útil como um elemento regulador para a modulação da expressão de uma molécula de polinu- cleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional.

[0031] Como utilizado aqui, um “padrão de expressão gênica” équalquer padrão de transcrição de uma molécula de DNA ligada de forma operacional em uma molécula de RNA transcrita. A molécula de RNA transcrita pode ser traduzida para produzir uma molécula de pro- teína ou pode fornecer uma molécula de RNA antissenso ou outra reguladora, tal como um dsRNA, um tRNA, um rRNA, um miRNA e similares.

[0032] Como utilizado aqui, o termo “expressão de proteína” équalquer padrão de tradução de uma molécula de RNA transcrita em uma molécula de proteína. A expressão de proteína pode ser caracterizada por suas qualidades temporais, espaciais, do desenvolvimento ou morfológicas bem como através de indicações quantitativas ou qualitativas.

[0033] Como utilizado aqui, o termo “promotor” refere-se de formageral a uma molécula de DNA que está envolvida no reconhecimento e na ligação da RNA polimerase II e outras proteínas (fatores de transcrição que atuam em trans) para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser inicialmente isolado da região não traduzida a 5’ (5’ UTR) de uma cópia genômica de um gene. Alternativamente, os promotores podem ser moléculas de DNA produzidas de forma sintética ou manipuladas. Os promotores também podem ser quiméricos, ou seja, um promotor produzido através da fusão de duas ou mais moléculas de DNA heterólogas. Os promotores úteis na prática da presente invenção incluem qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 163 e 169 ou os elementos promotores compreendidos dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212 ou fragmentos ou variantes dos mesmos. Em modalidades específicas da invenção, tais moléculas e quaisquer variantes ou derivados das mesmas como descrito aqui, são adicionalmente definidas como compreendendo atividade promotora, isto é, são capazes de atuar como um promotor em uma célula hospedeira, tal como em uma planta transgênica. Ainda em modalidades específicas adicionais, um fragmento pode ser definido como exibindo atividade promotora possuída pela molécula promotora partindo da qual é derivado ou um fragmento pode compreender um “promotor mínimo” que fornece um nível basal de transcrição e é compreendido de um TATA box ou sequência equivalente para o reconhecimento e para a ligação do complexo da RNA polimerase II para o início da transcrição.

[0034] Em uma modalidade, fragmentos de uma molécula promotora são fornecidos. Os fragmentos de promotores fornecem atividade promotora, como descrito anteriormente e podem ser úteis isoladamente ou em combinação com outros promotores e fragmentos de promotores, tal como na construto de promotores quiméricos. Em modalidades específicas, são fornecidos fragmentos de um promotor que compreendem pelo menos aproximadamente 50, 95, 150, 250, 500, 750 ou pelo menos aproximadamente 1000 nucleotídeos contíguos ou mais longos, de uma molécula de polinucleotídeo que possui atividade promotora divulgada aqui.

[0035] As composições derivadas de qualquer um dos promotoresapresentados como as SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 163 e 169 ou os elementos promotores compreendidos dentro das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212, tais como deleções internas ou a 5’, por exemplo, podem ser produzidos para aumentar ou alterar a expressão, incluindo a remoção de elementos que possuem efeitos positivos ou negativos sobre a expressão; duplicação de elementos que possuem efeitos positivos ou negativos sobre a expressão; e/ou duplicação ou remoção de elementos que possuem efeitos específicos ao tecido ou às células sobre a expressão. As composições derivadas de qualquer um dos promotores apresentados como as SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 163 e 169 ou os elementos promotores compreendidos dentro das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212 compreendidos de deleções a 3’ em que o elemento TATA Box ou sequência equivalente do mesmo e sequência a jusante é removida podem ser utilizados, por exemplo, para produzir elementos intensificadores. Deleções adicionais podem ser produzidas para remover quaisquer elementos que possuem efeitos positivos ou negativos; específicos ao tecido; específicos à célula; ou específicos ao tempo (tal como, mas não limitado aos ritmos circadianos) sobre a expressão. Qualquer um dos promotores apresentados como as SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 163 e 169 ou os elementos promotores compreendidos dentro das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212 e fragmentos ou intensificadores derivados dos mesmos podem ser utilizados para produzir composições de elemento regulador da transcrição quimérico compreendidas de qualquer um dos promotores apresentados como as SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 163 e 169 ou os elementos promotores compreendidos dentro das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212 e os fragmentos ou intensificadores derivados dos mesmos ligados de forma operacional a outros intensificadores e promotores. A eficácia das modificações, duplicações ou deleções descritas aqui sobre os aspectos de expressão desejados de um transgene particular pode ser testada empiricamente em ensaios com plantas estáveis e transitórios, tais como aqueles descritos nos exemplos de trabalho aqui, de forma a validar os resultados, que podem variar dependendo das alterações feitas e da meta da alteração na molécula de partida.

[0036] Como utilizado aqui, o termo “líder” refere-se a uma molécula de DNA isolada da região a 5’ não traduzida (5’ UTR) de uma cópia genômica de um gene e definida de forma geral a um segmento de nucleotídeos entre o sítio de início da transcrição (TSS) e o sítio de início da sequência codificadora de proteína. Alternativamente, os líderes podem ser elementos de DNA produzidos sinteticamente ou manipulados. Um líder pode ser utilizado como um elemento regulador a 5’ para a modulação da expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional. As moléculas líderes podem ser utilizadas com um promotor heterólogo ou com seu promotor nativo. As moléculas promotoras da presente invenção po- dem assim ser ligadas de forma operacional com seu líder nativo ou podem ser ligadas de forma operacional a um líder heterólogo. Os líderes úteis na prática da presente invenção incluem as SEQ ID NOs: 3, 164, 166 e 170 ou o elemento líder compreendido dentro das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212 ou fragmentos ou variantes dos mesmos. Em modalidades específicas, tais sequências podem ser fornecidas definidas como sendo capazes de atuar como um líder em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, uma célula vegetal transgê- nica. Em uma modalidade tais sequências são descodificadas como compreendendo atividade de líder.

[0037] As sequências líderes (5’ UTR) apresentadas como as SEQID NOs: 3, 164, 166 e 170 ou o elemento líder compreendido dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212 pode ser compreendido de elementos reguladores ou pode adotar estruturas secundárias que podem ter um efeito sobre a transcrição ou a tradução de um transgene. As sequências líderes apresentadas como as SEQ ID NOs: 3, 164, 166 e 170 ou o elemento líder compreendido dentro das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212 pode ser utilizado de acordo com a invenção para produzir elementos reguladores quiméricos que afetam a transcrição ou a tradução de um transgene. Em adição, as sequências líderes apresentadas como as SEQ ID NOs: 3, 164, 166 e 170 ou o elemento líder compreendido dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212 pode ser utilizado para produzir sequências líderes quiméricas que afetam a transcrição ou a tradução de um transgene.

[0038] A introdução de um gene estranho dentro de um novo hospedeiro vegetal nem sempre resulta em uma alta expressão do gene que entra. Além disso, se estiver lidando com características complexas, é algumas vezes necessário modular vários genes com padrões de expressão espacialmente ou temporalmente diferentes. Os íntrons podem principalmente fornecer tal modulação. Entretanto, o uso múltiplo do mesmo íntron em uma planta transgênica mostrou exibir desvantagens. Em tais casos é necessário ter uma coleção de elementos de controle básicos para a construto de elementos de DNA recombi- nantes apropriados. Como a coleção disponível de íntrons conhecidos na arte com propriedades intensificadoras da expressão é limitada, são necessárias alternativas.

[0039] As composições derivadas de qualquer um dos íntronsapresentados como as SEQ ID NOs: 4, 165 e 171 ou o elemento intrô- nico compreendido dentro das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212 pode ser compreendido de deleções ou duplicações internas de elementos reguladores em cis; e/ou alterações das sequências a 5’ e 3’ que compreendem as junções de processamento de íntron/éxon podem ser utilizadas para aumentar a expressão ou a especificidade da expressão quando ligadas de forma operacional a um promotor + líder ou promotor quimérico + líder e sequência codificadora. As alterações das regiões a 5’ e 3’ que compreendem a junção de processamento de íntron/éxon também podem ser feitas para reduzir o potencial para introdução de códons de início e de término falsos que são produzidos no produto da transcrição resultante após o processamento e o “splicing” do RNA mensageiro. Os íntrons podem ser testados empiricamente como descrito nos exemplos de trabalho para determinar o efeito do íntron sobre a expressão de um transgene.

[0040] De acordo com a invenção um promotor ou fragmento depromotor pode ser analisado em relação à presença de elementos promotores conhecidos, isto é, características de sequências de DNA, tal como um TATA-box e outros motivos de sítio de ligação de fatores de transcrição conhecidos. A identificação de tais elementos promotores conhecidos pode ser utilizada por um perito na arte para planejar variantes que possuem um padrão de expressão similar ao do promo- tor original.

[0041] Como utilizado aqui, o termo “intensificador” ou “elementointensificador” refere-se a um elemento regulador da transcrição que atua em cis, também conhecido como elemento cis, que confere um aspecto do padrão de expressão geral, mas é geralmente insuficiente sozinho para controlar a transcrição, de uma sequência de polinucleo- tídeo ligada de forma operacional. Ao contrário dos promotores, os elementos intensificadores não incluem usualmente um sítio de início da transcrição (TSS) ou TATA box ou sequência equivalente. Um promotor pode compreender naturalmente um ou mais elementos intensi- ficadores que afetam a transcrição de uma sequência de polinucleotí- deo ligada de forma operacional. Um elemento intensificador isolado também pode ser fusionado com um promotor para produzir um pro- motor.elemento cis quimérico, que confere um aspecto da modulação geral de expressão gênica. Um promotor ou um fragmento de promotor pode compreender um ou mais elementos intensificadores que afetam a transcrição de genes ligados de forma operacional. Acredita-se que elementos intensificadores de promotores se ligam a proteínas de ligação com o DNA e/ou afetam a topologia do DNA, produzindo conformações locais que permitem ou restringem seletivamente o acesso da RNA polimerase ao molde de DNA ou que facilitam a abertura seletiva da dupla hélice no sítio de início da transcrição. Um elemento in- tensificador pode funcionar para se ligar a fatores de transcrição que regulam a transcrição. Alguns elementos intensificadores se ligam a mais de um fator de transcrição e os fatores de transcrição podem interagir com afinidades diferentes com mais de um domínio de intensifi- cador. Os elementos intensificadores podem ser identificados por um número de técnicas, incluindo a análise de deleção, isto é, a deleção de um ou mais nucleotídeos da extremidade a 5’ ou internos a um promotor; análise de proteínas que se ligam ao DNA utilizando DNase I footprinting, interferência de metilação, ensaios de alteração da mobilidade em eletroforese, footprinting genômico in vivo por PCR mediada por ligação e outros ensaios convencionais; ou através da análise de similaridade de sequência de DNA utilizando motivos de elementos cis conhecidos ou elementos intensificadores como uma sequência alvo ou motivo alvo com métodos de comparação de sequências de DNA convencionais, tal como BLAST. A estrutura fina de um domínio inten- sificador pode ser adicionalmente estudada por mutagênese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou através de outros métodos convencionais. Os elementos intensificadores podem ser obtidos através de síntese química ou através do isolamento partindo de elementos reguladores que incluem tais elementos e estes podem ser sintetizados com nucleotídeos flanqueadores adicionais que contêm sítios de enzimas de restrição úteis para facilitar a manipulação de subse- quências. Assim, o planejamento, a construto e o uso de elementos intensificadores de acordo com os métodos divulgados aqui para a modulação da expressão das moléculas de polinucleotídeo que podem ser transcritas ligadas de forma operacional são abrangidos pela presente invenção.

[0042] Em plantas, a inclusão de alguns íntrons nas construtosgênicas leva a um maior acúmulo de mRNA e proteínas em relação a construtos que não possuem o íntron. Este efeito foi chamado de “in-tensificação mediada por íntron” (IME) da expressão gênica (Mascare- nhas e outros, (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920). Os íntrons conhecidos por estimularem a expressão em plantas foram identificados em genes do milho (por exemplo, tubA1, Adh1, Sh1, Ubi1 (Jeon e outros (2000) Plant Physiol. 123:1005-1014; Callis e outros (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Vasil e outros (1989) Plant Physiol. 91:1575-1579; Christiansen e outros (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) e em genes do arroz (por exemplo, salt, tpi: McElroy e outros, Plant Cell 2:163-171 (1990); Xu e outros, Plant Physiol. 106:459-467 (1994)). Similarmente, foi observado que os íntrons de genes de plantas dicotiledôneas como aqueles da petúnia (por exemplo, rbcS), da batata (por exemplo, st- ls1) e de Arabidopsis thaliana (por exemplo, ubq3 e pat1) elevam as taxas de expressão gênica (Dean e outros (1989) Plant Cell 1:201-208; Leon e outros (1991) Plant Physiol. 95:968-972; Norris e outros (1993) Plant Mol Biol 21:895-906; Rose e Last (1997) Plant J.11:455-464). Foi mostrado que deleções ou mutações dentro dos sítios de processamento de um íntron reduzem a expressão gênica, indicando que o processamento poderia ser necessário para IME (Mascarenhas e outros (1990) Plant Mol Biol. 15:913-920; Clancy e Hannah (2002) Plant Physiol. 130:918-929). Entretanto, tal processamento per se não é requerido para certa IME em plantas dicotiledôenas que foi mostrado por mutações pontuais dentro dos sítios de processamento do gene pat1 de A. thaliana (Rose e Beliakoff (2000) Plant Physiol. 122:535-542).

