MX2007006452A

MX2007006452A - Tolerancia a la tension en plantas por medio de la inhibicion selectiva de la trehalosa-6-fosfato fosfatasa.

Info

Publication number: MX2007006452A
Application number: MX2007006452A
Authority: MX
Inventors: Mark L Lagrimini; Michael Nuccio; Natasha Springer
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2004-12-03
Filing date: 2005-11-28
Publication date: 2007-07-19
Also published as: WO2006060376A2; EP1827081A4; AU2005312023A1; CN101115385A; BRPI0518596A2; WO2006060376A3; EP1827081A2; CA2588372A1; ZA200704131B

Abstract

La presente invencion se refiere a planas transgenicas que comprenden una molecula de ADN aislado que comprende un polinucleotido que codifica un acido nucleico que regula descendentemente un gen de T6PP endogeno, en donde el polinucleotido esta bajo el control de un promotor que es inducido por la tension y que es expresado predominantemente en el tejido vegetativo. El promotor tambien puede ser expresado de manera desarrollada en los granos maduros. La expresion del polinucleotido conduce a la disponibilidad incrementada del carbono con respecto a las flores/granos en desarrollo cuando las plantas son sometidas a una tension ambiental, tal como la falta de agua. La molecula de ADN de la invencion permite por esto que una cantidad mayor de fotosintato sea dirigida a los embriones/ovulos en desarrollo, conduciendo a un rendimiento estabilizado en los medios ambientes de crecimiento que son sometidos a una tension periodica.

Description

TOLERANCIA A LA TENSIÓN EN PLANTAS POR MEDIO DE LA INHIBICIÓN SELECTIVA DE LA TREHALOSA-6-FOSFATO FOSFATASA Campo de la Invención La presente invención abarca la expresión de la respuesta a la tensión de una secuencia de ácidos nucleicos capaz de la regulación descendente la actividad de la trehalosa-6-fosfato fosfatasa para el propósito de incrementar el rendimiento y/o de mejorar la tolerancia a la tensión abiótica de las plantas. Antecedentes de la Invención La tensión abiótica puede afectar el desarrollo de la planta de diferentes formas dependiendo de la temporización, la severidad, y la duración de la tensión. Las plantas de maíz son, por ejemplo, relativamente tolerantes a la sequía y pueden resistir una sequía moderada a severa en las etapas inicial y final de la temporada de crecimiento. Sin embargo, el maíz es muy susceptible a la tensión del agua durante un período de 10-14 días alrededor del florecimiento. El maíz no irrigado que ha crecido en U.S. Corn Belt típicamente experimenta la tensión del agua en la parte final del verano durante el florecimiento. Esta tensión usualmente se manifiesta por sí misma en la forma de un endurecimiento reducido de los granos debido al aborto del óvulo/embrión. En términos más simples, cuando las raíces están experimentando