BRPI0820741B1 - MÉTODO PARA REDUZIR OS NÍVEIS DE Cd EM UMA PLANTA DE TABACO - Google Patents

MÉTODO PARA REDUZIR OS NÍVEIS DE Cd EM UMA PLANTA DE TABACO Download PDF

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Alec Hayes
Chengalrayan Kudithipudi
Rutger Van der Hoeven
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Abstract

MÉTODO PARA REDUZIR OS NÍVEIS DE CD EM PELO MENOS UMA PARTE DE UMA PLANTA, PLANTA MODIFICADA, PRODUTO DE TABACO CONSUMÍVEL, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, POLIPEPTÍDEO SUBSTANCIALMENTE PURIFICADO E ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A UM POLIPEPTÍDEO. A presente invenção refere- se, em parte, a plantas transgênicas, incluindo plantas de tabaco transgênicas e sementes modificadas, geneticamente modificadas para inibir o transporte de cádmio (Cd) a partir do sistema radicular a porções aéreas de plantas transgênicas, por reduzir os níveis de expressão de transportadores relacionados a HMA. A invenção inclui plantas de tabaco transgênicas geneticamente modificadas para expressar de maneira estável um construto de RNAi que codifica polinucleotídeos de RNAi que permitem a degradação de variantes de RNA de NtHMA endógenos. A expressão reduzida de transportadores de NtHMA em plantas transgênicas resulta em conteúdo de cádmio (Cd) substancialmente reduzido na lâmina da folha. Vários produtos consumíveis que são substancialmente isentos de conteúdo de Cd, ou que o mesmo é substancialmente reduzido, podem ser produzidos através da incorporação das folhas derivadas a partir de plantas de tabaco transgênicas modificadas para reduzir a expressão de transportadores de NtHMA.

Description

CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se a composições, vetores de expressão, polinucleotídeos, polipeptídeos, plantas transgênicas, linhagens celulares transgênicas, e sementes transgênicas, e métodos de fabricação e uso destas modalidades para produzir várias plantas que podem reduzir o transporte de metais pesados para porções aéreas.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica a prioridade para o pedido provisório americano n° 60/996,982, depositado em 13 de dezembro de 2007, cujo conteúdo completo está aqui incorporado, por referência.
ANTECEDENTES
As plantas obtêm metais pesados essenciais, tais como Zn, Ni, e Cu, através da absorção de substratos de íon metálico do seu ambiente por vários mecanismos de transporte mediados por transportadores transmem- brana expressos sobre a superfície de células da raiz e outros tecidos vasculares. Transportadores classificados como ATPases do tipo P, como ATPa- ses do tipo P1B, são transportadores que translocam substratos carregados positivamente através das membranas plasmáticas pela utilização de energia liberada de reações de hidrólise de ATP exotérmicas. As ATPases do tipo P1B também são chamadas de ATPases de metal pesado ("HMAs") ou ATPases do tipo CPx. As HMAs foram agrupadas por especificidade de substrato em duas subclasses, os grupos de Cu/Ag e Zn/Co/Cd/Pb. A primeira ATPase do tipo P1B a serem caracterizadas em plantas é AtHMA4, clonada a partir de Arabidopsis. A seletividade de substrato das HMAs não está estritamente limitada ao transporte de metais essenciais, em que vários metais não essenciais podem ser reconhecidos indiscriminadamente como substratos, resultando no acúmulo de muitos metais não essenciais, tais como Cd, Pb, As, and Hg.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Vários aspectos da invenção são direcionados a composições e métodos para produzir plantas transgênicas, incluindo plantas de tabaco trans- gênicas, geneticamente modificadas para impedir o transporte de cádmio (Cd) do sistema radicular para a lâmina da folha por reduzir os níveis de expressão de transportadores da família HMA. Um homólogo de HMA ("NtHMA") foi identificado em tabaco, o qual pode ser utilizado para construir vários construtos de RNAi, que codificam polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse que podem facilitar a degradação de transcritos de RNA de NtHMA endógenos. Plantas transgênicas que podem expressar polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de acordo com a invenção podem ser utilizadas para reduzir os níveis do estado estacionário de transcritos de RNA de NtHMA, e consequentemente, para reduzir o número de transportadores de NtHMA funcionalmente ativos disponíveis para transportar metais através das membranas celulares.
Outros aspectos da invenção são direcionados para vetores de expressão recombinantes que compreendem vários construtos de RNAi de NtHMA, plantas e sementes transgênicas geneticamente modificadas para expressar exogenamente polinucleotídeos de RNAi de NtHMA, linhagens celulares derivadas de plantas e sementes transgênicas, e produtos consu- míveis que incorporam folhas derivadas das plantas transgênicas produzidas de acordo com os métodos apresentados.
De acordo com a presente invenção, é fornecido, em um aspecto um polinucleotídeo isolado selecionado do grupo que consiste em: um polinucleotídeo que compreende ou que consiste em uma sequência que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 70% de identidade de sequência à SEQ. ID N°: 1, e que codifica um transportador de NtHMA que tem atividade de ATPase do tipo R1B; um polinucleotídeo que compreende ou que consiste em uma sequência que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 70% de identidade de sequência à SEQ. ID N°: 3; um polinucleotídeo que compreende ou que consiste em uma sequência que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 70% de identidade de sequência à SEQ. ID N°: 47; um polinucleotídeo que compreende ou que consiste em uma sequência que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 70% de identidade de sequência à SEQ. ID N°: 2, sendo que o polipeptídeo é um transportador de NtHMA que tem atividade de ATPase do tipo P1B; e um polinucleotídeo que compreende ou que consiste em uma sequência que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo pelo menos 70% de identidade de sequência à SEQ. ID N°: 49, sendo que o polipeptídeo é um transportador de NtHMA que tem atividade de ATPase do tipo P1B.
O polinucleotídeo isolado da invenção pode hibridizar a uma molécula de ácido nucleico que compreende, ou que consiste em, SEQ ID Nos: 1, 3, ou 47, ou uma sequência complementar de SEQ ID N—: 1, 3 ou 47, sob condições de alta estringência.
Um outro aspecto da invenção é um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo isolado como definido aqui.
Também é fornecida uma planta transgênica produzida por um processo que compreende introduzir o polinucleotídeo isolado como aqui definido ou o vetor de expressão como definido aqui. A planta transgênica pode, por exemplo, ser uma planta de tabaco.
É ainda fornecida uma linhagem celular produzida por um processo que compreende introduzir o polinucleotídeo isolado como aqui definido ou o vetor de expressão como definido aqui.
Em um outro aspecto é fornecido um produto de tabaco consu- mível (por exemplo, mas não se limitando a, um artigo para fumar ou um produto de tabaco não fumável) que incorpora folhas colhidas da planta transgênica como definida aqui.
Em outro aspecto, é fornecido um construto de RNAi de NtHMA capaz de inibir a expressão de um RNA mensageiro de NtHMA ao qual ele corresponde, o construto compreendendo: uma primeira sequência que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 70% de identidade de sequência a uma porção de SEQ ID N2: 3 ou 47; uma segunda sequência; e uma terceira sequência que tem uma sequência reversa complementar da primeira sequência, posicionada na mesma orientação que a primeira sequência, em que a segunda sequência está posicionada entre a primeira sequência e a terceira sequência, e a segunda sequência é operacionalmente ligada à primeira sequência e à terceira sequência.
No construto de RNAi de NtHMA: (a) a primeira sequência pode ter pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência selecionada a partir de uma ou mais do grupo que consiste em: éxon 1 (SEQ ID N2: 5), um fragmento do éxon 1 (SEQ ID N2: 5), éxon 2 (SEQ ID N2: 7), um fragmento do éxon 2 (SEQ ID N2: 7), éxon 3 (SEQ ID N2: 9), um fragmento do éxon 3 (SEQ ID N2: 9), éxon 4 (SEQ ID N2: 11), um fragmento do éxon 4 (SEQ ID N2: 11), éxon 5 (SEQ ID N2: 13), um fragmento do éxon 5 (SEQ ID N2: 13), éxon 6 (SEQ ID N2: 15), um fragmento do éxon 6 (SEQ ID N2: 15), éxon 7 (SEQ ID N2: 17), um fragmento do éxon 7 (SEQ ID N2: 17), éxon 8 (SEQ ID N2: 19), um fragmento do éxon 8 (SEQ ID N2: 19), éxon 9 (SEQ ID N2: 21), um fragmento do éxon 9 (SEQ ID N2: 21), éxon 10 (SEQ ID N2: 23), um fragmento do éxon 10 (SEQ ID N2: 23), éxon 11 (SEQ ID N2: 25), e um fragmento do éxon 11 (SEQIDN2: 25); (b) a segunda sequência pode ter pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência selecionada a partir de uma ou mais do grupo que consiste em: íntron 1 (SEQ ID N2: 4), um fragmento do íntron 1 (SEQ ID Ns: 4), íntron 2 (SEQ ID N°: 6), um fragmento do íntron 2 (SEQ ID N2: 6), íntron 3 (SEQ ID N2: 8), um fragmento do íntron 3 (SEQ ID N2: 8), íntron 4 (SEQ ID N2: 10), um fragmento do íntron 4 (SEQ ID N2: 10), íntron 5 (SEQ ID N2: 12), um fragmento do íntron 5 (SEQ ID N2: 12), íntron 6 (SEQ ID N2: 14), um fragmento do íntron 6 (SEQ ID N2: 14), íntron 7 (SEQ ID N2: 16), um fragmento do íntron 7 (SEQ ID N2: 16), íntron 8 (SEQ ID N2: 18), um fragmento do íntron 8 (SEQ ID N2: 18), íntron 9 (SEQ ID N2: 20), um fragmento do íntron 9 (SEQ ID N2: 20), íntron 10 (SEQ ID N2: 22), um fragmento do íntron 10 (SEQ ID N2: 22), íntron 11 (SEQ ID N2: 24), um fragmento do íntron 11 (SEQ ID N2: 24), íntron 12 (SEQ ID N2: 26), e um fragmento do íntron 12 (SEQ ID N2: 26); (c) a terceira sequência pode ter pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência selecionada a partir de uma ou mais do grupo que consiste em: SEQ ID N2: 27, um fragmento de SEQ ID N2: 27, SEQ ID N2: 28, um fragmento de SEQ ID N2: 28, SEQ ID N2: 29, um fragmento de SEQ ID N2: 29, SEQ ID N2: 30, um fragmento de SEQ ID N2: 30, SEQ ID N2: 31, um fragmento de SEQ ID N2: 31, SEQ ID N2: 32, um fragmento de SEQ ID N2: 32, SEQ ID N2: 33, um fragmento de SEQ ID N2: 33, SEQ ID N2: 34, um fragmento de SEQ ID N2: 34, SEQ ID N2: 35, um fragmento de SEQ ID N2: 35, SEQ ID N2: 36, um fragmento de SEQ ID N2: 36, SEQ ID N2: 37, e um fragmento de SEQ ID N2: 37; (d) a primeira sequência pode compreender SEQ ID N2: 38, a segunda sequência pode compreender SEQ ID N2: 39, e a terceira sequência pode compreender SEQ ID N2: 40; (e) a primeira sequência pode compreender SEQ ID N2: 42, a segunda sequência pode compreender SEQ ID N2: 43, e a terceira sequên- cia pode compreender SEQ ID Ne: 44; ou (f) um ou dois ou três dentre (a), (b), (c), (d) e (e) podem se aplicar.
A invenção também abrange um vetor de expressão que compreende um promotor posicionado à montante e operativamente ligado ao construto de RNAi de NtHMA como definido aqui. O promotor pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: um promotor tecido-específico, um promotor induzível, e um promotor constitutivo.
No construto de RNAi de NtHMA, a primeira e a segunda sequências podem possuir, cada, um comprimento selecionado do grupo que consiste em 20 a 30 nucleotídeos, 30 a 50 nucleotídeos, 50 a 100 nucleotí- deos, 100 a 150 nucleotídeos, 150 a 200 nucleotídeos, 200 a 300 nucleotídeos, 300 a 400 nucleotídeos, 400 a 500 nucleotídeos, 500 a 600 nucleotídeos, e 600 a 700 nucleotídeos.
Um aspecto adicional da invenção é uma planta transgênica que compreende o RNAi (ou o construto de RNAi de NtHMA, ou o vetor de expressão) como definido aqui, sendo que a planta transgênica tem níveis de Cd reduzidos em pelo menos uma parte da planta em comparação à parte em um equivalente não transgênico. A planta transgênica pode, por exemplo, ser uma planta de tabaco.
Também é fornecido um produto de tabaco consumível (por e- xemplo, mas não se limitando a, um artigo para fumar ou um produto de tabaco não fumável) que incorpora folhas colhidas da planta transgênica que compreende o RNAi como definido aqui.
O produto pode ter uma redução do percentual de Cd de pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%.
O produto pode ter um conteúdo de Cd que é um valor na faixa de cerca de 0,01 a cerca de 0,05 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 1,0 ppm, ou de cerca de 0,01 a cerca de 5 ppm.
Em um outro aspecto da invenção, é apresentado um método para reduzir os níveis de Cd em pelo menos uma parte de uma planta, que compreende: reduzir os níveis de um mRNA de NtHMA na planta por gerar a expressão de um construto de RNAi.
Para este método, o construto de RNAi pode ser como definido aqui e, em particular, pode compreender: uma primeira sequência que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 90% de identidade de sequência a uma porção da SEQ ID N-: 3 ou 47; uma segunda sequência; e uma terceira sequência que tem uma sequência reversa complementar da primeira sequência, posicionada na mesma orientação que a primeira sequência, em que a segunda sequência está posicionada entre a primeira sequência e a terceira sequência, e a segunda sequência é operacionalmente ligada à primeira sequência e à terceira sequência.
De acordo com o método, após a expressão do construto de RNAi, a parte da planta pode ter um conteúdo de Cd reduzido em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%.
Adicional ou alternativamente, após a expressão do construto de RNAi, a parte da planta pode ter um conteúdo de Cd reduzido em pelo menos cerca de 0,01 a cerca de 0,05 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 1,0 ppm, ou de cerca de 0,01 a cerca de 5 ppm.
De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecido um polipeptídeo substancialmente purificado que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 70% de identidade de sequência ou pelo menos 95% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 2 ou 49, sendo que o polipeptídeo é um transportador de NtHMA que tem atividade de ATPase do tipo P1B.
Um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo como definido aqui, por exemplo, que compreende, ou que consiste em, SEQ ID Na: 2 ou 49, também é abrangido pela invenção.
Aspectos variados e adicionais (também referidos aqui como "modalidades") da presente invenção são descritos a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 é um esquema de um clone genômico de NtHMA que compreende 11 éxons.
A figura 2A ilustra uma estratégia de subclonagem exemplifica- dora para construir um vetor de expressão de RNAi de NtHMA RNAi que permite a expressão constitutiva de polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse, conforme descrito no exemplo 2.
A figura 2B ilustra um dúplex de RNA de dupla fita hipotético formado (como uma estrutura "haste-alça-haste") a partir de interações in- tramoleculares de pares de bases, dentro do polinucleotídeo de RNAi de NtHMA produzido como um produto transcrito a partir de um construto de RNAi de NtHMA exemplificador.
A figura 3A mostra uma sequência de RNAi exemplificadora, N- tHMA (660-915), para produzir polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse, conforme descrito no exemplo 2.
As figuras 3B a 3D mostram a redução de Cd na lâmina da folha de múltiplas linhagens transgênicas de primeira geração (TO), representando três variedades, que foram geneticamente modificadas para expressar polinucleotídeos de RNAi de NtHMA (660-915), conforme descrito no exemplo 5.
A figura 4A mostra uma sequência de RNAi exemplificadora, N- tHMA (1382-1584), para produzir polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse, conforme descrito no exemplo 3.
As figuras 4B a 4D mostram a redução de Cd na lâmina da folha de múltiplas linhagens transgênicas de primeira geração (T0), representando três variedades, que foram geneticamente modificadas para expressar poli- nucleotídeos de RNAi de NtHMA (1382-1584), conforme descrito no exemplo 5.
As figuras 5A a C mostram os níveis de transcrito de RNA de NtHMA normalizadosem várias linhagens transgênicas de primeira geração (TO) que foram geneticamente modificadas para expressar polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse, como determinado por análise por PCR em tempo real quantitativo de extratos da lâmina da folha, conforme descrito no exemplo 6.
A figura 6 mostra a distribuição de Cd e Zn entre a lâmina da folha e a raiz de várias linhagens transgênicas de primeira geração (TO) que foram geneticamente modificadas para expressar polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse, conforme apresentado na tabela 2 e descrito no E- xemplo 7.
A figura 7 mostra a distribuição de Cd entre os tecidos de cortiça ("B"), lâmina da folha ("L"), seiva ("P"), e raiz ("R") de várias linhagens transgênicas de primeira geração (TO) que foram geneticamente modificadas para expressar polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse, conforme apresentado na tabela 3 e descrito no Exemplo 8.
A figura 8 mostra a distribuição de Cd entre a lâmina da folha ("L") e a raiz ("R") de várias linhagens transgênicas de segunda geração (T1) que foram geneticamente modificadas para expressar polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse, conforme descrito no exemplo 9.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Isolamento de genes e produtos gênicos de NtHMA de tabaco
A figura 1 é um esquema de um clone genômico de NtHMA que compreende 11 éxons, que codifica um transportador de metal pesado relacionado à família HMA de transportadores. O Exemplo 1 ainda descreve a identificação do clone genômico de NtHMA (_HO-18-2) e 4 clones de cDNA de NtHMA. A tabela 1 abaixo fornece as posições de nucleotídeo que correspondem às sub-regiões do éxon e íntron mapeadas no clone genômico de NtHMA (_HO-18-2).