[0043] O aumento da expressão gênica por íntrons não é um fenômeno geral porque algumas inserções intrônicas nos cassetes de expressão recombinante falham em aumentar a expressão (por exemplo, íntrons de genes de dicotiledôneas (gene rbcS da ervilha, gene da faseolina do feijão e o gene stls-1 de Solanum tuberosum) e íntrons de genes do milho (gene adh1 o nono íntron, gene hsp81 o primeiro ín- tron)) (Chee e outros (1986) Gene 41:47-57; Kuhlemeier e outros (1988) Mol Gen Genet 212:405-411; Mascarenhas e outros (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920; Sinibaldi e Mettler (1992) Em WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol 42. Academic Press, New York, pp 229-257; Vancanneyt e outros 1990 Mol. Gen. Genet. 220:245-250). Portanto, nem todo íntron pode ser empregado com a finalidade de manipular o nível de expressão gênica de genes não endógenos ou genes endógenos nas plantas transgênicas. Quais características ou traços de sequências específi- cas têm que estar presentes em uma sequência intrônica com a finalidade de aumentar a taxa de expressão de certo gene não são conhecidos na arte anterior e, portanto, partindo da arte anterior não é possível prever se um certo íntron de planta, quando utilizado de forma heteróloga, causará IME.

[0044] Como utilizado aqui, o termo “quimérica” refere-se a umaúnica molécula de DNA produzida através da fusão de uma primeira molécula de DNA com uma segunda molécula de DNA, em que nem a primeira nem a segunda molécula de DNA seria normalmente encontrada em tal configuração, isto é, fundida uma com a outra. A molécula de DNA quimérica é assim uma nova molécula de DNA não normalmente encontrada de outra maneira na natureza. Como utilizado aqui, o termo “promotor quimérico” refere-se a um promotor produzido através de tal manipulação de moléculas de DNA. Um promotor quimérico pode combinar dois ou mais fragmentos de DNA; um exemplo seria a fusão de um promotor com um elemento intensificador. Assim, o planejamento, a construto e o uso de promotores quiméricos de acordo com os métodos divulgados aqui para a modulação da expressão de moléculas de polinucleotídeo que podem ser transcritas ligadas de forma operacional são abrangidos pela presente invenção.

[0045] Como utilizado aqui, o termo “variante” refere-se a uma segunda molécula de DNA que possui composição similar, mas não idêntica a de uma primeira molécula de DNA e ainda a segunda molécula de DNA ainda mantém a funcionalidade geral, isto é, o mesmo ou um padrão de expressão similar, da primeira molécula de DNA. Um variante pode ser uma versão mais curta ou truncada da primeira molécula de DNA e/ou uma versão alterada da sequência da primeira molécula de DNA, tal como uma com sítios de enzimas de restrição diferentes e/ou deleções, substituições e/ou inserções internas. Um “variante” também pode abranger um elemento regulador que possui uma sequência de nucleotídeos que compreende uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção de um ou mais nucleotídeos de uma sequência de referência, em que o elemento regulador derivado possui mais ou menos ou uma atividade de transcrição ou de tradução equivalente que aquela da molécula reguladora original correspondente. Os “variantes” do elemento regulador também podem abranger variantes que surgem de mutações que ocorrem naturalmente na transformação de bactérias ou células vegetais. Na presente invenção, uma sequência de polinucleotídeo fornecida como as SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212 pode ser utilizada para criar variantes similares na composição, mas não idênticos à sequência de polinucleotídeo do elemento regulador original, enquanto mantém ainda a funcionalidade geral, isto é, mesmo padrão de expressão ou similar, do elemento regulador original. A produção de tais variantes da presente invenção está bem dentro da perícia comum da arte à luz da divulgação e é abrangida dentro do âmbito da presente invenção. “Variantes” de elemento regulador quimérico compreendem os mesmos elementos constituintes que uma sequência de elemento regulador quimérico de referência, mas os elementos constituintes que compreendem o elemento regulador quimérico podem estar ligados de forma operacional através de vários métodos conhecidos na arte tais como, digestão e ligação de enzimas de restrição, clonagem independente de ligação, montagem modular de produtos da PCR durante a amplificação ou síntese química direta do elemento regulador quimérico bem como outros métodos conhecidos na arte. O elemento regulador quimérico “variante” é compreendido do mesmo ou variantes do mesmo, elementos constituintes como a sequência de referência, mas difere na sequência ou sequências que são utilizadas para ligar de forma operacional os elementos constituintes. Na presente invenção, as sequências de polinucleotídeo fornecidas como as SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212 fornecem cada uma uma sequência de referência em que os elementos constituintes da sequência de referência podem ser unidos através de métodos conhecidos na arte e podem consistir de substituições, deleções e/ou inserções de um ou mais nucleotídeos ou mutações que ocorrem naturalmente na transformação bacteriana e de células vegetais.Construtos

[0046] Como utilizado aqui, o termo “construto” significa qualquermolécula de polinucleotídeo recombinante tal como um plasmídeo, um cosmídeo, um vírus, uma molécula de polinucleotídeo que se replica de forma autônoma, um fago ou uma molécula de polinucleotídeo de DNA e RNA de filamento simples ou de filamento duplo linear ou circular, derivada de qualquer origem, capaz de integração genômica ou replicação autônoma, que compreende uma molécula de polinucleotí- deo em que uma ou mais moléculas de polinucleotídeo foram ligadas de uma maneira funcionalmente operacional, isto é, ligadas de forma operacional. Como utilizado aqui, o termo “vetor” significa qualquer construto de polinucleotídeo recombinante que possa ser utilizada para a finalidade de transformação, isto é, a introdução de DNA heterólo- go dentro de uma célula hospedeira. O termo inclui um cassete de expressão isolado de qualquer uma das moléculas mencionadas anteri-ormente.

[0047] Como utilizado aqui, o termo “ligada de forma operacional”refere-se a uma primeira molécula ligada a uma segunda molécula, em que as moléculas estão dispostas de tal maneira que a primeira molécula afeta a função da segunda molécula. As duas moléculas podem ou não fazer parte de uma única molécula contígua ou podem ou não estar adjacentes. Por exemplo, um promotor está ligado de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita se o promotor modular transcrição da molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita de interesse em uma célula. Um líder, por exemplo, está ligado de forma operacional à sequência codificadora quando este for capaz de servir como um líder para o polipeptídeo codificado pela sequência codificadora.

[0048] Os construtos da presente invenção podem ser fornecidas,em uma modalidade, na forma de construtos de DNA de bordas do plasmídeo Ti duplas que possuem as regiões de borda direita (RB ou AGRtu.RB) e de borda esquerda (LB ou AGRtu.LB) do plasmídeo Ti isolado de Agrobacterium tumefaciens que compreende um T-DNA, que junto com as moléculas de transferência fornecidas pelas células de A. tumefaciens, permitem a integração do T-DNA dentro do geno- ma de uma célula vegetal (ver, por exemplo, a Patente US 6.603.061). Os construtos podem conter ainda os segmentos de DNA estruturais do plasmídeo que fornecem a função de replicação e a seleção com antibióticos em células bacterianas, por exemplo, uma origem de repli- cação de Escherichia coli tal como ori322, uma origem de replicação de faixa ampla tal como oriV ou oriRi e uma região codificadora para um marcador selecionável tal como Spec/Strp que codifica Tn7 amino- glicosídeo adeniltransferase (aadA) conferindo resistência à especti- nomicina ou estreptomicina ou um gene marcador selecionável de gentamicina (Gm, Gent). Para a transformação de plantas, a cepa de bactéria hospedeira é frequentemente A. tumefaciens ABI, C58 ou LBA4404; entretanto, outras cepas conhecidas na arte de transformação de plantas podem funcionar na presente invenção.

[0049] Estão disponíveis métodos para a montagem e a introduçãodos construtos dentro de uma célula de tal maneira que a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita seja transcrita em uma molécula de mRNA funcional que é traduzida e expressa na forma de um produto protéico. Para a prática da presente invenção, composições e métodos convencionais para a preparação e para a utilização dos construtos e células hospedeiras podem ser encontrados, por exem- plo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição Volumes 1, 2 e 3 (2000) J.F. Sambrook, D.W. Russell e N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Os métodos para a produção de vetores recom- binantes particularmente adequados para a transformação de plantas incluem, sem limitação, aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos 4.971.908; 4.940.835; 4.769.061; e 4.757.011 em sua totalidade. Estes tipos de vetores também foram revisados na literatura científica (ver, por exemplo, Rodriguez e outros, Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, (1988) e Glick, e outros, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, FL. (1993)). Os vetores típicos úteis para a expressão de ácidos nucleicos em plantas superiores são bem conheci-dos na arte e incluem vetores derivados do plasmídeo indutor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens (Rogers e outros, Methods in Enzymology 153: 253-277 (1987)). Outros vetores recombinantes úteis para a transformação de plantas, incluindo o vetor de controle de transferência pCaMVCN, também foram descritos na literatura científica (ver, por exemplo, Fromm e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828 (1985)).

[0050] Vários elementos reguladores podem ser incluídos em umconstruto incluindo quaisquer daqueles fornecidos aqui. Quaisquer tais elementos reguladores podem ser fornecidos em combinação com outros elementos reguladores. Tais combinações podem ser planejadas ou modificadas para produzir características reguladoras desejáveis. Em uma modalidade, os construtos da presente invenção compreendem pelo menos um elemento regulador ligado de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional a uma molécula de término da transcrição a 3’.

[0051] Os construtos da presente invenção podem incluir qualquerpromotor ou líder fornecido aqui ou conhecido na arte. Por exemplo, um promotor da presente invenção pode estar ligado de forma operacional a um líder a 5’ não traduzido heterólogo tal como um derivado de um gene de proteína de choque térmico (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos 5.659.122 e 5.362.865). Alternativamente, um líder da presente invenção pode estar ligado de forma operacional a um promotor heterólogo tal como o promotor do produto da transcrição 35S do Vírus Mosaico de Couve-Flor (ver, Patente U.S. No 5.352.605). As propriedades de expressão conferidas por tais ligações operacionais de elementos heterólogos não são necessariamente aditivas das propriedades elucidadas de cada promotor e líder, mas ao invés disso são determinadas através de análise empírica da expressão controlada pelo promotor heterólogo e o líder ligados de forma operacional.

[0052] Como utilizado aqui, o termo “íntron” refere-se a uma molécula de DNA que pode ser isolada ou identificada da cópia genômica de um gene e pode ser definido geralmente como uma região processada durante o processamento do mRNA antes da tradução. Alternativamente, um íntron pode ser um elemento de DNA produzido sinteticamente ou manipulado. Um íntron pode conter elementos intensifica- dores que afetam a transcrição de genes ligados de forma operacional. Um íntron pode ser utilizado como um elemento regulador para a modulação da expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional. Um construto de DNA pode compreender um íntron e o íntron pode ou não ser heterólogo em relação à sequência da molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita. Os exemplos de íntrons na arte incluem o íntron da actina do arroz (Patente U.S. No 5.641.876) e o íntron de HSP70 do milho (Patente U.S. No 5.859.347). Os íntrons úteis na prática da presente invenção incluem as SEQ ID NOs: 4, 165 e 171 ou o elemento intrônico compreendido dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212.

[0053] Como utilizado aqui, o termo “molécula de término datranscrição a 3’” ou “3’ UTR” refere-se a uma molécula de DNA que é utilizada durante a transcrição para produzir a região não traduzida a 3’ (3’ UTR) de uma molécula de mRNA. A região não traduzida a 3’ de uma molécula de mRNA pode ser gerada através da clivagem específica e da poliadenilação a 3’, também conhecida como cauda de poliA. Uma 3’ UTR pode estar ligada de forma operacional a e localizada a jusante de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita e pode incluir polinucleotídeos que fornecem um sinal de poliadenilação ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição, o processamento do mRNA ou a expressão gênica. Acredita-se que as caudas de poliA funcionam na estabilidade do mRNA e no início da tradução. Os exemplos de moléculas de término da transcrição a 3’ são a região a 3’ da nopalina sintase (ver, Fraley e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803-4807 (1983)); a região a 3’ de hsp17 do trigo; a região a 3’ da subunidade pequena de rubisco da ervilha; a região a 3’ de E6 do algodão (Patente U.S. No 6.096.950); regiões a 3' divulgadas na WO0011200A2; e a 3’ UTR da coixina (Patente U.S. No 6.635.806).

[0054] As 3’ UTRs encontram tipicamente uso benéfico para a expressão recombinante de genes específicos. Em sistemas de animais, um maquinário de 3’ UTRs foi bem definido (por exemplo, Zhao e outros, Microbiol Mol Biol Rev 63:405-445 (1999); Proudfoot, Nature 322:562-565 (1986); Kim e outros, Biotechnology Progress 19:16201622 (2003); Yonaha e Proudfoot, EMBO J. 19:3770-3777 (2000);Cramer e outros, FEBS Letters 498:179-182 (2001); Kuerstem e Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626-637 (2003)). O término eficiente da transcrição de RNA é necessário para prevenir a transcrição inde- sejada de sequências não relacionadas à característica (a jusante), que podem interferir no desempenho da característica. A disposição de vários cassetes de expressão gênica na proximidade local um dos outros (por exemplo, dentro de um T-DNA) pode causar a supressão da expressão gênica de um ou mais genes no dito construto em comparação a inserções independentes (Padidam e Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001). Isto pode interferir na conquista de níveis adequados de expressão, por exemplo, em casos em que uma forte expressão gênica de todos os cassetes é desejada.