tensión osmótica, las mismas producen el ácido abscísico Ref .182585 (ABA) que es transportado a través de la planta. En la hoja, esto desencadena el cierre de la estomas, reduciendo así la pérdida de agua por medio de la transpiración. Desafortunadamente, esto también limita el intercambio de gases y consecuentemente la fotosíntesis es reducida. Sin la sucrosa de la fotosíntesis, el óvulo o embrión en desarrollo agota rápidamente su reserva de almidón y se aborta. La ruta de la trehalosa en las plantas es mostrada en la Figura 1. La ruta está colocada para demostrar la semejanza con la síntesis de la sucrosa por medio de la sucrosa-6-fosfato sintasa (8) y la sucrosa-6-fosfato fosfatasa (9) . La síntesis de la trehalosa es catalizada por la trehalosa-6-fosfato sintasa (T6PS) (10) , produciendo la trehalosa-6-fosfato (T6P) y la trehalosa-6-fosfato fosfatasa (T6PP) (11), produciendo la trehalosa. La trehalasa (12) segmenta la trehalosa en dos moléculas de glucosa. Estas enzimas están bien caracterizadas en los microbios y se piensa que están presentes solamente en pocas plantas, tales como en Myrothanmmus flabellifolia tolerante a la desecación, a causa de que la trehalosa que se puede medir, se acumula cuando las mismas se secan descendentemente (revisado en Müller et al., 1995). Muchos cultivos no acumulan trehalosa detectable, por lo tanto la mayoría de los investigadores creyeron que las mismas carecían de habilidad para fabricarla. Además, la trehalosa aplicada exógenamente puede ser tóxica para los tejidos de las plantas (Veluthambi et al., 1981). Los genes de E. coli que codifican T6PS y T6PP fueron clonados a principios de los años 1990 (Kaasen et al., 1992), y formaron la base para el trabajo inicial para el uso de la ingeniería genética para mejorar la tolerancia de las plantas a la tensión del agua (Holmstrom et al., 1996; Goddijn et al . , 1997) . Este trabajo de ingeniería genética vegetal, inicial, estuvo basado en la evidencia obtenida con los microorganismos. Está bien establecido que la trehalosa mejora la tolerancia a la desecación de los microorganismos y las macromoléculas (Weimken, 1990). Estos experimentos proporcionaron una correlación directa entre los niveles de trehalosa y la tolerancia a la desecación. Muchos grupos intentaron diseñar genéticamente la síntesis de la trehalosa en las plantas (Rontein et al., 2002). Mucho de su trabajo tuvo como objetivo incrementar los niveles de la trehalosa (Hoekema et al., 1999). Un número de invenciones utilizaron los genes de la síntesis de la trehalosa de la levadura o de E. coli . En resumen, las plantas diseñadas produjeron solamente cantidades pequeñas de trehalosa a pesar del incremento de la capacidad de la planta para fabricar trehalosa tal como en diez veces (Londesborough et al., 2000) .