O termo "polinucleotídeo" refere-se a um polímero de nucleotí- deos que compreende pelo menos 10 bases de comprimento. Os polinucleo- tídeos podem ser DNA, RNA ou um híbrido de DNA/RNA, que compreende ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, combinações de desoxirribo- e ribonucleotídeos, e combinações de bases e/ou modificações, incluindo ura- cila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocito- sina, e isoguanina. O termo inclui formas de fita simples e dupla de DNA ou RNA. O termo "DNA" inclui DNAs genômicos, cDNAs, DNAs quimicamente sintetizados, DNAs amplificados por PCR, e combinações/equivalentes dos mesmos. O termo "polinucleotídeo isolado" refere-se a um polinucleotídeo não contíguo a qualquer genoma de origem, ou separado de um contexto nativo. O termo inclui qualquer molécula de polinucleotídeo recombinante, como construtos de RNAi de NtHMA, vetores de expressão de RNAi de N- tHMA, clones genômicos de NtHMA, e fragmentos e variantes dos mesmos.
Conforme mostrado na figura 1, o clone genômico de NtHMA, chamado de SEQ ID N°: 1, compreende: íntron 1 (SEQ ID N2: 4), éxon 1 (SEQ ID N2: 5), íntron 2 (SEQ ID N2: 6), éxon 2 (SEQ ID N2: 7), íntron 3 (SEQ ID N2: 8), éxon 3 (SEQ ID N2: 9), íntron 4 (SEQ ID N2: 10), éxon 4 (SEQ ID N2: 11), íntron 5 (SEQ ID N2: 12), éxon 5 (SEQ ID N2: 13), íntron 6 (SEQ ID N2: 14), éxon 6 (SEQ ID N2: 15), íntron 7 (SEQ ID N2: 16), éxon 7 (SEQ ID N2: 17), íntron 8 (SEQ ID N2: 18), éxon 8 (SEQ ID N2: 19), íntron 9 (SEQ ID N2: 20), éxon 9 (SEQ ID N2: 21), íntron 10 (SEQ ID N2: 22), éxon 10 (SEQ ID N2: 23), íntron 11 (SEQ ID N2: 24, éxon 11 (SEQ ID N2: 25), e íntron 12 (SEQ ID N2: 26). Para as sequências, consulte a Listagem de Sequências abaixo. Várias modalidades da invenção são direcionadas a polinucleotídeos isolados que representam fragmentos genômicos isolados no lócus de NtHMA, que compreendem SEQ ID N2: 1, fragmentos da SEQ ID N2: 1, ou variantes dos mesmos. Várias modalidades são direcionadas a variantes de po-linucleotídeos de NtHMA isolados que compreendem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2:1, ou fragmentos de SEQ ID N2: 1.
Várias modalidades são direcionadas a polinucleotídeos isolados que tem sequências que complementam aquelas das variantes de polinucleotídeos de NtHMA que compreendem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 1, ou fragmentos de SEQ ID N2: 1. Várias modalidades são direcionadas a polinucleotídeos isolados que podem hibridizar especificamente, sob condições moderadas a altamente estringentes, a polinucleotídeos que compreendem SEQ ID N2: 1, ou fragmentos de SEQ ID N2: 1.
Várias modalidades são direcionadas a polinucleotídeos isolados de cDNA de NtHMA (Clone P6663), que compreendem SEQ ID N2: 3, fragmentos de SEQ ID N2: 3, ou variantes dos mesmos. Várias modalidades são direcionadas a variantes de polinucleotídeos de NtHMA isolados que compreendem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 3, ou fragmentos de SEQ ID N2: 3. Várias modalidades são direcionadas a variantes de polirribonucleotí- deos de NtHMA isolados que compreendem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 3, ou fragmentos de SEQ ID N2: 3, e nas quais Ts foram substituídas por Us (por exemplo,, RNAs). Várias modalidades são direcionadas a polinucleotídeos isolados que podem hibridizar especificamente, sob condições moderadas a altamente estringentes, a polinucleotídeos que compreendem SEQ ID N2: 3, ou fragmentos de SEQ ID N2: 3. Várias modalidades são direcionadas a polinucleotídeos isolados que tem uma sequência que complementa aquela das variantes de polinucleotídeos de NtHMA que compreendem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 3, ou fragmentos de SEQ ID N2: 3.
Várias modalidades são direcionadas a polinucleotídeos isolados de cDNA de NtHMA (Clone P6643), que compreendem SEQ ID N2: 47, fragmentos de SEQ ID N2: 47, ou variantes dos mesmos. Várias modalidades são direcionadas a variantes de polinucleotídeos de NtHMA isolados que compreendem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID Ns: 47, fragmentos de SEQ ID N-: 47. Várias modalidades são direcionadas a variantes de polirri- bonucleotídeos de NtHMA isolados que compreendem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N-: 47, fragmentos de SEQ ID N°: 47, e nas quais Ts foram substituídas por Us (por exemplo, RNAs). Várias modalidades são direcionadas a polinucleotídeos isolados que podem hibridizar especificamente, sob condições moderadas a altamente estringentes, a polinucleotídeos que compreendem SEQ ID N-: 47, e fragmentos de SEQ ID N-: 47. Várias modalidades são direcionadas a polinucleotídeos isolados que tem uma sequência que complementa aquela das variantes de polinucleotídeos de NtHMA que compreendem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N-: 47, e fragmentos de SEQ ID N°: 47.
Várias modalidades são direcionadas a biopolímeros que são homólogos aos polinucleotídeos de NtHMA e aos polipeptídeos de NtHMA ("homólogos de NtHMA"), que podem ser identificados a partir de diferentes espécies de planta. Por exemplo, os homólogos de NtHMA podem ser isolados experimentalmente por triagem de bibliotecas de ácido nucleico adequadas derivadas de diferentes espécies de planta de interesse. Alternativamente, os homólogos de NtHMA podem ser identificados por triagem de bases de dados do genoma contendo sequências de uma ou mais espécies utilizando uma sequência derivada de polinucleotídeos de NtHMA e/ou de polipeptídeos de NtHMA. Tais bases de dados genômicas são prontamente disponíveis para inúmeras espécies (por exemplo, na rede de alcance mundial (www) em tigr.org/tdb; genetics.wisc.edu; stanford.edu/.about.ball; hiv- web.lan1.gov; ncbi.nlm.nig.gov; ebi.ac.uk; e pasteur.fr/other/biology). Por exemplo, sequências de oligonucleotídeo degeneradas podem ser obtidas por "retrotradução" a partir dos fragmentos de polipeptídeo de NtHMA. Os polinucleotídeos de NtHMA podem ser utilizados como sondas ou iniciadores para identificar / amplificar sequências relacionadas, ou para obter sequências de comprimento completo para NtHMAs relacionadas por PCR, por e- xemplo, ou por outras técnicas bem conhecidas (por exemplo, vide PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990)).
B. Polipeptídeos de NtHMA
O termo "polipeptídeo de NtHMA" refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos chamada de SEQ ID N-: 2; polipeptídeos que tem homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial à SEQ ID N-: 2; fragmentos de SEQ ID N2: 2; e variantes dos mesmos. Os polipeptídeos de NtHMA incluem sequências que tem grau de identidade ou similaridade suficiente ou substancial à SEQ ID N-: 2, e que podem funcionar para transportar metais pesados através de membranas celulares.
Os polipeptídeos de NtHMA incluem variantes produzidas por introduzir qualquer tipo de alteração (por exemplo, inserções, deleções, ou substituições de aminoácidos; alterações nos estados de glicosilação; alterações que fazem re-enovelamento ou isomerizações, estruturas tridimensionais, ou estados de autoassociação), que podem ser deliberadamente manipuladas ou isoladas naturalmente. Os polipeptídeos de NtHMA podem ter forma linear ou serem ciclizados com o uso de métodos conhecidos (por e- xemplo, H. U. Saragovi, et a!., Bio/Technology 10, 773 (1992); e R. S. McDowell, etal., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9245 (1992), ambos aqui incorporados, a título de referência). Os polipeptídeos NtHMA compreendem pelo menos 8 a 10, pelo menos 20, pelo menos 30, ou pelo menos 40 aminoácidos contíguos.
Várias modalidades são direcionadas a polipeptídeos NtHMA i- solados codificados pela sequência de polinucleotídeo, SEQ ID N2: 1, que compreendem SEQ ID N2: 2, fragmentos de SEQ ID N2: 2, ou variantes dos mesmos. Várias modalidades são direcionadas a variantes de polipeptídeos de NtHMA isolados que compreendem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 2, ou fragmentos de SEQ ID N2: 2.
Várias modalidades são direcionadas a polipeptídeos NtHMA i- solados (Clone P6663), que compreendem SEQ ID Na: 2, fragmentos de SEQ ID Ns: 2, ou variantes dos mesmos. Várias modalidades são direcionadas a variantes de polipeptídeos de NtHMA isolados que compreendem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 2, ou fragmentos de SEQ ID N2: 2.
Várias modalidades são direcionadas a polipeptídeos NtHMA i- solados (Clone P6643), que compreendem SEQ ID N2: 49, fragmentos de SEQ ID N2: 49, ou variantes dos mesmos. Várias modalidades são direcionadas a variantes de polipeptídeos de NtHMA isolados que compreendem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 49, ou fragmentos de SEQ ID N2: 49.
II. Composições e métodos relacionados para reduzir a expressão gênica de NtHMA e/ou atividade transportadora mediada por NtHMA
Composições antagonistas adequadas que podem regular negativamente a expressão e/ou a atividade de NtHMA e variantes de NtHMA incluem polinucleotídeos de sequência-específica que podem interferir com a transcrição de um ou mais gene(s) endógeno(s) de NtHMA; polinucleotídeos de sequência-específica que podem interferir com a tradução de transcritos de RNA de NtHMA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, ribozimas); polipeptídeos desequência-específica que podem interferir com a estabilidade da proteína de NtHMA, com a atividade enzimática de NtHMA, e/ou com a atividade de ligação de NtHMA com relação aos substratos e/ou proteínas reguladoras; anticorpos que exibem especificidade para NtHMA; e compostos de pequenas moléculas que podem interferir com a estabilidade da proteína de NtHMA, com a atividade enzimática de NtHMA, e/ou com a atividade de ligação de NtHMA. Um antagonista eficaz pode reduzir o transporte de metal pesado (por exemplo, Cd) para as estruturas da lâmina da folha em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%.
A. Definições
Por toda esta descrição e reivindicações em anexo, os termos "a", "o" e "um", "uma" funcionam como referentes no singular e no plural, exceto onde o contexto determinar claramente de outro modo. Desta forma, por exemplo, uma referência a "um polinucleotídeo de RNAi" inclui uma pluralidade de tais polinucleotídeos de RNAi, e uma referência "a planta" inclui referência a uma ou mais de tais plantas.
O termo "orientação" refere-se a uma ordem particular na colocação de um polinucleotídeo em relação à posição de um polinucleotídeo de referência. Um DNA linear tem duas orientações possíveis: a direção 5'- para-3' e a direção 3'-para-5'. Por exemplo, caso uma sequência de referência esteja posicionada na direção 5'-para-3', e caso uma segunda sequência esteja posicionada na direção 5'-para-3' na mesma molécula / fita de polinucleotídeo, então, a sequência de referência e a segunda sequência estão orientadas na mesma direção, ou tem a mesma orientação. Tipicamente, uma sequência promotora e um gene de interesse sob a regulação de um dado promotor estão posicionados na mesma orientação. Entretanto, com relação a uma sequência de referência posicionada na direção 5'-para-3', caso uma segunda sequência esteja posicionada na direção 3'-para-5' na mesma molécula / fita de polinucleotídeo, então, a sequência de referência e a segunda sequência estão orientadas em uma direção antissenso, ou tem orientação antissenso. Duas sequências que tem orientações antissenso uma em relação à outra podem ser, alternativamente, descritas como tendo a mesma orientação, caso a sequência de referência (direção 5'-para-3') e a sequência reversa complementar da sequência de referência (sequência de referência posicionada em 5'-para-3') estejam posicionadas na mesma molécula / fita de polinucleotídeo.
O termo "vetor de expressão de RNAi de NtHMA" refere-se a um veículo de ácido nucleico que compreende uma combinação de componentes de DNA para permitir o transporte e a expressão dos construtos de RNAi de NtHMA. Vetores de expressão adequados incluem epissomos capazes de replicação extracromossomal, tais como plasmídeos de fita dupla circulares; plasmídeos de fita dulpa linearizados; e outros vetores de expressão funcionalmente equivalentes de qualquer origem. Um vetor de expressão de RNAi de NtHMA adequado compreende pelo menos um promotor posiciona- do à montante e operativamente ligado a um construto de RNAi de NtHMA, como definido abaixo.
O termo "construto de RNAi de NtHMA" refere-se a um fragmento de DNA recombinante de fita dupla que codifica "polinucleotídeos de RNAi de NtHMA" que tem atividade de interferência de RNA. Um construto de RNAi de NtHMA compreende uma "fita molde" com pareamento de bases com uma "fita senso ou codificante" complementar. Um dado construto de RNAi de NtHMA pode ser inserido em um vetor de expressão de RNAi de NtHMA em duas orientações possíveis, na mesma orientação (ou senso) ou na orientação reversa (ou antissenso) em relação à orientação de um promotor posicionado em um vetor de expressão de RNAi de NtHMA.
O termo "polinucleotídeos de RNAi de NtHMA" pode direcionar RNA de NtHMA para degradação enzimática, envolvendo a formação de fragmentos menores de polinucleotídeos de RNAi de NtHMA ("siRNAs") que podem se ligar a diversas sequências complementares dentro do RNA de NtHMA-alvo. Os níveis de expressão de um ou mais gene(s) de NtHMA pode ser reduzido pela atividade de interferência de RNA dos polinucleotídeos de RNAi de NtHMA.
O termo "fita molde" refere-se à fita que compreende uma sequência que complementa aquela da "fita senso ou codificante" de um dú- plex de DNA, tal como fragmento genômico de NtHMA, cDNA de NtHMA, ou construto de RNAi de NtHMA, ou qualquer fragmento de DNA que compreende uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita pela RNA polimerase. Durante a transcrição, a RNA polimerase pode se translocar ao longo da fita molde na direção 3'-para-5 durante a síntese do RNA nascente.
Os termos "fita senso" ou "fita codificante" referem-se à fita que compreende uma sequência que complementa aquela da fita molde em um dúplex de DNA. Por exemplo, a sequência da fita senso ("sequência senso") para o clone genômico de NtHMA identificado é designada como SEQ ID N°: 1. Por exemplo, a sequência senso para cDNA de NtHMA, identificada como clone P6663, é designada como SEQ ID Ns: 3. Por exemplo, a sequência senso para cDNA de NtHMA, identificada como clone P6643, é designada como SEQ ID N°: 46. Por exemplo, se a fita senso compreender uma sequência hipotética 5'-TAATCCGGT-3', então, a sequência correspondente substancialmente idêntica em um mRNA-alvo hipotético é 5'-UAAUCCGGU- 3'.
O termo "sequência reversa complementar" refere-se à sequência que complementa a "sequência senso" de interesse (por exemplo, sequência do éxon) posicionada na mesma fita, na mesma orientação em relação à sequência senso. Por exemplo, de uma fita compreende uma sequência hipotética 5-TAATCCGGT-3', então, a sequência reversa complementar 5'-ACCGGATTA-3' pode ser operativamente ligada à sequência senso, separada por uma sequência espaçadora.
Os termos "transcrito de RNA de NtHMA" ou "RNA de NtHMA," no contexto de interferência de RNA, referem-se a moléculas de ácido polir- ribonucleico produzidas dentro de uma célula de planta hospedeira de interesse, resultantes da transcrição de genes endógenos da família HMA, incluindo o gene de NtHMA isolado (SEQ ID N°: 1). Desta forma, estes termos incluem qualquer espécie de RNA ou variantes de RNA produzidas como produtos transcricionais de genes relacionados à HMA que podem ser distintos do gene de NtHMA isolado (SEQ ID Na: 1) , mas que têm similaridade suficiente nos níveis estruturais e/ou funcionais para serem classificados dentro da mesma família. Por exemplo, se uma célula de planta hospedeira selecionada para modificação genética de acordo com os métodos apresentados for tabaco, então, os transcritos de RNA de NtHMA-alvo incluem: (1) pré-mRNAs e mRNAs produzidos a partir da transcrição do gene de NtHMA isolado (SEQ ID N-. 1); (2) pré-mRNAs e mRNAs produzidos a partir da transcrição de quaisquer genes que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à sequência do gene de NtHMA isolado (SEQ ID Ns: 1) (isto é, outros genes distintos substancialmente idênticos ao gene de NtHMA identificado e que codifica isofomnas relacionadas de transportadores de HMA); e (3) pré-mRNAs and mRNAs produzidos a partir da transcrição de alelos do gene de NtHMA (SEQ ID N°: 1). Os transcritos de RNA de NtHMA incluem variantes de RNA produzidas como um resultado de reações de combinação alternativa de RNA de RNAs heteronucleares ("hnRNAs") de um gene de NtHMA particular, variantes de mRNA resultantes de tais reações de combinação alternativa de RNA, e quaisquer variantes de RNA intermediárias.
