CN101768603B

CN101768603B - 一种可高效清除环境污染物的转基因矮牵牛的培育方法

Info

Publication number: CN101768603B
Application number: CN 201010039820
Authority: CN
Inventors: 向太和; 张道祥; 胡江琴; 王利琳; 庞基良
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2010-01-21
Filing date: 2010-01-21
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2030-01-21
Also published as: CN101768603A

Abstract

本发明提供了一种可高效清除环境污染物的转基因矮牵牛的培育方法，所述方法包括：将含有CYP2E1基因的载体pSLD50-6转入发根农杆菌K599，利用农杆菌转基因法获得转CYP2E1基因的转基因毛状不定根，毛状不定根在MS+BA 1.0mg/L的培养基上诱导出愈伤组织，愈伤组织在MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L培养基上获得丛生芽，丛生芽在MS+NAA 0.1mg/L培养基上再生植株，获得转基因矮牵牛。本发明获得的矮牵牛可用于清除室内苯和甲苯等空气污染物，十分有利于人民的身心健康，有利于提高人民的生活品质，有利于生态环境建设。

Description

一种可高效清除环境污染物的转基因矮牵牛的培育方法

(一)技术领域

本发明涉及一种可高效清除苯、甲苯等环境污染物的转基因矮牵牛的培育方法。

(二)背景技术

苯和甲苯在油漆、染色剂、粘合剂、墙纸、地毯、合成纤维、清洁剂和一些有机溶剂等化工原料中广泛使用，是室内环境污染的主要危害气体之一；此外，在图文传真机、电脑终端机和打印机使用过程中也产生苯和甲苯的污染，烟草的烟雾和汽油的尾气中也含有苯和甲苯，而苯和甲苯具有极强的致癌性(王桂华，周中平，傅立新.《室内空气中苯和甲苯浓度分布特征调查》.上海环境科学，2003，22(12)：977-978，982；沈学优，罗晓璐，朱利中.《空气中挥发性有机化合物的研究进展》.浙江大学学报(理学版)，2001，28(5)：547-556)。对于室内苯和甲苯等污染物造成的空气污染，人们通常采取的方法是开窗通风换气，但由于装修、办公和起居生活产生的苯、甲苯等污染物都是缓慢长期释放的(庄晓虹，胡筱敏，孙承智.《室内空气中挥发性有机物的释放特征分析》.环境污染与防治，2008，30(12)：102-105)，其对入住的户主危害性极大。

利用植物净化空气化学污染是一种经济、有效、非破坏型的环境污染修复方式。植物净化化学性大气污染的主要过程是持留和去除，持留过程涉及植物截获、吸附和滞留等，去除过程包括植物吸收、降解、转化、同化和超同化等，而且这项技术更容易与环境融为一体，种下的花草更能满足绿化和审美的要求。(李长阁，于涛，傅桦，赵同科.《转基因植物修复重金属污染土壤研究进展》.土壤，2007，39(2)：181-189；廖晓勇，陈同斌，阎秀兰，聂灿军.提高植物修复效率的技术途径与强化措施.环境科学学报，2007，27(6)：881-892)。但遗憾的是，只有部分自然存在的植物对空气污染物具有一定的分解净化功能，并且其效率非常低。转基因技术为提高植物的环境修复能力提供了基础(胡光珍，王幼芳，何玉科.转基因植物对有机污染物的吸收、转化和降解.植物生理与分子生物学学报，2005，31(4)：340-346。Van Aken B.Transgenic plants for phytoremediation：helpingnature to clean up environmental pollution.Trends Biotechnol，2008，26(5)：225-227)。细胞色素P4502E1是哺乳动物肝脏中存在的一种分解酶，在动物体内对有机环境污染物具有很强的特异性分解功能(Gonzalez FJ.The2006Bernard B.Brodie Award Lecture CYP2E 1.Drug Metab Dispos，2007，35(1)：1-8。Lee SS，Buters JT，Pineau T，Femandez-SalgueroP，Gonzalez FJ.Role of CYP2E1 in the hepatotoxicity of acetaminophen.J Biol Chem，1996，271(20)：12063-12067)。

另一方面，矮牵牛(Petunia hybrida)是多年生草本花卉，被誉为“花坛花卉之王”。它既可以地栽布置花坛；又适宜盆植吊植、美化阳台居室，深受人们喜爱，在世界各地广泛种植。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可高效清除苯、甲苯等环境污染物的转基因矮牵牛的培育方法。

