TARIFNAME DOMATESTE MUTANT SENTROMER SPESIFIK HISTON 3 PROTEINI (thENH3) ARACILIGIYLA HAPLOID INDÜKLEYICI HATLAR GELISTIRILMESINE YÖNELIK YÖNTEM Teknik Alan Bu bulus, sebze ve meyve (Tarim) sanayisi için kritik öneme sahip domates bitkisinin islahi ve genetik çalismalarinda kullanilmak üzere, bitkiye ait sentromer spesifik histon 3 proteinin degistirilmesi sonucu haploid tetikleyici hatlarin gelistirilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Ayrica, mevcut bulus bu yöntem ile tarim uygulamalarinda haploid tetikleyici olarak kullanilabilecek transgenik bitki eldesi ile ilgilidir. Önceki Teknik Haploid bitki türlerinin eldesinde in vitro ve in vi'vo olmak üzere çok sayida yöntem mevcuttur. Ancak bu yöntemlerin kullaniminin genotipe bagli olmasi, haploid üretimi için gerekli olan haploid indükleyici hatlarin türe spesifik olmasi gibi sinirlamalar mevcuttur. Bu nedenle sentromer vasitasiyla genom eliminasyonunun gerçeklestirildigi ve haploid üretiminin saglandigi yöntemler ile bu sorunlar giderilmeye çalisilmaktadir. Sentromer bölgesi, hücre bölünmesi sirasinda kromozomlarin dogru ve eksiksiz dagilimi ve yavru hücrelere aktariminda görev almaktadir. Sentromer bölgesi sentromere özgü DNA tekrar dizilerinden ve aktif sentromerlerin temel bileseni olan sentromer spesifik histon H3 (CENHS) proteininden olusmaktadir [1]. 35062.34 Sentromer spesifik histon 3 (CenH3; Centromere-speciIic histone 3) araciligiyla haploid tetiklemeye yönelik ilk çalisma RaVi ve Chan tarafindan 2010 yilinda gerçeklestirilmistir [2]. Arabidopsi's thali'ana üzerinde yapilan bu çalismada, embriyo-letal (embryo-lethal) CenH33ye sahip bitkiler, GFP (Green Fluorescent Protein) ile isaretlenmis olan CenH3 ile kurtarilmistir. Kurtarilan transgenik bitkiler yabani A. thali'ana ile melezlendiginde ise transgenik bitkiden gelen genomun (kromozomlarin) elendigi gözlenmistir. Ayni etki, CenH33nin degisken N-terminal kuyrugu H3.3,nin (H3 varyant) kuyrugu degistirilip, GFP ile isaretlendiginde de gözlenmistir (GFP-tailswap) [2]. Bir baska çalismada Kelliher ve arkadaslari, ekonomik açidan önemli bir tür olan misirda (Z. Mays; Zea mays) CenH3 teknolojisinin uygulanabilirligini test etmislerdir. Çalismada misira ait dogal CenH3 iki farkli teknik kullanilarak (RNA interferans ve native gene knockout) susturulmus ve daha sonra iki farkli transgen ile tümlenerek haploid tetikleme oranlari belirlenmistir. Kullanilan transgenlerdeki degisiklikler RaVi ve Chansin çalismasindan örnek alinarak N-terminal kuyrugunda gerçeklestirilmistir. Çalisma sonucunda dogal CenH3 proteini susturulan transgenik bitkilerden haploid tetikleyici hatlar elde edilebilmistir [3]. N-terminal kuyrugunun degistirmek yerine, HFD bölgesinde yapilan tek nokta mutasyonlarinin da haploid tetikleyici etki gösterdigi belirtilmistir. A. thali'ana CenH3 proteini ele A136T mutasyonlaridir [4, 5]. Sentromer spesifik histon 3 (CenH3) sekans düzeyinde degisikliklerin haploid tetikleyen hatlar gelistirilmesine olanak sagladigina dair çalismalara literatürde rastlanmaktadir. Bazi türlerde bu yöntemle basari saglanmis olsa da sistem henüz ekonomik öneme sahip türlerde yayginlasmamistir. Domates haploid bitki elde etmeye yönelik etkinligi gösterilmis bir yöntemin henüz tespit edilemedigi bir türdür. Domatese ait native CenH3 susturmak için seçilen yöntemler etkin 35062.34 çalismadigi durumlarda istenilen etkinin gözlemlenemedigi olmustur. Bu nedenle etkin bir susturma için yeni bir yöntem gereklidir. Daha önceki çalismalarda haploid tetikleme orani seçili mutasyonlar en yüksek %122 olarak tespit edilmis, mutasyonlari tümlesik etkisine yönelik bir çalisma yapilmamistir. Bu kapsamda bulusumuZ ile domateste ilk defa haploid hat gelistirmeye yönelik bir yöntem ortaya konulmustur. Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bulus, yukarida bahsedilen tüm sorunlarin üstesinden gelen ve ilgili teknik alana ilave avantajlar getiren haploid tetikleyici hatlarin gelistirilmesine yönelik bir yöntem ve bu yöntemle elde edilen domates bitkisi ile ilgilidir. Mevcut bulus, domateste tüm genotiplere uygulanabilir, etkin bir haploid tetikleyici hat gelistirme yöntemi ile ilgilidir. Mevcut bulus, yukarida bahsedilen problemlerin üstesinden gelmek ve özellikle, CENH3 proteinlerinin önemli modifikasyonlarini içermeyen ve/veya genetik mühendisligi yapilmamis alternatif haploid indükleyici bitkilerin eldesi için haploid tetikleyici hatlarin gelistirilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Literatürde, bir histon 3 varyanti olan sentromerik histon 33ün (CenH3) yapisinda gerçeklestirilen mutasyonlar sonucu farkli türlerde (Z.mays ve A.thali`ana) haploid tetikleyici hatlarin gelistirilebildigine yönelik bilgiler yer almaktadir. Bu bulus kapsaminda bahsi geçen yeni ve daha etkili yöntem ile ekonomik degeri yüksek bir tür olan domates için uygulamalar gerçeklestirilmistir. Domates sahip oldugu ekonomik ve fonksiyonel önem nedeniyle haploid çalismalarindan üst düzeyde 35062.34 fayda saglayabilecek bir ürün olmasina ragmen literatürde bu ürüne yönelik, yüksek basariya sahip bir haploid bitki elde etme yöntemi henüz gösterilememistir. Sekillerin Kisa Açiklamasi Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen "Domateste Mutant Sentromer Spesifik Histon 3 Proteini (Mtcenh3) Araciligiyla Haploid Indükleyici Hatlar Gelistirilmesine Yönelik Yöntem" ekli sekillerde gösterilmis olup; bu sekillerden: Bulusta kullanilan ve domates aktarilan kirmizi renk ile isaretlenmis mutasyonlari (P498, G50E ve L96F) tasiyan sentetik gen, thenH3 gen dizilimidir. Bulus kapsaminda kullanilmasi kararlastirilan hedef RNAslar ve CenH3S.lycopersicum üzerinde hedefledikleri ekzonlarin gen dizilimidir. Bulus kapsaminda kullanilacak kilavuz RNA 1 ve 2 dizileridir. plazmitlerini dogrulamak için yürütülen farkli restriksiyon enzimleri (EcoRI-Ncol ve EcoRI-Xbal) ile kesim ve PCR çalismalarina ait jel görüntüleri. Sekilde solda, beklenildigi üzere EHA105-pPZP212- thenH3 plazmitinden 2385 ve 1504 baz çifti uzunlugunda ve pPZP212 plazmitinden 1041 baz çifti uzunlugunda elde edilen bantlar görülmektedir. Yine sekilde, EHA105-pPZP212-thenH3 plazmitinden 2875 baz çifti uzunlugunda elde edilen bantlar görülmektedir. pPZP212 plazmitinden beklenildigi üzere bant elde edilememistir. Reaksiyon ürünleri %1 (kütlece) agaroz ve %0.005 etidyum bromür içeren jelde, 100V potansiyel farkta yürütülmüstür. Ilk kuyuda referans DNA merdiveni (ThermoScientific, DNA Ladder GeneRuler 1kb) görülmektedir. Sagda AGL1-pPZP212-thenH3 35062.34 plazmitini dogrulamak thenH3 primer seti kullanilarak yürütülen PCR çalismasina ait jel görüntüsü. Sekilde hem test hem de pozitif kontrol kuyucugunda 1050 baz çifti uzunlugunda beklenen bant elde edilmistir. Negatif kontrol kuyucukta bant görülmemektedir. PCR ürünleri %1 (kütlece) agaroz ve %0.005 etidyum bromür içeren jelde, 100V potansiyel farkta yürütülmüstür. Ilk kuyuda referans DNA merdiveni (ThermoScientific, DNA Ladder GeneRuler 1kb) görülmektedir. EHA105-pFGC-pcoCas9-native ve AGLl-pFGC-pcoCas9-native plazmitlerini dogrulamak için yürütülen PacI restriksiyon enzimi ile kesim çalismasina ait jel görüntüsü. Sekilde test tüm örnekler ve pozitif kontrolde beklenen 769 baz çifti uzunlugunda bant görülmektedir. Negatif kontrol kuyucukta bant görülmemektedir. Reaksiyon ürünleri potansiyel farkta