Os termos "homologia" ou "identidade" ou "similaridade" referem-se ao grau de similaridade de sequência entre dois polipeptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico comparadas por alinhamento de sequência. O grau de homologia entre duas sequências de ácido nucleico distintas sendo comparadas é uma função do número de nucleotídeos idênticos, ou pareados, em posições comparáveis. O percentual de identidade pode ser determinado por inspeção visual e cálculo matemático. Alternati-vamente, o percentual de identidade de duas sequências de ácido nucleico pode ser determinado por comparar as informações da sequência com o uso do programa de computador GAP, versão 6.0 descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) e disponível junto à University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Parâmetros predeterminados típicos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) para nucleotídeos, e a matriz de comparação ponderada de Gribskov e Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, conforme descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna; e (3) nenhuma penalidade para lacunas finais. Vários programas conhecidos dos versados na técnica de comparação de sequência podem ser utilizados alternativamente.
O termo "à montante" refere-se a uma direção/posição posição em relação a um elemento de referência ao longo de uma sequência de polinucleotídeo linear, que indica uma direção/ posição em direção à extremidade 5' da sequência de polinucleotídeo. "À montante" pode ser usado de maneira intercambiável com a "extremidade 5' de um elemento de referência."
O termo "operativamente ligado" refere-se à união de elementos, fragmentos, ou sequências de DNA distintas para produzir uma unidade transcricional funcional ou um vetor de expressão funcional.
O termo "promotor" refere-se a um elemento/ sequência de ácido nucleico, posicionada tipicamente à montante e operativamente ligada um fragmento de DNA de fita dupla, como um construto de RNAi de NtHMA. Por exemplo, um promotor adequado permite a ativação transcricional de um construto de RNAi de NtHMA por recrutar o complexo transcricional, incluindo a RNA polimerase e vários fatores, para iniciar a síntese de RNA. Os "promotores" podem ser derivados inteiramente de regiões próximas a um gene nativa de interesse, ou podem ser compostas de elementos diferentes derivados de promotores nativos diferentes e/ou segmentos sintéticos de DNA. Promotores adequados incluem promotores tecido-específicos reconhecidos por fatores tecido-específicos presentes em diferentes tecidos ou tipos celulares (por exemplo, promotores raiz-específica, promotores broto- específico, promotores xilema-específico), ou presentes durante diferentes estágios do desenvolvimento, ou presentes em resposta a diferentes condições ambientais. Promotores adequados incluem promotores constitutivos que podem ser ativados na maioria dos tipos celulares sem requerer induto-res específicos. Exemplos de promotores adequados para controlar a produção do polipeptídeo de RNAi de NtHMA incluem os promotores do vírus do mosaico da couve-flor 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos ou os promotores de ubiquitina ou faseolina. Pessoas versadas na técnica são capazes de gerar inúmeras variações de promotores recombinan- tes, conforme descrito em diversas referências, como Okamuro e Goldberg, Biochemistry of Plants, Vol. 15: pp1-82 (1989).
Promotores tecido-específicos são elementos de controle transcricional que são ativos apenas em células ou tecidos particulares em momentos específicos durante o desenvolvimento da planta, como por exemplo, em tecidos vegetativos ou em tecidos reprodutivos. A expressão tecido- específico pode ser vantajosa, por exemplo, quando a expressão de polinucleotídeos em certos tecidos é preferida. Exemplos de promotores tecido- específicos sob controle do desenvolvimento incluem promotores que podem iniciar a transcrição apenas (ou primariamente apenas) em determinados tecidos, como tecidos vegetativos, por exemplo, raízes ou folhas, ou tecidos reprodutivos, como fruto, óvulos, sementes, pólen, pistilos, flores, ou qualquer tecido embrionário. Promotores específicos do tecido reprodutivo podem ser, por exemplo, antera-específicos, óvulo-específicos, embrião- específicos, endosperma-específicos, tegumento-específicos, semente- e revestimento das sementes-específicos, pólen-específicos, pétala-específicos, sépala-específicos, ou combinações dos mesmos.
Promotores folha-específica adequados incluem promotor de pi- ruvato ortofosfato diquinase (PPDK) de planta C4 (milho), promotor cab- m1Ca+2 de milho, o promotor relacionado a myb de Arabidopsis thaliana (Atmyb5), os promotores de ribulose bifosfato carboxilase (RBCS) (por e- xemplo, os genes RBCS 1, RBCS2 e RBCS3A de tomate expressos em folhas e mudas que crescem com luz, RBCS1 e RBCS2 expressos em frutos de tomate em desenvolvimento, e/ou promotor de ribulose bisfosfato carboxilase expresso quase exclusivamente em células do mesófilo em lâminas da folha e envoltórios da folha em altos níveis).
Promotores senescência-específicos adequados incluem um promotor de tomate ativo durante o amadurecimento dos frutos, senescência e queda das folhas, um promotor de milho de um gene que codifica uma cis- teína protease. Promotores antera-específicos adequados podem ser usados. Tais promotores são conhecidos na técnica ou podem ser descobertos por técnicas conhecidas; consulte, por exemplo, Bhalla e Singh (1999) Molecular control of male fertility in Brassica, Proc. 10th Annual Rapeseed Congress, Canberra, Austrália; van Tunen et al. (1990) Pollen- and antherspecific chi promoters from petunia: tandem promoter regulation of the chiA gene. Plant Cell 2: 393-40; Jeon et al. (1999) Isolation and characterization of an anther-specific gene, RA8, from rice (Oryza sativa L). Plant Molecular Biology 39: 35-44; e Twell et al. (1993) Activation and developmental regulation of an Arabidopsis anther-specific promoter in microspores and pollen of Nicotiana tabacum. Sex. Plant Reprod. 6: 217-224.
Promotores com preferência pela raiz adequados conhecidos daqueles versados na técnica podem ser selecionados. Vide, por exemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2): 207-218 (gene da glutamina sinteta- se raiz-especifico de soja); Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10): 1051-1061 (elemento de controle raiz-especifico no gene GRP 1.8 de feijão do tipo French bean); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 433-443 (promotor raiz-especifico do gene da manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); e Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1): 11-22 (clone de cDNA de comprimento completo que codifica glutamina sintetase (GS) citosólica, que é expresso em raízes e nódulos de raiz de soja). Vide ainda Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7): 633-641, onde dois promotores raiz-específicos isolados de genes de hemoglobina do não legume fixador de nitrogênio Pa- rasponia andersonii e do não legume não fixador de nitrogênio Trema to- mentosa são descritos.
Promotores com preferência pela semente adequados incluem promotores semente específicos (aqueles promotores ativos durante o desenvolvimento da semente, como promotores de proteínas de armazenamento de semente) e promotores de germinação da semente (aqueles promotores ativos durante a germinação da semente). Vide, por exemplo, Thompson et al. (1989) BioEssays 10: 108, aqui incorporado por referência. Tais promotores com preferência para semente incluem, mas não se limitam a, Cim1 (mensagem induzida por citocinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de milho); milps (mioinositol-1 -fosfato sintase); mZE40-2, também conhecido como Zm-40 (Pat. U.S. N2 6,403,862); nude ( Pat. U.S. N2 6,407,315); e celA (celulose sintase) (vide WO 00/11177). A gama-zeína é um promotor endos- perma-específico. Glob-1 é um promotor embrião-específico. Para dicotile- dôneas, os promotores semente-específicos incluem, mas não se limitam a, beta-faseolina de feijão, napina, beta-conglicinina, lectina de soja, cruciferi- na, e similares. Para monocotiledôneas, os promotores semente-específicos incluem, mas não se limitam a, um promotor de zeína de 15 kDa de milho, um promotor de zeína de 22 kDa, um promotor de zeína de 27 kDa, um promotor de zeína g, um promotor de gama-zeína de 27 kD(tal como o pro- motor gzw64A, vide o número de acesso do Genbank S78780), um promotor ceroso, um promotor shrunken 1, um promotor shrunken 2, um promotor de globulina 1 (vide o número de acesso do Genbank L22344), um promotor Itp2 (Kalla, et al., Plant Journal 6: 849-860 (1994); Patente US n° 5,525,716), promotor cim1 (vide Patente US n° 6,225,529) promotores end1 e end2 de milho(vide Patente US n° 6,528,704 e pedido 10/310,191, depositado em 4 de dezembro de 2002); promotor nud (Pat. U.S N2 6,407,315); promotor Zm40 ( Pat. U.S. N2 6,403,862); eep1 e eep2; led (pedido de patente U.S. N2 de série 09/718,754); promotor de tioredoxina H (Pedido de Patente Provisório U.S. 60/514,123); promotor de mlip15 ( Pat. U.S. N2 6,479,734); promotor de PCNA2; e o promotor de shrunken-2. (Shaw et al., Plant Phys 98: 1214-1216, 1992; Zhong Chen et al., PNAS USA 100: 3525-3530, 2003).
Exemplos de promotores induzíveis incluem promotores respon- sivos ao ataque de patógenos, condições anaeróbicas, temperatura elevada, luz,seca, temperatura fria, ou alta concentração de sal. Promotores induzíveis por patógeno incluem aqueles de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidas após infecção por um patógeno (por e- xemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glicanase, quitinase). Vide, por exemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116. Vide ainda o aplicação intitulada "Inducible Maize Promoters", pedido de patente U.S. N2 de série 09/257,583, depositado em 25 de fevereiro de 1999.
Além dos promotores de planta, outros promotores adequados podem ser derivados de origem bacteriana (por exemplo, o promotor de oc- topina sintase, o promotor de nopalina sintase e outros promotores derivados de plasmídeso Ti), ou podem ser derivados de promotores virais (por exemplo, promotores de RNA 35S e 19S de vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), promotores constitutivos de vírus do mosaivo do tabaco, promotores 19S e 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), ou promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária).
O termo "intensificador" refere-se a uma molécula de ácido nu- cleico, ou uma sequência de ácido nucleico, que pode recrutar proteínas reguladoras transcricionais, tais como ativadores transcricionais, aumentar a ativação transcricional mediante o aumento da atividade do promotor. Inten- sificadores adequados podem ser derivados de regiões adjacentes a um promotor nativo de interesse (fontes homólogas) ou podem ser derivados de contextos não nativos (fontes heterólogas) e operativamente ligados a qualquer promotor de interesse dentro de vetores de expressão de RNAi de N- tHMA para aumentar a atividade e/ou a especificidade por tecido de um promotor. Alguns intensificadores podem operar em qualquer orientação em relação à orientação de uma unidade de transcrição. Por exemplo, os intensificadores podem ser posicionados à montante ou à jusante de uma unidade transcricional que compreende um promotor e um construto de RNAi de NtHMA. Aqueles versados na técnica são capazes de ligar operativamente intensificadores e promotores para otimizar os níveis de transcrição de construtos de RNAi de NtHMA.
B. Vetores de expressão de RNAi que compreendem construtos de RNAi de NtHMA que codificam polinucleotídeos de RNAi de NtHMA
Interferência de RNA ("RNAi") ou silenciamento de RNA é um processo evolutivamente conservado pelo qual mRNAs específicos podem ser direcionados para degradação enzimática. Um RNA de dupla fita (dsR- NA) deve ser introduzido ou produzido por uma célula (por exemplo, vírus de dsRNA, ou polinucleotídeos de RNAi de NtHMA) para iniciar a via de RNAi. Os dsRNA podem ser convertidos em vários duplexes de siRNA com 21 a 23 bp de comprimento ("siRNAs") pelas RNases III, que são endonucleases específicas de dsRNA ("Dicer"). Os siRNAs podem ser, subsequentemente, reconhecidos por complexos de silenciamento induzidos por RNA ("RISC") que promovem o desenrolamento do siRNA através de um processo depen-dente de ATP. A fita antissenso desenrolada do siRNA guia o RISC ativado para o mRNA-alvo (por exemplo, variantes de RNA de NtHMA) que compreende uma sequência complementar à fita antissenso de siRNA. O mRNA atingido e a filamento antissenso podem formar uma A-hélice, e o sulco maior da forma de A-hélice pode ser reconhecido pelo RISC ativado. O mRNA- alvo pode ser clivado pelo RISC ativado em um único local definido pelo sítio de ligação da extremidade 5' da fita de siRNA. O RISC ativado pode ser reciclado para catalisar outro evento de divagem.
A figura 2A ilustra a construção de um vetor de expressão de RNAi de NtHMA exemplificador. Na figura 2A, "S "I denota a etapa I e "S II" denota a etapa II do processo de construção. Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem construtos de RNAi de NtHMA que codificam polinucleotídeos de RNAi de NtHMA que exibem atividade de interferência de RNA por reduzir o nível de expressão de mRNAs de NtHMA, pré-mRNAs de NtHMA, e variantes de RNA de NtHMA relacionadas. Os vetores de expressão compreendem um promotor posicionada à montante e operativamente ligado a um construto de RNAi de NtHMA, como definido adicionalmente abaixo. Os vetores de expressão de RNAi de NtHMA compreendem um promotor central mínimo a- dequado, um construto de RNAi de NtHMA de interesse, uma região reguladora à montante (5'), uma região reguladora à jusante (3'), incluindo sinais de término de transcrição e poliadenilação, e outras sequências conhecidas daqueles versados na técnica, tais como vários marcadores de seleção.
Os polinucleotídeos de NtHMA podem ser produzidos em várias formas, incluindo como estruturas de fita dupla semelhantes a grampo ("ds- RNAi"). O dsRNAi de NtHMA pode ser convertido enzimaticamente a siRNAs de NtHMA de fita dupla. Uma das fitas de dúplex de siRNA de NtHMA pode anelar a uma sequência complementar no mRNA de NtHMA-alvo e variantes de RNA de NtHMA relacionadas. Os duplexes de siRNA/mRNA são reconhecidos pelo RISC que pode clivar os RNAs de NtHMA em vários locais de uma forma dependente da sequência, resultando na degradação do mRNA de NtHMA-alvo e variantes de RNA de NtHMA relacionadas.
A figura 2B ilustra a formação de um duplex de RNA de dupla fita hipotético (com uma estrutura "haste-alça-haste") como um produto transcrito a partir de um construto de RNAi de NtHMA exemplificador. Na figura 2B, um construto de RNAi de NtHMA hipotético 10 é mostrado, que compreende 3 fragmentos de DNA de fita dupla, tais como os fragmentos 1 a 3. A seta I denota a formação do construto de RNAi, aa seta II a transcrição, e a seta III a formação de dsRNA. O fragmento 1 está posicionado à montante e operativamente ligado ao fragmento 2, que está posicionado à montante e operativamente ligado ao fragmento 3, aos quais as fitas/sequências de DNA 4, 6, e 8 estão ligadas juntas in tandem para formar a fita 11, conforme mostrado. Alternativamente, um construto de RNAi de NtHMA compreende "uma sequência senso" 5, que está posicionada à montante e operativamente ligada a "uma sequência espaçadora" 7, que está posicionada à montante e operativamente ligada a "uma sequência reversa complementar" 9. As fi-tas/sequências 5, 7, e 9 podem estar ligadas juntas in tandem para formar a fita/sequência 12. Alternativamente, um construto de RNAi de NtHMA compreende "uma sequência senso" 8, que está posicionada à montante e operativamente ligada a "uma sequência espaçadora" 6, que está posicionada à montante e operativamente ligada a "uma sequência reversa complementar" 4. As fitas/sequências 8, 6, e 4 podem estar ligadas juntas in tandem para formar a fita/sequência 11. A fita 12 é complementar à fita 11. A fita 11 é uma fita molde que pode ser transcrita em um polinucleotídeo de RNAi de NtHMA RNAi 13. O polinucleotídeo de RNAi de NtHMA 13 forma i,a estrutura em forma de grampo ("haste-alça-haste"), na qual a haste 16 é uma região complementar resultante das interações de pares de base intramoleculares do polinucleotídeo de RNAi de NtHMA 15 e a alça 17 representa uma região não complementar codificada por uma sequência espaçadora, como as fitas/sequências 6 ou 7.
Qualquer polinucleotídeo de RNA de NtHMA de interesse pode ser produzido mediante a seleção de uma composição de sequências adequada, tamanho da alça e comprimento da haste para produzir o dúplex de NtHMA em forma de grampo. Uma variação adequada para desenhar comprimentos de haste de um dúplex em forma de grampo, inclui comprimentos de haste de 20 a 30 nucleotídeos, 30 a 50 nucleotídeos, 50 a 100 nucleotí- deos, 100 a 150 nucleotídeos, 150 a 200 nucleotídeos, 200 a 300 nucleotí-deos, 300 a 400 nucleotídeos, 400 a 500 nucleotídeos, 500 a 600 nucleotídeos, e 600 a 700 nucleotídeos. Uma faixa adequada para desenhar com- primentos de alça de um duplex em forma de grampo, inclui comprimentos de alça de 4 a 25 nucleotideos, 25 a 50 nucleotideos, ou mais se o comprimento da haste do dúplex em forma de grampo for substancial. Em determinados contextos, estruturas em forma de grampo com regiões em dúplex mais longas que 21 nucleotideos podem promover silenciamento direcionado por siRNA eficaz, Independentemente da sequência e comprimento da alça.