[0055] Em plantas, sequências de sinal de poliadenilação claramente definidas não são conhecidas. Hasegawa e outros, Plant J. 33:1063-1072, (2003)) não foram capazes de identificar sequências de sinal de poliadenilação conservadas tanto em sistemas ambos in vitro quanto in vivo em Nicotiana sylvestris e de determinar o comprimento real do produto de transcrição primário (não poliadenilado). Uma 3’ UTR fraca possui o potencial de gerar leitura completa, o que pode afetar a expressão dos genes localizados nos cassetes de expressão vizinhos (Padidam e Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001)). O controle apropriado do término da transcrição pode prevenir a leitura completa nas sequências (por exemplo, outros cassetes de expressão) localizadas a jusante e pode ainda permitir a reciclagem eficiente da RNA polimerase, para aprimorar a expressão gênica. O término eficiente da transcrição (liberação da RNA Polimerase II do DNA) é um pré-requisito para o reinício da transcrição e dessa maneira afeta dire-tamente o nível de produto de transcrição geral. Subsequente ao término da transcrição, o mRNA maduro é liberado do sítio de síntese e do molde para o citoplasma. Os mRNAs eucarióticos são acumulados nas formas de poli(A) in vivo, de maneira que é difícil detectar os sítios de término da transcrição através de métodos convencionais. Entretanto, a previsão de 3’ UTRs funcionais e eficientes através dos métodos de bioinformática é difícil e não há sequências conservadas que permitiria facilitar a previsão de uma 3’ UTR eficiente.

[0056] Partindo de um ponto de vista prático, é tipicamente benéfico que uma 3’ UTR utilizada em um cassete de transgene possua as características a seguir. A 3’ UTR deve ser capaz de terminar eficientemente e efetivamente a transcrição do transgene e prevenir a leitura completa do produto da transcrição para qualquer sequência de DNA vizinha que pode ser compreendida de outro cassete de transgene como no caso de vários cassetes residindo em um T-DNA ou no DNA cromossômico vizinho dentro do qual o T-DNA foi inserido. A 3’ UTR não deve causar uma redução na atividade de transcrição conferida pelo promotor, pelo líder e pelos íntrons que são utilizados para controlar a expressão do transgene. Na biotecnologia de plantas, a 3’ UTR é frequentemente utilizada para iniciar as reações de amplificação do RNA transcrito de forma inversa extraído da planta transformada e utilizado para (1) avaliar a atividade da transcrição ou a expressão do cassete do transgene uma vez integrado no cromossomo da planta; (2) avaliar o número de cópias de inserções dentro do DNA da planta; e (3) avaliar a zigosidade da semente resultante após o cruzamento. A 3’ UTR é também utilizada nas reações de amplificação do DNA extraído da planta transformada para caracterizar a integridade do cassete inserido.

[0057] As 3’ UTRs úteis no fornecimento da expressão de umtransgene em plantas podem ser identificadas com base na expressão de tags de sequências expressos (ESTs) em bibliotecas de cDNA feitas do RNA mensageiro isolado da semente, da flor e outros tecidos derivados do painço português (Setaria italica (L.) Beauv). As bibliotecas de cDNA são feitas de tecidos isolados de espécies de plantas selecionadas utilizando tecido da flor, semente, folha e raiz. Os cDNAs resultantes são sequenciados utilizando vários métodos de sequenci- amento. Os ESTs são montados em agrupamentos utilizando software de bioinformática tal como clc_ref_assemble_complete versão 2.01.37139 (CLC bio USA, Cambridge, Massachusetts 02142). A abundância do produto da transcrição de cada agrupamento é determinada através da contagem do número de leituras do cDNA para cada agrupamento. As 3’ UTRs identificadas podem ser compreendidas de sequência derivada da sequência do cDNA bem como da sequência derivada do DNA genômico. A sequência de cDNA é utilizada para desenhar iniciadores, que são então utilizados com bibliotecas de Ge- nomeWalkerTM (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construídas seguindo o protocolo do fabricante para clonar a região a 3’ da sequência de DNA genômica correspondente para fornecer uma sequência de término mais longa. A análise da abundância do produto de transcrição relativa através de contagens diretas ou contagens normalizadas de leituras de sequência observadas para cada biblioteca de tecido pode ser utilizada para inferir propriedades em relação aos padrões de expressão. Por exemplo, algumas 3’ UTRs podem ser encontradas em produtos da transcrição observados em maior abundância no tecido de raiz ao contrário da folha. Isto é sugestivo que o produto da transcrição é altamente expresso na raiz e que as propriedades de expressão na raiz podem ser atribuídas à regulação da transcrição do promotor, do líder, dos íntrons ou da 3’ UTR. Um teste empírico das 3’ UTRs identificadas através das propriedades de expressão dentro de órgãos, tecidos ou tipos de células específicos pode resultar na identificação das 3’ UTRs que aumentam a expressão naqueles órgãos, tecidos ou tipos de células específicos.

[0058] Os construtos e os vetores também podem incluir uma sequência codificadora de peptídeo de trânsito que expressa um peptí- deo ligado que é útil para o direcionamento de um produto protéico, particularmente para um cloroplasto, um leucoplasto ou outra organela de plastídeo; mitocôndria; peroxissomo; vacuolo; ou uma localização extracelular. Para destrições do uso de peptídeos de trânsito para o cloroplasto, ver a Patente U.S. No 5.188.642 e a Patente U.S. No 5.728.925. Muitas proteínas localizadas no cloroplasto são expressas partindo de genes nucleares como precursores e são direcionadas para o cloroplasto através de um peptídeo de trânsito para o cloroplasto (CTP). Os exemplos de tais proteínas do cloroplasto isoladas incluem, mas não estão limitados àquelas associadas com a subunidade pequena (SSU) da ribulose-1,5,-bisfosfato carboxilase, ferredoxina, fer- redoxina oxidoredutase, a proteína I e a proteína II do complexo de captação da luz, tiorredoxina F, enolpiruvil shikimati fosfato sintase (EPSPS) e peptídeos de trânsito descritos na Patente U.S. No 7.193.133. Foi demonstrado in vivo e in vitro que proteínas que não são do cloroplasto podem ser direcionadas para o cloroplasto através do uso de fusões de proteínas com um CTP heterólogo e que o CTP é suficiente para direcionar uma proteína para o cloroplasto. Foi mostrado que a incorporação de um peptídeo de trânsito para o cloroplasto adequado tal como o EPSPS CTP de Arabidopsis thaliana (CTP2) (ver, Klee e outros, Mol. Gen. Genet. 210:437-442 (1987)) ou o EPSPS CTP de Petunia hybrida (CTP4) (ver, della-Cioppa e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877 (1986)) direciona sequências de proteínas EPSPS heterólogas para cloroplastos em plantas transgênicas (ver, Patentes U.S. Nos 5.627.061; 5.633.435; e 5.312.910 e EP0218571; EP 189707; EP 508909; e EP 924299).Moléculas de polinucleotídeo que podem ser transcritas

[0059] Como utilizado aqui, o termo “molécula de polinucleotídeoque pode ser transcrita” refere-se a qualquer molécula de DNA capaz de ser transcrita em uma molécula de RNA, incluindo, mas não limitada àquelas que possuem sequências codificadoras de proteínas e àquelas que produzem moléculas de RNA que possuem sequências úteis para a supressão gênica. Um “transgene” refere-se a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga a uma célu- la hospedeira pelo menos em relação a sua localização no genoma e/ou uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita artificialmente incorporada dentro do genoma da célula hospedeira na presente ou em qualquer geração prévia da célula.

[0060] Um promotor da presente invenção pode estar ligado deforma operacional com uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que é heteróloga em relação à molécula promotora. Como utilizado aqui, o termo “heterólogo” refere-se à combinação de duas ou mais moléculas de polinucleotídeo quando tal combinação não for normalmente encontrada na natureza. Por exemplo, as duas moléculas podem ser derivadas de espécies diferentes e/ou as duas moléculas podem ser derivadas de genes diferentes, por exemplo, genes diferentes da mesma espécie ou os mesmos genes de espécies diferentes. Um promotor é assim heterólogo em relação a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de forma operacional se tal combinação não for normalmente encontrada na natureza, isto é, tal molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita não ocorre na-turalmente ligada de forma operacional em combinação com tal molécula promotora.

[0061] A molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita podegeralmente ser qualquer molécula de DNA para a qual a expressão de um produto de transcrição de RNA é desejada. Tal expressão de um produto da transcrição de RNA pode resultar na tradução da molécula de mRNA resultante e assim na expressão da proteína. Alternativamente, por exemplo, uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita pode ser planejada para em última análise causar uma menor expressão de um gene ou uma proteína específica. Em uma modalidade, isto pode ser realizado através da utilização de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que fica orientada na direção antissenso. Sucintamente, uma vez que a molécula de polinu- cleotídeo que pode ser transcrita antissenso é transcrita, o produto de RNA se hibridiza com e sequestra uma molécula de RNA complementar dentro da célula. Esta molécula de RNA em duplex não pode ser traduzida em uma proteína pelo maquinário de tradução da célula e é degradada na célula. Qualquer gene pode ser regulado negativamente desta maneira.

[0062] Assim, uma modalidade da invenção é um elemento regulador da presente invenção, tal como aqueles fornecidos com as SEQ ID NOs: 1-199, 211 e 212, ligado de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita de forma a modular a transcrição da molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita em um nível desejado ou em um padrão desejado quando o construto for integrada no genoma de uma célula vegetal. Em uma modalidade, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita compreende uma região codificadora de proteína de um gene e o promotor afeta a transcrição de uma molécula de RNA que é traduzida e expressa na forma de um produto protéico. Em outra modalidade, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita compreende uma região antis- senso de um gene e o promotor afeta a transcrição de uma molécula de RNA antissenso, RNA de filamento duplo ou outra molécula de RNA inibidora similar com a finalidade de inibir a expressão de uma molécula de RNA específica de interesse em uma célula hospedeira alvo.Genes de Interesse Agronômico

[0063] As moléculas de polinucleotídeo que podem ser transcritaspodem ser genes de interesse agronômico. Como utilizado aqui, o termo “gene de interesse agronômico” refere-se a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que quando expressa emum tecido, uma célula ou um tipo de célula vegetal particular confere uma característica desejável, tal como associada à morfologia, à fisiologia, ao crescimento, ao desenvolvimento, ao rendimento, ao produto, ao perfil nutricional, à resistência a doenças ou pragas e/ou à tolerância ambiental ou química da planta. Os genes de interesse agronômico incluem, mas não estão limitados a, aqueles que codificam uma proteína de rendimento, uma proteína de resistência a estresse, uma proteína de controle do desenvolvimento, uma proteína de diferenciação de tecido, uma proteína de meristema, uma proteína que responde ao ambiente, uma proteína de senescência, uma proteína que responde a hormônios, uma proteína de abscisão, uma proteína de fonte, uma proteína de escoadouro, uma proteína de controle da flor, uma proteína de semente, uma proteína de resistência a herbicidas, uma proteína de resistência a doenças, uma enzima biossintética de ácido graxo, uma enzima biossintética de tocoferol, uma enzima biossintética de aminoácido, uma proteína pesticida ou qualquer outro agente tal como uma molécula antissenso ou de RNAi que se direciona a um gene particular para supressão. O produto de um gene de interesse agronômico pode atuar dentro da planta com a finalidade de causar um efeito sobre a fisiologia ou o metabolismo da planta ou pode atuar como um agente pesticida na dieta de uma praga que se alimenta da planta.

[0064] Em uma modalidade da invenção, um promotor da presenteinvenção é incorporado em um construto de forma que o promotor está ligado de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que é um gene de interesse agronômico. A expressão do gene de interesse agronômico é desejável com a finalidade de conferir uma característica benéfica agronomicamente. Uma característica agronômica benéfica pode ser, por exemplo, mas não está limitada a tolerância a herbicidas, controle de insetos, rendimento modificado, resistência a doenças fúngicas, resistência a vírus, resistência a nematoides, resistência a doenças bacterianas, crescimento e desenvolvimento da planta, produção de amido, produção de óleos modifi- cados, alta produção de óleos, conteúdo modificado de ácidos graxos, alta produção de proteínas, amadurecimento dos frutos, maior nutrição animal e humana, biopolímros, resistência a estresses ambientais, peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis, características de processamento aprimoradas, maior capacidade de digestão, produção de enzimas, aroma, fixação de nitrogênio, produção de sementes híbridas, produção de fibras e produção de biocombustíveis. Os exemplos de genes de interesse agronômico incluem aqueles para resistência a herbicidas (Patentes U.S. Nos 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; e 5.463.175), maior rendimento (Patentes U.S. Nos USRE38.446; 6.716.474;6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211;6.235.971; 6.222.098; e 5.716.837), controle de insetos (Patentes U.S. Nos 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756;6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949;6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573;6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013;5.959.091; 5.942.664; 5.942.658. 5.880.275; 5.763.245; e 5.763.241), resistência a doenças fúngicas (Patentes U.S. Nos 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696;6.121.436; 6.316.407; e 6.506.962), resistência a vírus (Patentes U.S. Nos 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; e 5.304.730), resistência a nematoides (Patente U.S. No 6.228.992), resistência a doenças bacterianas (Patente U.S. No 5.516.671), crescimento e desenvolvimento da planta (Patentes U.S. Nos 6.723.897 e 6.518.488), produção de amido (Patentes U.S. Nos 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), produção de óleos modificados (Patentes U.S. Nos 6.444.876; 6.426.447; e 6.380.462), alta produção de óleos (Patentes U.S. Nos 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; e 6.476.295), conteúdo modificado de ácidos graxos (Patentes U.S. Nos 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; e 6.459.018), alta produção de proteínas (Patente U.S. No 6.380.466), amadurecimento dos frutos (Patente U.S. No 5.512.466), maior nutrição animal e humana (Patentes U.S. Nos 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605; e 6.171.640), biopolímeros (Patentes U.S. Nos US- RE37.543; 6.228.623; e 5.958.745 e 6.946.588), resistência a estres-ses ambientais (Patente U.S. No 6,072,103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (Patentes U.S. Nos 6.812.379; 6.774.283;6.140.075; e 6.080.560), características aprimoradas de processamento (Patente U.S. No 6.476.295), maior capacidade de digestão (Patente U.S. No 6.531.648) baixo teor de rafinose (Patente U.S. No 6.166.292), produção de enzimas industriais (Patente U.S. No 5.543.576), sabor aprimorado (Patente U.S. No 6.011.199), fixação de nitrogênio (Patente U.S. No 5.229.114), produção de sementes híbridas (Patente U.S. No 5.689.041), produção de fibras (Patentes U.S. Nos 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; e 5.869.720) e produção de biocombustíveis (Patente U.S. No 5.998.700).

