CN100588707C - 一种培育低重金属积累植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育低重金属积累植物的方法。该方法包括以下步骤：1)构建含有“植物重金属吸收相关基因cDNA-内含子-植物重金属吸收相关基因cDNA”结构的RNAi表达载体；2)将步骤1)的RNAi表达载体转化植物，获得低重金属积累植物。本发明的方法具有广泛的适用性，可实现在重金属污染的土地上生产的粮食既耐受重金属离子而又在食用部分(种子)不积累或低积累重金属，以获得新型优质的安全作物品种。

Description

一种培育低重金属积累植物的方法

技术领域

本发明涉及一种培育低重金属积累植物的方法。

背景技术

随着工业的发展，重金属污染已成为一个严重威胁人类生存的问题，其中镉(Cd)是此类污染物之一。据统计，我国受镉污染的农田面积已超过20万亩，有11处污灌区甚至达到了生产“镉米”的程度，如沈阳的张士灌区由于采用污水灌溉造成严重的镉污染，导致大面积水稻严重减产，且稻米含镉量超标。此外，成都东郊污灌区内稻米的含镉量最高可达1.65mg/kg，湖北大冶稻谷的含镉量最高可达1.7mg/kg。调查表明，污灌区居民每人每日摄取的镉量平均为558μg，大大超过了联合国粮农组织和世界卫生组织议定的每日每公斤体重1μg的最大可忍受值。重金属镉较其它重金属更容易被农作物吸收，因此更容易对人类健康造成危害。研究表明，长期摄入过量的镉，会影响体内其它有益元素的效能，导致肝肾损害、肺气肿、支气管炎、内分泌失调、食欲不振、失眠等疾病。2003年8月，Nature-Medicine发表文章指出镉有模拟雌激素的作用，即便低于每日每公斤体重1μg的剂量也会对机体造成影响，甚至可诱发子宫癌和乳癌。

针对农业土壤重金属污染严重的现实，国内外多从两方面入手解决这一难题。一方面，采用常规的物理或化学方法，如吸附固定法、络合浸提法，以及近年来新兴的生物修复技术来清除、净化受重金属污染的土壤。然而用吸附固定法、络合浸提法清除土壤污染的成本太高且收效甚微，难以进行大面积推广使用，尤其不适用于发展中国家。另一方面，近年来人们开始研究利用高等植物能够吸收和富集重金属的特性来净化被污染的土壤或水体的新技术，即植物修复技术，这是一种经济有效的去污净化方案，由于它可使金属回收具有潜在的经济价值，还能保持土壤结构和微生物活性，因此被土壤及环境专家视为集“生态效益、环境效益、经济效益与社会效应”于一体的原位绿色技术。但是目前国内外尚没有通过现代分子调控技术培育对重金属高耐受低吸收农作物，特别是开发在农作物食用部分不积累重金属的关键技术的研究。

RNA干涉技术(RNA interference，简称RNAi)是指一些双链RNA能够特异地诱导产生一种能够识别并降解这样的RNA序列的RNase，从而在转录后的水平上强烈地抑制该类基因的表达，即利用上述双链RNA使目的基因沉默的技术。当已知某个或某类具有特定功能基因的cDNA序列时，可将该cDNA片段与一段能够被预期的宿主细胞识别并切除的内含子序列构建成“cDNA-内含子-cDNA”的结构，将其转化进入宿主细胞后，细胞内的核酸酶就会将转录出的RNAi结构中的由内含子片段转录的部分切除，形成一段由cDNA转录出的双链RNA结构，而该双链RNA结构会诱导宿主细胞合成一种RNase，该RNase可特异地识别并降解宿主细胞内正常转录的目的基因的mRNA，从而抑制该基因的表达。

研究表明，植物络合素(Phytochelatins，PCs)是一种可以有效地螯合镉(Cd)等重金属的多肽物质，在植物对重金属Cd的抗性机制中起重要作用。PCs主要通过络合与区室化作用来对重金属离子特别是镉离子起解毒作用。经过不同途径进入液泡的低分子量PCs-Cd复合物在液泡中最终形成高分子量的PCs-Cd复合物，Cd被有效地与细胞中的其它生物分子隔离。在液泡的酸性环境中，虽然S^2-、SO₃ ^2-可对高分子量的Cd-PCs复合物起到稳定作用，但是此复合物还是可能发生降解。降解后游离出的Cd²⁺可被液泡中含量丰富的有机酸如苹果酸、柠檬酸、草酸等所沉淀，而复合物中的多肽成分将被分解为氨基酸，氨基酸又可进入细胞质中，参与下一轮PCs的合成或其它代谢过程。目前已知植物络合素不是基因的直接表达产物，而是以谷胱甘肽为底物的酶促反应的产物，其中植物络合素合酶(Phytochelatin synthase，PCS)是合成该多肽物质的关键酶。目前为止，包括水稻在内的十几种植物的PCS基因已被克隆并进行了序列测定。水稻的PCS基因与重金属尤其是镉的吸收有关。