Construtos de RNAi de NtHMA exemplificadores para regular negativamente o nível de expressão do gene de NtHMA (SEQ ID Ns: 1) e outros genes relacionados a NtHMA incluem os seguintes: Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem um construto de RNAi de NtHMA que compreende um ou mais dentre: íntron 1 (SEQ ID Ns: 4), éxon 1 (SEQ ID N°: 5), íntron 2 (SEQ ID N-: 6), éxon 2 (SEQ ID N-: 7), íntron 3 (SEQ ID N2: 8), éxon 3 (SEQ ID Ns: 9), íntron 4 (SEQ ID N2: 10), éxon 4 (SEQ ID Ns: 11), íntron 5 (SEQ ID N2: 12), éxon 5 (SEQ ID N2: 13), íntron 6 (SEQ ID N2: 14), éxon 6 (SEQ ID N2: 15), íntron 7 (SEQ ID N2: 16), éxon 7 (SEQ ID N2: 17), íntron 8 (SEQ ID N2: 18), éxon 8 (SEQ ID N2: 19), íntron 9 (SEQ ID N2: 20), éxon 9 (SEQ ID N2: 21), íntron 10 (SEQ ID N2: 22), éxon 10 (SEQ ID N2: 23), íntron 11 (SEQ ID N2: 24, éxon 11 (SEQ ID N2: 25), and íntron 12 (SEQ ID N2: 26), fragmentos dos mesmos, e variantes dos mesmos. Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem: um construto de RNAi de NtHMA que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência a uma sequência selecionada do grupo que consiste em: éxon 1 (SEQ ID N2: 5), um fragmento do éxon 1 (SEQ ID N2: 5), éxon 2 (SEQ ID N2: 7), um fragmento do éxon 2 (SEQ ID N2: 7), éxon 3 (SEQ ID N2: 9), um fragmento do éxon 3 (SEQ ID N2: 9), éxon 4 (SEQ ID N2: 11), um fragmento de éxon 4 (SEQ ID N2: 11), éxon 5 (SEQ ID N2: 13), um fragmento do éxon 5 (SEQ ID N2: 13), éxon 6 (SEQ ID N2: 15), um fragmento do éxon 6 (SEQ ID N2: 15), éxon 7 (SEQ ID N2: 17), um fragmento do éxon 7 (SEQ ID N2: 17), éxon 8 (SEQ ID N2: 19), um fragmento do éxon 8 (SEQ ID N2: 19), éxon 9 (SEQ ID N2: 21), um fragmento do éxon 9 (SEQ ID N2: 21), éxon 10 (SEQ ID N2: 23), um fragmento do éxon 10 (SEQ ID N2: 23), éxon 11 (SEQ ID N2: 25), e um fragmento do éxon 11 (SEQ ID N2: 25).
Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem: um construto de RNAi de NtHMA que codifica polinucleotídeos de RNAi de NtHMA capazes de autoanelamento para formar uma estrutura em forma de grampo, nos quais o construto de RNAi compreende (a) uma primeira sequência que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de se-quência à SEQ. ID N2: 3 ou SEQ ID N2: 47; (b) uma segunda sequência que codifica um elemento espaçador do polinucleotídeo de RNAi de NtHMA que forma uma alça da estrutura em forma de grampo; e (c) uma terceira sequência que compreende uma sequência reversa complementar da primeira sequência, posicionada na mesma orientação que a primeira sequência, sendo que a segunda sequência está posicionada entre a primeira sequência e a terceira sequência, e a segunda sequência é operativamente ligada à primeira sequência e à terceira sequência.
Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem: um construto de RNAi de NtHMA que codifica polinucleotídeos de RNAi de NtHMA capazes de autoanelamento para formar uma estrutura em forma de grampo, nos quais o construto de RNAi compreende (a) uma primeira sequência que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de se-quência à SEQ. ID N2: 3 ou SEQ ID N2: 47; (b) uma segunda sequência que codifica um elemento espaçador do polinucleotídeo de RNAi de NtHMA que forma uma alça da estrutura em forma de grampo; e (c) uma terceira sequência que compreende uma sequência reversa complementar da primeira sequência (SEQ ID N2: 46 ou SEQ ID N2: 48), posicionada na mesma orientação que a primeira sequência, sendo que a segunda sequência está posicionada entre a primeira sequência e a terceira sequência, e a segunda sequência é operativamente ligada à primeira sequência e à terceira sequência.
Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem: um construto de RNAi de NtHMA que compreende uma primeira sequência que tem "similaridade substancial," ou que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 3, ou porções de SEQ ID N2: 3. Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem um construto de RNAi de NtHMA que compreende uma primeira sequência que tem "similaridade substancial," ou que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID NO: 47, ou porções de SEQ ID N2: 47.
Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem: um construto de RNAi de NtHMA que compreende uma segunda sequência que tem "similaridade substancial," ou que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência a uma sequência selecionada do grupo que consiste em: íntron 1 (SEQ ID N2: 4), um fragmento do íntron 1 (SEQ ID N2: 4), íntron 2 (SEQ ID N2: 6), um fragmento do íntron 2 (SEQ ID N2: 6), íntron 3 (SEQ ID N2: 8), um fragmento do íntron 3 (SEQ ID N2: 8), íntron 4 (SEQ ID N2: 10), um fragmento do íntron 4 (SEQ ID N2: 10), íntron 5 (SEQ ID N2: 12), um fragmento do íntron 5 (SEQ ID N2: 12), íntron 6 (SEQ ID N2: 14), um fragmento do íntron 6 (SEQ ID N2: 14), íntron 7 (SEQ ID N2: 16), um fragmento do íntron 7 (SEQ ID N2: 16), íntron 8 (SEQ ID N2: 18), um fragmento do íntron 8 (SEQ ID N2: 18), íntron 9 (SEQ ID N2: 20), um fragmento do íntron 9 (SEQ ID N2: 20), íntron 10 (SEQ ID N2: 22), um fragmento do íntron 10 (SEQ ID N2: 22), íntron 11 (SEQ ID N2: 24), um fragmento do íntron 11 (SEQ ID N2: 24), íntron 12 (SEQ ID N2: 26), e um fragmento do íntron 12 (SEQ ID N2: 26). Alternativamente, a segunda sequência do construto de RNAi de NtHMA pode ser gerada aleatoriamente sem utilizar uma sequência de íntron derivada do gene de NtHMA (SEQ ID N2: 1).
Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem: um construto de RNAi de NtHMA que compreende uma terceira sequência que tem "similaridade substancial," ou que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N-: 46, ou porções de SEQ ID N-: 46. Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem um construto de RNAi de NtHMA que compreende uma terceira sequência que tem "similaridade substancial," ou que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ. ID NO: 48, ou porções de SEQ ID N2: 48.
Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem: um construto de RNAi de NtHMA que compreende uma terceira sequência que tem "similaridade substancial," ou que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência a uma sequência reversa complementar selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID N2: 27 (éxon 1), um fragmento de SEQ ID N2: 27 (éxon 1), SEQ ID N2: 28 (éxon 2), um fragmento de SEQ ID N2: 28 (éxon 2), SEQ ID N2: 29 (éxon 3), um fragmento de SEQ ID N2: 29 (éxon 3), SEQ ID N2: 30 (éxon 4), um fragmento de SEQ ID N2: 30 (éxon 4), SEQ ID N2: 31 (éxon 5), um fragmento de SEQ ID N2: 31 (éxon 5), SEQ ID N2: 32 (éxon 6), um fragmento de SEQ ID N2: 32 (éxon 6), SEQ ID N2: 33 (éxon 7), um fragmento de SEQ ID N2: 33 (éxon 7), SEQ ID N2: 34 (éxon 8), um fragmento de SEQ ID N2: 34 (éxon 8), SEQ ID N2: 35 (éxon 9), um fragmento de SEQ ID N2: 35 (éxon 9), SEQ ID N2: 36 (éxon 10), um fragmento de SEQ ID N2: 36 (éxon 10), SEQ ID N2: 37 (éxon 11), e um fragmento de SEQ ID N2: 37 (éxon 11).
Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem um construto de RNAi de NtHMA que compreende: SEQ ID N2: 38 ("sequência/fragmento senso"), a segunda sequência compreende SEQ ID N2: 39 ("sequência/fragmento espaçador) e a terceira sequência compreende SEQ ID N2: 40 ("sequência/fragmento antis- senso").
Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão de RNAi de NtHMA que compreendem um construto de RNAi de NtHMA que compreende: SEQ ID N2: 42 ("sequência/fragmento senso"), a segunda sequência compreende SEQ ID Ns: 43 ("sequência/fragmento espaçador"), e a terceira sequência compreende SEQ ID N2: 44 ("sequência/ fragmento antissenso").
Alternativamente, as sequências apresentadas podem ser utilizadas para construir vários polinucleotídeos de NtHMA que não formam estruturas em forma de grampo. Por exemplo, um RNA de fita dupla de NtHMA longo pode ser formado através de (1) transcrever uma primeira fita do cDNA de NtHMA por ligação operativa a um primeiro promotor, e (2) transcrever a sequência reversa complementar da primeira fita do fragmento de cDNA de NtHMA por ligação operativa a um segundo promotor. Cada fita do polinucleotídeo de NtHMA pode ser transcrita a partir do mesmo vetor de expressão, ou a partir de vetores de expressão diferentes. O dúplex de RNA de NtHMA que tem atividade de interferência de RNA pode ser convertido enzimaticamente a siRNAs para reduzir os níveis de RNA de NtHMA.
C. Vetores de expressão para redução a expressão gênica de NtHMA Gene por cossupressão
Várias composições e métodos são fornecidos para reduzir os níveis de expressão endógenos de membros da família de genes NtHMA por promover a cossupressão da expressão gênica de NtHMA. O fenômeno de cossupressão ocorre como um resultado da introdução de múltiplas cópias de um transgene em uma célula hospedeira de planta. A integração de múltiplas cópias de um transgene pode resultar em expressão reduzida do transgene e o gene endógeno direcionado. O grau de cossupressão depende do grau de identidade de sequência entre o transgene e o gene endógeno direcionado. O silenciamento do gene endógeno e do transgene pode ocorrer por metilação extensa dos lócus silenciados (isto é, o promotor endógeno e o gene endógeno de interesse) que pode impedir a transcrição. Alternativamente, em alguns casos, a cossupressão do gene endógeno e do transgene pode ocorrer por silenciamento gênico pós-transcricional ("PTGS"), no qual os transcritos podem ser produzidos, mas taxas aumentadas de degradação impedem o acúmulo dos transcritos. Acredita-se que o mecanismo para cossupressão por PTGS se assemelhe à interferência de RNA, em que o RNA parece ser tanto um importante iniciador como um alvo nestes processos, e pode ser mediado pelo menos em parte pelo mesmo maquinário molecular, possivelmente através de degradação guiada por RNA dos mRNAs.
A cossupressão de membros da família de genes NtHMA pode ser obtida por integrar múltiplas cópias do cDNA de NtHMA ou fragmentos dos mesmos, como transgenes, no genoma de uma planta de interesse. A planta hospedeira pode ser transformada com um vetor de expressão que compreende um promotor operativamente ligado a um cDNA de NtHMA ou fragmentos dos mesmos. Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão para promover a cossupressão de genes endógenos da família NtHMA que compreendem: um promotor operativamente ligado ao cDNA de NtHMA identificado como Clone P6663 (SEQ ID N-: 3) ou um fragmento do mesmo, ou cDNA de NtHMA identificado como Clone P6643 (SEQ ID N2: 47) ou um fragmento do mesmo. Várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão para promover cossupressão de genes endógenos genes da família NtHMA que compreendem: um promotor operativamente ligado ao cDNA de NtHMA, ou um fragmento do mesmo, que tem pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 3 ou SEQ ID N2: 47.
Várias modalidades são direcionadas a métodos para reduzir o nível de expressão de genes endógenos da família NtHMA por integrar múltiplas cópias de cDNA de NtHMA ou um fragmento do mesmo no genoma de uma planta, que compreendem: transformar uma célula hospedeira de planta com um vetor de expressão que compreende um promotor operativamente ligado à SEQ ID N2: 3, ou um fragmento da mesma; ou SEQ ID N2: 47, ou um fragmento da mesma. Várias modalidades são direcionadas a métodos para reduzir o nível de expressão de genes endógenos da família NtHMA por integrar múltiplas cópias de cDNA de NtHMA, ou um fragmento do mesmo, no genoma de uma planta, que compreendem: transformar uma célula hospedeira de planta com um vetor de expressão que compreende um pro- motor operativamente ligado a cDNA de NtHMA, ou um fragmento do mesmo, que tem pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à SEQ. ID N2: 3 ou SEQ ID N2: 47.
D. Vetores de expressão para reduzir a expressão gênica de NtHMA através da inibição da tradução por agentes antissenso
Várias composições e métodos são fornecidos para reduzir o nível de expressão endógeno da família de genes NtHMA através da inibição da tradução do mRNA de NtHMA. Uma célula de planta hospedeira pode ser transformada com um vetor de expressão que compreende: um promotor operativamente ligado a cDNA de NtHMA ou um fragmento do mesmo, posicionado em uma orientação antissenso em relação ao promotor para permitir a expressão de polinucleotídeos de RNA que tem uma sequência complementar a uma porção do mRNA de NtHMA. Vários vetores de expressão para inibir a tradução do mRNA de HMA compreendem: um promotor operativamente ligado ao cDNA de NtHMA identificado como Clone P6663 (SEQ ID N2: 3) ou um fragmento do mesmo; ou cDNA de NtHMA identificado como Clone P6643 (SEQ ID N2: 47) ou um fragmento do mesmo, no qual o cDNA de NtHMA, ou o fragmento do mesmo, está posicionado em orientação antissenso em relação ao promotor. Vários vetores de expressão para inibir a tradução de mRNA de HMA compreendem: um promotor operativamente ligado a um cDNA de NtHMA, ou um fragmento do mesmo, que tem pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a SEQ ID N2: 3 ou SEQ ID N2: 47, no qual o cDNA de NtHMA, ou o fragmento do mesmo,está posicionado em orientação antissenso com relação ao promotor. Os comprimentos dos polinucleotídeos de RNA de NtHMA antissenso podem variar, incluindo 15 a 20 nucleotídeos , 20 a 30 nucleotídeos, 30 a 50 nucleotídeos, 50 a 75 nucleotídeos, 75 a 100 nucleotídeos, 100 a 150 nucleotídeos, 150 a 200 nucleotídeos, e 200 a 300 nucleotídeos.
Várias modalidades são direcionadas a métodos para reduzir o nível de expressão de genes endógenos da família NtHMA por através da inibição da tradução do mRNA de NtHMA, que compreendem: transformar uma célula hospedeira de planta com um vetor de expressão que compreende um promotor operativamente ligado ao cDNA de NtHMA identificado como Clone P6663 (SEQ ID N°: 3) ou um fragmento do mesmo; ou cDNA de NtHMA identificado como Clone P6643 (SEQ ID N°: 47) ou um fragmento do mesmo, no qual o cDNA de NtHMA, ou o fragmento do mesmo, está posicionado em orientação antissenso com relação ao promotor. Várias modalidades são direcionadas a métodos para reduzir o nível de expressão de genes endógenos da família NtHMA através da inibição da tradução do mRNA de NtHMA, que compreendem: transformar uma célula hospedeira de planta com um vetor de expressão que compreende um promotor operativamente ligado ao cDNA de NtHMA, ou um fragmento do mesmo, que tem pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a SEQ ID Ns: 3 ou SEQ ID N°: 47, no qual o cDNA de NtHMA, ou o fragmento do mesmo, está posicionado em orientação an-tissenso com relação ao promotor.
E. Outras composições e métodos para reduzir expressão gêni- ca de NtHMA
Métodos para obter variantes conservatives e variantes mais divergentes de polinucleotídeos e polipeptídeos de NtHMA são conhecidos daqueles versados na técnica. Qualquer planta de interesse pode ser geneticamente modificada por vários métodos conhecidos para induzir mutagê- nese, incluindo mutagênese sítio-dirigida, mutagênese dirigida por oligonu- cleotídeo, mutagênese induzida quimicamente, mutagênese induzida por irradiação, e outros métodos equivalentes. Por exemplo, a mutagênese sítio- dirigida é descrita, por exemplo, em Smith (1985) "In vitro mutagenesis," Ann. Rev. Genet. 19: 423-462, e referências ali contidas, como Botstein & Shortle (1985) "Strategies and Applications of in vitro Mutagenesis," Science 229: 1193-1201; e em Carter (1986) "Site-directed mutagenesis," Biochem. J. 237: 1-7. A mutagênese dirigida por oligonucleotídeo é descrita, por exemplo, em Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide-directed Mutagenesis using M13-derived Vectors: an Efficient and General Procedure for the Produc- tion of Point mutations in any DNA Fragment," Nucleic Acids Res. 10: 6487- 6500. Mutagênese utilizando bases modificadas é descrita, por exemplo, em Kunkel (1985) "Rapid and Efficient Site-specific Mutagenesis without Phenotypic Selection," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492, e em Taylor et al. (1985) "The Rapid Generation of Oligonucleotide-directed Mutations at High Frequency using Phosphorothioate-modified DNA," Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787. Mutagênese utilizando DNA de dúplex com lacunas é descrita, por exemplo, em Kramer et al. (1984) "The Gapped Duplex DNA Approach to Oligonucleotide-directed Mutation Construction," Nucl. Acids Res. 12: 9441-9460). Mutagênese de não pareamento pontual é descrita, por exemplo, em Kramer et al. (1984) "Point Mismatch Repair," Cell 38: 879-887). Mutagênese de quebra de dupla-fita é descrita, por exemplo, em Mandecki (1986) "Oligonucleotide-directed Double-strand Break Repair in Plasmids of Escherichia coli: A Method for Site-specific Mutagenesis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181, e em Arnold (1993) "Protein Engineering for Unusual Environments," Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455). Mutagênese utilizando cepas hospedeiras com reparo deficiente pe descrita, por exemplo, em Carter et al. (1985) "Improved Oligonucleotide Site-directed Mutagenesis using M13 Vectors," Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443. Mutagênese por síntese completa do gene é descrita, por exemplo, em Nambiar et al. (1984) "Total Synthesis and Cloning of a Gene Coding for the Ribonuclease S Protein," Science 223: 1299-1301. Embaralhamento de DNA é descrito, por exemplo, em Stemmer (1994) "Rapid Evolution of a Protein in vitro by DNA Shuffling," Nature 370: 389-391, e em Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In Vitro Recombination for Molecular Evolution," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751.