yürütülmüstür. Ilk kuyuda referans DNA merdiveni (ThermoScientific, DNA Ladder GeneRuler lkb) görülmektedir. a) "Sürgün Tetikleme" ortamina alinmis eksplantlar; b) eksplantlardan ayrilmis sürgünler; c) "Kök Tetikleme" ortamina aktarilmaya hazir hale gelen, yaklasik 2 cm uzunlugundaki sürgünler; d) "Kök Tetikleme" ortaminda kök olusturan sürgünler; e) Alt ve üst aksami saglikli gelisen bitkiciklerin aklimatizasyon öncesi durumu; f) Aklimatizasyon sonrasi büyütme kabininde, 24-28°C sicaklikta, 20:4 fotoperiyotta normal gelisim gösteren domates bitkisi Bitki 39,a ait farkli gelisim asamalarinda elde edilmis görüntüler; a) aklimatizasyon sonrasi; b) ilk sahaya ekim; c-d) gelisim; e) ilk çiçek ve I) ilk meyve tutumu asamalari görülmektedir. Seçilmis bir grup potansiyel transgenik bitkiye yönelik, CRISPR-Cas9 ve sgRNAslari tespit eden primer seti kullanilarak gerçeklestirilen 35062.34 PCRslara ait jel görüntüsü. Bitki 393da bu primer seti için 852 baz çifti uzunlugunda bant elde edilmistir. PCR ürünleri %1 (kütlece) agaroz ve yürütülmüstür. Ilk kuyuda referans DNA merdiveni (ThermoScientific, DNA Ladder GeneRuler lkb) görülmektedir. Merdivenin alttan belirtmektedir. Sekil 9. Bitki 393un genomunda bulunan -3 delesyona sahip CenH3 alleline ait kromatogram. Sekil 10. Bitki 393un sahip oldugu dogalCenH3 genine ait allelerde, CRISPR- Cas9 aktiVitesi sonucu olusan mutasyonun protein sekansi düzeyindeki etkisi; -3 delesyon sonucu 33. pozisyondaki alanin amino asidinin kaybidir. Bulusun Ayrintili Açiklamasi Söz konusu bulus, transgenik olan ve transgenik olmayan bitkilerle, tercihen ekin bitkilerinden olan domates bitkisi ile ilgilidir. Genetik materyal; 93.4.1.1.1.1.1-1 numarali bir F8 generasyonunda sirik domates hatti olup, Proto Tohum tarafindan karsiliksiz deneysel amaçli kullanim için bedelsiz verilmistir. Bu genetik materyal Fusarium oxysproum race 2 (12), tomato spotted Wilt Virus-TSWV (SW5) ve Fusarium oxysprorum radicis-lycopercis (FORL) hastalik dayanimlari olan bir Mevcut bulus, CENH3 proteinlerinin önemli modifikasyonlarini içermeyen ve/Veya genetik mühendisligi yapilmamis alternatif haploid indükleyici bitkilerin eldesi için haploid tetikleyici hatlarin gelistirilmesine yönelik bir yöntem ile 35062.34 Ayrica mevcut bulus, mevcut bulusa ait domates bitkilerinin vahsi tip (Wild-type) veya mutasyon tasiyan domates bitkileri ile çaprazlanarak elde edilebilen haploid ve çift (double) haploid bitkileri üretme yöntemlerinin de gerçeklestirilmesini saglamaktadir. Bulus konusu bitki üretimi yönteminin özelliklerinden biri, domatesin sahip oldugu Solanum esculantum türünün native CenH3 geninin etkin susturulmasinin saglanmasidir. Domatesin sahip oldugu native CenH3 geni CRISPR-Cas9 araciligi ile susturulmustur. Diger bir deyisle, CRISPR-Cas9 gen düzenleme teknolojisi kullanilarak domatese ait dogal CenH3 geni devre disi birakilmis ve nullCenH3 tasiyan domates bitkisi eld edilmistir. Bu sekilde elde edilen bitkiler kendi aralarinda ve ticari hibritler ile melezlendirilmistir. Söz konusu bulus ile CRISPR- Cas9 teknolojisinin kullanimi ile daha önce sorunlu çalisan dogal CenH3 genini susturma yöntemlerinden daha etkin bir susturma islemi gerçeklestirilmistir. Burada kullanildigi sekliyle "gen aktarimi" terimi, nükleik asit moleküllerini (DNA gibi) hücre içine transferini saglayan yöntem anlamina gelmektedir. Transfer yöntemi, teknikte bilinen (örn. Elektroporasyon, Agrobacterium tumefaciens aracili aktarim) uygulamalar ile gerçeklestirilmektedir. Gen aktarimi sirasinda plasmid Söz konusu bulus kapsaminda haploid tetikleyici hat gelistirilmesi, CenH3 proteinine yönelik tekil etkisi henüz domateste, dahasi tümlesik etkisi hiçbir türde belirtilmemis olan üç nokta mutasyonunu tasiyan mutant genin (thenH3), domatese Agrobacterium tumefaciens araciligi ile gen aktarimi vasitiasi ile yapilmaktadir. 