La investigación adicional mostró que la acumulación de trehalasa baja en las substancias transgénicas se debió, en parte, a la actividad de la trehalasa endógena (Goddijn et al., 1997). Otros colaboradores creen que la síntesis de la sucrosa y del almidón limitó la capacidad de la planta para fabricar la trehalosa (Hoekema et al., 1999). Las publicaciones más recientes describieron métodos para mejorar la acumulación de la trehalosa en las plantas transgénicas por la inhibición de la trehalasa (Goddijn et al., 2003), expresando una proteína de fusión de T6PS-T6PP de E. coli (Garg et al., 2002; Jang et al., 2003) y expresando el gen de la síntesis de la trehalosa de E. coli en los plástidos (Lebel et al., 2004) . Algunos grupos lograron una acumulación mejorada de trehalosa y, la mayoría reportó mejoras pequeñas en la tolerancia a la sequía aún cuando se observaron defectos del crecimiento totales en las plantas transgénicas . Los avances en el trabajo de información y complemento del genoma en la levadura identificaron los genes de las plantas que codifican T6PS, T6PP y trehalasa funcionales (Vogel et al., 1998; Blázquez et al., 1998; Aescherbacher et al., 1999; Müller et al., 2001; Vogel et al., 2001) . Los genes de la ruta de la trehalosa son expresados a niveles bajos, pero la expresión ha sido detectada en todos los tejidos examinados. Los datos de la secuencia de varias especies de plantas indican la presencia de los genes del metabolismo de la trehalosa (Leyman et al, 2001; Wingler, 2002; Eastmond y Graham, 2003; Eastmond et al. , 2003) . En la mayoría de los estudios de diseño genético de las plantas, las enzimas de la ruta de la trehalosa, o los genes diseñados para que tengan influencia en una actividad de la enzima de la ruta de la trehalosa (por ejemplo, una construcción de ARN de antisentido) , son ubicados como objetivo para el citosol (Holmstrom et al, 1996; Goddijn et al., 1997; Romero et al., 1997; Pilon-Smits et al., 1998; Garg et al., 2002; Jang et al., 2003) . A pesar de su enorme capacidad en el incremento o en el cambio sintético, los experimentos hacen pequeña la influencia de la trehalosa o de la trehalosa-6-fosfato en estas plantas. En efecto, las plantas de tabaco y de papa que expresan los genes de TßPS y T6PP de E. coli tienden a sufrir defectos de crecimiento pleotrópico (Goddijn et al., 1997). Por consiguiente, existe una necesidad de desarrollar plantas tolerantes a la tensión que tampoco exhiban defectos en el crecimiento. Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a plantas transgénicas que comprenden un polipéptido que codifica un ácido nucleico que tiene como objetivo un gen de T6PP endógeno, en donde la molécula de ADN aislado está bajo el control de un promotor que es inducible por tensión en el tejido vegetativo. El ácido nucleico también puede ser expresado desarrolladamente en los granos maduros. La expresión inducida por la tensión del ácido nucleico de la invención incrementa la capacidad del carbono para desarrollar los granos/floretes cuando las plantas están bajo condiciones de tensión, tales como la falta de agua. El polipéptido de la presente invención transformado en una planta permite por esto, que más fotosintato sea dirigido al desarrollo de los óvulos/embriones conduciendo a un rendimiento estabilizado en los medios ambientes en crecimiento que están sometidos a tensión periódica. La presente invención incluye además una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, la secuencia del ADN aislado está enlazada operativamente a un promotor que es inducido por tensión en el tejido vegetativo, en donde el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de T6PP. La presente invención incluye un método para incrementar el contenido de almidón en el grano de una planta, que comprende las etapas de transformar una célula vegetal con una molécula de ADN que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en el tejido vegetativo, en donde el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un T6PP; generar una planta a partir de la célula de la planta; inducir la expresión del ácido nucleico en el tejido vegetativo de la planta cuando la planta está sometida a condiciones de tensión durante su etapa reproductiva; e incrementar el contenido de almidón en la semilla comparado con el contenido de almidón en la semilla de una planta isogénica que no contiene la molécula de ADN cuando la planta transgénica y la planta isogénica están creciendo bajo substancialmente las mismas condiciones de tensión. La presente invención incluye además una molécula de ácido nucleico de interferencia (siARN) corta, de doble hebra, que regula descendentemente la expresión de un gen de T6PP en el tejido vegetativo de una planta, en donde la molécula de siARN comprende al menos aproximadamente 21 pares base. La presente invención abarca una molécula de siARN de doble hebra que regula descendentemente la expresión de un gen de T6PP, en donde una primera hebra de la molécula de siARN de doble hebra comprende una secuencia de nucleótidos substancialmente semejante a la secuencia de nucleótidos de un gen de T6PP o una porción del mismo y, en donde una segunda hebra de la molécula de siARN de doble hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria con respecto a la secuencia de la primera hebra. La invención también incluye una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en el tejido vegetativo, en donde el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de T6PP. La invención incluye una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido en donde el polinucleótido es mostrado por la SEC ID NO: 6. La invención incluye una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido, en donde la secuencia de nucleótidos comprende al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID NO: 6. La invención incluye una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en el tejido vegetativo, en donde el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de T6PP, y en donde el polinucleótido está colocado en una orientación de sentido o antisentido con relación al promotor .