Alternativamente, os genes de NtHMA podem ser direcionados para inativação por introduzir transposons (e elementos IS) nos genomas das plantas de interesse. Estes elementos genéticos móveis podem ser introduzidos por fertilização sexual cruzada e os mutantes de inserção podem ser selecionados quanto à perda na atividade de NtHMA, tal como transporte de Cd reduzido. O gene de NtHMA interrompido em uma planta parental po- de ser introduzido em outras plantas através do cruzamento da planta parental com uma planta não submetida à mutagênese induzida por transposon, por exemplo, por fertilização sexual cruzada. Qualquer técnica de reprodução-padrão conhecida de versados na técnica pode ser utilizada. Em uma modalidade, um ou mais genes relacionados à NtHMA podem ser inativados pela inserção de um ou mais transposons. As mutações podem resultar em interrupção homozigota de um ou mais genes de NtHMA, em interrupção heterozigota de um ou mais genes de NtHMA, ou uma combinação de ambas as interrupções homozigota e heterozigota caso mais de um gene NtHMA seja interrompido. Elementos transponíveis adequados podem ser selecionados a partir de duas amplas classes, chamadas classe I e classe II. Elementos transponíveis de classe I adequados incluem retrotransposons, retroposons, e elementos do tipo SINE. Tais métodos são conhecidos dos versados na técnica, conforme descrito em Kumar e Bennetzen (1999), Plant Retrotransposons in Annual Review of Genetics 33: 479.
Alternativamente, os genes de NtHMA podem ser direcionados para inativação através de um método chamado de Lesões Locais Induzidas em Genomas ("TILLING"), que combina uma alta densidade de mutações pontuais com detecção sensível e rápida de mutações. Tipicamente, sementes de plantas são expostas a mutágenos, tais como etilmetanossulfonato (EMS) ou alquilatos de guanina EMS, o que leva, tipicamente, ao pareamen- to errôneo. Agentes e métodos adequados são conhecidos daqueles versados na técnica, conforme descrito em McCallum et al., (2000), "Targeting Induced Local Lesions IN Genomics (TILLING) for Plant Functional Genomics," Plant Physiology 123: 439-442; McCallum et al., (2000) "Targeted screening for induced mutations," Nature Biotechnology 18: 455-457; and Colbert et al., (2001) "High-Throughput Screening for Induced Point Muta-tions," Plant Physiology 126:480-484.
Alternativamente, genes de NtHMA podem ser direcionados para inativação através da introdução de ribozimas derivadas de inúmeros pequenos RNAs circulares que são capazes de autoclivagem e replicação em plantas. Estes RNAs podem replicar sozinhos (RNAs viróides) ou com um vírus auxiliar (RNAs satélites). Exemplos de RNAs adequados incluem aqueles derivados de RNAs satélite e do tipo avocado sunblotch viroid derivados dos vírus tobacco ringspot virus, lucerne transient streak virus, velvet tobacco mottle virus, solanum nodiflorum mottle virus, e subterranean clover mottle virus. Várias ribozimas RNA-específicas são conhecidas dos versados na técnica, conforme descrito em Haseloff et al. (1988) Nature, 334: 585-591.
III. Plantas, linhagens celulares, e sementes transgênicas que compreendem polinucleotídeos de RNAi de NtHMA e métodos relacionados
Várias modalidades são direcionadas a plantas transgênicas geneticamente modificadas para reduzir o nível de expressão gênica de NtHMA através de vários métodos que podem ser utilizados para silenciamento de expressão gênica de NtHMA e, assim, produzir plantas transgênicas nas quais o nível de expressão de transportadores de NtHMA pode ser reduzido nos tecidos de planta de interesse. As taxas de transporte de metal pesado e os padrões de distribuição do transporte de metal pesado, em particular, o transporte de cádmio, podem ser alterados em plantas transgênicas produzidas de acordo com os métodos e composições apresentados. Plantas a- dequadas para modificação genética incluem monocotiledôneas e dicotile- dôneas.
Várias modalidades são direcionadas a plantas de tabaco transgênicas geneticamente modificadas para reduzir o nível de expressão gênica de NtHMA através de vários métodos, conhecidos dos versados na técnica, que podem ser utilizados para regular negativamente a expressão do gene de NtHMA e, assim, produzir plantas de tabaco transgênicas nas quais o nível de expressão de transportadores de NtHMA pode ser reduzido nos tecidos da planta de interesse. Foram fornecidos vários vetores de expressão para produzir linhagens transgênicas de tabaco de qualquer variedade, os quais exibem níveis reduzidos de expressão do gene de NtHMA. As composições e métodos apresentados podem ser aplicados a qualquer espécie de planta de interesse, incluindo plantas do gênero Nicotiana, várias espécie de Nicotiana, incluindo N. rústica e N. tabacum (por exemplo, LA B21, LN KY171, T11406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, e Petiço). Outras espécies incluem N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuate, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonaríensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearís, N. longiflora, N. marítima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperís, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrívalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. set- chellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveo- lens, N. sylvestrís, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trígo- nophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, e N. x san- derae. Plantas adequadas para transformação incluem qualquer tecido de planta capaz de transformação através de vários métodos de transformar plantas conhecidos pelos versados na técnica, incluindo eletroporação, bombardeio com microprojéteis, e transferência mediada por Agrobacterium, conforme descrito, por exemplo, na Patente US n°. 4,459,355 que revela um método para transformar plantas suscetíveis, incluindo dicotiledôneas, com uma cepa de Agrobacterium que contém um plasmídio Ti; a Patente US n° 4,795,855 que revela a transformação de plantas lenhosas com um vetor de Agrobacterium; a Patente US n° 4,940,838 que revela um vetor binário de Agrobacterium; a Patente US n° 4,945,050; e a Patente US n° 5,015,580.
[0001]Várias modalidades são direcionadas a plantas de tabaco transgênicas geneticamente modificadas para expressar exogenamente um construto de RNAi que codifica polinucleotídeos de RNAi de NtHMA que facilitam a degradação de transcritos de RNA de NtHMA, e consequentemente, que reduzem o número de transcritos de RNA disponíveis para tradução em transportadores de NtHMA. Várias modalidades são direcionadas a plantas transgênicas que compreendem um vetor de expressão que permite a expressão de polinucleotídeos de NtHMA produzidos de acordo com os métodos apresentados. Várias modalidades são direcionadas a linhagens célula- res derivadas das plantas transgênicas produzidas de acordo com os métodos apresentados. Várias modalidades são direcionadas a sementes transgênicas derivadas das plantas transgênicas produzidas de acordo com os métodos apresentados.
[0002]Várias modalidades são direcionadas a métodos para reduzir os níveis de expressão gênica de NtHMA em plantas, o método compreendendo reduzir o nível de expressão de um gene de NtHMA, o que pode ser realizado através de vários métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Como exemplos, esta descrição descreveu: (1) método de interferência de RNA para reduzir o nível do estado estacionário de variantes de RNA de NtHMA endógenas disponíveis para tradução através da expressão de polinucleotídeos de RNAi de NtHMA; (2) método de co-supressão para reduzir a transcrição de gene(s) de NtHMA através da integração de múltiplas cópias do cDNA de NtHMA ou fragmentos do mesmo, como transge- nes, no genoma de uma planta; (3) método antissenso para reduzir a tradução de NtHMA através da expressão de polinucleotídeos antissenso que podem atingir o RNA de NtHMA; e (4) vários métodos para induzir mutagê- nese.
[0003]Várias modalidades são direcionadas a plantas de tabaco transgênicas geneticamente modificadas para reduzir o nível de expressão gênica de NtHMA através de vários métodos, conhecidos dos versados na técnica, e modificados adicionalmente para reduzir a expressão de um segundo gene endógeno de interesse (isto é, não relacionado a NtHMA) ou até aumentar a expressão de um gene exógeno de interesse (isto é, não rela-cionado a NtHMA). Por exemplo, pode ser desejável regular negativamente um segundo gene endógeno de interesse que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de alcaloides. Em outras situações, pode ser desejável aumentar o nível de expressão de um transgene que codifica uma proteína recombinante de interesse, tal como um hormônio humano para uso terapêutico. Os versados na técnica são capazes de produzir várias plantas transgênicas que podem ser modificadas, por exemplo, para expressar exo- genamente polinucleotídeos de RNAi de NtHMA e pelo menos um produto gênico recombinante de interesse, tal como um fator de crescimento humano recombinante ou polinucleotídeos de RNAi que podem atingir um segundo gene de interesse não relacionado à família NtHMA.
[0004]A produção de plantas transgênicas de acordo com os métodos apresentados fornece inúmeras vantagens. As plantas transgênicas, incluindo plantas de tabaco transgênicas, podem ser cultivadas em solos contendo concentrações de Cd variáveis, ou em solos contendo concentrações de Cd menores que as desejáveis. Estas plantas transgênicas e sementes derivadas podem fornecer mais opções para cultivá-las em uma faixa mais ampla de ambientes de solo, que podem aumentar a quantidade de solos cultiváveis disponíveis para os profissionais (por exemplo, fazendeiros). Além disso, estas plantas transgênicas, que exibem conteúdo de Cd reduzido em comparação aos seus equivalentes não transgênicos podem ser consumidas diretamente como produtos comestíveis. O consumo de porções comestíveis destas plantas transgênicas pode ser uma opção mais saudável em comparação ao consumo de equivalentes não transgênicos. Plantas adequadas que podem ser geneticamente modificadas de acordo com os métodos apresentados, incluem plantas cultiváveis para uso agrícola, incluindo arroz, milho, abóbora, soja, alface, batatas, beterrabas, ervas, trigo, cevada, cenouras, etc. A redução no percentual de Cd nestas plantas transgênicas, incluindo a porção da lâmina da folha, pode ser de aproximadamente pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99%, quando comparada a equivalentes não transgênicos. O conteúdo de Cd destas plantas transgênicas, incluindo a porção da lâmina da folha, é um valor de uma faixa de cerca de 0,01 a cerca de 0,05 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 1,0 ppm, e de cerca de 0,01 a cerca de 5 ppm.
[0005]IV. Produtos consumíveis que incorporam folhas de tabaco geneticamente modificadas para conter conteúdo de Cd reduzido
[0006]Várias modalidades fornecem plantas transgênicas, nas quais o nível de expressão de membros da família de genes NtHMA é subs- tancialmente reduzido para reduzir ou impedir o transporte de Cd para a lâmina da folha. A lâmina da folha derivada das plantas de tabaco transgênicas produzidas de acordo com os métodos apresentados, pode ser incorporada em vários produtos consumíveis contendo Cd a um nível substancialmente abaixo daquele de produtos consumíveis produzidos através da incorporação de folhas de tabaco derivadas de plantas do mesmo genótipo que foram cultivadas sob condições idênticas, mas não geneticamente modi-ficadas com relação ao nível de expressão reduzido de membros da família de genes de NtHMA ("equivalentes não transgênicos").
[0007]Em algumas modalidades, estas plantas transgênicas que exibem conteúdo de Cd reduzido em comparação a equivalentes não transgênicos podem ser incorporadas em produtos consumíveis, incluindo vários artigos para fumar, tais como charutos, cigarros, e produtos de tabaco não fumável (isto é, não combustíveis). Artigos para fumar e produtos de tabaco não fumável, produzidos através da incorporação de folhas de tabaco derivadas de plantas de tabaco geneticamente modificadas para conter níveis de Cd reduzidos de acordo com os métodos apresentados, podem fornecer opções mais saudáveis em comparação a equivalentes não transgênicos.
[0008]Produtos de tabaco não fumável que incorporam plantas de tabaco geneticamente modificadas de acordo com os métodos apresentados podem ser fabricados em qualquer formato adequado para adaptação na cavidade oral do consumidor. Produtos de tabaco não fumável contêm tabaco em qualquer forma, incluindo partículas secas, fragmentos, grânulos, pós, ou uma pasta fluida (isto é, extrato de tabaco), depositado sobre, misturado em, circundado por, ou combinado de outro modo com outros ingredientes em qualquer formato, tais como flocos, filmes, tabletes, espumas ou esferas. Produtos de tabaco não fumável podem ser embalados com um material que pode ser comestível (isto é, de desintegração oral) ou não comestível. Os conteúdos líquidos de produtos de tabaco não fumável podem ser confinados em uma forma, tal como esferas, para evitar a interação com um invólucro solúvel em água. O invólucro pode ter o formato de um saco de contenção para encerrar, parcial ou completamente, as composições que incorporam tabaco, ou para funcionar como um adesivo para manter diversos tabletes, esferas, ou flocos de tabaco juntos. Um invólucro pode, também, encerrar uma composição de tabaco moldável que se adapta ao formato da boca de um consumidor. Um invólucro de desintegração oral pode revestir tabaco não fumável, por exemplo, como um rapé seco ou tabaco solúvel, e pode ser formado em um equipamento de termoformação contínuo ou formação/preenchimento/selagem horizontal ou outro equipamento de embalagem adequado com o uso de filmes comestíveis (que podem ou não conter tabaco). Materiais exemplificadores para construir um invólucro incluem composições de filme que compreendem HPMC, CMC, pectina, alginatos, pululano, e outros polímeros formadores de filme comestíveis comercialmente viáveis. Outros materiais de invólucro podem incluir cápsulas pré- formadas produzidas a partir de gelatina, HPMC, amido/carragenina, ou outros materiais disponíveis para comercialização. Tais materiais de invólucro podem incluir tabaco como um ingrediente. Os invólucros que não são de desintegração oral podem ser compostos de materiais tecidos ou não- tecidos, de papel revestido ou não-revestido, ou de filmes plásticos perfurados ou porosos de outro modo. Os invólucros podem incorporar agentes fla- vorizantes e/ou corantes. Produtos não fumáveis podem ser unidos aos invólucros utilizando qualquer método de embalagem comercial conhecido dos versados na técnica, incluindo métodos tais como embalagem em blister e stik-paking, no qual uma pequena embalagem pode ser formada por uma máquina de embalagem de formação/preenchimento/selagem vertical.
[0009]0 percentual de redução de Cd nestes artigos fumáveis e produtos não fumáveis, produzidos através da incorporação de folhas de tabaco derivadas de plantas de tabaco geneticamente modificadas para conter níveis de Cd reduzidos, é um valor de pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e 100%, quando comparada aos produtos consumíveis derivados de equivalentes não transgênicos. Em algumas modalidades, o conteúdo de Cd destes artigos fumáveis e produtos não fumáveis, produzidos através da incorporação de folhas de tabaco deri- vadas de plantas de tabaco geneticamente modificadas para conter níveis de Cd reduzidos, é um valor em uma faixa de cerca de 0,01 a cerca de 0,05 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 1,0 ppm, e de cerca de 0,01 a cerca de 5 ppm.
[0010]O grau de acúmulo de Cd em plantas pode ser substancialmente variável dependendo de vários parâmetros atribuídos à complexidade do genótipo e ao ambiente de crescimento. Por exemplo, as concentrações de Cd em folhas de tabaco crescidas em campo podem ser extremamente variáveis dependendo de fatores tais como o agro-clima, parâmetros do solo, e os cultivares. Além disso, os padrões de distribuição de Cd relativos dentro de diferentes porções de uma planta de tabaco podem variar de acordo com a espécie, o órgão/tecido, e as condições de crescimento (isto é, cultivadas em campo versus cultivadas hidroponicamente). Em média, as concentrações de Cd medidas em folhas de tabaco cultivadas em campo (incluindo, o sulco central da folha e as nervuras) pode situar-se na faixa de aproximadamente 0,5 a 5 ppm (partes por milhão, ou ug/g de peso seco de folhas de tabaco). Entretanto, muitos níveis de Cd publicados tipicamente não definem o estágio de maturação do tabaco, a variedade do tabaco, ou as porções particulares da folha (isto é, remoção da posição do pedúnculo da folha) coletadas para análise. Em algumas variedades, as folhas mais baixas podem acumular níveis de Cd maiores do que as folhas intermediárias e superiores. No nível intracelular, o Cd pode ser encontrado em vários componentes celulares de uma célula de planta, incluindo a parede celular, o citoplasma, o cloroplasto, o núcleo e os vacúolos.