统计资料表明，全世界水稻的平均播种面积近20亿公顷，几乎有一半人口(主要集中在亚洲)以水稻作为主要食品。水稻也是我国重要的粮食作物，种植面积占粮食作物总面积的30％左右，稻谷产量占粮食总产量的50％左右，平均亩产超过350公斤，比世界平均产量高40％，全国约有6亿多人以水稻为主食。目前我国的一些水稻主产区，由于污水灌溉、化肥及杀虫剂的过量使用导致土壤重金属离子污染，并造成稻米中重金属含量超标，由此引发的粮食安全问题日趋为公众所关注。但是以我国现阶段的社会、经济条件，又不可能对这些粮食产区进行土地的废耕处理，并且在目前的流通和监管体制下，也无法阻止这些受污染粮食流入市场。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育低重金属积累植物的方法。

本发明所提供的培育低重金属积累植物的方法，包括以下步骤：

1)构建含有“植物重金属吸收相关基因cDNA-内含子-植物重金属吸收相关基因cDNA”结构的RNAi表达载体；

2)将步骤1)的RNAi表达载体转化植物，获得低重金属积累植物。

当所述RNAi表达载体的启动子为组成型启动子(如Ubiquitin启动子)时，可培育整个植株中低重金属积累的植物；当所述RNAi表达载体的启动子为组织特异性启动子(如ZMM1启动子)时，可培育目标组织和器官中低重金属积累的植物。

所述Ubiquitin启动子是一个来源于玉米的组成型表达的强启动子，所述ZMM1启动子来源于玉米，可启动外源基因在种子中表达。

所述植物重金属吸收相关基因可为植物络合素基因、ABC转运蛋白基因或金属硫蛋白基因。

所述内含子的大小为300-700bp，任意一个植物基因组的内含子序列均能达到本发明的目的，但最好是来源于目标植物。

本发明的方法较适合于培育如下低重金属积累的植物，如低Cd、Cu、As或Pb等多种重金属元素积累的植物，尤其是低镉积累植物(水稻、玉米或小麦等)，特别适合于培育低镉积累水稻。

当培育低镉积累水稻时，所述植物络合素基因可为水稻植物络合素基因片段。

所述水稻植物络合素基因片段可为具有序列表中序列1的核苷酸序列或为序列1的5’至3’端第4-434位碱基共431bp的核苷酸片段。

其中，序列表中的序列1由1422个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第1422位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。

用于构建所述RNAi表达载体的出发载体可为基因工程领域中的植物表达载体，如pTCK303、pCAMBIA1301(CAMBIA)或pBI121(CLONTECH)等；优选为含有ubiquitin启动子和NOS基因终止子的载体pTCK303。

以pTCK303为出发载体构建的含有水稻植物络合素基因(OsPCS1)片段的RNAi表达载体为pUbi-RNAi-OsPCS1；为了特异地降低种子中重金属Cd的累积量，还可将pUbi-RNAi-OsPCS1中的ubiquitin启动子切除后，将其与种子特异启动子ZMM1重新连接，获得RNAi表达载体pZMM1-RNAi-OsPCS1。

所述转化植物的方法可为农杆菌介导法、基因枪介导转化法或花粉管通道法，优选为农杆菌介导转化法。

所述转化用农杆菌优选为农杆菌EHA105。

以pUbi-RNAi-OsPCS1为RNAi表达载体转化水稻为例，说明本发明方法的原理：pUbi-RNAi-OsPCS1通过农杆菌介导整合到水稻细胞染色体之后，内含子和其两端的OsPCS1片段在Ubiquitin启动子的控制之下转录，转录后内含子被切除，从而形成大量的OsPCS1片段的发夹结构。Dicer酶复合物将结合这个发夹结构，然后又以其为模板与水稻内源OsPCS1的mRNA结合，并以大约22bp左右的间隔将其切割，从而抑制OsPCS1的表达。

本发明利用含有种子特异性启动子ZMM1的RNAi表达载体pZMM1-RNAi-OsPCS1转化水稻，实现了在水稻种子中特异地抑制OsPCS1的表达，获得了在种子中低镉积累的水稻(与对照相比降低了76％)。本发明的方法具有广泛的适用性，可实现在重金属污染的土地上生产的粮食既耐受重金属离子而又在食用部分(种子)不积累或低积累重金属，以获得新型优质的安全作物品种。