La invención también incluye una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en el tejido vegetativo, en donde el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de T6PP, en donde el promotor es derivado de la región 5 ' de un gen de Rabl7 y exhibe la actividad del promotor en las plantas. La invención también incluye una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en el tejido vegetativo, en donde el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de T6PP, en donde el promotor es derivado de la región 5 ' de un gen de Rabl7 y exhibe la actividad del promotor en las plantas y comprende además una región 3 ' derivada de un gen de Rabl7 y exhibe la actividad del terminador en las plantas. La invención incluye además una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en un tejido vegetativo, en donde el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de T6PP, en donde el promotor comprende aproximadamente 100-1649 nucleótidos contiguos de ADN, en donde los nucleótidos contiguos de ADN tienen desde 85 % hasta 100 % de identidad con respecto a aproximadamente 100 hasta 1649 nucleótidos contiguos del ADN que tiene la secuencia de la SEC ID NO: 42. La invención incluye además una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico es capaz de conformarse en un ARN de doble hebra. La invención incluye además una molécula de AD? aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende el AR? del co-supresor . La invención incluye además una molécula de AD? aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende el AR? catalítico . La invención incluye además una molécula de AD? aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico en donde la secuencia de ácidos nucleicos es capaz de conformarse en un ácido nucleico triplex. La invención incluye además una molécula de AD? aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en un tejido vegetativo, en donde el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de T6PP, en donde el promotor también es expresado en el tejido de la semilla. La invención también incluye una célula vegetal que tiene una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en el tejido vegetativo, en donde el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de T6PP, y también incluye una planta transgénica derivada de la célula vegetal. La invención incluye además una molécula de ADN aislado en donde la molécula de ADN es mostrada por la SEC ID NO. 8 o la SEC ID NO. 18. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es una representación esquemática de las rutas del metabolismo del azúcar primario en la célula vegetal típica. Los diversos grupos de azúcar y de azúcar activada, asociados con la síntesis del almidón y la sucrosa, son mostrados. Un bloque permanente en la síntesis de la trehalosa ha sido mostrado en el arte que va a ser letal . Sin embargo, la presente invención reconoce que un bloque condicional en la ruta desde la T-6-P hasta la trehalosa utilizando un promotor inducible por la tensión para expresar la TßPP-RNAi en el tejido vegetativo, redirige el flujo a la síntesis de la sucrosa o el almidón en una configuración de desarrollo o inducible por la tensión. Las figuras 2A y 2B son una representación esquemática que muestra cómo fueron ensambladas las secuencias de ADNc de T6PP1 del maíz. La figura 2A, los ADNcs fueron identificados por investigaciones de TBLASTN de las bases de datos de EST y de ADNc del maíz y ensamblados en un secuenciador. Las hebras 1, 2, y 3 mostradas en el fondo de la sección A, muestran los marcos de lectura abiertos más ( + ) . La hebra 1 (ZmT6PP-l) contiene el marco de lectura abierto continuo más grande y está realzado o subrayado. La figura 2B muestra la secuencia de proteínas de ZmTßPP-1. La figura 3A y la figura 3B muestran la alineación de las secuencias de la proteína de TßPP. Las secuencias de AtTßPPA y AtTßPPB de Arabidopsis están alineadas con los homólogos 0sT6PP-l, OsT6PP-2, ZmTßPP-1, ZmT6PP-2, ZmTßPP-3 del arroz y del maíz. La alineación también incluye el objetivo de ZmTßPP. La alineación fue efectuada utilizando AlignX dentro del vector NTI (versión 7.1). La figura 4A muestra la relación filogenética de las proteínas de TßPP del maíz, del arroz y de Arabidopsis. La figura 4B muestra una tabla de semejanza y divergencia que ilustra la semejanza de cada proteína con respecto a las otras a lo largo del eje horizontal y la divergencia de cada proteína a partir de las otras a lo largo del eje vertical. Los valores de semejanza están arriba y los valores de divergencia están abajo de la figura "100" en cada columna. La figura 5 es un diagrama de barras que muestra el perfil de expresión del gen 0sT6PP-l en varios tejidos. La expresión relativa arriba de 100 es considerada significativa. El perfil de la expresión es consistente con la expresión conocida del gen AtT6PP-A de Arabidopsis. La figura 6 es un diagrama que muestra la alineación de la secuencia de ESTs del maíz (accesos del GenBank Nos. BE510187, A 171812, AW081181, AI855276, BE453688 y AI941695). Los datos de la secuencia del clon de ZmTßPP están denotados por t3. rev.91331. abi y ti . rev.91323. abl . También son identificados los cebadores utilizados para clonar el fragmento de ADNc de ZmTßPP-1 y para construir el cásete de ZmTßPP-dsARN. La figura 7 es un mapa del fragmento de ADNc de T6PP-1 del maíz en el vector TOPO de pCR 4, referido como pCR4-TOPO-ZmT6PP-NS . La figura 8 es un mapa del cásete de expresión de PNOV3210. La figura 9 es un mapa del cásete de expresión de pNOV3232.