[0011]Além disso, o conteúdo de Cd medido em folhas de tabaco pode variar substancialmente dependendo dos níveis de Cd no ambiente do solo onde as plantas de tabaco foram cultivadas. As folhas de tabaco cultivadas em áreas contaminadas com Cd podem acumular Cd de cerca de 35 ppm ou mais, em comparação com as folhas de equivalentes geneticamente idênticos cultivados em áreas não contaminadas, que podem acumular Cd em uma faixa de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 8 ppm. Os va- cúolos das folhas de plantas cultivadas em áreas contaminadas com Cd podem acumular concentrações de Cd muito altas. Métodos para modificar as composições reveladas para serem adequadas para uma dada espécie de planta de interesse são conhecidos daqueles versados na técnica.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 Clonagem e Mapeamento de Éxon de um Clone Genômico de Extensão Completa NtHMA de Nicotiana
Dois clones genômicos parciais que representam diferentes porções de um gene endógeno de NtHMA foram identificados independentemente, referidos como "CHO_OF96xf)1.ab1" e "CHO_OF261xo09c1.ab1". Com base na informação de sequência obtida dos clones genômicos parciais, um clone genômico de extensão completa (_HO-18-2) e 4 cDNAs de NtHMA de extensão completa foram identificados subsequentemente, incluindo o clone P6663 (SEQ ID NO: 3) e o clone P6643 (SEQ ID NO: 47). As sub-regiões de éxon e íntron do clone genômico de extensão completa (_HO-18-2) (17.921 bp) foram mapeadas. Como mostrado na figura 1, o gene endógeno NtHMA de extensão completa clonado de Nicotiana compreende 11 éxons que consistem de 3392 nucleotídeos no total.
EXEMPLO 2
Construção do vetor de expressão de RNAi de NtHMA PBI121 -NtHMA (660-915) que codifica polinucleotídeos de RNAi A Tabela 1 fornece uma lista de posições de nucleotídeo mapeadas para cada éxon dentro do clone genômico NtHMA isolado (SEQ ID NO: 1). Tabela 1
O clone genômico parcial CHO_OF96xf01.ab1 inclui uma parte do íntron 4, éxon 4, íntron 5, éxon 5, íntron 6 e uma parte do éxon 6, como mostrado na figurai e listado na Tabela 1. O clone genômico parcial CHO_OF261xo09c1.ab1 inclui uma parte do íntron 7, éxon 7, íntron 8, éxon 8 e uma parte do éxon 9, como mostrado na figura 1. Para produzir plantas transgênicas que possam produzir estavelmente polinucleotídeos de RNAi de NtHMA recombinante de interesse, que possam facilitar a degradação de transcritos de RNA endógenos que codificam polipeptídeos de NtHMA, dois conjuntos de vetores de expressão de de RNAi de NtHMA, o vetor de expressão de RNAi PBI121-NtHMA (660-915), como descrito posteriormente abaixo, e o vetor de expressão de RNAi PB1121-NtHMA (1382-1584) como descrito mais tarde no Exemplo 3.
A figura 2 ilustra uma estratégia de subclonagem exemplar para a construção de um vetor de expressão de RNAi de NtHMA que possibilita a expressão constitutiva de polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse. Com base no mapeamento de éxon e na análise de sequência do clone genômico CHO_OF96xf01.ab1, os construtos de RNAi foram desenhados.
A figura 3A mostra uma sequência de RNAi exemplar, NtHMA (660-915), para a produção de polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse. Na figura 3A, o construto de RNAi NtHMA RNAi (SEQ ID NO: 41) compreende um fragmento de senso (272 bp) (SEQ ID NO: 38) composto pelo éxon 4 (272 bp), que está posicionado a montante e operativamente ligado a um fragmento espaçador (80 bp) (SEQ ID NO: 39) composto pelo íntron 5, que está posicionado a montante e operativamente ligado a um fragmento complementar reverso (272 bp) (SEQ ID NO: 40) composto pelo éxon 4 posicionado em orientação antissenso. Os construtos de RNAi que codificam os polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse foram inseridos no vetor de clonagem PBKCMV e foram colocados a jusante e operativamente ligados a um promotor de citomegalovírus (CMV). Os sítios Xbal e Hindlll foram incorporados nas extremidades 5' e 3' do fragmento de senso de NtHMA com 352 bp, que incluía o fragmento de íntron com 80 bp, pela utilização dos iniciadores de PCR modificados para incorporar esses sítios de enzima de restrição ((PMG783F: ATTCTAGACTGCTGCTATGTCATC ACTGG [SEQ ID NO: 50] e PMG783R: ATAAGCTTAGCCTGAAGAATTG AGCAAA [SEQ ID NO: 51]). Similarmente, os sítios Spel e Saci foram incorporados nas extremidades 5' e 3' do fragmento complementar reverso de NtHMA correspondente pela utilização dos iniciadores de PCR (PMG 785F: ATGAGCTCTGGTTATGTAGGCTACTGCTGCT [SEQ ID NO: 52] e PMG 786R: ATACTAGTATTTGTAGTGCCAGCCCAGA [SEQ ID NO: 53]) para produzir o plasmídeo PBKCMV-NtHMA RNAi. Os vetores de expressão de RNAi de PBI121 -NtHMA foram construídos pela (a) excisão da ORF de β- glicuronidase ORF do vetor de expressão binário ("pBI121" da CLONTECH), e (b) substituição do construto de RNAi de NtHMA, excisados do plasmídeo PBKCMV-NtHMA RNAi, nos sítios de Xbal/Sacl do plasmídeo PBI121 no lugar da ORF de β-glicuronidase removida. Os vetores de expressão de RNAi de PBI121-NtHMA compreendem: (i) um fragmento de senso com 352 bp Xbal-Hindlll NtHMA que inclui (ii) um fragmento de íntron com 80bp, operativamente ligado ao fragmento reverso complementar (iii) com 272bp Spel- I-Sacl NtHMA.
EXEMPLO 3 Construção de um Vetor de expressão de RNAi de HtHMA PBI121-NtHMA (1382-1584) que codifica polinucleotídeos de RNAi
A figura 4A mostra uma sequência exemplar de RNAi, HtHMA (1382-1584), para a produção de polinucleotídeos de RNAi de HtHMA de interesse. Com base no mapeamento de éxon e na análise de sequência do clone genômico CHO_OF261xo09c1, um construto de RNAi (SEQ ID NO: 41) foi desenhado incluindo um fragmento de senso (191 bp) (SEQ ID NO: 42) que compreende as sequências do éxon 7, que está posicionado a montante e operativamente ligado a uma fragmento espaçador de DNA (139 bp) (SEQ ID NO: 43) que compreende as sequências do íntron 8, que está posi-cionado a montante e operativamente ligado a um fragmento complementar reverso (196 bp) (SEQ ID NO: 44) que compreende as sequências do éxon 7 posicionado em orientação antissenso. Esses construtos de RNAi que codifi- cam os polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse foram inseridos no vetor de clonagem PBKCMV e foram colocados a jusante e operativamente ligados a um promotor de citomegalovírus (CMV). Os sítios Xbal e Hindlll foram incorporados nas extremidades 5' e 3' do fragmento de senso de N- tHMA com 330 bp, que incluía um fragmento de íntron com 139 bp pela utilização dos iniciadores de PCR modificados para incorporar esses sítios de enzima de restrição (PMG754F: ATTCTAGATGAGAGCAAGTCAGGT- CATCC [SEQ ID NO: 54] e PMG754R: ATAAGCTTTTCAAACATCCACCG- CATTA [SEQ ID NO: 55]). Similarmente, os sítios Spel e Saci foram incorporados nas extremidades 5' e 3' do fragmento complementar reverso de NtHMA correspondente pela utilização dos iniciadores de PCR PMG757F: AT- GAGCTCGCATTGAGAGCAAGTCAGGTC [SEQ ID NO: 56] e PMG757R: ATCTGCAGCCTGTGGTACATCCAGCTCTT [SEQ ID NO: 57]) para produzir o vetor de expressão PBKCMV-NtHMA RNAi. Os vetores de expressão de RNAi de PB1121-NtHMA foram construídos pela (a) excisão da ORF de β- glicuronidase ORF do vetor de expressão binário ("pBI121" da CLONTECH), e (b) substituição do construto de RNAi de NtHMA, excisado do plasmídeo PBKCMV-NtHMA RNAi, nos sítios de Xbal/Sacl do plasmídeo PBI121 no lugar da ORF de β-glicuronidase removida. Os vetores de expressão de RNAi de PBI121-NtHMA compreendem: (i) um fragmento de senso com 330 bp Xbal-Hindlll NtHMA que inclui (ii) um fragmento de íntron com 139 bp, operativamente ligado ao fragmento reverso complementar (iii) com 196 bp Spell-Sacl NtHMA. Os vetores de expressão de RNAi de PBI121-NtHMA, tal como aqueles descritos nos Exemplos 2 e 3, podem ser introduzidos em qualquer célula hospedeira de planta de interesse pelos vários métodos conhecidos por pessoas versadas na técnica.
EXEMPLO 4 Transformação das Variedades Burley (TN90), Flue- cured"(K326) e Dark (VA359) de Tabaco com os Vetores de Expressão de RNAi de NtHMA
As sementes de tabaco de três variedades diferentes, Burley (TN90), Flue-cured (K326) e Dark (VA359), foram esterilizadas e germinadas em uma placa de Petri contendo meio basal MS suplementado com 5 ml/L de mistura conservadora de planta (PPM). As mudas, aproximadamente 7 a 10 dias após a germinação, foram selecionadas para transformação com vários vetores de expressão de RNAi de NtHMA. Uma colônia isolada de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 foi inoculada em um meio líquido LB contendo 50 mg I’1 de canamicina (monosulfato de canamicina) e foi incubada por 48 h a 28°C com agitação recíproca (150 ciclos min'1). As células bac- terianas cultivadas foram coletadas por centrifugação (6000 xg, 10 min) e foram suspensas até uma densidade final de 0,4 a 0,7 OD6oo, com 20 ml de meio líquido MS contendo sacarose 20 g'1. Os explantes de mudas com 7 a 10 dias foram imersos em uma suspensão bacteriana por 5 min e foram colocados sobre filtros de papel estéreis. Cinquenta explantes foram colocados sobre alíquotas de 40 ml de meio ágar REG (meio MS basal suplementado com NAA 0,1 mg I'1 e BAP 1 mg I'1) em placas de Petri de 100 mm x 20 mm. Os explantes foram co-cultivados com Agrobacterium a 25°C. Depois de 3 dias de co-cultivação, os explantes foram lavados e transferidos para o meio RCPK (meio REG com canamicina 100 mg'1, carbenicilina 500 mg I'1 e PPM 5 ml) para selecionar os transformantes. Os explantes foram subcultivados a cada 2 semanas. Depois de 8 a 12 semanas de crescimento sob condições seletivas, as plantas sobreviventes, que representam os transformantes que tiveram os construtos de expressão de RNAi de HtHMA integrados em seus genomas, foram transferidos para um meio de enraizamento (meio MS basal suplementado com canamicina 100 mg I'1). As plantas enraizadas foram transferidas para vasos para promover o crescimento adicional.
EXEMPLO 5 Redução de Cd na Lâmina da Folha da Primeira Geração de Transgênicos Geneticamente Modificada para Expressar Polinucleotídeos de RNAi de NtHMA
Para determinar o efeito da expressão do polinucleotídeo de RNAi de NtHMA sobre o transporte de Cd da raiz até as porções aéreas das plantas transgênicas, os níveis de Cd foram determinados para várias linhagens transgênicas que tinham sido geneticamente modificadas para expres- sar tanto os polinucleotídeos de RNAi NtHMA (660-915) quanto (1382-1584).
Aproximadamente 40 plantas transgênicas independentes, que representam três variedades de tabaco, foram transformadas com vários vetores de expressão de RNAi PBI121-NÍHMA. Inicialmente, os transforman- tes foram cultivados em bandejas flutuantes contendo meio de Hoaglands por 4 semanas. As plantas positivas para NPT II por PCR foram selecionadas e plantadas em vasos de 25cm (10") com um sistema hidropônico que contém o meio de Hoaglands contendo CdCI2 5 μM. Depois de 4 a 8 semanas, duas amostras de folhas médias foram coletadas e liofilizadas para análise de metal ou foram congeladas em nitrogênio líquido para análise de expressão de gene. Aproximadamente 500 mg de tabaco foram pesadas e digeridas em q0 ml de HNO3 concentrado pelo sistema de reação 5 sistema de digestão acelerada por micro-onda (CEM Corporation, Mathews, NC). As concentrações de metal pesado foram analisadas usando a espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado ("ICP-MS", Agilent 7500A; Agilent Technologies, Paio Alto, CA). Como tabaco de controle não transgê- nico, uma amostra consistindo de folhas de tabaco da Virginia com certificação polonesa, CVA-VTL-2, foi preparada sob condições comparáveis (Dybczynski et al., 1997).
As figuras 3B-3D mostram a redução de Cd na lâmina da folha de múltiplas primeiras gerações (T0) de linhagens transgênicas, que representam três variedades, que foram geneticamente modificadas para expressar polinucleotídeos de RNAi de NtHMA (690-915). Em cada gráfico, a unidade do eixo de y está em μg/mg de tecido.
As figuras 4B-4D mostram a redução de Cd na lâmina da folha de múltiplas primeiras gerações (T0) de linhagens transgênicas, que representam três variedades, que foram geneticamente modificadas para expressar polinucleotídeos de RNAi de NtHMA (1382-1584). Em cada gráfico, a unidade do eixo de y está em μg/mg de tecido.
EXEMPLO 6 ReduçãoT nos Transcritos de RNA de HtHMA em Folha de Tabaco Transgênica pela Expressão de Polinucleotídeos de RNAi de NtHMA
Para determinar o efeito da expressão do polinucleotídeo de RNAi de NtHMA sobre os níveis de estado de equilíbrio de transcritos de RNA de NtHMA endógeno, a alteração relativa nos transcritos de RNA de NtHMA foi medida pelo isolamento de RNA celular total de porções da lâmina da folha de várias linhagens transgênicas, que representam três variedades de tabaco.
O RNA total foi isolado de folhas médias de plantas TO usando TRI® Reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para remover as impurezas do DNA, o RNA purificado foi tratado com RNase sem DNase (TURBO DNA- free, Ambion, Austin, TX). Para sintetizar a primeira fita de cDNA, aproximadamente 10 μg de RNA total foi transcrito reversamente utilizando o High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir o nível de transcritos de NtHMA nas amostras, uma RT-PCR quantitativa de 2 etapas foi realizada de acordo com a química baseada na sonda Taq- man MGB. A mistura RT continha 4 μM de mix de dNTP, 1X iniciadores aleatórios, 1X Tampão RT, 10 g de cDNA, 50 U de Multiscribe Reverse transcriptase (Applied Biosystems), 2U de Superase-In RNase Inhibitor (Ambion) e água sem nuclease. A mistura de PCR continha 1X Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM de iniciador adiante, 400 nM de iniciador reverso, 250 nM de sonda Taqman MGB, 2 ng de cDNA e água sem nuclease. RT-PCR foi realizada utilizando um ABI 7500 Real-Time System (Applied Biosystems, Foster City, CA) e sob as condições de amplificação: 50°C por 2 min.; 95°C por 10 min.; 40 ciclos de 95°C por 15 seg.; e 60°C por 1 min. Para normalizar os níveis de transcrito de RNA de NtHMA medidos, Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase (G3PDH) foi selecionado como um transcrito de RNA endógeno de controle, cujo nível de ex-pressão não é responsivo à atividade do RNA de interferência específico para a sequência dos polinucleotídeos de RNAi de NtHMA sob análise. A modulação no nível de transcrito de RNA de HtHMA causada pela expressão do polinucleotídeo de RNAi de NtHMA foi calaculada pela determinação da proporção de (a)/(b), na qual (a) representa o valor normalizado do nível de transcrito de RNA de NtHMA determinado para as amostras derivadas de plantas transgênicas transformadas com um vetor de expressão de RNAi de NtHMA e (b) representa o valor normalizado do nível de transcrito de RNA de NtHMA determinado para as amostras derivadas de plantas transgênicas transformadas com um vetor de expressão deficiente no construto de RNAi de NtHMA RNAi.
As figuras 5A-C mostram os níveis normalizados de transcrito de RNA de NtHMA em várias primeiras gerações (TO) de linhagens transgênicas, que foram geneticamente modificadas para expressar polinucleotídeos de RNAi de NtHMA, como determinado pela análise de PCR quantitativa em tempo real de extratos de lâmina de folha. A figura 5A mostra que, para múltiplas linhagens transgênicas derivadas, independentemente, de K326, os níveis de transcrito estavam reduzidos pela atividade de interferência de RNA de polinucleotídeos de RNAi de NtHMA (660-915). A figura 5B mostra que para as múltiplas linhagens transgênicas derivadas, independentemente, de TN90, os níveis de transcrito estavam reduzidos pela atividade de interferência de RNA de polinucleotídeos de RNAi de NtHMA (660-915). A figura 5C mostra que para as múltiplas linhagens transgênicas derivadas, independentemente, de VA359, os níveis de transcrito estavam reduzidos pela atividade de interferência de RNA de polinucleotídeos de RNAi de NtHMA (660-915). A redução nos níveis de transcrito de RNA de NtHMA é consistente com a redução no conteúdo de Cd medido nas folhas médias para as mesmas linhagens transgênicas testadas. "PBI121" representa um vetor de expressão deficiente no construto de RNAi que codifica os polinucleotídeos de RNAi de NtHMA (660-915).