[0065] Alternativamente, um gene de interesse agronômico podeafetar a característica ou o fenótipo da planta mencionado anteriormente através da codificação de uma molécula de RNA que causa a modulação direcionada da expressão gênica de um gene endógeno, por exemplo, via antissenso (ver, por exemplo, Patente U.S. No 5.107.065); RNA inibidor (“RNAi”, incluindo a modulação da expressão gênica via mecanismos mediados por miRNA, siRNA, siRNA que atua em trans e sRNA em fase, por exemplo, como descrito nos pedidos de patentes publicados US 2006/0200878 e US 2008/0066206 e no pedido de patente US 11/974.469); ou mecanismos mediados por cossu- pressão. O RNA poderia também ser uma molécula de RNA catalítica (por exemplo, uma ribozima ou um riboswitch; ver, por exemplo, US 2006/0200878) projetada para clivar um produto de mRNA endógeno desejado. Assim, qualquer molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica uma molécula de RNA transcrita que afeta um fenótipo importante agronomicamente ou alteração na morfologia de interesse pode ser útil para a prática da presente invenção. Os métodos são conhecidos na arte para o construto e para a introdução de construtos dentro de uma célula de tal maneira que a molécula de po- linucleotídeo que pode ser transcrita é transcrita em uma molécula que é capaz de causar supressão gênica. Por exemplo, a supressão gêni- ca pós-transcrição utilizando um construto com uma molécula de poli- nucleotídeo que pode ser transcrita orientada de forma antissenso para regular a expressão gênica em células vegetais é divulgada nas Patentes U.S. Nos 5.107.065 e 5.759.829 e a supressão pós-transcrição utilizando um construto com uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita orientada de forma senso para regular a expressão gênica em plantas é divulgada nas Patentes U.S. Nos 5.283.184 e 5.231.020. A expressão de um polinucleotídeo que pode ser transcrito em uma célula vegetal também pode ser utilizada para suprimir pragas de plantas que se alimentam da célula vegetal, por exemplo, composições isoladas de pragas de coleópteros (Publicação de Patente U.S. N° US20070124836) e composições isoladas de pragas de nematoi- des (Publicação de Patente U.S. No. US20070250947). As pragas de plantas incluem, mas não estão limitadas a pragas de artrópodes, pragas de nematoides e pragas fúngicas ou microbianas. Os exemplos de moléculas de polinucleotídeo que podem ser transcritas para incorporação dentro dos construtos da presente invenção incluem, por exemplo, moléculas de DNA ou genes de uma espécie sem ser a espécie alvo ou genes que se originam em ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporados nas células receptoras através de méto- dos de engenharia genética ao invés das técnicas de reprodução ou cruzamento clássicas. O tipo de molécula de polinucleotídeo pode incluir, mas não está limitado a, uma molécula de polinucleotídeo que já está presente na célula vegetal, uma molécula de polinucleotídeo de outra planta, uma molécula de polinucleotídeo de um organismo diferente ou uma molécula de polinucleotídeo gerada externamente, tal como uma molécula de polinucleotídeo contendo uma mensagem an- tissenso de um gene ou uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma versão artificial, sintética ou de outra maneira modificada de um transgene.

Marcadores Selecionáveis

[0066] Como utilizado aqui o termo “marcador” refere-se a qualquer molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita cuja expressão ou falta da mesma, pode ser verificada ou classificada de alguma maneira. Os genes marcadores para uso na prática da presente invenção incluem, mas não estão limitados a moléculas de polinucleotídeo que podem ser transcritas que codificam β-glucuronidase (GUS descrita na Patente U.S. No 5.599.670), proteína fluorescente verde e variantes das mesmas (GFP descrita nas Patentes U.S. Nos 5.491.084 e 6.146.826), proteínas que conferem resistência a antibióticos ou proteínas que conferem tolerância a herbicidas. Os marcadores de resistência a antibióticos úteis incluem aqueles que codificam proteínas que conferem resistência à canamicina (nptII), higromicina B (aph IV), es- treptomicina ou espectinomicina (aad, spec/strep) e gentamicina (aac3 e aacC4). Os herbicidas para a tolerância de plantas transgênicas foi demonstrada e o método da presente invenção pode ser aplicado, incluem, mas não estão limitados a: ácido amino-metil-fosfônico, glifosa- to, glufosinato, sulfonilureias, imidazolinonas, bromoxinil, delapon, di- camba, ciclo-hezanediona, inibidores da protoporfirinogênio oxidase e herbicidas de isoxasflutole. As moléculas de polinucleotídeo que po- dem ser transcritas que codificam proteínas envolvidas na tolerância a herbicidas incluem, mas não estão limitadas a, uma molécula de poli- nucleotídeo que pode ser transcrita que codifica 5-enolpiruvilshikimato- 3-fosfato sintase (EPSPS para tolerância ao glifosato descrita nas Patentes U.S. Nos 5.627.061; 5.633.435; 6.040.497; e 5.094.945); uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica uma glifosato oxidorredutase e uma glifosato-N-acetil transferase (GOX descrita na Patente U.S. No 5.463.175; GAT descrita na Publicação de Patente U.S. No. 20030083480 e dicamba mono-oxigenase Publicação de Patente U.S. No. 20030135879); uma molécula de polinucleotí- deo que pode ser transcrita que codifica bromoxinil nitrilase (Bxn para tolerância a Bromoxinil descrita na Patente U.S. No 4.810.648); uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica fitoe- no dessaturase (crtI) descrita em Misawa e outros, Plant Journal 4:833-840 (1993) e Misawa e outros, Plant Journal 6:481-489 (1994) para tolerância a norflurazon; uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica aceto-hidroxiácido sintase (AHAS, também conhecida como ALS) descrita em Sathasiivan e outros, Nucl. Acids Res. 18:2188-2193 (1990) para tolerância a herbicidas de sulfo- nilureia; e o gene bar descrito em DeBlock e outros, EMBO Journal 6:2513-2519 (1987) para tolerância ao glufosinato e bialafos. As moléculas promotoras da presente invenção podem expressar moléculas de polinucleotídeo que podem ser transcritas ligadas que codificam a fosfinotricina acetiltransferase, EPSPS resistente ao glifosato, amino- glicosídeo fosfotransferase, hidroxifenil piruvato desidrogenase, higro- micina fosfotransferase, neomicina fosfotransferase, dalapon desalo- genase, nitrilase resistente a bromoxinil, antranilato sintase, ariloxial- canoato dioxigenases, acetil CoA carboxilase, glifosato oxidorredutase e glifosato-N-acetil transferase.

[0067] Incluídos dentro do termo “marcadores selecionáveis” são ainda genes que codificam um marcador que pode ser secretado cuja secreção pode ser detectada como um meio de identificação ou de seleção para células transformadas. Os exemplos incluem marcadores que codificam um antígeno que pode ser secretado que pode ser identificado por interação com anticorpo ou ainda enzimas que podem ser secretadas que podem ser detectadas de forma catalítica. As proteínas marcadoras secretadas selecionáveis se encaixam em um número de classes, incluindo proteínas que se difundem pequenas que são detectáveis, (por exemplo, por ELISA), enzimas ativas pequenas que são detectáveis em solução extracelular (por exemplo, alfa-amilase, beta-lactamase, fosfinotricina transferase) ou proteínas que são inseridas ou capturadas na parede celular (tais como proteínas que incluem uma sequência líder tal como a encontrada na unidade de expressão de extensão ou proteínas relacionadas com patogênese no tabaco também conhecidas como PR-S do tabaco). Outros genes marcadores selecionáveis possíveis serão evidentes para os peritos na arte e são abrangidos pela presente invenção.

Transformação Celular

[0068] A invenção também está direcionada a um método de produção de células e plantas transformadas que compreendem um promotor ligado de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita.

[0069] O termo “transformação” refere-se à introdução de ácidonucléico dentro de um hospedeiro receptor. Como utilizado aqui, o termo “hospedeiro” refere-se a bactérias, fungos ou planta, incluindo quaisquer células, tecido, órgãos ou progênie das bactérias, fungos ou planta. Tecidos e células vegetais de interesse particular incluem pro- toplastos, calos, raízes, tubérculos, sementes, caules, folhas, plantas jovens, embriões e pólen.

[0070] Como utilizado aqui, o termo “transformado(a)” refere-se a uma célula, um tecido, um órgão ou um organismo dentro do qual uma molécula de polinucleotídeo estranha, tal como um construto, foi introduzida. A molécula de polinucleotídeo introduzida pode ser integrada dentro do DNA genômico da célula, tecido, órgão ou organismo receptor de forma que a molécula de polinucleotídeo introduzida é herdada pela progênie subsequente. Uma célula ou um organismo “transgêni- co” ou “transformado” inclui ainda a progênie da célula ou do organismo e a progênie produzida partindo de um programa de cruzamento que emprega tal organismo transgênico como um parental em um cruzamento e que exibe um fenótipo alterado resultante da presença de uma molécula de polinucleotídeo estranha. O termo “transgênico(a)” refere-se a uma bactéria, um fungo ou uma planta que contém uma ou mais moléculas de ácido polinucléico heterólogas.

[0071] Há muitos métodos para a introdução de moléculas de ácido polinucléico nas células vegetais. O método geralmente compreende as etapas de seleção de uma célula hospedeira adequada, a transformação da célula hospedeira com um vetor recombinante e a obtenção da célula hospedeira transformada. Os métodos adequados incluem infecção bacteriana (por exemplo, Agrobacterium), vetores de cromossomo artificial bacteriano binário, fornecimento direto de DNA (por exemplo, via transformação mediada por PEG, captação de DNA mediada por dessecação/inibição, eletroporação, agitação com fibras de carbureto de silício e aceleração de partículas revestidas com DNA etc. (revisados em Potrykus e outros, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205 (1991)).

[0072] Quaisquer métodos de transformação podem ser utilizadospara transformar uma célula hospedeira com um ou mais promotores e/ou construtos da presente invenção. As células hospedeiras podem ser qualquer célula ou organismo tal como uma célula vegetal, uma célula de alga, alga, célula de fungo, célula de bactéria ou célula de inseto. Os hospedeiros e células transformadas preferidos incluem células de: plantas, Aspergillus, leveduras, insetos, bactérias e algas.

[0073] As plantas transgênicas regeneradas podem ser autopolini-zadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas. Alternativamente, o pólen obtido das plantas transgênicas regeneradas pode ser cruzado com plantas não transgênicas, preferencialmente linhagens intracruzadas de espécies importantes na agronomia. As descrições de métodos de cruzamento que são comumente utilizados para características e plantas de cultivo diferentes podem ser encontradas em um de vários livros de referência, ver, por exemplo, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep e Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2a Edição, Monografia, 16:249 (1987); Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol. 1) e Crop Species Soybean (Vol 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987). De forma inversa, o pólen de plantas não transgênicas pode ser utilizado para polinizar as plantas transgênicas regeneradas.

[0074] As plantas transformadas podem ser analisadas em relaçãoà presença dos genes de interesse e ao nível e/ou perfil de expressão conferido pelos elementos reguladores da presente invenção. Os peritos na arte estão cientes dos vários métodos disponíveis para a análise de plantas transformadas. Por exemplo, os métodos para a análise de plantas incluem, mas não estão limitados a Southern blots ou northern blots, abordagens à base de PCR, análises bioquímicas, métodos de verificação fenotípica, avaliações de campo e ensaios de imu- nodiagnóstico. A expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita pode ser medida utilizando reagentes TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) e métodos que são descritos pelo fabricante e tempos de ciclos de PCR determinados utilizando o TaqMan® Testing Matrix. Alternativamente, os reagentes Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) e os métodos que são descritos pelo fabricante podem ser utilizados para a expressão transgênica.

[0075] As sementes das plantas desta invenção podem ser colhidas de plantas transgênicas férteis e ser utilizadas para crescer gerações de progênie de plantas transformadas desta invenção incluindo linhagens de plantas híbridas que compreendem o construto desta invenção e a expressão de um gene de interesse agronômico.

[0076] A presente invenção fornece ainda partes das plantas dapresente invenção. As partes das plantas, sem limitação, incluem folhas, caules, raízes, tubérculos, sementes endosperma, óvulo e pólen. A invenção inclui e fornece ainda células vegetais transformadas que compreendem uma molécula de ácido nucléico da presente invenção.

[0077] A planta transgênica pode passar a molécula de polinucleo-tídeo transgênica para sua progênie. A progênie inclui qualquer parte regenerável da planta ou semente que compreende o transgene derivado de uma planta ancestral. A planta transgênica é preferencialmente homozigota em relação à molécula de polinucleotídeo transformada e transmite tal sequência a toda a prole como um resultado da reprodução sexual. A progênie pode ser crescida partindo de sementes produzidas pela planta transgênica. Estas plantas adicionais podem então ser autopolinizadas para gerar uma linhagem de cruzamento verdadeiro de plantas. A progênie destas plantas é avaliada, entre outras coisas, em relação à expressão gênica. A expressão gênica pode ser detectada através de vários métodos comuns tais como western blotting, northern blotting, imunoprecipitação e ELISA.