附图说明

图1为重组载体pUbi-RNAi-OsPCS1的构建示意图

图2为重组载体pZMM1-RNAi-OsPCS1的构建示意图

图3为未转化的水稻愈伤组织

图4为转化的水稻愈伤组织

图5为开始分化的水稻转化愈伤组织

图6为移栽的转基因水稻

图7为转基因水稻幼苗

图8为GUS检测结果

图9为PCR法检测转基因植株的琼脂糖凝胶电泳图谱

图10为转基因植株和野生型水稻种子中的OsPCS1 RT-PCR定量分析结果

图11为转基因水稻叶、颖壳和种子中的OsPCS1 RT-PCR定量分析结果

图12a为水稻SRNAi-09株系与对照茎、叶、颖壳和稻米中镉积累的比较

图12b为水稻SRNAi-09株系与对照根中镉积累的比较

具体实施方式

实验材料及化学试剂

1、质粒

质粒pCAMBIA1301为CAMBIA产品，pUC19购自TaKaRa公司。

2、植物材料

水稻品种采用粳稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)，其萌发条件为：将水稻种子置于铺有湿滤纸的培养皿中，室温下置于暗处，3-4天后发芽，再将其置于光照条件下继续培养7天，用于提取RNA。

3、化学试剂

所用限制性内切酶，mRNA selective kit，LA Taq DNA合成酶，dNTP均购于TaKaRa生物技术公司；SMART^TM cDNA Library Construction Kit，SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit购于Clontech公司；pGEM-T Easy载体购于Promega公司；Trizol，Superscript Reverse Transcriptase购于Invitrogen公司；其它常用化学药品购于华美生物工程公司、北京化学试剂公司；引物由上海生工生物工程公司和博亚公司合成，序列测定工作由基康公司和博亚生物技术公司完成。

下述实例中所用实验方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、OsPCS1表达被抑制的转基因水稻的获得及其表达检测

一、水稻RNAi载体的构建

1、水稻总RNA的提取

包括以下步骤：

1)取100mg萌发7天的水稻幼苗，置液氮中研磨至粉状，加入1ml Trizol试剂，混匀后12000rpm离心5分钟，取上清；

2)将步骤1)中的上清液用1∶1比例混合的苯酚氯仿溶液抽提两遍，离心取上清；

3)向步骤2)获得的上清中加入等体积的异丙醇，沉淀5分钟后4℃12000rpm离心5分钟，弃上清；

4)将步骤3)中获得的沉淀用70％乙醇洗两遍；

5)将步骤4)的沉淀在室温下干燥10分钟，再将沉淀溶于20μl DEPC处理水。

2、mRNA的纯化及浓缩

使用Oligotex mRNA Spin-Column Kit(Clontech公司)并参照其说明书对步骤1获得的水稻总RNA进行纯化及浓缩，得到含有水稻mRNA的浓缩液，具体步骤如下：

1)取250-500μg步骤1获得的水稻总RNA置于1.5ml离心管中，60℃加热3min；

2)加入RNase-free水至总体积为500μl，漩涡混合5sec；

3)加入500μl OBB缓冲液(Oligotex mRNA Spin-Column Kit自带)和30μlOligotex凝胶悬浮液(Oligotex mRNA Spin-Column Kit自带)后混匀，70℃保温3min；

4)室温放置10min后，15000rpm离心3min，弃上清；

5)加入400μl OW2缓冲液(Oligotex mRNA Spin-Column Kit自带)悬浮沉淀后，将其转移至small spin column(Oligotex mRNA Spin-Column Kit自带)中，15000rpm离心2min，弃收集液；

6)再向small spin column中加入400μl OW2缓冲液，15000rpm离心2min，弃收集液；

7)将small spin column转移至一新的RNase-free的1.5ml离心管中，加入50μl 70℃预热的OEB溶液(Oligotex mRNA Spin-Column Kit自带)，悬浮凝胶，15000rpm离心2min，获得经纯化的mRNA溶液；

8)向纯化的mRNA溶液中加入1/10体积的3M NaAc和2倍体积的乙醇，-20℃放置1h后8000rpm离心15min，弃上清；

9)向步骤8)的沉淀中加入1ml 70％乙醇，混匀后8000rpm离心15min，弃上清；

10)将步骤9)的沉淀室温下干燥10min，用RNase-free水溶解沉淀获得水稻mRNA浓缩液。

3、水稻cDNA的合成

使用SMART^TM cDNA Library Construction Kit并参照其说明书合成水稻的cDNA，具体步骤如下：

1)配制第一链合成反应液：1μL水稻总RNA(约0.5μg)、1μl SMART IV^TM寡核苷酸(SMART^TM cDNA Library Construction Kit自带)、1μl CDS III/3’PCR引物(序列为：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGcGGCCGACATG(T)₃₀-3’，SMART^TM cDNA LibraryConstruction Kit自带)和2μl DEPC处理的H₂O，将上述溶液混匀后72℃保温2min，再冰浴2min得到第一链合成反应液；

2)水稻第一链cDNA合成反应，反应体系为：2.0μl 5×第一链合成反应液、1.0μL DTT(20mM)、1.0μl dNTP混合物(10mM)和1.0μl Superscript ReverseTranscriptase，42℃空气浴1hr，再置于冰上终止反应；

3)合成水稻双链cDNA，反应体系为：2μL步骤2)合成的水稻第一链cDNA、80μl灭菌水、10μl 10×PCR反应缓冲液、2μl 50×dNTP混合液、2μl 5’PCR引物(序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，10mM)、2μl CDS III/3’PCR引物(SMART^TMcDNA Library Construction Kit自带)和2μl 50×Advantage 2DNA聚合酶(SMART^TMcDNA Library Construction Kit自带)；反应程序为：72℃10min；95℃1min；再95℃15sec，68℃8min 3个循环。