EXEMPLO 7 Distribuição de Cd e Zn nas Linhagens Transgênicas Geneticamente Modificadas para Expressar os Polinucleotídeos de RNAi de NtHMA
Para determinar o efeito da expressão do polinucleotídeo de RNAi de NtHMA (660-915) sobre a distribuição de Cd e Zn dentro da lâmina da folha e a raiz, foi analisado o conteúdo de metal de plantas transgênicas das três variedades. Cinco linhagens transgênicas de cada variedade, isto é, Flue-cured (K326), Burley (TN90) e Dark (VA359), foram selecionadas quanto a exibição de conteúdo de Cd na faixa mais baixa na lâmina da folha. As folhas médias e as raízes dessas plantas transgênicas e as plantas de controle foram coletadas para análise de metal por ICP-MS. Por 8 semanas, todas as plantas foram cultivadas em meio de Hoaglands suplementado com CdCI2 5 μM antes da colheita.
A Tabela 2 relaciona os níveis de Cd e Zn medidos na lâmina da folha e na raiz de várias linhagens transgênicas, que representam as três variedades de tabaco, como fornecidas abaixo. Na Tabela 2, a distribuição de Cd entre a lâmina da folha e a raiz foi substancialmente modificada pela expressão de polinucleotídeos de RNAi de NtHMA (660-915) em todas as três variedades, Flue-cured (K326), Burley (TN90) e Dark (VA359). Para as linhagens transgênicas de K326, a % de redução de Cd variou entre 97,16 a 98,54% quando comparada com os níveis de Cd observados nas plantas K326 de controle. Para as linhagens transgênicas de TN90, a % de redução de Cd variou entre 85,12 a 90,96% quando comparada com os níveis de Cd observados nas plantas TN90 de controle. Para as linhagens transgênicas de VA359, a % de redução de Cd variou entre 93,24 a 99,07% quando comparada com os níveis de Cd observados nas plantas VA359 de controle. A linhagem transgênica VA359 NtHMA-11 exibiu o nível mais baixo de Cd (1,62 μg/g) e o maior % de redução de Cd (99,07%), quando comparada com as duas linhagens de controle deficientes em RNAi de NtHMA ("VA359 PB121") que exibiram níveis de Cd de 158,3 a 205,96 μg/g. A análise comparativa da raiz das linhagens transgênicas mostrou que uma quantidade substancial de Cd pode se acumular na raiz, resultando na modulação dos níveis de Cd da raiz variando entre 6,90 a 15,38, em relação aos níveis de Cd observados nos respectivos controles.
Em contraste com a redução significativa de Cd na lâmina das folhas das linhagens transgênicas, o conteúdo de Zn da lâmina da folha não estava substancialmente reduzido, embora alguma redução tenha sido observada na maioria das linhagens transgênicas, causada pela expressão de polinucleotídeos de RNAi de NtHMA (660-915). O conteúdo de Zn dentro da raiz (última coluna da Tabela 3) aumentou em todas as linhagens transgênicas, resultando em um aumento de 4 a 6 vezes nas linhagens transgênicas das variedades K326 e VA359 e um aumento de 3 a 5 vezes na variedade 5 TN90.
A figura 6 mostra a distribuição de Cd e Zn entre a lâmina da folha e a raiz de várias linhagens transgênicas de primeira geração que foram geneticamente modificadas para expressar os polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse, como apresentadas na Tabela 2. Em cada gráfico da 10 figura 6, a unidade do eixo de y é μg/mg de tecido. Tabela 2
EXEMPLO 8 Distribuição de Cd em Vários Tecidos de Linhagens Transgênicas Geneticamente Modificadas para Expressar os Polinucleotí- 15 deos de RNAi de NtHMA
Para determinar o efeito da expressão do polinucleotídeo de RNAi de NtHMA (1382-1584) sobre a distribuição de Cd em vários tecidos (isto é, cortiça, lâmina, seiva e raiz), o conteúdo de metal de várias linhagens transgênicas que representam duas variedades, Burley (TN90) e Flue-cured (K326) foi analisado. Plantas transgênicas completamente maduras e plantas de controle foram coletadas para análise de metal por ICPMS. Por 8 semanas, todas as plantas foram cultivadas em 5μM de CdCI2 em meio de Hoaglands antes da colheita.
A Tabela 3 relaciona o conteúdo de Cd nos tecidos da cortiça, lâmina, seiva e raiz de várias linhagens transgênicas, como fornecido abaixo. Na Tabela 3, os níveis de Cd estavam substancialmente reduzidos nos tecidos da cortiça, lâmina e seiva de todas as linhagens transgênicas testadas quando comparadas com aquele de plantas de controle. O "Controle" representa plantas não transgênicas. "PBI121" representa as plantas transgênicas transformadas com um vetor de expressão deficiente no construto de RNAi de NtHMA RNAi. A extensão da redução do conteúdo de Cd na cortiça, seiva e lâmina da folha das linhagens transgênicas de K326 era significativamente maior do que aquela observada nas linhagens transgênicas TN90. A expressão de polinucleotídeos de RNAi (1382-1584) em plantas transgênicas K326 resultou em uma redução de Cd de 9 a 11 vezes na cortiça, uma redução de Cd de 6 a 13 vezes na seiva e uma redução de Cd de 31 a 32 vezes na lâmina da folha. A expressão de polinucleotídeos de RNAi (1382-1584) em plantas transgênicas TN90 resultou em uma redução de Cd de 4 a 7 vezes na cortiça, uma redução de Cd de 5 a 8 vezes na seiva e uma redução de Cd de 6 a 20 vezes na lâmina da folha. Em contraste, aumentos mais modestos (5 a 6 vezes) no conteúdo de Cd da raiz dessas linhagens transgênicas forram observados quando comparados com aquele das plantas de controle.
A figura 7 mostra a distribuição de Cd entre a cortiça ("B"), lâmina da folha ("L"), seiva ("P") e a raiz ("R") de várias linhagens transgênicas de primeira geração que foram geneticamente modificadas para expressar os polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse, como apresentadas na Tabela 3. Em cada gráfico da figura 7, a unidade do eixo de y é pg/mg de tecido. Tabela 3
EXEMPLO 9 Redução de Cd na lâmina da folha da Segunda Geração de Linhagens Transgênicas Geneticamente Modificadas para Expressar os Polinucleotídeos de RNAi de NtHMA
Para determinar o efeito da expressão do polinucleotídeo de RNAi de NtHMA (660-915) sobre o conteúdo de Cd na lâmina da folha, duas linhagens transgênicas (T1) da variedade VA359 foram cultivadas em solo contendo concentrações variáveis de Cd por 4 semanas. Duas linhagens transgênicas, 06T498 e 06T506, selecionadas como positivas para canami- cina foram rastreadas por PCR. Vários vasos de 25,4cm (10") preenchidos com uma mistura de areia: solo foram saturados com 0, 0,1, 0,5 ou 5 μM de CdCfe. Três plantas por tratamento por linhagem transgênica foram cultivadas por 4 semanas com a adição de meio de Hoaglands ao prato. O número total de folhas, índice de área da folha, peso da folha, peso do caule e peso da raiz foram observados. Duas folhas médias e amostras da raiz foram liofi- lizadas e submetidas à análise de metal pesado.
A figura 8 mostra a distribuição de Cd entre a lâmina da folha ("L") e a raiz ("R") de várias linhagens transgênicas da segunda geração (T1) que foram geneticamente modificadas para expressar os polinucleotídeos de RNAi de NtHMA de interesse. Em cada gráfico da figura 8, a unidade do eixo de y é μg/mg de tecido. A partir da figura 8 pode ser observado que o conteúdo de Cd das plantas transgênicas era consistentemente menor do que aquele das plantas de controle em todas as concentrações de Cd testadas (0, 0,1, 0,5 e 5 μM). Uma redução no conteúdo de Cd da lâmina da folha (2 a 4,7 vezes) foi observada em várias linhagens transgênicas testadas. O nível de Cd para a linhagem 06T498 era apenas de ~20% das plantas de controle com CdCI2 5 μM. Portanto, o conteúdo reduzido de metal pesado na lâmina da folha/mudas em linhagens transgênicas, que expressam o polinucleotídeo de RNAi de NtHMA (660-915), sugeriu que a translocação de uma quantidade substancial de metais pesados da raiz para as lâminas da folha/mudas pode ser interrompida pela interferência de RNAi. Os resultados são consistentes com a redução de Cd observada na lâmina da folha da primeira geração das linhagens transgênicas, caracterizado pelo fato de que a segunda geração das linhagens transgênicas também demonstrou (a) níveis reduzidos de Cd na lâmina da folha e (b) Cd aumentado nas raízes. As linhagens transgênicas não demonstraram diferenças fenotípicas na aparência em gera, crescimento e desenvolvimento em relação às plantas de controle.
EXEMPLO 10 Polinucleotídeos de NtHMA
Um polinucleotídeo de NtHMA conterá geralmente ligações de fosfodiéster, embora em alguns casos, análogos de ácido nucleico que são incluídos possam ter arcabouços alternativos compreendendo, por exemplo, ligações de fosforoamidato, fosforotioato, fosforoditioato ou O-metilfosfo- roamidita (veja Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press); e arcabouços e ligações de ácido nucleico peptídico. Outros análogos de ácidos nucleicos incluem aqueles com arcabouços positivos; arcabouços não iônicos e arcabouços sem ribose, incluindo aqueles descritos nas Patentes U.S. N° 5.235.033 e 5.034.506, e nos Capítulos 6 e 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, Eds. Ácidos nucleicos que contêm um ou mais açúcares carbocíclicos também estão incluídos dentro da definição de ácidos nucleicos. As modificações do esqueleto de ribose-fosfato podem ser feitas por uma variedade de razões, por exemplo, para aumentar a estabilidade e a meia-vida de tais moléculas em ambientes fisiológicos ou como sondas em um biochip. Misturas de ácidos nucleicos que ocorrem natural- mente e análogos podem ser feitas; alternativamente, misturas de análogos diferentes de ácido nucleico e misturas de ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente e análogos podem ser feitas.
Uma variedade de referências descreve tais análogos de ácido nucleico incluindo, por exemplo, fosforamidato (Beaucage etal., Tetrahedron 49(10): 1925 (1993) e as referências desse; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl et aí., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Letsinger et a!., Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1986); Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger etal., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); e Pauwels et al., Chemica Scripta 26: 141 91986)), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991); e Pat. U.S. No. 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989), ligações O-metilfosforoamidita (vela Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), e arcabouços e ligações de ácido nucleico peptidico (veja Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380: 207 (1996), todos incorporados aqui por referência). Outros ácidos nucleicos análogos incluem aqueles com arcabouços positivos (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 6097 (1995); arcabouços não iônicos (Pat. U.S. Nos. 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 e 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Inti. Ed. English 30: 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); Capítulos 2 e 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui e P. Dan Cook; Mesmaeker etal., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996)) e arcabouços sem ribose, incluindo aqueles descritos nas Pat. U.S. Nos. 5.235.033 e 5.034.506, e nos Capítulos 6 e 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui e P. Dan Cook. Ácidos nucleicos que contêm um ou mais açúcares carbociclicos também estão incluídos dentro da definição de ácidos nucleicos (veja Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169-176). Vários análogos de ácido nucleico estão descritos em Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 pagina 35. Essas referências estão expressamente incorporadas aqui por referência.
Outros análogos incluem ácidos nucleicos peptídicos (PNA) que são análogos de ácido nucleico peptídico. Esses arcabouços são substancialmente não iônicos sob condições neutras, ao contrário do esqueleto fosfo- diéster altamente carregado dos ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente. Isso resulta em duas vantagens. Primeira, o esqueleto de PNA exibe cinética de hibridização aperfeiçoada. PNAs têm alterações maiores na temperatura de fusão (Tm) para pares de bases não pareados versus pares de bases perfeitamente pareados. DNA e RNA exibem tipicamente uma queda de 2 a 4 °C na Tm para um não pareamento interno. Com o esqueleto não iônico de PNA, a queda é próxima de 7 a 9°C. Similarmente, devido a sua natureza não iônica, a hibridização das bases acopladas a esses arcabouços é relativamente insensível a concentração de sal. Além disso, PNAs não são degradados pelas enzimas celulares e, portanto, podem ser mais estáveis.
Entre os usos dos polinucleotídeos de NtHMA descritos e combinações de seus fragmentos, está o uso de fragmentos como sondas ou iniciadores ou no desenvolvimento de moléculas de RNAi. Tais fragmentos geralmente compreendem pelo menos cerca de 17 nucleotideos contíguos de uma sequência de DNA. Em outras modalidades, um fragmento de DNA compreende pelo menos 30 ou pelo menos 60 nucleotideos contíguos de uma sequência de DNA. Os parâmetros básicos que afetam a escolha das condições de hibridização e a orientação para o desenvolvimento de condi-ções adequadas estão descritos em Sambrook et al., 1989 e estão descritos em detalhes acima. Usando o conhecimento do código genético em combinação com as sequências de aminoácidos descritas acima, conjuntos de oligonucleotídeos degenerados podem ser preparados. Tais oligonucleotí- deos são úteis como iniciadores, por exemplo, em reações em cadeia da polimerase (PCR), através do que os fragmentos de DNA são isolados e amplificados. Em certas modalidades, iniciadores degenerados podem ser usados como sondas para bibliotecas genéticas não humanas. Tais bibliotecas podem incluir, mas não são limitadas a bibliotecas de cDNA, bibliotecas genômicas e até bibliotecas de EST eletrônicas (express sequence tag) ou de DNA. Sequências homólogas identificadas por esse método podem, portanto, serem usadas como sondas para identificar homólogos não humanos da sequência de NtHMA aqui identificada.
A invenção também inclui polinucleotídeos e oligonucleotídeos que hibridizam sob condições reduzidas de estringência, condições de es- tringência tipicamente moderadas e condições estringentes comumente altas (também referidas aqui como "alta estringência), a uma polinucleotídeo de NtHMA aqui descrito. Os parâmetros básicos que afetam a escolha das condições de hibridização e a orientação para o desenvolvimento de condições adequadas estão descritos em Sambrook, J., E. F. Fritsch, e T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 e 11; e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., seções 2.10 e 6.3-6.4, e podem ser facilmente determinadas por aqueles versados na técnica com base, por exemplo, na extensão e/ou composição de base do polinucleotídeo. Uma maneira de se atingir condições moderadamente estringentes envolve o uso de uma solução de pré-lavagem contendo SSC 5x. SDS 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8.0), tampão de hibridização com cerca de 50% de formamida. SSC 6x e temperatura de hibridização de cerca de 55°C (ou outras soluções de hibridização similares, tal como aquela que contém cerca de 50% de formamida com uma temperatura de hibridização de cerca de 42°C) e condições de lavagem de cerca de 60°C, em SSC 0,5x, SDS 0,1%. Geralmente as condições altamente estringentes são definidas como as condições de hibridização como acima, mas com a lavagem em aproximadamente 68°C, SSC 0,2x, SDS 0,1%. SSPE (SSPE 1x é NaCI 0,15M, NaH2PO4 10 mM, e EDTA 1,25 mM, pH 7,4) pode ser substituído por SSC (SSC 1x é NaCI 0,15M e citrato de sódio 15 mM) nos tampões de hibridização e lavagem; as lavagens são realizadas por 15 minutos depois que a hibridização termina. Deve ser compreendido que a temperatura da lavagem e a concentração de sal da lavagem podem ser ajustadas como necessário para se obter um grau desejado de estringência pela aplicação dos princí- pios básicos que governam as reações de hibridização e a estabilidade do dúplice, como conhecido por aqueles versados na técnica e descrito adicionalmente abaixo (veja, por exemplo, Sambrook et al., 1989). Quando se hi- bridiza um ácido nucleico a um polinucleotídeo-alvo de sequência desconhecida, o comprimento do híbrido é presumido ser aquele do ácido nucleico hibridizante. Quando ácidos nucleicos de sequência conhecida são hibridi- zados, o comprimento do híbrido pode ser determinado pelo alinhamento das sequências dos ácidos nucleicos e identificação da região ou das regiões de complementaridade de sequência ótima. A temperatura de hibridização para híbridos antecipados terem menos do que 50 pares de bases de extensão deve ser 5 a 10°C menor do que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido, onde a Tm é determinada de acordo com as seguintes equações. Para híbridos menores do que 18 pares de base em extensão, Tm (°C) = 2(número de bases A+T) +4 (número de bases G+C). Para híbridos com mais de 18 pares de bases de extensão Tm(°C) = 81,5+16,6(log10 [Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), onde N é o número de bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons de sódio no tampão de hibridização ([Na+] para SSC 1x = 0,165M). Tipicamente, cada ácido nucleico hibridizado tem uma extensão que é de pelo menos 25% (comumente pelo menos 50%, 60% ou 70% e mais comumente pelo menos 80%) da extensão de um polinucleotídeo da descrição com o qual ele hibridiza e tem pelo menos 60% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5% ou pelo menos 99%) com um polinucleotídeo da descrição com o qual ele hibridiza.