本发明采用的技术方案是：

一种可高效清除环境污染物的转基因矮牵牛的培育方法，所述方法包括：

(1)将含有CYP2E1基因(GenBank登记号M15061)的质粒导入发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，筛选得到抗性菌落；CYP2E1基因是P450酶基因家族中的成员之一，在哺乳动物肝脏组织中特异性表达，其编码蛋白在代谢小分子有机污染物中起重要作用。

(2)步骤(1)抗性菌落的单克隆菌液侵染带有伤口的野生型矮牵牛(Petunia hybrida)叶片，培养获得转基因毛状不定根；

(3)步骤(2)转基因毛状不定根在含苄氨基嘌呤1.0mg/L的MS培养基中培养获得愈伤组织，愈伤组织在含苄氨基嘌呤1.0mg/L+α-萘乙酸0.4mg/L的培养基中培养获得丛生芽，丛生芽在含α-萘乙酸0.1mg/L的培养基中培养获得转基因矮牵牛的再生植株。

所述含有CYP2E1基因的质粒可自行构建，采用现有已知质粒，本发明中，所述质粒为质粒pSLD50-6，由美国华盛顿大学Doty教授惠赠。

本发明中，所述发根农杆菌为发根农杆菌K599。发根农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。

所述环境污染物是指苯或其衍生物，优选的，所述环境污染物为苯或甲苯。

具体的，所述步骤(1)为：在发根农杆菌K599感受态细胞中加入pSLD50-6的纯化质粒DNA，混匀后冰上放置10min，置于液氮速冻5min，28℃水浴热激5min，加入LB液体培养基于28℃振荡培养2h后，取菌液涂布于含卡那霉素50mg/L+链霉素50mg/L的LB固体培养基，28℃培养48h后，筛选得到抗性菌落。

具体的，所述步骤(2)为：抗性菌落经活化培养后，在含卡那霉素50mg/L+链霉素50mg/L的MS液体培养基中28℃下振荡培养至OD600为0.4～0.6，离心，收集的菌体细胞经清洗后进行浸染操作；将带有伤口的野生型矮牵牛的叶片预培养于含乙酰丁香酮20mg/L的MS液体培养基3d后，用收集的抗性菌落的菌体细胞侵染8min，再转入含乙酰丁香酮20mg/L的MS液体培养基共培养3d，经含头孢霉素500mg/L的MS液体培养基清洗后转入含苄氨基嘌呤1.0mg/L+卡那霉素50mg/L+头孢霉素500mg/L的MS液体培养基中，长出不定根后，将不定根转入含头孢霉素500mg/L+卡那霉素50mg/L的MS液体培养基中除菌和繁殖，获得转基因毛状不定根。

本发明首先将含有CYP2E1基因的载体pSLD50-6和含有对照GUS基因的载体pKH200分别转入发根农杆菌K599，利用农杆菌转基因法获得转CYP2E1和对照GUS基因的转基因毛状不定根，毛状不定根在MS+BA 1.0mg/L的培养基上诱导出愈伤组织，愈伤组织在MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L培养基上获得丛生芽，丛生芽在MS+NAA 0.1mg/L培养基上再生植株。经过PCR分析，再生植株含有目的基因和rolB基因。随机选取3株转CYP2E1基因的再生植株、1株转GUS基因的对照植株和1株野生型(非转基因)植株分别提取植株总RNA，用GAPDH基因做内参进行荧光定量PCR分析，结果显示转CYP2E1基因的再生植株中，外源CYP2E1基因均高效表达，含GUS基因的对照植株和野生型植株则没有检测到CYP2E1的表达信号。利用气相色谱定量分析转基因再生株系对苯和甲苯的吸收情况，结果(r²＞0.99，p＜0.05)显示在含有5mL MS液体基本培养基的20mL的有机物分析瓶中，同时加入42.5μg苯和15μg甲苯，6天后0.75g鲜重的转CYP2E1基因的再生植株材料，对苯的吸收率达59.03％、对甲苯的吸收率达75.74％，转CYP2E1基因的再生植株在清除环境中的苯、甲苯的能力极显著地提高；而对照转GUS基因的植株和野生型植株对苯和甲苯的吸收无明显变化。