4)反应结束后将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果得到0.5-2kb的弥散条带，表明获得了水稻cDNA，-20℃保存。

4、OsPCS1基因的克隆

根据Tiger(http://www.tigr.org)所公布的推测的水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.Japonica)的植物络合素合酶基因序列设计引物，并分别在上游引物中加入EcoRI识别位点，在下游引物中加入Pst I识别位点，引物序列如下：

引物1(OsPCS-up)：5’-GAATTCATGGCGTCTAAACCAAGCA-3’(划线部分碱基为EcoRI识别位点)

引物2(OsPCS-lw)：5’-CTGCAGTCAATGCAAGGTTCTAGGAG-3’(划线部分碱基为Pst I识别位点)

以步骤3获得的水稻cDNA为模板，在引物1和引物2引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系为：步骤3获得的水稻cDNA 1ng、12μl H₂O、2μl 10×PCR反应缓冲液、3μl 10mMdNTP混合液，1μl引物1(10mM)，1μl引物2(10mM)，1μl LATaq DNA聚合酶；PCR循环条件为：94℃ 5min；再94℃ 20sec，50℃ 20sec，72℃ 3min，3个循环；然后94℃ 20sec，65℃ 20sec，72℃ 3min，30个循环。将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据Tiger所公布的水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.Japonica)的植物络合素合酶基因序列(长度为1497bp)用玻璃奶DNA回收试剂盒(博大泰克公司)回收1.5kb左右的基因片段，经测序结果表明，该基因片断具有序列表中序列1的核苷酸序列，自5’端至3’端序列长度为1422bp，编码具有序列表中序列2(473个氨基酸残基)的氨基酸残基序列的蛋白质。并将该基因命名为OsPCS1，所克隆的OsPCS1序列与Tiger所公布的序列1497bp相比，自5’至3’端第734位碱基处开始缺失了长度为75bp的片断，因而选择OsPCS1基因自5’至3’端第4-434位碱基共431bp的核苷酸片段作为靶序列进行RNAi抑制。再用T4DNA连接酶将电泳纯的OsPCS1与载体pGEM-T Easy连接，将连接产物用引物1和引物2进行PCR检测和酶切鉴定后，将阳性克隆进行序列测定，结果表明获得了正确的含有OsPCS1的重组载体，并将其命名为pGEM-OsPCS1，将该重组载体转入大肠杆菌DH5α，选取阳性克隆提质粒。

5、水稻RNAi载体的构建

含玉米ubiquitin启动子和nopaline synthetase(NOS)基因的终止子融合到pCAMBIA1301中(参见文献：Ge L et al.，Overexpression of OsRAA1 causespleiotropic phenotypes in transgenic rice plants，including altered leaf，flower，and root development and root response to gravity.Plant Physiology，2004.135，1502-1513)。将水稻内含子序列【参见水稻基因组序列中第7号染色体中(GenBank AP003758)OsTubA1(GenBank X91808)基因的第三个内含子的序列(557bp)】插入以上载体的ubiquitin启动子和NOS基因终止子之间，即构建成质粒pTCK303，所含酶切位点如图1所示。根据参考文献(Theissen G et al.，Structuralcharacterization，chromosomal localization and phylogenetic evaluation of twopairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize.Gene，1995.156(2)，155-166)所提供的序列(GenBank X81199)，设计引物对(5’-CCA AGC TTC ATG CAT GGC GGCATG ACC A-3’，斜体划线部分碱基为HindIII位点；5’-CTG GAT CCG CTG GAG ATCTCA GCT GAA ATG CA-3’，斜体划线部分碱基为BamH I位点)以玉米基因组DNA为模板扩增(反应程序为：94℃ 2min；再94℃ 30min，64℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；然后72℃10min)种子专一性表达的ZMM1启动子，并利用限制性内切酶Hind III和BamH I将其克隆到pUC19上构建成质粒pKM1-I。

选取步骤4扩增的OsPCS1基因自5’至3’端第4-434位碱基共431bp的核苷酸片段作为靶序列进行RNAi抑制，并将其作为所要构建的水稻RNAi载体的目标元件，根据所测定的OsPCS1序列设计引物，并分别在上游引物中加入Kpn I和Spe I识别位点，在下游引物中加入Sac I和BamH I识别位点，引物序列如下：

引物3：(Os-pcs-ks up)5’-GGGGTACC

CTAAACCAAGCAG-3’

                           Kpn I Spe I

引物4：(Os-pcs-bns lw)5’-CGGGATCCATGGAGCTCGGCGAGCGTGGCC-3’