EXEMPLO 11 Polipeptídeos de NtHMA
Um polipeptídeo da descrição pode ser preparado pela cultura de células hospedeiras transformadas ou recombinantes sob condições de cultura adequadas para expressar um polipeptídeo da descrição. O polipeptídeo expresso resultante pode então ser purificado a partir de tal cultura u- sando processos de purificação conhecidos. A purificação do polipeptídeo também pode incluir uma coluna de afinidade contendo agentes que irão se ligar ao polipeptídeo; uma ou mais etapas com coluna sobre tais resinas de afinidade como concanavalina A-agarose, heparina-toyopeari® ou Cibacrom blue 3GA Sepharose®; uma ou mais etapas que envolvam a cromatografia de interação hidrofóbica usando resinas tais como éter de fenila, éter de buti- la ou éter de propila; ou cromatografia de imunoafinidade. Alternativamente, o polipeptídeo da descrição também pode ser expresso em uma forma que facilitará a purificação. Por exemplo, ele pode ser expresso como um polipeptídeo de fusão, tal como aqueles do polipeptídeo que se ligam a maltose (MBP), glutationa-5-transferase (GST) ou tioredoxina (TRX). Kits para a expressão e purificação de tais polipeptídeos de fusão são comercialmente disponibilizados por New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, N.J.) e Invitrogen, respectivamente. O polipeptídeo também pode ser marcado com um epitopo e subsequentemente purificado usando um anticorpo específico dirigido para tal epitopo. Finalmente, uma ou mais etapas de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP- HPLC) empregando meios de RP-HPLC hidrofóbicos, por exemplo, gel de sílica que tenha grupos metila pendentes ou outros grupos alifáticos, podem ser empregadas para purificar adicionalmente o polipeptídeo. Algumas ou todas as etapas de purificação precedentes, em várias combinações, também podem ser empregadas para fornecer um polipeptídeo recombinante substancialmente homogêneo. O polipeptídeo assim purificado está subs-tancialmente livre de outros polipeptídeos de mamífero e é definido de acordo com a invenção como um "polipeptídeo substancialmente purificado"; tais polipeptídeos purificados incluem um polipeptídeo de NtHMA, fragmento, variante e semelhantes. A expressão, isolamento e a purificação de polipeptídeos e fragmentos da descrição podem ser obtidas por qualquer técnica adequada, incluindo, mas não limitadas aos métodos aqui descritos.
Também é possível utilizar uma coluna de afinidade, tal como um anticorpo monoclonal gerado contra os polipeptídeos da descrição, para purificar por afinidade os polipeptídeos expressos. Esses polipeptídeos podem ser removidos de uma coluna de afinidade usando técnicas convencionais, por exemplo, em uma tampão de eluição com muito sal e depois diali- sado em uma tampão com pouco sal ou pela alteração do pH ou outros componentes dependendo da afinidade da matriz utilizada, ou eles podem ser competitivamente removidos usando um substrato que ocorre naturalmente da porção de afinidade, tal como um polipeptídeo derivado da descrição.
Um polipeptídeo da descrição também pode ser produzido pela síntese química convencional conhecida. Métodos para a construção dos polipeptídeos da descrição ou de seus fragmentos por meios sintéticos são conhecidos por aqueles versados na técnica. As sequências sinteticamente construídas do polipeptídeo, em virtude de partilharem características estruturais primárias, secundárias ou terciárias e/ou conformacionais com um polipeptídeo nativo podem possuir propriedades biológicas em comum com elas, incluindo a atividade biológica.
EXEMPLO 12 Anticorpos anti-NtHMA
Em outra modalidade, os anticorpos que são imunorreativos com os polipeptídeos da descrição são aqui fornecidos. Os polipeptídeos de N- tHMA, fragmentos, variantes, polipeptídeos de fusão e semelhantes, como aqui descritos, podem ser empregados como "imunógenos" na produção de anticorpos imunorreativos a eles. Tais anticorpos se ligam especificamente aos polipeptídeos através de sítios de ligação ao antígeno do anticorpo. Os anticorpos que se ligam especificamente são aqueles que reconhecerão e se ligarão especificamente a polipeptídeos da família de NtHMA, homólogos e variantes, mas não com outras moléculas. Em uma modalidade, os anticor-pos são específicos para polipeptídeos que têm uma sequência de aminoá- cidos de NtHMA da descrição como descrita na SEQ ID NO: 2 e não interagem com outros polipeptídeos.
Mais especificamente, os polipeptídeos, fragmentos, variantes, polipeptídeos de fusão e semelhantes contêm determinantes antigênicos ou epitopos que desencadeiam a formação de anticorpos. Esses determinantes antigênicos ou epitopos podem ser lineares ou conformacionais (descontínuos). Os epitopos lineares são compostos por uma única seção de aminoá- eidos do polipeptídeo, enquanto que epitopos conformacionais ou descontínuos são compostos de seções de aminoácidos de diferentes regiões da cadeia do polipeptídeo que são colocadas em íntima proximidade depois do enovelamento do polipeptídeo. Os epitopos podem ser identificados por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. Adicionalmente, os epitopos dos polipeptídeos da descrição podem ser usados como reagentes de pesquisa, em ensaios, e para purificar anticorpos que se ligam especifica-mente de substâncias tais como soros policlonais ou sobrenadantes de hi- bridomas cultivados. Tais epitopos ou suas variantes podem ser produzidos usando técnicas conhecidas tais como a síntese em fase sólida, a clivagem química ou enzimática de um polipeptídeo ou usando a tecnologia de DNA recombinante.
Ambos os anticorpos policlonais e monoclonais para os polipeptídeos da descrição podem ser preparados por técnicas convencionais. Veja, por exemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988); Kohler e Milstein, (U.S. Pat. No. 4,376,110); a técnica do hibridoma de célula B humana (Kosbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026, 1983); e a técnica do hibridoma de EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). As linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais específicos para os polipeptídeos da descrição também são consideradas aqui. Tais hibridomas podem ser produzidos e identificados pelas técnicas convencionais. Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros podem ser imunizados pela injeção de um polipeptídeo de NtHMA, seus fragmentos, variantes ou mutantes. Tais animais hospedeiros podem incluir, mas não são limitados a coelhos, camundongos e ratos, para relacionar alguns. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica. Dependendo da espécie hospedeira, tais adjuvantes incluem, mas não são limitados a Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxi- do de alumínio, substâncias tensoativas tais como lisolecitina, polióis plurô- nicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianina de keyhole limpet, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacteríum parvum. Os anticorpos monoclonais podem ser recuperados por técnicas convencionais. Tais anticorpos monoclonais podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD ou de qualquer subclasse dessas.
Os anticorpos da descrição também podem ser usados em ensaios para detectar a presença de polipeptídeos ou fragmentos da descrição, tanto in vitro quanto in vivo. Os anticorpos também podem ser empregados na purificação de polipeptídeos ou fragmentos da descrição pela cromato- grafia de imunoafinidade.
EXEMPLO 13 RNAs de fita dupla
Em uma modalidade, a descrição fornece moléculas de ácido ri- bonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão do gene de NtHMA em uma célula (por exemplo, uma célula de planta), em que o dsRNA compreende uma fita antissenso que compreende uma região de complementaridade que é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA formado na expressão do gene de NtHMA e em que a região de complementaridade é menor do que 30 nucleotídeos de extensão e em que o dito dsRNA, depois do contato com uma célula que expresse o dito gene de NtHMA, iniba a expressão do dito gene de NtHMA em pelo menos 20%. O dsRNA compreende duas fitas de RNA que são suficientemente complementares para hibridizar para formar uma estrutura em dúplice. Uma fita do dsRNA (a fita antissenso) compreende uma região de complementaridade que é substancialmente complementar e, tipicamente, totalmente complementar, a uma sequência- alvo, derivada da sequência de um mRNA formado durante a expressão do gene de NtHMA, a outra fita (fita senso) compreende uma região que é complementar a fita antissenso, tal que as duas fitas hibridizam e formam uma estrutura em dúplice quando combinadas sob condições adequadas. A estrutura em dúplice tem entre cerca de 15 a 30 (por exemplo, entre cerca de 18 e 25), tipicamente entre cerca de 19 e 24 (por exemplo, entre cerca de 21 e 23) pares de base em extensão. Similarmente, a região de complementaridade à sequência-alvo tem entre cerca de 15 a 30 (por exemplo, entre cerca de 18 e 25), tipicamente entre cerca de 19 e 24 (por exemplo, entre cerca de 21 e 23) pares de base em extensão. O dsRNA da descrição pode compreender, adicionalmente, uma ou mais projeções de fita simples de nucleotí- deo. O dsRNA pode ser sintetizado por meios padronizados conhecidos na técnica como discutidos posteriormente abaixo, por exemplo, pelo uso de um sintetizador de DNA automatizado, tal como é comercialmente disponibilizado, por exemplo, por Biosearch, Applied Biosystems, Inc. Em outro aspecto, um vetor de expressão pode ser usado para expressar uma molécula de RNAi in vivo.
O dsRNA da descrição pode conter um ou mais pareamentos errôneos com a sequência-alvo. Em uma modalidade, o dsRNA da descrição contém mais do que 3 pareamentos errôneos. Se a fita antissenso do dsRNA contiver pareamentos errôneos com a sequência-alvo, é típico que a á- rea de pareamento errôneo não esteja localizada no centro da região de complementaridade. Se a fita antissenso do dsRNA contiver pareamentos errôneos com a sequência-alvo, é típico que a área de pareamento errôneo esteja restrita a 5 nucleotídeos de qualquer extremidade, por exemplo, 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeo da extremidade 5' ou 31 da região de complementaridade. Por exemplo, para uma fita de dsRNA com 23 nucleotídeos que é complementar a uma região do gene de NtHMA, o dsRNA preferivelmente não contém qualquer pareamento errôneo dentro dos 13 nucleotídeos centrais. Os métodos descritos dentro da descrição podem ser usados para determinar se um dsRNA que contém um pareamento errôneo com a sequência-alvo é eficaz na inibição da expressão do gene de NtHMA.
Em uma modalidade, pelo menos uma extremidade do dsRNA tem uma projeção de fita simples de 1 a 4 nucleotídeos (por exemplo, 1 ou 2 nucleotídeos). dsRNAs que têm pelo menos uma projeção de fita simples de um nucleotídeo têm propriedades inibitórias. O dsRNA também pode ter uma extremidade cega, tipicamente localizada na extremidade 5' da fita antissen- so.
Em outra modalidade, o dsRNA é quimicamente modificado para aumentar a estabilidade. Os ácidos nucleicos da descrição podem ser sintetizados e/ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica, tais como aqueles descritos em "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S. L. etal. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA, que está incorporado aqui por referência. As modificações químicas podem incluir, mas não estão limitadas a modificações a 2', introdução de bases não naturais, acoplamento covalente a um ligante e substituição de ligações fosfato por ligações tiofosfato. Nessa modalidade, a integridade da estrutura do dúplice é reforçada com pelo menos uma, tipicamente duas, ligações químicas. A ligação química pode ser obtida por qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas, por exemplo, pela introdução de ligações covalentes, iônicas ou de hidrogênio; interações hidrofóbicas, interações de van der Waals ou de empilhamento; por meio de coordenação me- tal-íon ou através do uso de análogos de purina.
Em outra modalidade, os nucleotideos em uma ou em ambas as fitas simples podem ser modificados para evitar ou inibir a ativação de enzimas celulares, tais como, por exemplo, sem limitação, certas nucleases. As técnicas para a inibição da ativação de enzimas celulares são conhecidas incluindo, mas não limitadas a modificações 2'-amino, modificações 2-flúor. modificações 2'-alquila, modificações de esqueleto não carregado, modificações com morfolino, modificações 2-O-metila e fosforoamidato (veja, por exemplo, Wagner, Nat. Med. (1995) 1: 1116-8). Portanto, pelo menos um grupo 2-hidroxila dos nucleotideos em um dsRNA é substituído por um grupo químico. Pelo menos um nucleotídeo também pode ser modificado para formar um nucleotídeo inacessível. Tal nucleotídeo inacessível contém uma ponte de metileno ou etileno que conecta o oxigênio em 2' da ribose com o carbono em 4' da ribose. Os oligonucleotídeos que contêm o nucleotídeo inacessível estão descritos em Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630) e Okiba, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404). A introdução de um nucleotídeo inacessível em um oligonucleotídeo aperfeiçoa a afinidade de sequências complementares e aumenta a temperatura de fusão em vários graus (Braasch, D.A. e D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8: 1- 7).
A conjugação de um ligante a um dsRNA pode aumentar sua absorção celular. Em certas circunstâncias, um ligante hidrofóbico é conjugado a um dsRNA para facilitar a permeação direta da membrana celular. Alternativamente, um ligante conjugado ao dsRNA é um substrato para a endocitose mediada pelo receptor. Essas abordagens têm sido usadas para facilitar a permeação celular de oligonucleotídeos antissenso. Em certas cir-cunstâncias, a conjugação de um ligante catiônico aos oligonucleotídeos geralmente resulta em resistência aperfeiçoada a nucleases. Exemplos representativos de ligantes catiônicos são a propilamônia e a dimetilpropila- mônia. Interessantemente, os oligonucleotídeos antissenso foram descritos reter sua afinidade de ligação ao mRNA quando o ligante catiônico está disperso através do oligonucleotídeo. Veja, M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 e as referências desse.
EXEMPLO 14 Métodos para a Identificação de Agentes Moduladores de NtHMA
A descrição fornece métodos para a identificação de agentes que podem modular o nível de expressão e/ou a atividade de NtHMA. Os candidatos ("um agente de teste") que podem ser rastreados para identificar a atividade modulatória específica de NtHMA incluem moléculas pequenas, químicos, peptideomiméticos, anticorpos, peptídeos, polipeptídeos (por e- xemplo, RNAi, siRNA, moléculas antissenso ou de ribozima) e agentes desenvolvidos por um projeto baseado em computador. A modulação de NtHMA inclui um aumento ou uma diminuição na atividade ou na expressão. Por exemplo, um método para a identificação de candidatos que possam modular a expressão e/ou a atividade de NtHMA compreende: contatar uma a- mostra que contém um polipeptídeo ou um polinucleotídeo de NtHMA com um agente de teste sob condições que permitam ao agente de teste e ao polipeptídeo ou um polinucleotídeo de NtHMA interagir e medir a expressão e/ou atividade do polipeptídeo de NtHMA na presença ou na ausência do agente de teste.
Em uma modalidade, uma célula contendo um polinucleotídeo de NtHMA é contatada com um agente de teste sob condições tais que a célula e o agente de teste são deixados interagir. Tais condições incluem tipicamente condições normais de cultura celular, consistentes com o tipo celular a ser utilizado em particular, conhecidas na técnica. Pode ser desejável deixar que o agente de teste e a célula interajam sob condições associadas à temperatura aumentada ou na presença de reagentes que facilitem a absorção do agente de teste pela célula. Um controle é tratado similarmente, mas na ausência do agente de teste. Alternativamente, a atividade ou a expressão de NtHMA podem ser medidas antes de contatar o agente de teste (por exemplo, o padrão ou medida de controle) e depois novamente, após o contato com o agente de teste. As células tratadas são comparadas com o controle e a diferença na expressão ou na atividade de NtHMA comparadas com o controle é indicativa de um agente que modula a atividade ou expressão de NtHMA.
Quando a expressão de NtHMA está sendo medida, a detecção da quantidade de mRNA que codifica um polipeptídeo de NtHMA na célula pode ser quantificada, por exemplo, por PCR ou Northern blot. Onde uma alteração na quantidade do polipeptídeo de NtHMA na amostra está sendo medida, a detecção de NtHMA pelo uso de anticorpos anti-NtHMA pode ser usada para quantificar a quantidade de polipeptídeo de NtHMA na célula usando técnicas conhecidas. Alternativamente, a atividade biológica (por exemplo, transporte de metal pesado) pode ser medida antes e depois do contato com o agente de teste.
Será considerado que, apesar das modalidades específicas da invenção terem sido descritas aqui com propósitos de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Consequentemente, a invenção não está limitada, exceto pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos têm o significado padronizado como comumente com- preendidos pelas pessoas versadas na técnica. Apesar dos métodos exemplares, dispositivos e materiais terem sido descritos com particularidades, métodos e materiais alternativos, que podem ser similares ou equivalentes àqueles aqui descritos, são aplicáveis na produção das composições descri- 5 tas e na prática dos métodos descritos.
Qualquer publicação citada ou descrita aqui fornece informações relevantes descritas antes da data de depósito do presente pedido. As descrições fornecidas no presente pedido não devem ser consideradas como uma admissão de que os inventores não têm o direito de anteceder tais re- 10 velações.

Claims (2)

1. Método para reduzir os níveis de Cd em uma planta de tabaco, caracterizado pelo fato de que compreende modificar geneticamente a planta através da redução da expressão do gene ATP-ase de metal pesado (NtHMA), em que o gene NtHMA na forma modificada ou não-modificada é selecionado do grupo que consiste em: um gene que compreende ou que consiste em uma sequência que tem de SEQ ID NO: 1 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos, e que codifica um transportador de NtHMA que tem atividade de ATPase do tipo P1B; um gene que compreende ou que consiste em uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos; um gene que compreende ou que consiste em uma sequência de SEQ ID NO: 47 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos; em que a redução da expressão do gene NtHMA é alcançada por modificação por mutagênese do gene NtHMA ou por inativação do gene NtHMA, em que a inativação é alcançada pela introdução de transposons e/ou elementos de inserção de sequência (IS) no genoma da planta, pelo método chamado de Lesões Locais Induzidas em Genomas ("TILLING") ou pela introdução de ribozimas alvo-específicas.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutagênese do gene NtHMA é alcançada por mutagênese sítio direcionada, mutagênese direcionada por oligonucleotídeo, mutagênese quimicamente induzida ou mutagênese induzida por irradiação.
BRPI0820741-0A 2007-12-13 2008-12-11 MÉTODO PARA REDUZIR OS NÍVEIS DE Cd EM UMA PLANTA DE TABACO BRPI0820741B1 (pt)

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