本发明的有益效果主要提现在：本发明获得的矮牵牛可用于清除室内苯和甲苯等空气污染物，十分有利于人民的身心健康，有利于提高人民的生活品质，有利于生态环境建设。

(四)附图说明

图1为质粒pSLD50-6图谱；

图2矮牵牛转CYP2E1基因的不定根和再生植株；A：诱导出的不定根；B：不定根诱导的愈伤组织；C：再生植株；D：自然生长的再生植株；

图3矮牵牛转CYP2E1基因再生植株的PCR鉴定；A：CYP2E1基因扩增结果(1：野生型发根农杆菌K599自身携带的Ri质粒；2：组织培养再生的植株；3～9：转CYP2E1基因植株)；B：rolB基因扩增结果(1：质粒pSLD50-6；2：组织培养再生的植株；3～9：转CYP2E1基因植株)；图4为荧光定量RT-PCR分析CYP2E1基因在转CYP2E1基因、转GUS基因和野生型(非转基因)植株中表达情况；

图5为气相色谱分析转CYP2E1基因、转GUS基因、野生型(非转基因)矮牵牛植株对苯的分解吸收情况；

图6为气相色谱分析转CYP2E1基因、转GUS基因、野生型(非转基因)矮牵牛植株对甲苯的分解吸收情况；

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.材料与方法

1.1材料

矮牵牛(Petunia hybrida)品种为QL01，利用离体叶片组织培养获得无菌苗。野生型发根农杆菌K599由杭州师范大学生命与环境科学学院植物学重点实验室保存，含CYP2E1基因的质粒pSLD50-6(质粒图谱见图1)以及对照含GUS基因的质粒pKH200均由美国华盛顿大学Doty教授惠赠。

1.2质粒pSLD50-6和pKH200导入野生型发根农杆菌K599

利用冻融法将质粒pSLD50-6和pKH200分别转入发根农杆菌K599，即在100μLK599感受态细胞中加入约0.1μg纯化质粒DNA，混匀后在冰上放置10min，置于液氮速冻5min，立即用28℃水浴热激5min，加入500μL LB液体培养基，在28℃缓慢振荡培养2h。取100μL菌液分别涂布于LB+Km(卡那霉素)50mg/L+Str(链霉素)50mg/L固体培养基上，28℃培养约48h筛选抗性菌落。

1.3矮牵牛转基因不定根的诱导和植株再生

参考王琳和向太和的方法(王琳，向太和.《矮牵牛F3′，5′H全长cDNA的克隆及花特异启动子介导表达载体的构建》.热带亚热带植物学报，2009，17(4)：358-364)，利用改良的叶盘法对矮牵牛叶片外植体进行遗传转化，即：发根农杆菌K599/pSLD50-6或pKH200于LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L平板中划线28℃活化后，挑取单克隆于LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L液体培养基中28℃，200r/min过夜培养。取1mL菌液移入50mL的MS+Km 50mg/L+Str 50mg/L液体培养基中28℃，200r/min培养至OD₆₀₀为0.5左右，离心管收集菌液并用MS液体培养基悬浮清洗3次。在无菌条件下侵染事先预培养于MS+As(乙酰丁香酮)20mg/L3d带有伤口的叶片8min，转入MS+As 20mg/L固体培养基共培养3d后，经MS+Cef(头孢霉素)500mg/L液体培养基清洗3次后转入MS+6-BA 1.0mg/L+Km 50mg/L+Cef500mg/L的筛选培养基中。待长出不定根后，将不定根转入MS+Cef500mg/L+Km 50mg/L培养基中除菌和繁殖。

根据CYP2E1基因(GenBank登记号M15061)和GUS基因(GenBank登记号AF354045)设计引物：

CYP2E1-P1：5′-TGAAGGGTGTGCAGCCGATGACAA-3′

CYP2E 1-P2：5′-CATCGGGAATCTTCTCCAGTTGG-3′，

GUS-P 1：5′-CTGCGACGCTCACACCGAT-3′，

GUS-P2：5′-TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3′；

同时，参考王琳和向太和的方法(王琳，向太和.《矮牵牛F3′，5′H全长cDNA的克隆及花特异启动子介导表达载体的构建》.热带亚热带植物学报，2009，17(4)：358-364)，利用引物rolB-P1：5′-GCCAGCATTTTTGGTGAACT-3′和rolB-P2：5′-CTGGCCCATCGTTCTAAAAAA-3′对获得的CYP2E1基因和GUS基因的不定根的基因组DNA进行PCR扩增鉴定。

除菌繁殖后的不定根在MS+BA 1.0mg/L的培养基上诱导愈伤组织，愈伤组织在MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L培养基获得丛生芽，丛生芽在MS+NAA 0.1mg/L培养基上再生根获得完整植株。此外，同不定根的方法对再生植株进行PCR扩增鉴定。