35062.34 Mevcut bulus, biyolojik aktivitesi haploid indükleyici olan ve sentromer histon H3 (cenH3) proteinine ait nükleik asit dizisindeki üç nokta mutasyonu vasitasi ile haploid indükleyici aktiviteyi saglayan bir haploid indükleyici domates bitkisi eldesi ile ilgilidir. Mevcut bulus, haploid indükleyici biyolojik aktivisitesine sahip olan ve mutant bir sentromer histon H3 (thENH3) proteini içeren domates bitkisi olup, burada thENH3 proteini bitkiye haploid indükleyici biyolojik aktivite kazandirilmasini saglayan üç amino asit mutasyonu içermektedir. CENH3, oldukça degisken bir N-terminal kuyrugu ve nispeten korunmus bir histon katlama alani (HFD; Histone Fold Domain) bölgesi içermektedir. Diger histonlarin aksine, CENH3 hizli bir evrimsel süreç geçirmistir. Bu nedenle, CENH3'ün N- terminal kuyrugu, birbirine yakin türlerde dahi sekans farkliligi gösterirken, HFD bölgesi evrimsel süreçte nispeten iyi korunmustur. Söz konusu bulusta, CenH3 proteininde korunumun basladigi HFD bölgesine yakin konumlanan Ot-N-terminali heliksi hedef alinmistir. Tercihen N-terminalde bir amino asidin, daha özelde tercihen Ot-N-terminali heliksinde yer alan "PGTXAL" motifi içinde bir amino asidin yer degistirmesine neden olan en az bir mutasyon içermektedir. Bu amino asit degisikligine sebep olan mutasyon sayesinde mutasyona ugratilan CENH3 proteini söz konusu bitkinin bir haploid indükleyici olarak biyolojik aktivite kazanmasini saglamaktadir. Söz konusu bulusta tercih edilen CenH3 proteininde gerçeklestirilen mutasyon, haploid indükleyici etkinin yaratilabilmesi için en az 3 amino asit degisimi saglamaktadir. Mutant CenH3 (thenH3) proteininin tasiyacagi üç nokta 35062.34 belirtilen amino asit degisimleri elde edilecek sekilde nükleik asit dizisinde mutasyonlar gerçeklestirilmistir. Amino asitlerin gösterimler: P/Pro/Proline; S/Ser/Serine; G/Gly/Glycine ; E/Glu/ Glutamic acid; L/Leu/ Leucine; F/Phe/ Phenylalanine seklidendir. Wildtype CenH3 dizi no 1 olarak, üç nokta mutasyonunu içeren mutant CenH3 dizi no 2 olarak gösterilmistir. Domates CenH3 proteininde P49 ve G50 dördüncü ekzonda, L96F ise besinci ekzonda yer almaktadir. Amino asitler ve kodonlardaki mutasyonel degisimler su sekildedir: P49-CCA kodunu S49-TCT kodonu, G50-GGG kodonu E50-GAG kodonu ve son olarak L96-TTA kodonu F96-TTT kodonu ile degistirilmistir. Öncelikle, ""thenH3" ismi verilen P498, G50E ve L96F mutasyonlarini tasiyan, klonlamaya yardimci restriksiyon enzimi bölgeleri tasiyan thenH3 sentetik geni tasarlanmistir (Sekil 1, Örnek 2). Bulusun alternatif bir uygulamasinda, elde edilen thenH3 kodlayan bölgeye native gene ait ilk 3 intron, mutant genin hücre içi ifadesini arttirma potansiyeli nedeniyle eklenebilmektedir. Mevcut bulusta, haploid tetikleyici (indükleyici) hat gelistirilmesi, üç nokta mutasyonunu tasiyan mutant genin (thenH3), domatese Agrobacteri'um tumefaci'ens araciligi ile gen aktarimi vasitasi ile yapilmaktadir. Buna göre thenH3 proteini içeren ve haploid indükleyici biyolojik aktiViteye sahip olan bir domates bitkinin eldesi/üretimi için yöntem asagidaki adimlari içermektedir: 35062.34 - thenH3 genini içeren vektörün Agrobacterium tumefaciens suslarina gen aktarimi vasitasi ile aktarilmasi, - Elde edilen transformant Agrobacterium suslarinin domates bitkisine enfekte edilmesi, - thenH3 tasiyan domates bitkisinin eldesi. Bulusun bir uygulamasi, haploid veya çift haploid domates bitkisi üretimi için bir yöntem sunmakta olup; asagidaki adimlari içermektedir: - yukarida bahsi geçen thenH3 proteinine sahip bir birincil domates bitkisi ile vahsi tip (Wild-type) veya mutasyon tasiyan ikincil bir domates bitkisinin çaprazlanmasi - bu çaprazlanma sonucu elde edilen haploid/ çift haploid bitkilerin tespiti Bulusun tercih edilen uygulamasinda, thenH3 proteini içeren bitkiler ile nullCenH3 tasiyan domates bitkilerinin çaprazlandirilmasi amaçlanmaktadir. NullCenH3 tasiyan bitkiler Ek olarak mevcut bulus, mevcut bulusa ait yöntem ile elde edilen haploid indükleyici domastes bitkisi tarim islahinda ve çalismalarinda kullanimini da içermektedir. Asagidaki örnekler bulus konusunu daha iyi anlatmak için olup bulus konusu, bu örneklerle sinirli degildir. ÖRNEKLER Örnek 1- In silico çalismalar 35062.34 Ilk olarak domatese ait kanonik H3 ve CenH3 proteinlerine ait genomik ve protein sekans bilgileri in silico olarak elde edilmistir. Bu bilgiler isiginda literatürde hali hazirda var olan CenH3 veri tabani genisletilmis ve bu sayede kapsamli bir veri tabani olan "Genisletilmis CenH3 Veri Tabani" olusturulmustur. Bu veri tabani kullanilarak ileri düzey biyoinformatik çalismalar yürütülmüs, nihayetinde native-CenH3 proteininde yapilmasi planlanan modifikasyonlar tespit edilmis, etkilerine yönelik öngörülerde bulunulmus ve sentetik genler tasarlanmistir. Buna ek olarak, CRISPR-Cas9 sistemini silahlandirmak için gerekli sgRNAsler CenH33ye ait elde edilmis sekans bilgileri kullanilarak tasarlanmistir. Gerçeklestirilen tüm biyoinformatik çalismalar, etkin ve basarili laboratuvar çalismalarinin öncüsü olmus, dahasi CenH33nin in silico tespiti için yeni bir biyoinformatik kriteri literatüre kazandirmistir. Bu veri tabani olusturulurken ilk olarak, Phytozome V12.1.5 internet platformunda yer alan BLAST araci kullanilarak, A. thali'ana ait kanonik histon 3 protein sekansi kilavuzlugunda 92 türe ait genomlar taranmistir. Tarama islemi sonucu tüm türler için ilgili türe özgü kanonik H3,e ait sekans bilgisine ulasilmistir. Daha sonra bu bilgi kullanilarak her tür için o türe ait H3 varyantlarina ait bilgiler ortaya çikarilmis, bu varyantlar arasindan da o türe özgü CenH3 tespit edilmistir. Titizlikle yürütülen bu çalisma literatürde belirtilen Histone DB 2.0 biyoinformatik kriterler kullanilarak, elle yapilmistir. Farkli türlerde tespit edilen CenH3 sekanslari, sekanslarda rastlanabilecek kirlilikler (örnegin, yanlis notasyon) bakimindan Dr. Inanç Soylu tarafindan gelistirilmis program betikleri araciligiyla taranmistir. Akabinde yapilacak diger biyoinformatik çalismalarda (ÇSH (çoklu sekans hizalamasi), motif belirleme ve ortak evrim) kolaylik saglamasi amaciyla, 35062.34 CenH3 proteininde korunumun basladigi HFD (Histone Fold Domain) bölgesine yakin konumlanan Ot-N-terminali heliksinde yer alan "PGTXAL" motifi kullanilarak sekans düzeyinde ikiye ayrilmistir. Elde edilen alt-sekanslar "hiper- varyant N-kuyrugu" ve "kismen korunumlu HFD" olarak isimlendirilerek, veri tabanina kaydedilmistir. Phytozome 12.1.53e ek olarak, tüm-genom dizilemenin yapilmadigi; buna ragmen Amerikan Ulusal Biyoteknoloji Bilgileri Merkezi (NCBI) veri tabanina yüklenmis münferit CenH3 sekanslari da yukaridaki paragrafta anlatilan yöntem ile temin edilmis ve veri tabanina kaydedilmistir. likofit, kirk iki monokot ve elli bir dikot olmak üzere, toplam yüz alti türe ait, yüz yirmi üç CenH3 protein sekansindan olusmaktadir. Bu veri tabam temel olarak üç amaca hizmet etmistir: i) literatürde yer alan kriterler dogrulanmis ve yeni bir kriter literatüre kazandirilmistir. CenH3 ve H3 arasinda bir farklilik olarak V93L (S. lycopersicumsda V96L) mutasyonu yeni bir biyoinformatik kriter olarak tespit edilmistir. Ortak