[0078] Tendo agora descrito de forma geral a invenção, a mesmaserá mais facilmente entendida através de referência aos exemplos a seguir que são fornecidos com a finalidade de ilustração e não são pretendidos como sendo limitantes da presente invenção, a não ser que seja especificado. Deve ser considerado pelos peritos na arte que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelos inventores como funcionando bem na prática da invenção. Entretanto, os peritos na arte devem, à luz da presente di-vulgação, considerar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção, portanto, todo o assunto apresentado ou mostrado nos desenhos em anexo deve ser interpretado como ilustrativo e não em um sentido limi- tante.EXEMPLOSExemplo 1: Identificação e Clonagem de Elementos Reguladores

[0079] Novos elementos reguladores da transcrição ou sequênciasde grupos de elementos de expressão reguladores da transcrição (EXP) foram identificados e isolados partindo do DNA genômico da espécie dicotiledônea Cucumis melo WSH-39-1070AN.

[0080] Os elementos reguladores da transcrição foram selecionados com base nos dados de microarranjos proprietários e públicos derivados de experimentos de obtenção do perfil de transcrição conduzidos na soja (Glycine max) e Arabidopsis bem como pesquisas baseadas na homologia utilizando sequências de dicotiledôneas como busca contra sequências de Cucumis melo proprietárias.

[0081] Utilizando as sequências identificadas, uma análise debioinformática foi conduzida para identificar elementos reguladores dentro do DNA amplificado, seguida pela identificação do sítio de início da transcrição (TSS) e qualquer bidirecionalidade, íntrons ou sequência codificadora a montante presente na sequência. Utilizando os resultados desta análise, os elementos reguladores foram definidos den- tro das sequências de DNA e iniciadores foram desenhados para amplificar os elementos reguladores. A molécula de DNA correspondente para cada elemento regulador foi amplificada utilizando condições de reação em cadeia da polimerase padronizadas com iniciadores contendo sítios de enzimas de restrição únicos e DNA genômico isolado de Cucumis melo. Os fragmentos de DNA resultantes foram ligados dentro de vetores de expressão de plantas de base utilizando a digestão com enzimas de restrição padronizada de sítios de restrição compatíveis e métodos de ligação do DNA.

[0082] A análise do elemento regulador TSS e junções de processamento de íntron/éxon pode ser realizada utilizando protoplastos de planta transformados. Sucintamente, os protoplastos são transformados com os vetores de expressão em plantas que compreendem os fragmentos de DNA clonados ligados de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga e o 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Versão 2.0 (In- vtrogen, Carlsbad, California 92008) é utilizado para confirmar o elemento regulador TSS e as junções de processamento de íntron/éxon através da análise da sequência dos produtos de transcrição de mRNA produzidos pela mesma.

[0083] As sequências que codificam grupos de elementos de expressão reguladores da transcrição (EXP) de ubiquitina 1 foram analisadas como descrito anteriormente e cada um dos grupos de elementos de expressão reguladores da transcrição (“EXP’s”) foi decomposto nos promotores, líderes e íntrons correspondentes que compreendem cada grupo de elementos de expressão reguladores da transcrição. As sequências dos grupos de elementos de expressão reguladores da transcrição (“EXP’s”) da ubiquitina 1 identificados são fornecidas aqui como as SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 9 e 11 e são listados na Tabela 1 abaixo. Os promotores da ubiquitina 1 correspondentes são fornecidos aqui como as SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10 e 12. O líder e o íntron da ubi- quitina 1 são fornecidos aqui como as SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente.

[0084] As sequências que codificam outros grupos de elementosde expressão reguladores da transcrição de Cucumis ou sequências EXP que são compreendidas de um elemento promotor, ligado de forma operacional a um elemento líder; ou um elemento promotor, ligado de forma operacional a um elemento líder e um elemento intrônico ou um elemento promotor, ligado de forma operacional a um elemento líder, ligado de forma operacional a um elemento intrônico, ligado de forma operacional a um elemento líder são fornecidas como as SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116,117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130,131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144,145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 159, 162,167, 168, 172, 175, 176, 177, 178, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 189,190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 211 e 212 e também estão listadas na Tabela 1 abaixo. Os elementos promotores adicionais são fornecidos como as SEQ ID NOs: 163 e 169. Os elementos líderes adicionais são fornecidos como as SEQ ID NOs: 164, 166 e 170. Os elementos intrônicos adicionais são fornecidos como as SEQ ID NOs: 165 e 171. Elementos em que um promotor está ligado de forma operacional a um elemento líder são fornecidos como as SEQ ID NOs: 157, 160, 173, 179 e 186. Os elementos em que um íntron está ligadi de forma operacional a um elemento líder são fornecidos como as SEQ ID NOs: 158, 161, 174, 180 e 187. Em relação ao subconjunto de sequências fornecidas como as SEQ ID NOs: 13 até 199, 211 e 212, estas sequências foram selecionadas e clonadas com base nos resultados dos experimentos tal como a obtenção de perfis do produto da transcrição ou a expressão controlada pelos promotores de genes homólogos de uma espécie diferente sugerindo padrões de expressão desejáveis tal como expressão constitutiva, expressão na raiz, expressão acima do solo ou expressão em sementes. A atividade real conferida pelas sequências de Cucumis é determinada empiricamente e não é necessariamente a mesma que aquela de um elemento regulador derivado de um gene homólogo de uma espécie sem ser Cucu- mis melo quando utilizado em uma célula hospedeira vegetal transformada e uma planta transgênica inteira.

[0085] Como mostrado na Tabela 1, por exemplo, o grupo de elemento de expressão regulador da transcrição (EXP) denominado EXP- CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), com componentes isolados de C. melo, compreende um elemento promotor de tamanho de 2068 pares de bases, P-CUCme.Ubq1-1:1:15 (SEQ ID NO: 2), ligado de forma operacional 5’ a um elemento líder, L-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3), ligado de forma operacional 5’ a um elemento intrônico, I- CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 4). O grupo de elemento de expressão regulador da transcrição (EXP) denominado EXP- CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5), com componentes isolados de C. melo, compreende um elemento promotor de 1459 pb, P- CUCme.Ubq1-1:1:16 (SEQ ID NO: 6), ligado de forma operacional 5’ a um elemento líder, L-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3), ligado de forma operacional 5’ a um elemento intrônico, I-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 4). O grupo de elemento de expressão regulador da transcrição (EXP) denominado EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7), com componentes isolados de C. melo, compreende um elemento promotor de 964 pb, P-CUCme.Ubq1-1:1:17 (SEQ ID NO: 8), ligado de forma operacional 5’ a um elemento líder, L-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3), ligado de forma operacional 5’ a um elemento intrônico, I- CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 4). O grupo de elemento de expressão regulador da transcrição (EXP) denominado EXP- CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9), com componentes isolados de C. melo, compreende um elemento promotor de 479 pb, P-CUCme.Ubq1- 1:1:18 (SEQ ID NO: 10), ligado de forma operacional 5’ a um elemento líder, L-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3), ligado de forma operacional 5’ a um elemento intrônico, I-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 4). O grupo de elemento de expressão regulador da transcrição (EXP) denominado EXP-CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11), com componentes isolados de C. melo, compreende um elemento promotor de 173 pb, P-CUCme.Ubq1-1:1:19 (SEQ ID NO: 12), ligado de forma operacional 5’ a um elemento líder, L-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3), ligado de forma operacional 5’ a um elemento intrônico, I- CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 4).

[0086] Um alinhamento das sequências promotoras da ubiquitina 1é fornecido nas Figs. 1a-1f. Os elementos promotores, P- CUCme.Ubq1-1:1:16 (SEQ ID NO: 6), P-CUCme.Ubq1-1:1:17 (SEQ ID NO: 8), P-CUCme.Ubq1-1:1:18 (SEQ ID NO: 10) e P-CUCme.Ubq1- 1:1:19 (SEQ ID NO: 12) foram construídos através da introdução de comprimentos variáveis de deleções partindo da extremidade a 5’ do promotor, P-CUCme.Ubq1-1:1:15 (SEQ ID NO: 2).Exemplo 2: Análise de Elementos Reguladores Que Regulam GUS em Protoplastos de Cotilédone de Soja

[0087] Os protoplastos de cotilédone de soja foram transformadoscom vetores de expressão em plantas contendo um grupo de elementos de expressão reguladores da transcrição de teste que controlam a expressão do transgene da β-glucuronidase (GUS) e comparados com a expressão de GUS nos protoplastos foliares em que a expressão de GUS é controlada por promotores constitutivos conhecidos.

[0088] A expressão de um transgene controlada por EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), EXP-CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5), EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7), EXP-CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9) e EXP-CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11) foi comparada com a expressão partindo de promotores constitutivos conhecidos. Cada vetor de expressão em plantas era compreendido de uma região de borda direita de Agrobacterium tumefaciens, um primeiro cassete de transgene compreendido de uma sequência EXP ou promotor constitutivo conhecido ligado de forma operacional a 5’ de uma sequência codificadora da β-glucuronidase (GUS, SEQ ID NO: 206) contendo um íntron que pode ser processado controlado par- tindo do gene ST-LS1 específico ao tecido que pode ser induzido pela luz da batata (Genbank Accession: X04753), ligado de forma operacional a 5’ a uma região de término a 3’ do gene E6 de Gossypium bar- badense (T-Gb.E6-3b:1:1, SEQ ID NO: 204), do gene RbcS2-E9 de Pisum sativum (T-Ps.RbcS2-E9-1:1:6, SEQ ID NO: 203) ou do gene FbLate-2 de Gossypium barbadense (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205); um segundo cassete de seleção de transgene utilizado para a seleção de células vegetais transformadas que conferem resistência ao herbicida glifosato (controlada pelo promtor da Actina 7 de Arabi- dopsis) ou ao antibiótico, canamicina e uma região de borda esquerda de A. tumefaciens. Um vetor de expressão em plantas de controle sem promotor (pMON124912) serviu como um controle negativo para a ex-pressão. O teste anterior e os grupos de elementos de expressão constitutivos foram clonados nos vetores de expressão em plantas como mostrado na Tabela 2 a seguir.Tabela 2. Vetores de expressão em plantas e grupo de elemento de expressão correspondente e 3’ UTR.

[0089] Dois plasmídeos, para uso na cotransformação e normalização dos dados, também foram construídos. Um plasmídeo de con- trole da transformação era compreendido de um promotor constitutivo, que controla a expressão da sequência codificadora da luciferase do vaga-lume (Photinus piralis) (FLuc, SEQ ID NO: 207), ligado de forma operacional a 5’ a uma região de término a 3’ do gene da nopalina sin- tase de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 209). O outro plasmídeo de controle da transformação era compreendido de um promotor constitutivo, que controla a expressão da sequência codificadora da luciferase de sea pansy (Renilla reniformis) (RLuc, SEQ ID NO: 208), ligado de forma operacional a 5’ a uma região de término a 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tu- mefaciens.

[0090] Os vetores de expressão em plantas, pMON80585,pMON109584, pMON118756, pMON124912, pMON138776,pMON138777, pMON138778, pMON138779 e pMON138780 foramutilizados para transformar células de protoplastos de cotilédone de soja utilizando métodos de transformação com PEG. As células de protoplastos foram transformadas com quantidades equimolares de cada um dos dois plasmídeos de controle da transformação e um vetor de expressão em plantas de teste. A atividade da GUS e da luciferase foi analisada. Medidas tanto da GUS quanto da luciferase foram conduzidas colocando alíquotas de uma preparação de células lisadas transformadas como citando anteriormente em duas bandejas de poços pequenos diferentes. Uma bandeja foi utilizada para medidas de GUS e uma segunda bandeja foi utilizada para realizar um ensaio dual da luciferase utilizando o sistema de ensaio repórter da luciferase dual (Promega Corp., Madison, WI; ver, por exemplo, Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02). As medidas das amostras foram feitas utilizando 3 ou 4 réplicas por transformação. Os valores médios de GUS e luciferase são apresentados na Tabela 3 a seguir.Tabela 3. Valores médios de expressão de GUS e luciferase ex- pressão e proporções de GUS/luciferase.

[0091] Para comparar a atividade relativa d e cada promo tor nosprotoplastos de cotilédone de soja, os valores de GUS foram expres-sos como uma proporção de atividade de GUS em relação à luciferase e normalizados em relação aos níveis de expressão observados para os grupos de elementos de expressão constitutiva, EXP-At.Act7:1:11 e EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3. A Tabela 4 a seguir mostra as proporções de GUS em relação à luciferase de vaga-lume (FLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e a EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3. A Tabela 5 a seguir mostra as proporções de GUS em relação à luciferase de renilla (RLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e a EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.Tabela 4. Proporções de GUS em relação à luciferase de vaga- lume (FLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e a EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Tabela 5. Proporções de GUS em relação à luciferase de renilla (RLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e a EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

[0092] Como pode ser observado nas Tabelas 4 e 5 anteriores, cada um dos grupos de elementos de expressão EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), EXP-CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5), EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7), EXP-CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9) e EXP-CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11) demonstrou a capacidade de controlar a expressão transgênica em protoplastos de cotilédone de soja. Os níveis de expressão eram maiores que aqueles de EXP- At.Act7:1:11 e eram 2,9 até 5,8 (FLuc) ou 3 até 7 (RLuc) vezes maiores que aqueles para EXP-At.Act7:1:11 neste ensaio. A expressão era equi-valente ou maior que a expressão observada para EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3. Os níveis de expressão eram 0,8 até 1,7 (FLuc) ou 1 até 2,4 (RLuc) vezes maiores que a expressão observada para EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.Exemplo 3: Análise de Elementos Reguladores Que Controlam GUS em Folhas e Raízes de Soja Bombardeadas.