1.4矮牵牛转基因植株CYP2E1基因的荧光定量RT-PCR分析

提取植株总RNA，用Fermentas公司试剂盒RevertAid^TM First StrandcDNA Synthesis Kit进行RT-PCR扩增，荧光定量PCR扩增试剂为TaKaRa公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix。根据矮牵牛GAPDH基因序列(GenBank登记号GQ122207)设计引物，GAPDH-F：5′-AGCAAGGCAGTTAGTGGTGCA-3′和GAPDH-R ：5′-TTGTGATCTCCGCTCCTAGCA-3′，扩增结果作为内参。根据CYP2E1基因序列设计引物，CYP2E 1-F：5′-ATTCCCAAGTCCTTTGGCAGG-3′；CYP2E 1-R：5′-TGTGGTTCAACAGCATCTCCC-3′，进行CYP2E1基因的定量分析。用Roche LightCycler 480荧光定量PCR仪型进行扩增，荧光定量PCR条件是起始95℃2min，随后95℃30s、59℃30s、72℃20s进行40循环，结束后在4℃保存。参考schmittgen和Livak的方法计算相对表达量＝2-(cT处理-CT内参)(Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-timePCR data by the comparative C(T)method.Nat Protoc，2008，3(6)：1101-1108)。

1.5矮牵牛转基因植株对苯和甲苯吸收能力的气相色谱分析

在20mL的挥发性有机物分析瓶(VOA(volatile organic analysis)vial)内盛放5mL MS液体基本培养基，灭菌。在超净工作台上无菌切取称量相同质量(0.75g)的转基因无菌苗植株、对照无菌植株的叶茎放入VOAvial中，并设置空白对照瓶(仅有培养基而无植物材料)，用塑料膜封口，放入组织培养室的摇床上，100r/min，22～24℃，光照16h/d。1d后，用微量加样器向VOA vial中加入42.5μg苯、15μg甲苯，用带放气阀的瓶盖封口，继续在上述的培养条件下培养。平衡培养2h后，用气密性气体取样器进行第1次取样，用Aglient型号为6890N的气相色谱仪，色谱柱型号为DB-624(30m×0.53mm×3.0um)进行检测。检测条件为进样口温度为200℃，检测组温度250℃，分流比为5∶1，用N₂以4.0mL/min恒流洗脱，柱温60℃，5min，并以20℃/min升到200℃并保持5min，顶空80℃，30min。随后2d(48h)、4d(96h)和6d(146h)分别取样进行气相色谱分析。

2.结果与分析

2.1矮牵牛转基因不定根和再生植株的获得

矮牵牛无菌苗离体叶片在发根农杆菌侵染后10d左右，切口边缘长出白色小突起；15d左右，切口边缘长出明显可见的白色不定根(图2A)；而未经发根农杆菌侵染的外植体未见根的生成。待不定根长到5cm左右，切成两段，培养在无任何植物激素的MS+Cef 500mg/L+Km 50mg/L上除菌。在该培养基上不定根生长旺盛，15～20d即可形成大量毛状分枝的不定根。除菌后的转基因不定根在MS+BA 1.0mg/L培养基中培养，15d左右不定根出现绿色愈伤组织(图2B)。愈伤组织在MS+BA 1.0mg/L+NAA0.4mg/L培养基上45d左右，绿色愈伤组织分化出丛生芽，丛生芽在MS+NAA 0.1mg/L培养基上再生出根而形成完整植株(图2C)，且植株在形态上表现出矮生和丛生分枝状。

根据CYP2E1基因序列设计的引物CYP2E1-P1和CYP2E1-P2对转CYP2E1基因植株和质粒pSLD50-6均扩增出410bp的条带；而组织培养再生的植株未能扩增出任何条带。根据rolB基因序列设计的引物rolB-P1和rolB-P2对随机选取的7个转CYP2E1基因和野生型发根农杆菌K599自身携带的Ri质粒均扩增出约500bp大小的条带，而组织培养再生的植株未能扩增出条带。图3)。

2.2转CYP2E1基因矮牵牛植株荧光定量RT-PCR

在随机选取的3株转CYP2E1基因的再生植株、1株转GUS基因的对照植株和1株野生型(非转基因)植株中，用GAPDH基因做内参进行荧光定量PCR分析，结果显示转CYP2E1基因的再生植株中，外源CYP2E1基因均高效表达，含GUS基因的对照植株和野生型植株则没有检测到CYP2E1的表达信号(图4)。