evrim iki farkli pozisyondaki amino asidin kendi aralarindaki korelasyonunun bir ifadesidir ve arastirmacinin mevzu bahis pozisyonlara yönelik yapisal veya fonksiyonel olarak degerlendirme yapmasinda olanak saglamaktadir. Genisletilmis CenH3 veri tabani kullanilarak yapilan ortak evrim çalismalari sonucu tasarlanacak thenH3 sentetik geninde gerçeklestirilecek mutasyonlarin proteinin üç boyutlu yapisi üzerine olan etkiler incelenmis ve önemli bilgiler elde edilmistir. Elde edilen bilgiler ve literatürde yer alan çalismalardan faydalanilarak tümlesik etki göstermesi beklenen, thenH3 tasiyacagi üç nokta mutasyon belirlenmistir; P498, G50E ve L96F. Biyoinformatik çalismalarin sonucunda kullanilacak mutant CenH3 ve CRISPR-Cas9 sistemini silahlandiracak sgRNAsler tasarlanmistir. 35062.34 Örnek 2- In vitro thenH3 eldesi Domates CenH3 proteininde P49 ve G50 dördüncü ekzonda, L96F ise besinci ekzonda yer almaktadir. thenH33nin kodlayan bölgesini üretmek için tüm ekzonlar titizlikle birlestirilmis ve kodon optimizasyonuna dikkat ederek P49S, G50E ve L96F mutasyonlari gerçeklestirilmistir. Buna göre, P49-CCA kodunu S49-TCT kodonu, G50-GGG kodonu E50-GAG kodonu ve son olarak L96-TTA kodonu F96-TTT kodonu ile degistirilmistir. Elde edilen thenH3 kodlayan bölgeye native gene ait ilk 3 intron, mutant genin hücre içi ifadesini arttirma potansiyeli nedeniyle eklenmistir. Baslatici (promoter) olarak NCBI veri tabaninda 204 baz çifti içeren bölge belirlenmis olsa da potansiyel ifade artirici elementleri kaybetmemek adina, "ifade baslangiç bölgesinin" -1500 gerisinden baslayacak sekilde tüm baz çiftleri baslatici olarak tasarima eklenmistir. uygulanan stratejinin herhangi bir sorun teskil etmesini önlemistir. Sonlandirici (terminator) olarak NCBI veri tabaninda 371 baz çifti içeren bir bölge belirlenmistir. Bu bölge bir bütün olarak sentetik gene eklendiginde toplam tasarim boyutu 2979 baz çiftine ulasmaktadir. Klonlamada kullanilmasi amaciyla sentetik gen tasarimin önüne sirasiyla "TTT" baglayici esliginde Xhol (CTCGAG) ve EcoRI (GAATTC), sonuna ise ayni baglayici esliginde Xbal (TCTAGA) ve BamHI(GGATCC) restriksiyon enzimleri tanima sekanslari eklenmistir. Sonuçta klonlamaya yardimci restriksiyon enzimi bölgeleri tasiyan thenH3 sentetik geni tasarlanmistir (Bkz. Teknik Resim ve Açiklamaya Yönelik Semalar, Sekil 1). Örnek 3- CRISPR/Cas9 sistemi 35062.34 Native CenH3 genini susturacak CRISPlUCas9 sistemini silahlandirmada kullanilacak sgRNAslari (kilavuz RNA) tasarlamak için "CrisprDirect" programi kullanilmistir. Çalismada native CenH3 (domates) genini nakavt etmek amaciyla iki kilavuz RNA kullanilmasi kararlastirilmistir. Kilavuz RNAslari belirlemek için CrisprDirect programina LOC sekansi girdi olarak sunulmustur. Tüm proteini susturmak için en etkili yöntem proteinin baslangicinda bir çerçeve kaymasi yaratmak oldugu için, kilavuz RNAslari belirlerken ilk ekzonlari hedef alinmistir. LOC104649437 girdisinden CrisprDirect 43 tanesinin yüksek seçicilikte oldugu, toplam 369 hedef RNA tespit etmistir. Yüksek seçicilikte olan hedef RNAslar referans genomda tarandiginda (domates genomu) hem tüm hedef düzeyinde (20 bp) hem de kismi hedef (12bp) düzeyinde sadece tek bir bölgeyi hedeflemektedir. Bu hedef RNAslardan iki tanesi birinci ve üçüncü eksonlari hedeflemeleri, aralarinda 507 bp mesafe bulunmasi, etkinlik açisindan herhangi bir sorun teskil etmemeleri sebebiyle seçilmis ve çalisma kapsaminda kullanilmistir (Bkz. Teknik Resim ve Açiklamaya Yönelik Semalar, Sekil 2). Tespit edilen kilavuzRNAslarin önüne ve sonuna (her sgRNA için ayri olacak sekilde) sirasiyla A.thaliana,ya ait U promoter ve terminator sekanslari