[0093] As folhas e raízes de soja foram transformadas com vetoresde expressão em plantas contendo um grupo de elementos de expressão reguladores da transcrição de teste que controla a expressão do transgene da β-glucuronidase (GUS) e comparado com a expressão de GUS nas raízes e nas folhas em que a expressão de GUS é controlada por promotores constitutivos conhecidos.

[0094] A expressão de um transgene controlada por EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), EXP-CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5), EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7), EXP-CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9) e EXP-CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11) foi comparada com a expressão partindo de promotores constitutivos conhecidos nas folhas e raízes de soja bombardeadas com partículas. Os vetores de expressão em plantas utilizados para a transformação de folhas e raízes eram os mesmos que aqueles apresentados na Tabela 2 do Exemplo 2 anterior.

[0095] Os vetores de expressão em plantas, pMON80585, pMON109584, pMON118756, pMON124912, pMON138776,pMON138777, pMON138778, pMON138779 e pMON138780 foramutilizados para transformar folhas e raízes de soja utilizando métodos de transformação por bombardeio de partículas.

[0096] Sucintamente, sementes de soja A3244 tiveram sua superfície esterilizada e foi permitido que germinassem em bandejas com um fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão. Após apro-ximadamente 13 dias, o tecido foliar e radicular foi coletado sob condi-ções estéreis partindo das plantas jovens e utilizado para o bombardeio. As amostras de tecido foram colocadas aleatoriamente sobre uma placa de petri contendo meio de cultura de planta. Dez microgra- mas de DNA plasmideal foram utilizados para revestir partículas de ouro de 0,6 micron (# de Catálogo 165-2262 Bio-Rad, Hercules, CA) para bombardeio. Os microcarreadores foram carregados com partículas de ouro revestidas com DNA (# de Catálogo 165-2335 Bio-Rad, Hercules CA). Uma pistola de biolística PDS 1000/He foi utilizada para a transformação (# de Catálogo 165-2257 Bio-Rad, Hercules CA). Foi permitido que os tecidos radiculares e foliares bombardeados fossem incubados na escuridão durante 24 horas a 26 graus Celsius. Após esta incubação durante toda a noite, os tecidos foramcorados em solução para expressão de GUS durante a noite a 37 graus Celsius. Após a coloração durante toda a noite, os tecidos foram embebidos em etanol a 70% durante toda a noite para remover clorofila e revelar a coloração de GUS. Os tecidos foram então fotografados e uma escala de classificação de “0”, “+” até “++++++” refletindo o nível de expressão de GUS é atribuída a cada construção (0- sem expressão, + até ++++++ - baixa até alta, respectivamente).

[0097] A expressão do transgene GUS demonstrada em cada tecido é utilizada para inferir o nível potencial relativo e a especificidade de capacidade de cada elemento de controlar a expressão transgênica em plantas de milho transformadas de forma estável. As classificações de expressão média de GUS são fornecidas na Tabela 6 a seguir.Tabela 6. Classificações da expressão de GUS para folha e raiz bombardeadas com partículas.

[0098] Como pode ser observado na Tabela 6 acima, cada um dosgrupos de elementos de expressão EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), EXP-CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5), EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7), EXP-CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9) e EXP-CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11) demonstrou a capacidade de controlar a expressão transgênica em tecidos foliares e radi- culares transformados por bombardeio.Exemplo 4: Análise dos Elementos Reguladores Que Controlam GUS em Protoplastos de Cotilédone de Soja

[0099] Os protoplastos de cotilédone de soja foram transformadoscom vetores de expressão em plantas contendo um grupo de elementos de expressão reguladores da transcrição de teste que controla a expressão do transgene β-glucuronidase (GUS) e comparados com a expressão de GUS em protoplastos de folha em que a expressão de GUS é controlada por promotores constitutivos conhecidos.

[00100] A expressão de um transgene controlada por P-CUCme.1- 1:1:1rc (SEQ ID NO: 155), P-CUCme.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 14), P- CUCme.3-1:1:3 (SEQ ID NO: 15), EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156), EXP-CUCme.5:1:1 (SEQ ID NO: 159), P-CUCme.6-1:1:1 (SEQ ID NO: 18), P-CUCme.8-1:1:2 (SEQ ID NO: 19), P-CUCme.9-1:1:2 (SEQ ID NO: 20), P-CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21), EXP-CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162), P-CUCme.15-1:1:2 (SEQ ID NO: 23), P-CUCme.16a-1:1:2 (SEQ ID NO: 24), P-CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26), P-CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO: 27), P-CUCme.19- 1:1:3 (SEQ ID NO: 167), P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211), P-CUCme.21-1:1:1 (SEQ ID NO: 30), P-CUCme.22-1:1:3 (SEQ ID NO: 31), EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168), P-CUCme.26-1:1:2 (SEQ ID NO: 33), P-CUCme.28-1:1:2 (SEQ ID NO: 34) e EXP-CUCme.29:1:2 (SEQ ID NO: 212) foi comparada com a expressão par-tindo de grupos de elementos de expressão constitutiva conhecidos. Cada vetor de expressão em plantas era compreendido de uma região de borda direita de Agrobacterium tumefaciens, um primeiro cassete de transgene compreendido de um promotor de teste ou um promotor constitutivo conhecido ligado de forma operacional a 5’ com uma se-quência codificadora de β-glucuronidase (GUS, SEQ ID NO: 206) con-tendo um íntron que pode ser processado derivado do gene ST-LS1 específico ao tecido que pode ser induzido pela luz da batata (Acesso do Genbank: X04753), ligado de forma operacional a 5’ a uma região de término a 3’ do gene E6 de Gossypium barbadense (T-Gb.E6- 3b:1:1, SEQ ID NO: 204), do gene RbcS2-E9 de Pisum sativum (T- Ps.RbcS2-E9-1:1:6, SEQ ID NO: 203) ou do gene FbLate-2 de Gos- sypium barbadense (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205); um segundo cassete de seleção de transgene utilizado para a seleção de células vegetais transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato (controlada pelo promotor da Actina 7 de Arabidopsis) ou ao antibióti- co, canamicina e uma região de borda esquerda de A. tumefaciens. Um vetor de expressão em plantas de controle sem promotor (pMON124912) serviu como um controle negativo para a expressão. Os grupos de elementos de expressão de teste e constitutivos descritos anteriormente foram clonados nos vetores de expressão em plantas como mostrado na Tabela 7 a seguir.Tabela 7. Vetores de expressão em plantas e grupo de elemento de expressão correspondente e 3’ UTR.

[00101] Dois plasmídeos, para uso na cotransformação e na normali- zação dos dados, também foram construídos. Um plasmídeo de controle da transformação era compreendido de um promotor constitutivo, que controla a expressão da sequência codificadora da luciferase de vaga- lume (Photinus piralis) (FLuc, SEQ ID NO: 207), ligado de forma operaci- onal a 5’ a uma região de término a 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 209). O outro plasmídeo de controle da transformação era compreendido de um promotor constitutivo, que controla a expressão da sequência codificado-ra da luciferase de sea pansy (Renilla reniformis) (RLuc, SEQ ID NO: 208), ligado de forma operacional a 5’ a uma região de término a 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens.

[00102] Os vetores de expressão em plantas, pMON80585, pMON109584, pMON118756, pMON124912, pMON140818,pMON140819, pMON140820, pMON140821, pMON140822,pMON140823, pMON140824, pMON140825, pMON140826,pMON140827, pMON140828, pMON140829, pMON140830,pMON140831, pMON140832, pMON140833, pMON140834,pMON140835, pMON140836, pMON140837, pMON140838 e pMON140839 foram utilizados para transformar células de protoplastos de cotilédone de soja utilizando métodos de transformação com PEG. As células de protoplasto foram transformadas com quantidades equimola- res de cada um dos dois plasmídeos de controle da transformação e um vetor de expressão em plantas de teste. A atividade da GUS e da lucife-rase foi analisada. Medidas tanto da GUS quanto da luciferase foram conduzidas colocando alíquotas de uma prepração de células lisadas de células transformadas como descrito anteriormente dentro de duas ban- dejas de poços pequenos diferentes. Uma bandeja foi utilizada para me-didas de GUS e uma segunda bandeja foi utilizada para realizar um en-saio da luciferase dual utilizando o sistema de ensaio repórter da lucife-rase dual (Promega Corp., Madison, WI; ver, por exemplo, Promega No-tes Magazine, No: 57, 1996, p.02). As medidas das amostras foram feitas utilizando 3 ou 4 réplicas por transformação. Os valores médios da Gus e da luciferase são apresentados na Tabela 8 a seguir.Tabela 8. Valores de expressão médios de Gus e luciferase e pro- porções de GUS/luciferase.

[00103] Para comparar a atividade relativa de cada promotor nos protoplastos de cotilédone de soja, os valores de GUS foram expressos na forma de uma proporção de atividade de GUS em relação à luciferase e normalizados em relação aos níveis de expressão observados para os grupos de elementos de expressão constitutiva, EXP- At.Act7:1:11 e EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3. A Tabela 9 a seguir mostra as proporções de GUS em relação à luciferase de vaga-lume (FLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3. A Tabela 10 a seguir mostra as proporções de GUS em relação à luciferase de renilla (RLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.Tabela 9. Proporções de GUS em relação à luciferase de vaga- lume (FLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Tabela 10. Proporções de GUS em relação à luciferase de renilla (RLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

[00104] Como pode ser observado nas Tabelas 9 e 10, a maioria dos grupos de elementos de expressão testados, demonstrou a capacidade de controlar a expressão transgênica em células de protoplas- tos de cotilédone de soja. Um grupo de elemento de expressão, EXP- CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156) demonstrou níveis de expressão transgênica mais altos que aqueles de EXP-At.Act7:1:11 neste ensaio. Exemplo 5: Análise de Elementos Reguladores Que Controlam GUS em Folhas e Raízes de Soja Bombardeadas.

[00105] As folhas e as raízes de soja foram transformadas com vetores de expressão em plantas contendo um grupo de elementos de expressão reguladores da transcrição de teste que controla a expressão do transgene da β-glucuronidase (GUS) e comparadas com a expressão de GUS nas raízes e nas folhas em que expressão de GUS é controlada por promotores constitutivos conhecidos.

[00106] A expressão de um transgene controlado por P-CUCme.1- 1:1:1rc (SEQ ID NO: 155), P-CUCme.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 14), P- CUCme.3-1:1:3 (SEQ ID NO: 15), EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156), EXP-CUCme.5:1:1 (SEQ ID NO: 159), P-CUCme.6-1:1:1 (SEQ ID NO: 18), P-CUCme.8-1:1:2 (SEQ ID NO: 19), P-CUCme.9-1:1:2 (SEQ ID NO: 20), P-CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21), EXP-CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162), P-CUCme.15-1:1:2 (SEQ ID NO: 23), P-CUCme.16a-1:1:2 (SEQ ID NO: 24), P-CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26), P-CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO: 27), P-CUCme.19- 1:1:3 (SEQ ID NO: 167), P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211), P-CUCme.21-1:1:1 (SEQ ID NO: 30), P-CUCme.22-1:1:3 (SEQ ID NO: 31), EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168), P-CUCme.26-1:1:2 (SEQ ID NO: 33), P-CUCme.28-1:1:2 (SEQ ID NO: 34) e EXP-CUCme.29:1:2 (SEQ ID NO: 212) foi comparada com a expressão de grupos de elementos de expressão constitutiva conhecidos nas folhas e nas raízes de soja bombardeadas. Os vetores de expressão em plantas utilizados para a transformação de folhas e raízes eram os mesmos que os apresentados na Tabela 7 do Exemplo 4 acima.

[00107] Os vetores de expressão em plantas, pMON80585, pMON109584, pMON118756, pMON124912, pMON140818, pMON140839 foram utilizados para transformar folhas e raízes de soja utilizando métodos de transformação por bombardeio de partículas.

[00108] Sucintamente, sementes de soja A3244 tiveram sua superfície esterilizada e foi permitido que germinassem em bandejas com um fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão. Após apro-ximadamente 13 dias, o tecido foliar e radicular foi coletado sob condi- ções estéreis das plantas jovens e utilizado para bombardeio. As amostras de tecido foram colocadas aleatoriamente sobre uma placa de petri contendo meio de cultura de planta. Dez microgramas de DNA plasmideal foram utilizados para revestir partículas de ouro de 0,6 micron (# de Catálogo 165-2262 Bio-Rad, Hercules, CA) para bombardeio. Os microcarreadores foram carregados com as partículas de ouro revestidas com DNA (# de Catálogo 165-2335 Bio-Rad, Hercules CA). Uma pistola de biolística PDS 1000/He foi utilizada para a transformação (# de Catálogo 165-2257 Bio-Rad, Hercules CA). Foi permitido que os tecidos radiculares e foliares fossem incubados na escuridão durante 24 horas a 26 graus Celsius. Após esta incubação durante toda a noite, os tecidos foram corados em solução para expressão de GUS durante a noite a 37 graus Celsius. Após a coloração durante toda a noite, os tecidos foram embebidos em etanol a 70% durante toda a noite para remover clorofila e revelar a coloração de GUS. Os tecidos foram então fotografados e uma escala de classificação de “0”, “+” até “++++++” refletindo o nível de expressão de GUS é atribuída a cada construção (0- sem expressão, + até ++++++ - baixa até alta, respectivamente).

[00109] A expressão do transgene GUS demonstrada em cada tecido é utilizada para inferir o nível potencial e a especificidade da capacidade de cada elemento de controlar a expressão transgênica em plantas de milho transformadas de forma estável. As classificações de expressão média de GUS são fornecidas na Tabela 11 a seguir.Tabela 11. Classificações da expressão de GUS para folha e raiz bombardeadas com partículas.