2.3转CYP2E1基因矮牵牛植株对苯和甲苯的分解吸收能力

利用气相色谱定量分析转基因再生株系对苯和甲苯的吸收情况，结果(r2＞0.99，p＜0.05)显示在含有5mL MS液体基本培养基的20mL的有机物分析瓶中，同时加入42.5μg苯和15μg甲苯，6d后0.75g鲜重的转CYP2E1基因的再生植株材料对苯的吸收率达59.03％、对甲苯的吸收率达75.74％，分析瓶中苯和甲苯的含量显著地下降；而对照转GUS基因的植株和野生型植株对苯和甲苯的吸收无明显变化(图5和6)。

3.结论

植物在近地表大气污染物的清除中起着重要作用，利用植物净化空气污染是一种经济、有效、非破坏型的环境污染修复方式；而且这项技术更容易与环境融为一体，种下的花草更能满足绿化和审美的要求。但遗憾的是只有部分自然存在的植物对空气污染物具有一定的分解净化功能，并且其效率非常低。转基因技术为提高植物的环境修复能力提供了基础。

CYP2E1基因是P450酶基因家族中的成员之一，在哺乳动物肝脏组织中特异性表达，其编码蛋白在代谢小分子有机污染物中起重要作用。

本发明成功地通过发根农杆菌转基因技术，将细胞色素P4502E1酶基因(CYP2E1)转入矮牵牛中，获得CYP2E1基因高效表达的转基因植株，具有高效清除苯和甲苯的能力。本发明获得的转CYP2E1基因花卉矮牵牛，在生产上具有实用性，这为利用花卉园艺植物降低室内空气中苯和甲苯的污染提供了一条新途径。此外，本发明使用的是发根农杆菌转基因法，获得的转基因植株在形态上表现出矮生和丛生分枝状，因此也有利于选育出新异形态的矮牵牛育种材料。

SEQUENCE LISTING

<110>杭州师范大学

<120>一种可高效清除环境污染物的转基因矮牵牛的培育方法

<130>

<160>10

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

tgaagggtgt gcagccgatg acaa 24

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

catcgggaat cttctccagt tgg 23

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

ctgcgacgct cacaccgat 19

<210>4

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<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

tcaccgaagt tcatgccagt ccag 24

<210>5

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<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>5

gccagcattt ttggtgaact 20

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<220>

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ctggcccatc gttctaaaaa a 21

<210>7

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<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>7

agcaaggcag ttagtggtgc 20

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<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

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<223>人工序列

<400>8

ttgtgatctc cgctcctagc a 21

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>9

attcccaagt cctttggcag g 21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>10

tgtggttcaa cagcatctcc c 21

Claims

1.一种可高效清除环境污染物的转基因矮牵牛的培育方法，所述方法包括：

(1)将含有GenBank登记号为M15061的CYP2E1基因的质粒导入发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，筛选得到抗性菌落；

(2)抗性菌落经活化培养后，在含卡那霉素50mg/L+链霉素50mg/L的MS液体培养基中28℃下振荡培养至OD600为0.4～0.6，离心，收集的菌体细胞经清洗后进行浸染操作；将带有伤口的野生型矮牵牛(Petunia hybrida)的叶片预培养于含乙酰丁香酮20mg/L的MS液体培养基3d后，用收集的抗性菌落的菌体细胞侵染8min，再转入含乙酰丁香酮20mg/L的MS液体培养基共培养3d，经含头孢霉素500mg/L的MS液体培养基清洗后转入含苄氨基嘌呤1.0mg/L+卡那霉素50mg/L+头孢霉素500mg/L的MS液体培养基中，长出不定根后，将不定根转入含头孢霉素500mg/L+卡那霉素50mg/L的MS液体培养基中除菌和繁殖，获得转基因毛状不定根；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有CYP2E1基因的质粒为质粒pSLD50-6。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发根农杆菌为发根农杆菌K599。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述环境污染物为苯或甲苯。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)为：在发根农杆菌K599感受态细胞中加入pSLD50-6的纯化质粒DNA，混匀后冰上放置10min，置于液氮速冻5min，28℃水浴热激5min，加入LB液体培养基于28℃振荡培养2h后，取菌液涂布于含卡那霉素50mg/L+链霉素50mg/L的LB固体培养基，28℃培养48h后，筛选得到抗性菌落。