eklenmistir. Daha sonra sekanslara, klonlamaya yardimci olmasi amaciyla ilk kilavuz RNASnin önüne Acll "AACGTT", Spel "ACTAGT" ve sonuna Pacl "TTAATTAA"; ikinci kilavuz RNASnin önüne Pacl ve sonuna Acll eklenmistir (Bkz. Teknik Resim ve Açiklamaya Yönelik Semalar, Sekil 3). Örnek 4 - Gen aktarimi Tasarlanan thenH3, kilavuz RNAslar ve Cas9 domatese Agrobacterium tumefaci'ens araciligiyla gen aktarimi yöntemi ile aktarilmistir. Agrobacterium tumefaci'ens suslari olarak EHA105 ve AGLl kullanilmistir. Domatesin sentetik genler (thenH3) ile transformasyonu amaciyla ilk olarak tasarlanan genler Ankara Sentegen firmasinda sentezlenmistir. Sentezlenen genler tarafimiza 35062.34 klonlama vektörüne (pTZS7R) klonlamis halde ulastirilmistir. Moleküler çalismalarda literatürde yer etmis standart yöntemler kullanilmistir. Klonlama vektöründen sentetik genler uygun restriksiyon enzimleri kullanilarak çikarilmis daha sonra Agrobacterium tumefaciens suslarinin transformasyonunda kullanilacak binary vektörlere aktarilmistir. Klonlama vektöründen çikarilan thenH3 pPZP212 vektörüne ve sgRNAslar pFGC-pcoCas9 vektörüne klonlanmistir. Transformasyona hazir hale getirilen vektörler elektroporasyon yöntemi ile Agrobacterium suslarina aktarilmistir (EHAlOS-pPZPZlZ-thenH3, AGLl- pcoCas9-sgRNA1-2). thenH3 nükleik asit dizine ait gösterim Dizi No 1 olarak verilmistir. Elde edilen transformant Agrobacterium suslarinin tasidiklari EHAlOS-pPZPZlZ- thenH3 ve AGLl-pPZPZlZ-thenH3 plazmitleri gerçeklestirilen restriksiyon enzimleri ile kesim ve PCR çalismalari ile dogrulanmistir (Bkz. Teknik Resim ve Açiklamaya Yönelik Semalar, Sekil 4). Elde edilen transformant Agrobacterium suslarinin tasidiklari EHAlOS-pFGC- pcoCas9-sgRNA1-2 ve AGL-pFGC-pcoCas9-sgRNA1-2 plazmitleri gerçeklestirilen restriksiyon enzimleri ile kesim ile dogrulanmistir (Bkz. Teknik Resim ve Açiklamaya Yönelik Semalar, Sekil 5). Prof. Dr. Nedim Mutlu ve Dr. Inanç Soylu tarafindan gerçeklestirilen moleküler, biyoteknolojik ve mikrobiyolojik çalismalarin sonunda arzu edilen vektörleri tasiyan Agrobacterium tumefaciens suslari elde edilmistir, domatesler bu suslar ile enfekte edilmistir. Örnek 5 - Doku kültürü 35062.34 Arzu edilen vektörleri tasiyan Agrobacterium tumefaciens suslari ile enfekte edilmis domates eksplantlari (yaprak dokusu parçalari) doku kültürüne alinmistir. Doç. Dr. Hasan Pinar ve ekibi tarafindan gerçeklestirilen doku kültürü çalismalari temel olarak 6 asamadan olusmaktadir (Bkz. Teknik Resim ve Açiklamaya Yönelik Semalar, Sekil 6.) Ilk asama, "Tohum Çimlendirme"de, tohumlar sterilizasyon isleminin ardindan çimlendirilmektedir. Ikinci asama, "Enfeksiyon Öncesi"nde çimlendirilen tohumlardan kotiledon yapraklar kesilerek eksplantlar elde edilmektedir. Üçüncü asama, "Enfeksiyon"da eksplantlar ve transformasyon vektörlerini tasiyan A. tumefaciens kültürleri birlestirilmekte, bakterilerin bitki dokusunu enfekte etmesi saglanmaktadir. Dördüncü asama, "Sürgün Tetikleme"de transformant bitki hücrelerinden uygun antibiyotik seleksiyonunda sürgünler olusmaktadir. Besinci asama, "Kök Tetikleme"de eksplanttan ayrilan ve yeterince gelisme gösteren sürgünlerden kök olusmaktadir. Altinci ve son asama, "Aklimatizasyon"da alt ve üst aksami olusan transgenik bitkilerin ortam sartlarina uyumu saglanmaktadir. Doku kültürü için kullanilan kimyasallar ve miktarlari Tablo 1,de paylasilmistir. Tablo 1. Doku kültürü çalismalari için kullanilan kimyasallar ve miktarlari. Asama Ortam Içerigi Tohum 2,15 g of Murashige ve Skoog (MS) tuzlari, 10 g sükroz, 6 Çimlendirme g agar, pH 5,8 4,3 g of Murashige ve Skoog (MS) tuzlari, 0,56 g MES, 2 Enfeksiyon _ _ _ _ _ Oncesi tiyamin, 100 ug kinetin, 