                           BamH I  Sac I

以步骤4的质粒pGEM-OsPCS1为模板，在引物3和引物4引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系为：pGEM-OsPCS1 1-10ng，10×PCR缓冲液2μl，dNTPs(10mM)3μl，LA Taq DNA聚合酶1μl，1μl引物3(10mM)，1μl引物4(10mM)，用ddH₂O至20μl；PCR循环条件为：94℃5min；再94℃20sec，55℃20sec，72℃3min，2个循环；然后94℃ 20sec，65℃ 20sec，72℃ 3min，30个循环。将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，表明获得了长度约431bp的片段，用玻璃奶DNA回收试剂盒(博大泰克公司)回收该431bp左右的基因片段，测序结果与预期结果相符，获得了序列正确的RNAi靶序列。将该回收片段用Sac I和Spe I限制性内切酶酶切后与用相同酶酶切的载体pTCK303用T₄ DNA连接酶连接得到重组载体，将其命名为p2S-OsPCS1(用于构建水稻RNAi载体的中间载体)，再把该回收片段和中间载体p2S-OsPCS1用BamH I和Kpn I双酶切后用T₄DNA连接酶连接，得到含有ubiquitin启动子和两段序列相同、方向相反的OsPCS1序列的OsPCS1的水稻RNAi载体，将其命名为pUbi-RNAi-OsPCS1(其构建过程如图1所示)；用HindIII和BamH I将重组载体pUbi-RNAi-OsPCS1所含的ubiquitin启动子切除，用HindIII和BamH I将种子特异表达启动子ZMM1从质粒pKM1-I上切下，电泳回收该ZMM1启动子片段，然后将其用T₄DNA连接酶与切除了ubiquitin启动子的线性pUbi-RNAi-OsPCS1片段连接获得种子特异水稻RNAi载体，将其命名为pZMM1-RNAi-OsPCS1(其构建过程如图2所示)。

二、水稻的转化

培养基配方：

A)愈伤组织诱导培养基：N6培养基的无机盐，B5培养基的微量元素和维生素，水解酪蛋白300mg/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶2.0g/L，pH 5.8；

B)共培养培养基：N6培养基的无机盐，B5培养基的微量元素和维生素，水解酪蛋白1g/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖20g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶2.0g/L，100μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.2；

C)筛选培养基：N6培养基的无机盐，B5培养基的微量元素和维生素，水解酪蛋白1g/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶2.0g/L，羧苄青霉素500mg/L，潮霉素50mg/L pH 5.8；

D)分化培养基：MS基本培养基的无机盐、微量元素，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇30g/L，6-BA 2mg/L，NAA 0.2mg/L，植物凝胶2.0g/L，潮霉素30mg/L pH 5.8

E)壮苗培养基：MS基本培养基的无机盐、微量元素，蔗糖30g/L，植物凝胶2.0g/L，潮霉素50mg/L pH 5.8；

F)农杆菌培养基：YEB培养基添加50mg/L利福平、100mg/L卡那霉素和100mg/L链霉素。

1、水稻愈伤组织的诱导：

取成熟粳稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)的种子，剥去外壳后用70％乙醇浸泡1分钟进行消毒，再用无菌水冲洗2-3遍；然后用0.1％的升汞溶液振荡消毒20分钟，再用无菌水冲洗5-6遍，将消毒后的种子置于愈伤组织诱导培养基上，于28℃暗培养，每14天继代一次。继代2次后，得到愈伤组织(图3)。

2、根癌农杆菌的培养和转化

具体包括以下步骤：

1)根癌农杆菌的培养：用电转化法将步骤一构建的表达载体pUbi-RNAi-OsPCS1和pZMM1-RNAi-OsPCS1导入农杆菌EHA105中，经筛选，将含有载体pUbi-RNAi-OsPCS1的重组菌株命名为EHA105/pUbi-RNAi-OsPCS1，将含有载体pZMM1-RNAi-OsPCS1的重组菌株命名为EHA105/pZMM1-RNAi-OsPCS1。从YEB固体培养基上分别挑取上述重组菌EHA105/pUbi-RNAi-OsPCS1和EHA105/pZMM1-RNAi-OsPCS1的单克隆接种到20ml含100mg/L卡那霉素(Km)、100mg/L链霉素以及50mg/L利福平(Rif)的YEB液体培养基中，在28℃210rpm振荡培养至对数生长期(OD₆₀₀约0.5)。培养结束后3000rpm离心10min，弃上清，将沉淀用等体积的含100μmol/L乙酰丁香酮(AS)的液体AAM培养基悬浮。

2)将步骤1的愈伤组织在愈伤组织诱导培养基上预培养一周后，将其分别用含有重组菌EHA105/pUbi-RNAi-OsPCS1和EHA105/pZMM1-RNAi-OsPCS的液体AAM培养基浸泡20min，用无菌滤纸吸干多余培养液，然后将用上述两种不同菌株侵染的愈伤组织转移到共培养培养基上(其表面铺一张无菌滤纸)，在25℃的黑暗条件下共培养48-72小时。