[00110] Como pode ser observad o na Tabe a 11 acima, todos me-nos um dos grupos de elementos de expressão demonstraram a capa- cidade de controlar a expressão transgênica no tecido foliar e radicular de soja bombardeado com partículas. Dois grupos de elementos de expressão, P-CUCme.28-1:1:2 (SEQ ID NO: 34) e EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156) demonstram níveis de expressão similares ou supe-riores em relação à expressão controlada por EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 neste ensaio.Exemplo 6: Análise de Elementos Reguladores Que Controlam GUS em Protoplasto de Cotilédone de Soja Utilizando Amplicons do Cassete de Transgene

[00111] Os protoplastos de cotilédone de soja foram transformados com amplicons do cassete de transgene contendo um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição que controla a expressão do transgens da β-glucuronidase (GUS) e comparados com a expressão de GUS nos protoplastos foliares em que a expressão de GUS é controlada por promotores constitutivos conhecidos. Os amplicons do cassete de transgene eram compreendidos de uma sequência de EXP, ligada de forma operacional a uma sequência codificadora de GUS (GUS, SEQ ID NO: 206), ligada de forma operacional a uma 3’ UTR (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205). A expressão média de GUS foi comparada com os elementos de EXP de controle, P-CaMV.35S- enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 210) e EXP-At.Atntt1:1:2 (SEQ ID NO: 200).

[00112] Um plasmídeo, para uso na cotransformação e na normalização dos dados também foi utilizado de uma maneira similar àquela descrita anteriormente no Exemplo 2. O plasmídeo de controle da transformação era compreendido de um promotor constitutivo, que controla a expressão da sequência codificadora da luciferase de vaga-lume (Pho- tinus piralis) (FLuc, SEQ ID NO: 205), ligado de forma operacional a 5’ a uma região de término a 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 209).

[00113] A Tabela 12 a seguir mostra os valores de expressão média de GUS conferidos por cada amplicon do transgene. A Tabela 13 a seguir mostra as proporções de GUS em relação à luciferase de vaga- lume (FLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Atntt1:1:2 e P- CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2Tabela 12. Valores de Expressão Média de Gus e luciferase e pro- porções de GUS/luciferase.

Tabela 13. Proporções de GUS em relação à luciferase de vaga- lume (FLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Atntt1:1:2 e P- CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2.

[00114] Como pode ser observado na Tabela 12 anterior, nem todas as sequências de EXP demonstravam a capacidade de controlar aexpressão transgênica quando comparadas com o controle sem promotor. Entretanto, as sequências de EXP, CumMe_WSM_SF16429.G5670 (SEQ ID NO: 40), PCUCme.CumMe_WSM_SF16444.G5140-1:1:1 (SEQ ID NO: 175), PCUCme.CumMe_WSM_SF16563.G5560-1:1:1 (SEQ ID NO: 176),CumMe_WSM_SF17051.G5470 (SEQ ID NO: 48), PCUCme.CumMe_WSM_SF17111.G5790-1:1:1 (SEQ ID NO: 177), PCUCme.WSM_SF17252.G7330-1:1:1 (SEQ ID NO: 179), CumMe_WSM_SF17866.G6050 (SEQ ID NO: 62), PCUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340-1:1:1 (SEQ ID NO: 181), PCUCme.CumMe_WSM_SF18536.G6480-1:1:1 (SEQ ID NO: 182),CumMe_WSM_SF18575.G6410 (SEQ ID NO: 71), PCUCme.CumMe_WSM_SF18634.G5190-1:1:1 (SEQ ID NO: 183),CumMe_WSM_SF18986.G6110 (SEQ ID NO: 79), EXPCUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1 (SEQ ID NO: 185), PCUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760-1:1:1 (SEQ ID NO: 188), PCUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090-1:1:1 (SEQ ID NO: 189),CumMe_WSM_SF19902.G5260 (SEQ ID NO: 87), PCUCme.CumMe_WSM_SF20132.G5560-1:1:1 (SEQ ID NO: 190),CumMe_WSM_SF20359.G5870 (SEQ ID NO: 92), CumMe_WSM_SF206458.G5970 (SEQ ID NO: 98), CumMe_WSM_SF206534.G5200 (SEQ ID NO: 99), CumMe_WSM_SF22008.G5670 (SEQ ID NO: 108), CumMe_WSM_SF22355.G5310 (SEQ ID NO: 113), PCUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120-1:1:1 (SEQ ID NO: 192),EXP-CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1 (SEQ ID NO: 193), PCUCme.CumMe_WSM_SF23906.G6180-1:1:1 (SEQ ID NO: 194),CumMe_WSM_SF24045.G5400 (SEQ ID NO: 123), PCUCme.CumMe_WSM_SF25141.G5160-1:1:2 (SEQ ID NO: 195), PCUCme.CumMe_WSM_SF25936.G5450-1:1:1 (SEQ ID NO: 197),CumMe_WSM_SF28729.G5340 (SEQ ID NO: 134), CumMe_WSM_SF31264.G5380 (SEQ ID NO: 136) e PCUCme.CumMe_WSM_SF35856.G5150-1:1:1 (SEQ ID NO: 198) demonstravam a capacidade de controlar a expressão transgênica emprotoplastos de cotilédone de soja em um nível similar ou maior queEXP-At.Atntt1:1:2. Como mostrado na Tabela 13 acima, a sequênciade EXP P-CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760-1:1:1 (SEQ ID NO:188) demonstrava a capacidade de controlar a expressão transgênicaneste ensaio em um nível maior que EXP-At.Atntt1:1:2.Exemplo 7: Análise de Elementos Reguladores Que ControlamGUS em Protoplastos de Folha de Algodão

[00115] Os protoplastos de folha de algodão foram transformados com vetores de expressão em plantas contendo um grupo de elementos de expressão reguladores da transcrição de teste que controla a expressão dos transgenes da β-glucuronidase (GUS) e comparados com a expressão de GUS nos protoplastos de folha em que a expressão de GUS é controlada por promotores constitutivos conhecidos.

[00116] A expressão de uma transgene controlada por P-CUCme.1- 1:1:1rc (SEQ ID NO: 155), P-CUCme.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 14), P- CUCme.3-1:1:3 (SEQ ID NO: 15), EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156), P-CUCme.6-1:1:1 (SEQ ID NO: 18), P-CUCme.8-1:1:2 (SEQ ID NO: 19), P-CUCme.9-1:1:2 (SEQ ID NO: 20), P-CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21), EXP-CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162), P-CUCme.15- 1:1:2 (SEQ ID NO: 23), P-CUCme.16a-1:1:2 (SEQ ID NO: 24), P- CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26), P-CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO: 27), P-CUCme.19-1:1:3 (SEQ ID NO: 167), P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211), P-CUCme.21-1:1:1 (SEQ ID NO: 30), P-CUCme.22-1:1:3 (SEQ ID NO: 31), EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168), P- CUCme.26-1:1:2 (SEQ ID NO: 33), P-CUCme.28-1:1:2 (SEQ ID NO: 34) e EXP-CUCme.29:1:2 (SEQ ID NO: 212) foi comparada com a expressão partindo de grupos de elementos de expressão constitutiva conhecidos. Cada vetor de expressão em plantas era compreendido de uma região de borda direita de Agrobacterium tumefaciens, um primeiro cassete de transgene compreendido de um promotor de teste ou um promotor constitutivo conhecido ligado de forma operacional 5’ a uma sequência codificadora de β-glucuronidase (GUS, SEQ ID NO: 206) contendo um íntron que pode ser processado derivado do gene ST-LS1 específico ao tecido que pode ser induzido pela luz da batata (Acesso do Genbank: X04753), ligado de forma operacional a 5’ a uma região de término a 3’ do gene E6 de Gossypium barbadense (T- Gb.E6-3b:1:1, SEQ ID NO: 204), do gene RbcS2-E9 de Pisum sativum (T-Ps.RbcS2-E9-1:1:6, SEQ ID NO: 203) ou do gene FbLate-2 de Gossypium barbadense (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205); um segundo cassete de seleção do transgene utilizado para a seleção de células vegetais transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato (controlada pelo promotor da Actina 7 de Arabidopsis) ou ao antibiótico, canamicina e uma região de borda esquerda de A. tumefa- ciens. Um vetor de expressão em plantas de controle sem promotor (pMON124912) serviu como um controle negativo para a expressão. Os grupos de elementos de expressão de teste e constitutivos descritos anteriormente foram clonados nos vetores de expressão em plantas como mostrado na Tabela 14 a seguir.Tabela 14. Vetores de expressão em plantas e grupo de elemento de expressão correspondente e 3’ UTR.

[00117] Dois plasmídeos, para uso na cotransformação e na normali-zação dos dados, também foram construídos. Um plasmídeo de controle da transformação era compreendido de um promotor constitutivo, que controla a expressão da sequência codificadora da luciferase de vaga- lume (Photinus piralis) (FLuc, SEQ ID NO: 205), ligado de forma operaci- onal a 5’ a uma região de término a 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 209). O outro plasmídeo de controle da transformação era compreendido de um promotor constitutivo, que controla a expressão da sequência codificado-ra da luciferase de sea pansy (Renilla reniformis) (RLuc, SEQ ID NO:206), ligado de forma operacional a 5’ a uma região de término a 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens.

[00118] Os vetores de expressão em plantas, pMON80585,pMON109584, pMON118756, pMON124912, pMON140818,pMON140819, pMON140820, pMON140821, pMON140823,pMON140824, pMON140825, pMON140826, pMON140827,pMON140828, pMON140829, pMON140830, pMON140831,pMON140832, pMON140833, pMON140834, pMON140835,pMON140836, pMON140837, pMON140838 e pMON140839 foramutilizados para transformar células de protoplasto de folha de algodão utilizando métodos de transformação com PEG. As células de proto- plasto foram transformadas com quantidades equimolares de cada um dos dois plasmídeos de controle da transformação e um vetor de ex-pressão em plantas de teste. A atividade da GUS e da luciferase foi analisada. As medidas tanto da GUS quanto da luciferase foram con-duzidas colocando alíquotas de uma preparação de células lisadas transformadas como descrito anteriormente dentro de duas bandejas de poços pequenos diferentes. Uma bandeja foi utilizada para as medidas de GUS e uma segunda bandeja foi utilizada para realizar um ensaio de luciferase dual utilizando o sistema de ensaio repórter de luciferase dual (Promega Corp., Madison, WI; ver, por exemplo, Pro- mega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02). As medidas das amostras foram feitas utilizando 4 réplicas por transformação. Os valores médios de Gus e luciferase são apresentados na Tabela 15 a seguir.Tabela 15. Valores de expressão média de Gus e luciferase e pro-porções de GUS/luciferase.

[00119] Para comparar a atividade relativa de cada promotor nos protoplastos de folha de algodão, os valores de GUS foram expressos na forma de uma proporção de atividade de GUS em relação à luciferase e normalizados em relação aos níveis de expressão observados para os grupos de elementos de expressão constitutiva, EXP- At.Act7:1:11 e EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3. A Tabela 16 a seguir mostra as proporções de GUS em relação à luciferase de vaga- lume (FLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3. A Tabela 17 a seguir mostra as proporções de GUS em relação à luciferase de renilla (RLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.Tabela 16. Proporções de GUS em relação à luciferase de vaga- lume (FLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Tabela 17. Proporções de GUS em relação à luciferase de renilla (RLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Act7:1:11 e EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

[00120] Como pode ser observado nas Tabelas 16 e 17, a maioria dos grupos de elementos de expressão testados, demonstrava a capacidade de controlar a expressão transgênica em células de protoplasto de folha de algodão. Um grupo de elemento de expressão, EXP- CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156) demonstrava níveis de expressão transgênica maiores que aqueles de EXP-At.Act7:1:11 neste ensaio. Exemplo 8: Análise de Elementos Reguladores Que Controlam GUS nos Protoplastos de Folha de Algodão Utilizando Amplicons do Cassete de Transgene

[00121] Os protoplastos de folha de algodão foram transformados com amplicons do cassete de transgene contendo um grupo de elemento de expressão regulador da transcrição que controla a expressão dos transgenes da β-glucuronidase (GUS) e comparados com a expressão de GUS em protoplastos de folha em que a expressão de GUS é controlada por promotores constitutivos conhecidos. Os amplicons do cassete de transgene eram compreendidos de uma sequência de EXP, ligada de forma operacional a uma sequência codificadora de GUS (GUS, SEQ ID NO: 206), ligada de forma operacional a uma 3’ UTR (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205). A expressão média de GUS foi comparada com os elementos de EXP de controle, P-CaMV.35S- enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 210) e EXP-At.Atntt1:1:2 (SEQ ID NO: 200).

[00122] Um plasmídeo, para uso na cotransformação e para a nor-malização dos dados também foi utilizado de uma maneira similar àquela descrita anteriormente no Exemplo 2. O plasmídeo de controle da transformação era compreendido de um promotor constitutivo, que controla a expressão da sequência codificadora da luciferase de vaga- lume (Photinus piralis) (FLuc, SEQ ID NO: 205), ligado de forma ope-racional a 5’ a uma região de término a 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 209).

[00123] A Tabela 18 a seguir mostra os valores de expressão média de GUS conferidos por cada amplicon do transgene. A Tabela 19 a seguir mostra as proporções de GUS em relação à luciferase de vaga- lume (FLuc) normalizadas em relação a EXP-At.Atntt1:1:2 e P- CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2. Tabela 18. Valores de expressão média de Gus e luciferase e pro- porções de GUS/luciferase.

Tabela 19. Proporções de GUS em re lume (FLuc) normalizadas em relaçã a EXP-At.Atntt1:1:2 e PCaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2.