30 g sükroz, 8 g agar, pH 5,8 35062.34 Enfeksiyon 4,3 g of Murashige ve Skoog (MS) tuzlari, 0,56 g MES, 2 mg/L zeatin, 2 ml 100mM asetosiringon, 100 ug indol- asetik asit, 10 ml nitsch vitaminleri, 30 g sükroz, 7 g agar, pH 5,8 Sürgün Tetikleme 4,3 g of Murashige ve Skoog (MS) tuzlari, 0,56 g MES, 2 mg/L zeatin, 100 ug indol-asetik asit, 50 mg/L kanamisin, 100 mg/L timentin, 10 ml/L nitsch vitaminleri, 30 g sükroz, 8 g agar, pH 5,8 Kök Tetikleme 4,3 g of Murashige ve Skoog (MS) tuzlari, 0,56 g MES, 2 mg/L zeatin, 100 ug indol-asetik asit, 50 mg/L kanamisin, 100 mg/L timentin, 10 ml/L nitsch vitaminleri, 30 g sükroz, 8 g agar, pH 5,8 Aklimatizasyon Bitki büyütme kabininde 24-28°C sicaklikta 16:8 fotoperiyot Doku kültürü çalismalarinda eksplantlar, pPZP212-thenH3 ve pFGC-pcoCas9- sgRNAl-Z transformasyon vektörlerinin 1:1 oranda karisimi ile elde edilen inIiltrasyon sivisi ile enfekte edilmistir. Bu nedenle doku kültürü çalismalarindan üç sonucun elde edilmesi beklenmektedir; 1. Her iki plazmit (pPZP ile domates transformasyonu saglanir. Domates hem thenH3 genini hem de CRISPR-Cas9 sistemini tasir. 2. Sadece pPZP212-thenH3 ile domates transformasyonu saglanir. Domates sadece thenH3 trans genini tasir. 35062.34 3. Sadece pFGC-pcoCas9-sgRNA1-2 ile domates transformasyonu saglanir. Domates sadece CRISPR-Cas9 sistemini tasir. Çalisma sonucu üstte bahsedilen senaryolardan birincisine yönelik hiçbir bitki elde edilememistir. Yukarida yer alan listedeki ikinci senaryoya yönelik toplamda 8 bitki bulusun ilerleyen olgunluk seviyelerinde yer alan melezleme çalismalarinda kullanilacaktir (T2 ve ileri ki popülasyonlarda). Yukarida yer alan listedeki üçüncü senaryoya yönelik sadece bir bitki elde edilmistir (B39, Bkz. Teknik Resim ve Açiklamaya Yönelik Semalar, Sekil 7). Bitki B39 fenotipik olarak zayif, gelisimi oldukça yavas bir bitki olarak dikkat çekmektedir. Bitkinin yaprak yüzey alani küçük olmasi ve yapraklarinin kivrik olmasi sebebiyle ayni gelisim seviyesindeki bir domates ile kiyaslandiginda hacimce yaklasik üçte bir oranindadir. Çiçeklenme dönemine de oldukça yavas ulasan B39, ilk üç salkim çiçegini gerçeklestirilen tüm kendileme çabalarina ragmen meyve tutmamistir. Ancak daha sonraki kendileme saglanmis ve meyvenin çiçek tutmasi basarilmistir. Olgunlasan meyvelerden 50 tohum elde edilmistir. Tohumlar (Tl), mutant karakterlerinin belirlenmesi amaciyla çimlendirilip, fideler yetistirilmis ve seraya dikilmistir. B39 genotipik olarak CRISPR-Cas9 ve sgRNAslari tasimaktadir (Bkz. Teknik Resim ve Açiklamaya Yönelik Semalar Native cenH3p proteininde kilavuz RNA 2,nin hedefledigi bölge AAAAAGTCCAAGGTCTGCACCGG,dir. "CGG" PAM sekansini ifade etmektedir. B393dan CTAB metoduna göre DNA çikarilmis ve CenH3 lokusu taranmis, yapilan sekanslama sonucu B393un sahip oldugu CenH3 allelerinden birinde -3 delesyon tespit edilmistir (Bkz. Teknik Resim ve Açiklamaya Yönelik 35062.34 Semalar, Sekil 9). Diger allel wt (Wild-type) durumundadir. -3 delesyon native CenH3 proteininde 33 pozisyonda yer alan alanin (A) amino asidinin silinmesine yol açmistir (Bkz. Teknik Resim ve Açiklamaya Yönelik Semalar, Sekil 10). Bulusun ilerleyen olgunluk seViyelerinde B39T1 popülasyonundan seçili bireyler melezlendirilip, nullCenH3+thenH33ne tasiyan bireyler tespit edilmistir. Sonraki asamada, bu bireyler ile ticari hibritler melezlenecek ve nihai popülasyon haploid bireyler bakimindan taranacaktir. Ilaveten, son bir ayda yaptigimiz analizlerde cenH3 heterozigot null-mutasyonu (WW) tasiyan bitkileri ana olarak kullandigimiz üç farkli hibriti baba olarak kullandigimiz melezlerden %1.6 ile %8 arasinda çift haploid bitki elde ettik. TR TR TR