3)将步骤2)的愈伤组织用含0.1mol/L甘露醇和500mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干多余水分后转移到含有50mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的选择培养基上进行筛选，具体操作为：a)抗性愈伤组织的筛选：将上述愈伤组织用选择培养基培养21天(图4)后继代第一次，以后每14天继代一次，一个月左右，在褐色或黑色的愈伤组织上长出白色的抗性愈伤组织；b)分化：将经过3代筛选长出的生长迅速、结构致密的抗性愈伤组织转移到铺放有2层无菌滤纸的培养皿中干燥处理2天，然后将其接种到分化培养基上培养，培养条件设为光周期12小时，白天28℃，夜晚25℃(每2周继代一次)，约一个月后愈伤组织开始变绿、发芽，同时开始生根(图5)；c)壮苗：将分化出芽与根的幼苗转移到壮苗培养基上，至幼苗高度为10cm后打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培(图6、图7)。

三、转基因水稻的筛选

1、GUS检测

取长约0.2cm大小的未转化植株(对照)或转化植株的叶片材料进行GUS染色，结果得到转化有pZMM1-RNAi-OsPCS的含有ZMM1启动子的RNAi阳性植株共35株(共转化67株)，图8中左侧叶片为对照的叶片，右侧叶片为转化植株的叶片；但在相同的转化和筛选条件下，含有ubiquitin启动子启动的RNAi植株难以转化和分化，经多次实验共得到23株，用GUS染色确认转化有pUbi-RNAi-OsPCS1(含有ubiquitin启动子)的阳性苗仅获得4株。

2、基因组PCR检测

提取步骤1经GUS染色检测为阴性和阳性的转化植株的总DNA，在靠近ZMM1启动子3’端处设计上游引物(引物5(zmm1113s)：5’-TGTTCATCCCATTTGCTG-3’)，将其与OsPCS1片段中的特异引物(引物6(Pospcs168s)：5’-CAGCCTCGTCTCCGTCT-3’)配合，以上述提取的基因组DNA为模板进行PCR检测，将PCR进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图9所示(泳道1为GUS染色检测为阴性的转化植株，泳道2为野生型植株，泳道3-8为GUS染色检测为阳性的转化植株，泳道M为标准分子量(分子量范围：100-3000bp)，表明获得了OsPCS1的RNAi载体转入的转基因水稻植株。

实施例2、转基因水稻组织中OsPCS1表达的RT-PCR检测

1、材料处理

分别提取pZMM1-RNAi-OsPCS转化植株和野生型植株不同部位(叶片、种子、颖壳)的总RNA，按实施例1中步骤一的方法提取不同部位的RNA，用Beckman DU640可见-紫外分光光度计测其浓度，再按实施例1中步骤一所述方法合成不同部位的cDNA。

2、RT-PCR对OsPCS1转录的定量分析

植物中的微管蛋白(tublin)的编码基因为组成型表达，因此选择该基因作为RT-PCR检测的内参。根据水稻中tublin所编码的基因序列设计引物，引物序列如下：

引物7(OsTublin1)：5’-GAACTGGTATGGTCAAGGCTG-3’

引物8(OsTublin2)：5’-ACACGGAGCTCGTTGTAGAAG-3’

以步骤1获得的cDNA为模板，进行PCR反应。该RT-PCR反应体系为：步骤1获得的cDNA 1ng，10×PCR缓冲液2μl，dNTPs(10mM)3μl，LA Taq聚合酶1μl，引物7和引物8(10μM)各1μL，用ddH₂O补充至20μL。反应条件为：94℃ 3min；94℃ 20sec，55℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，54.5℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，54℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，53.5℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，53℃ 20sec，72℃ 50sec，19个循环。对得到的PCR产物定量，然后调整模板量使PCR产物量一致，再以定量的不同组织的第一链cDNA为模板，在OsPCS1特异引物(引物序列如下)的引导下，进行PCR检测OsPCS1的转录情况：

引物9(OsPCS 588s)：5’-CGCTCGCTTCAAATACCCTC-3’

引物10(OsPCS824a)：5’-GGATCCTCCTTCCTCTTGTCTCC-3’

PCR反应体系为：定量的第一链cDNA 1ng，10×PCR缓冲液2μl，dNTPs(10mM)3μl，LA Taq聚合酶1μl，引物9和引物10(10μM)各1μl，用ddH₂O补充至20μl。反应条件为：94℃ 3min；94℃ 20sec，55℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，54.5℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，54℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，53.5℃ 20sec，72℃ 50sec；94℃ 20sec，53℃ 20sec，72℃ 50sec，27个循环。

取等量的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳、扫描后，利用Bio1D对各泳道的条带进行积分，同法测定对应的Tublin表达量，结果如图10所示，表明与野生型相比，ZMM1启动子调控的RNAi植株种子中OsPCS1的转录量降低了54.5％，说明OsPCS1在种子中转录后受到了明显的抑制，但并不是完全抑制。转基因植株不同部位的OsPCS1表达量大小顺序如下：叶＞颖壳＞种子(图11)。