[00124] Como pode ser observado na Tabela 18 anterior, nem todas as sequências de EXP demonstravam a capacidade de controlar a ex-pressão transgênica quando comparadas com o controle sem promotor. Entretanto, as sequências de EXP, P-CUCme.CumMe_WSM_SF16444. G5140-1:1:1 (SEQ ID NO: 175) e P-CUCme.CumMe_WSM_SF19839. G5090-1:1:1 (SEQ ID NO: 189) demonstravam a capacidade de controlar a expressão transgênica em protoplastos de cotilédone de soja em um nível similar ou maior que aquele de EXP-At.Atntt1:1:2. Como mostrado na Tabela 19 anterior, a sequência de EXP, P-CUCme.CumMe_ WSM_SF19839.G5090-1:1:1 (SEQ ID NO: 189) demonstrava a capaci-dade de controlar a expressão transgênica neste ensaio em um nível maior que EXP-At.Atntt1:1:2.Exemplo 9: Análise de Elementos Reguladores Que Controlam GUS na Soja Transformada de Maneira Estável

[00125] As plantas de soja foram transformadas com vetores de expressão em plantas contendo uma sequência de EXP que controla a expressão dos transgenes da β-glucuronidase (GUS).

[00126] A expressão do transgene GUS controlada por EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7), P-CUCme.1-1:1:1rc (SEQ ID NO: 155), P-CUCme.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 14), P-CUCme.3-1:1:3 (SEQ ID NO: 15), EXP-CUCme.4:1:1 (SEQID NO: 156), EXP-CUCme.5:1:1 (SEQ ID NO: 159), P-CUCme.6-1:1:1(SEQ ID NO: 18), P-CUCme.8-1:1:2 (SEQ ID NO: 19), P-CUCme.9- 1:1:2 (SEQ ID NO: 20), P-CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21), EXP- CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162), P-CUCme.15-1:1:2 (SEQ ID NO:23), P-CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26), P-CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO: 27), P-CUCme.19-1:1:3 (SEQ ID NO: 167), P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211), P-CUCme.21-1:1:1 (SEQ ID NO: 30), EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168), P-CUCme.26-1:1:2 (SEQ IDNO: 33), EXP-CUCme.29:1:2 (SEQ ID NO: 212), P-CUCme.CumMe_WSM_SF25355.G5000-1:1:1 (SEQ ID NO: 196), P-CUCme.CumMe_WSM_SF17111.G5790-1:1:1 (SEQ ID NO: 177), P-CUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120-1:1:1 (SEQ ID NO: 192), P-CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340-1:1:1 (SEQ ID NO: 181), P- CUCme.CumMe_WSM_SF23760.G5200-1:1:1 (SEQ ID NO: 193), EXP- CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1 (SEQ ID NO: 185), P-CUCme.WSM_SF17252.G7330-1:1:1 (SEQ ID NO: 179), P-CUCme.CumMe_WSM_SF18634.G5190-1:1:1 (SEQ ID NO: 183), P-CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760-1:1:1 (SEQ ID NO: 188), P-CUCme.CumMe_WSM_SF25936.G5450-1:1:1 (SEQ ID NO: 197), P-CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090-1:1:1 (SEQ ID NO: 189), CumMe_WSM_SF206458.G5970 (SEQ ID NO: 98) e P-CUCme.CumMe_WSM_SF18716.G5860-1:1:1 (SEQ ID NO: 184) foi analisada tanto qualitativamente através da inspeção de seções coradas quanto quantitativamente. Cada vetor de expressão em plantas era compreendido de uma região de borda direita de Agrobacterium tume- faciens, um primeiro cassete de transgene compreendido de uma se-quência de EXP ligada de forma operacional a 5’ a uma sequência codi-ficadora de β-glucuronidase (GUS, SEQ ID NO: 206) contendo um ín- tron que pode ser processado derivado do gene ST-LS1 específico ao tecido que pode ser induzido pela luz da batata (Acesso do Genbank: X04753), ligado de forma operacional a 5’ a uma região de término a 3’ do gene FbLate-2 de Gossypium barbadense (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205); um segundo cassete de seleção de transgene utilizado para a seleção de células vegetais transformadas que conferia resistência ao herbicida glifosato (controlada pelo promotor da Actina 7 de Arabi- dopsis) e uma região de borda esquerda de A. tumefaciens.

[00127] As sequências de EXP anteriores foram clonadas em cons-truções de expressão em plantas como mostrado nas Tabelas 20 até 23 abaixo e utilizadas para transformar plantas de soja utilizando um método de transformação mediado por Agrobacterium. A expressão de GUS foi analisada qualitativamente utilizando seções histológicas de tecidos selecionados e quantitativamente.

[00128] A análise histoquímica de GUS foi utilizada para a análise de expressão qualitativa de plantas transformadas. Seções de tecidos intei-ros foram incubadas com a solução de coloração de GUS X-Gluc (5- bromo-4-cloro-3-indolil-b-glucuronídeo) (1 miligrama/mililitro) durante um período de tempo apropriado, lavadas e inspecionadas visualmente em relação à coloração azul. A atividade de GUS foi determinada qualitati-vamente através de inspeção visual ou inspeção sob um microscópio utilizando órgãos e tecidos de plantas selecionados. As plantas da gera-ção R0 foram inspecionadas em relação à expressão em Vn5 Raiz, R1 Raiz, Vn5 Folha de Escoadouro, Vn5 Folha de Fonte, R1 Folha de Fonte, R1 Pecíolo, Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, R3 Semente Imatura, R3 Vagem, R5 Cotilédone e R1 Flor.

[00129] Para a análise quantitativa, a proteína total foi extraída dos tecidos selecionados de plantas de milho tranformadas. Um microgra- ma de proteína total foi utilizado com o substrato fluorogênico 4- metileumbeliferil-β-D-glucuronideo (MUG) em um volume de reação total de 50 microlitros. O produto de reação, 4-metilumbeliferona (4- MU), é maximamente fluorescente em pH alto, quando o grupo hidroxi- la é ionizado. A adição de uma solução básica de carbonato de sódio interrompe simultaneamente o ensaio e ajusta o pH para a quantificação do produto fluorescente. A fluorescência foi medida com excitação a 365 nm, emissão a 445 nm utilizando um Fluoromax-3 (Horiba; Kyoto, Japão) com Micromax Reader, com amplitude de fenda em excitação de 2 nm e emissão de 3 nm.

[00130] As Tabelas 20 e 21 a seguir mostram os níveis de expressão quantitativos medidos nos tecidos vegetais na geração R0. Os tecidos não analisados são mostrados na forma de células em branco em ambas as tabelas. Tabela 20. Expressão média de GUS em Vn5 Raiz, R1 Raiz, Vn5 Folha de Escoadouro, Vn5 Folha de Fonte, R1 Folha de Fonte e R1 Pecíolo de plantas de soja transformadas da geração R0

Tabela 21. Expressão média de GUS em Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, R3 Semente Imatura, R3 Vagem, R5 Cotilédone R1 Flor de plantas de soja transformadas da geração R0

[00131] Como pode ser observado nas Tabelas 20 e 21, as sequências de EXP, EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), EXP- CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7), P-CUCme.1-1:1:1rc (SEQ ID NO: 155), P-CUCme.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 14), EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156), EXP-CUCme.5:1:1 (SEQ ID NO: 159), P-CUCme.6-1:1:1 (SEQ ID NO: 18), P-CUCme.8-1:1:2 (SEQ ID NO: 19), P-CUCme.9- 1:1:2 (SEQ ID NO: 20), P-CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21), EXP- CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162), P-CUCme.15-1:1:2 (SEQ ID NO: 23), P-CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26), P-CUCme.18-1:1:2(SEQ ID NO: 27), P-CUCme.19-1:1:3 (SEQ ID NO: 167), P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211), P-CUCme.21-1:1:1 (SEQ ID NO: 30), EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168), P-CUCme.26-1:1:2 (SEQ ID NO: 33), EXP-CUCme.29:1:2 (SEQ ID NO: 212), P- CUCme.CumMe_WSM_SF25355.G5000-1:1:1 (SEQ ID NO: 196), P-CUCme.CumMe_WSM_SF17111.G5790-1:1:1 (SEQ ID NO: 177), P-CUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120-1:1:1 (SEQ ID NO: 192), P-CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340-1:1:1 (SEQ ID NO: 181), P-CUCme.CumMe_WSM_SF23760.G5200-1:1:1 (SEQ ID NO: 193), EXP-CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1 (SEQ ID NO: 185), P- CUCme.WSM_SF17252.G7330-1:1:1 (SEQ ID NO: 179), P-CUCme.CumMe_WSM_SF18634.G5190-1:1:1 (SEQ ID NO: 183), P-CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760-1:1:1 (SEQ ID NO: 188), P-CUCme.CumMe_WSM_SF25936.G5450-1:1:1 (SEQ ID NO: 197), P-CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090-1:1:1 (SEQ ID NO: 189), CumMe_WSM_SF206458.G5970 (SEQ ID NO: 98) e P-CUCme.CumMe_WSM_SF18716.G5860-1:1:1 (SEQ ID NO: 184) de-monstravam quantitativamente a capacidade de controlar a expressão transgênica em alguns ou em todos os tecidos analisados, dependendo da sequência de EXP utilizada para controlar a expressão.

[00132] A análise histológica de seções de tecidos selecionados forneceu evidência adicional de expressão para muitas das sequências de EXP. EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1) e EXP- CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7) demonstravam um padrão de ex-pressão constitutivo com coloração observada em todos os tecidos, muito embora a análise quantitativa demonstrasse níveis muito baixos de expressão. Este tipo de padrão de expressão pode ser principalmente adventício para controlar a expressão de transgenes que requerem um baixo nível de expressão constitutiva. A expressão controlada por P-CUCme.1-1:1:1rc (SEQ ID NO: 155) demonstrava expressão em feixes vasculares de folhas de escoadouro e de fonte e no xilema e no córtex da raiz, floema, xilema, endoderme, estela e ponta. A expressão controlada por EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156) foi observada em todos os tecidos com a expressão mais alta observada na fase reprodutiva da planta. A expressão controlada por P-CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21) foi observada apenas na V5 Folha de Escoadouro e R1 Anteras de Flor. A expressão controlada por EXP-CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162) demonstrava um padrão de expressão constitutivo com a expressão mais alta sendo observada no embrião de vagem amarela e no cotilédone. A atividade do embrião de vagem amarela era 5 vezes maior na geração R1 do que na geração R0 (ver Tabela 23 a seguir). A expressão controlada por P-CUCme.15-1:1:2 (SEQ ID NO: 23), P-CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26) e P-CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO: 27) demonstrava um nível constitutivo de expressão his- tologicamente. A expressão controlada por P-CUCme.19-1:1:3 (SEQ ID NO: 167) demonstrava um padrão constitutivo de expressão histo- logicamente com a exceção da V5 raiz e do R1 pecíolo. A R3 vagem exibia a expressão mais alta.

[00133] A expressão controlada por P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211) demonstrava um padrão constitutivo histologicamente com a exceção da expressão na V5 raiz. A expressão era mais alta no cotilédone em estágio R8. A expressão controlada por EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168) demonstrava um padrão constitutivo de expressão com ex-pressão observada histologicamente em todos os tecidos. A expressão de GUS foi observada como aumentando na geração R1 (ver as Tabelas 22 e 23 a seguir). As flores e os pecíolos no estágio R1 demonstravam os níveis mais altos de expressão na soja. A expressão controlada por P- CUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120-1:1:1 (SEQ ID NO: 192) de-monstrava um padrão constitutivo de expressão histologicamente com expressão mais alta no cotilédone e no embrião no estágio R8. A expres-são controlada por P-CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340-1:1:1 (SEQ ID NO: 181) demonstrava um nível constitutivo de expressão enquanto que a alta expressão quantitativamente foi observada no embrião de vagem amarela.

[00134] Foi permitido que as plantas de geração R0 transformadas com as construções plasmideais compreendendo EXP- CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162) e EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168) produzissem sementes e as plantas de geração R1 foram analisadas em relação à expressão de GUS. As plantas de geração R1 foram analisadas em relação à expressão em Vn5 Raiz, Vn5 Folha de Escoadouro, Vn5 Folha de Fonte, R1 Folha de Fonte, R1 Pe- cíolo de Embrião de Vagem Amarela, Cotilédone de Vagem Amarela, R3 Semente Imatura, R3 Vagem, R5 Cotilédone e R1 Flor. As Tabelas 22 e 23 mostram a expressão média de GUS medida em cada tecido das plantas transformadas de geração R1.

Claims (5)

1. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 168; em que a referida molécula de DNA está ligada de forma operacional a uma molécula de polinucleotídeo heteróloga que pode ser transcrita.

2. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivin-dicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de polinucleotí- deo que pode ser transcrita heteróloga compreende um gene de interesse agronômico.

3. Molécula de DNA recombinante de acordo coma a rei-vindicação 2, caracterizada pelo fato de que o gene de interesse agronômico confere tolerância a herbicidas nas plantas.

4. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivin-dicação 2, caracterizada pelo fato de que o gene de interesse agronô-mico confere resistência a pragas nas plantas.

5. Processo para expressão de uma molécula de polinucle- otídeo que pode ser transcrita, caracterizado pelo fato de que compre-ende as etapas de:a) transformar uma célula vegetal com a molécula de DNA recombinante como definida na reivindicação 1 para produzir uma célula vegetal transgênica, em que a referida molécula de DNA é integrada no genoma da referida célula vegetal;b) regenerar uma planta transgênica a partir da referida cé-lula vegetal transgênica; ec) cultivar a referida planta transgênica compreendendo a molécula de DNA como definida na reivindicação 1, em que o polinu- cleotídeo que pode ser transcrito é expresso.

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