实施例3、镉的原子吸收实验

在28L的塑料桶中种植水稻，每桶中装入25公斤按1∶1比例混匀的林下土和泥炭土。每桶种植野生型和转基因植株各2株，移栽一个月后加入CdSO₄(终浓度为10ppm)。水稻在网室中成熟收获后，分别对多个株系的不同部位包括根、茎、叶、颖壳和稻米取材，在80摄氏度烘箱中放置24小时后，委托北京谱尼理化分析测试中心进行原子吸收测定，所用仪器为SB-01原子吸收光谱仪AAS(SOLAAR-M6TJA)，参照国家标准GB/T 5009.15-2003进行测定，测定方法如下：

1)取水稻的不同部位(根、茎、叶、颖壳和稻米)在80摄氏度的烘箱中烘烤24小时，磨碎过20目筛，备用；

2)样品消解：称取0.5g样品，置于瓷坩锅中，先小火碳化至无烟，移入马弗炉500±2.5摄氏度灰化6-8小时，自然冷却。用硝酸(0.5mol/L)将灰分充分溶解，少量多次地过滤到25ml的容量瓶中，定容后摇匀备用。同时作试剂空白对照；

3)测定：委托具有国家计量认证资质的北京谱尼理化分析测试中心[(2000)量认京字Z0407]进行。

测定结果表明ZMM1启动子调控的RNAi水稻植株中茎、叶、颖壳和稻米中镉的含量均有所降低，SRNAi-09株系与对照株系相比，茎、叶、颖壳和稻米中镉的含量分别降低了58.3％、70％、86％和76％(图12a，CK-01：对照株系；SRNAi-09：ZMM1启动子的RNAi株系)。但根中的含量没有明显降低，有些株系甚至有所升高，如SRNAi-09株系(图12b)。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1422

<212>DNA

<213>稻属水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)

<400>1

atggcgtcta aaccaagcag ccgagcggaa agcaaccagg cggcggcggc ggtgccgtcg     60

ctgtacgggc gcgccctgcc gtcgccgccg gcggtggagt tcgcgtcggc ggaggggcgg    120

cggctgttcg cggaggcgct ccaggggggc accatgcagg ggttctccag cctcgtctcc    180

gtcttccaga cgcagtcgga gccggccttc tgcggcctcg ccacgctcgc cgtcgtcctc    240

aacgcgctcc gcatcgaccc ggggcggcgg tggaagggcc cctggcagtg gttcgacgag    300

tccatgctcg actgctgcga gcacctcgac acggtcaggg cggaggggat caccttcggc    360

aaggtcgcct gcctcgccca ctgctccggc gccgacgtcc gcaccttccg cgccgcccag    420

gccacgctcg ccgacctccg ccgccacctc ctgcgctgcg cctcctccca ggattgccat    480

ctcgtcgcct cctaccaccg gaagcttctc ggccagactg gaacagggca tttctcgccg    540

attggcggct accatgctgg gcaggacatg gcgctgatcc tggatgtcgc tcgcttcaaa    600

taccctcctc attggattcc gctgccgctt ctttgggaag ccatgaacac gattgatgag    660

gcaactgggc ttctcagggg gttcatgctt atctcaagga atactgaagc tcctttattg    720

atccgtgcag tgagtaaatt aacatgccaa tgcttggtga atcaaatatt gaatcatctt    780

cctcccaatg ctggaaattt tatcaaatgg gtcattgaag ttaggagaca agaggaagga    840

ggatccagcc caagtaaaga ggctaacgaa atgcctttcc tgaaggaaaa ggtcctacag    900

caaatccgtg atactaagct ttttcagctg gtccacaaac tgcaatgttc taagcagccc    960

tgttgtagtt gctcgtcttt aacggacgaa gattccattt cccagattgc agccagtgtg   1020

tgctgtgaag caaccgcatt gctaagtggg aatctgtcat caagagatgg attatttttc   1080

agtgaaactt gttccggatg tacacaagtg aatgatgagg ggcttaaaaa tgtcattaca   1140

ggcaaagtgg tatctgaagg caatggacat gttgataagc tttcaccgat atcctcgact   1200

gaaacatgct tctgcaattc aactctgagc aatgaaactg tcaattatcc atcaaacaca   1260

gacattctaa ctgttctatt actgtcgtta catcctagca catggttgtg cattgaagat   1320

gagaagttga aagctgaatt tcagagcctt gtttctacgg acgatcttcc tgatcctctt   1380

aaactggagg tgtgctgtct cactcctaga accttgcatt ga                      1422

<210>2

<211>473

<212>PRT

<213>稻属水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)

<400>2

Met Ala Ser Lys Pro Ser Ser Arg Ala Glu Ser Asn Gln Ala Ala Ala

1               5                   10                  15

Ala Val Pro Ser Leu Tyr Gly Arg Ala Leu Pro Ser Pro Pro Ala Val

            20                  25                  30

Glu Phe Ala Ser Ala Glu Gly Arg Arg Leu Phe Ala Glu Ala Leu Gln

        35                  40                  45

Gly Gly Thr Met Gln Gly Phe Ser Ser Leu Val Ser Val Phe Gln Thr

    50                  55                  60

Gln Ser Glu Pro Ala Phe Cys Gly Leu Ala Thr Leu Ala Val Val Leu

65                  70                  75                  80

Asn Ala Leu Arg Ile Asp Pro Gly Arg Arg Trp Lys Gly Pro Trp Gln

                85                  90                  95

Trp Phe Asp Glu Ser Met Leu Asp Cys Cys Glu His Leu Asp Thr Val

            100                 105                 110

Arg Ala Glu Gly Ile Thr Phe Gly Lys Val Ala Cys Leu Ala His Cys

        115                 120                 125

Ser Gly Ala Asp Val Arg Thr Phe Arg Ala Ala Gln Ala Thr Leu Ala

    130                 135                 140

Asp Leu Arg Arg His Leu Leu Arg Cys Ala Ser Ser Gln Asp Cys His

145                 150                 155                 160

Leu Val Ala Ser Tyr His Arg Lys Leu Leu Gly Gln Thr Gly Thr Gly

               165                 170                 175

His Phe Ser Pro Ile Gly Gly Tyr His Ala Gly Gln Asp Met Ala Leu

            180                 185                 190

Ile Leu Asp Val Ala Arg Phe Lys Tyr Pro Pro His Trp Ile Pro Leu

        195                 200                 205

Pro Leu Leu Trp Glu Ala Met Asn Thr Ile Asp Glu Ala Thr Gly Leu

    210                 215                 220

Leu Arg Gly Phe Met Leu Ile Ser Arg Asn Thr Glu Ala Pro Leu Leu

225                 230                 235                 240

Ile Arg Ala Val Ser Lys Leu Thr Cys Gln Cys Leu Val Asn Gln Ile

                245                 250                 255

Leu Asn His Leu Pro Pro Asn Ala Gly Asn Phe Ile Lys Trp Val Ile

            260                 265                 270

Glu Val Arg Arg Gln Glu Glu Gly Gly Ser Ser Pro Ser Lys Glu Ala

        275                 280                 285

Asn Glu Met Pro Phe Leu Lys Glu Lys Val Leu Gln Gln Ile Arg Asp

    290                 295                 300

Thr Lys Leu Phe Gln Leu Val His Lys Leu Gln Cys Ser Lys Gln Pro

305                 310                 315                 320

Cys Cys Ser Cys Ser Ser Leu Thr Asp Glu Asp Ser Ile Ser Gln Ile

                325                 330                 335

la Ala Ser Val Cys Cys Glu Ala Thr Ala Leu Leu Ser Gly Asn Leu

            340                 345                 350

Ser Ser Arg Asp Gly Leu Phe Phe Ser Glu Thr Cys Ser Gly Cys Thr

        355                 360                 365

Gln Val Asn Asp Glu Gly Leu Lys Asn Val Ile Thr Gly Lys Val Val

    370                 375                 380

Ser Glu Gly Asn Gly His Val Asp Lys Leu Ser Pro Ile Ser Ser Thr

385                 390                 395                 400

Glu Thr Cys Phe Cys Asn Ser Thr Leu Ser Asn Glu Thr Val Asn Tyr

                405                 410                 415

Pro Ser Asn Thr Asp Ile Leu Thr Val Leu Leu Leu Ser Leu His Pro

            420                 425                 430

Ser Thr Trp Leu Cys Ile Glu Asp Glu Lys Leu Lys Ala Glu Phe Gln

        435                 440                 445

Ser Leu Val Ser Thr Asp Asp Leu Pro Asp Pro Leu Lys Leu Glu Val

    450                 455                 460

Cys Cys Leu Thr Pro Arg Thr Leu His

465                 470

Claims (9)

1、一种培育低重金属积累植物的方法，包括以下步骤：

1)构建含有“植物重金属吸收相关基因cDNA-内含子-植物重金属吸收相关基因cDNA”结构的RNAi表达载体；所述植物重金属吸收相关基因为植物络合素基因；所述内含子的大小为300-700bp的核苷酸序列；

2)将步骤1)的RNAi表达载体转化植物，获得低重金属积累植物。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述RNAi表达载体的启动子为组成型启动子或组织特异性启动子。

3、根据权利要求1或2所述的方法，所述重金属为Cd、Cu、As或Pb。

4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻、玉米或小麦。

5、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述植物络合素基因为水稻络合素基因。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述水稻络合素基因的碱基序列如序列表中序列1所示，或为序列1的自5’端第4-434位碱基共431bp的核苷酸片段。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述启动子为Ubiquitin启动子或ZMM1启动子。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：用于构建所述RNAi表达载体的出发载体为pTCK303、pCAMBIA1301或pBI121。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述RNAi表达载体为如图1所示的pUbi-RNAi-OsPCS1或如图2所示的pZMM1-RNAi-OsPCS1。

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