La figura 10 es un mapa de la construcción de pRabl7-TßPP-RNAi . El cásete de expresión de Rabl7 completo puede ser movilizado como un fragmento de Kpnl. La figura HA es un mapa de un vector binario de Agrobacterium tumefaciens, pNOV2117, que contiene el marcador seleccionable de la planta de la fosfomanosa isomerasa (cPMI-01) dentro de sus límites de T-ADN. La figura 11B es un mapa de un cásete de expresión de Rabí7-TßPP -RNAi de Agrobacterium tumefaciens clonado en p?OV2117. La figura 12 ilustra los datos de la producción del endurecimiento de la semilla a partir de un experimento en invernadero . Las plantas que representan cada genotipo f eron sometidas a condiciones con una buena cantidad de agua (WW (por sus siglas en inglés) ) o sometidas a tensión con sal (SS (por sus siglas en inglés) ) durante el período de dos semanas alrededor del florecimiento. Los acigotos (WT (por sus siglas en inglés) ) y los hemicigotos (TPP (por sus siglas en inglés) ) fueron evaluados entonces para verificar el endurecimiento de la semilla. Los datos son los promedios, n=3-5. La figura 13 ilustra los datos de rendimiento del endurecimiento de la semilla de un segundo experimento en invernadero. Las plantas que representan cada genotipo fueron sometidas a condiciones con una buena cantidad de agua (WW) o sometidas a tensión con una sal (SS) durante el período de dos semanas alrededor del florecimiento. Los acigotos (WT) y los hemicigotos (TPP) fueron evaluados entonces para verificar el endurecimiento de la semilla. Los datos son los promedios, n = 14-20. La figura 14 ilustra los datos del rendimiento del endurecimiento de la semilla para Rabí7 -TßPP-RNAi evento 78A18B en el campo. Las mazorcas de cada planta en el campo fueron colectadas y descortezadas. Los granos se contaron y se pesaron. Los promedios para las plantas de hemicigotos y acigotos fueron calculados. El asterisco indica una diferencia estadísticamente significativa entre las plantas de acigotos y hemicigotos. La figura 15 ilustra los datos del rendimiento para la progenie de Rabl7 -TßPP-RNAi evento 81A10B en el campo. Las mazorcas de cada planta en el campo fueron colectadas y descortezadas. Los granos se contaron y se pesaron. Los promedios para las plantas de hemicigotos y acigotos fueron calculados. El asterisco indica una diferencia estadísticamente significativa entre las plantas de acigotos y hemicigotos. La figura 16A y la figura 16B ilustran la alineación de la secuencia del AD?c de TßPP conservada de varias especies de plantas. La alineación también incluye la secuencia de TßPP-RNAi . La alineación fue efectuada utilizando AlignX dentro del vector NTI (versión 7.1). La figura 17 muestra la relación filogenética de la secuencia de ADNc de TßPP conservada de varias especies de plantas. La tabla ilustra el porcentaje de semejanza de cada í secuencia con respecto a las otras a lo largo del eje horizontal. El análisis fue efectuado utilizando AlignX dentro del vector NTI (versión 7.1). Descripción Detallada de la Invención La ruta de trehalosa representa un nivel del control de flujo a través del metabolismo del azúcar central. Varios estudios identificaron los mecanismos de control que regulan las enzimas en la red metabólica mostrada en la Figura 1. Los datos no son por medios exhaustivos. Sin embargo, dada la adecuación de la ruta de la trehalosa y la expresión del gen de la ruta en las plantas (Wingler, 2002), y la letalidad de un elemento agénico en el punto de entrada de la ruta (Eastmond et al., 2002) la presente invención reconoce que la ruta de la trehalosa probablemente funcione como un punto de verificación para ayudar a la regulación el tamaño de las agrupaciones de glucosa-1-fosfato (g-l-P) , glucosa-6-fosfato (g-6-P) y fructosa-6-fosfato (f-6-P) en el citosol. En las situaciones en donde la capacidad para generar estas moléculas excede la capacidad para utilizarlas, la ruta de la trehalosa actúa como una "vía de derrame" para inactivar rápidamente la g-6-P y la uridina difosfato glucosa (UDP-g) y reciclar la porción de la glucosa. En esta capacidad, la ruta establece un ciclo inútil aparente que consume energía innecesariamente, convirtiendo los substratos a los productos y por último convierte estos productos de regreso a los substratos originales. Esta aseveración tiene precedencia en las redes bioquímicas de las plantas (Rontein et al., 2002b; Ronocha et al., 2001). Tales mecanismos de control son valiosos con respecto al consumo de energía, escaso pero necesario, a causa de su papel principal en el mantenimiento de la estabilidad del sistema. Por consiguiente, la presente invención reconoce además que la ruta de la trehalosa proporciona un mecanismo de control rápido, probablemente de capacidad baja, para estabilizar las agrupaciones de fosfato de hexosa citosólico. La ruta de la trehalosa es equilibrada para competir con otros procesos metabólicos - tales como la síntesis del almidón, la síntesis de la sucrosa y la glicólisis - para g-ß-P y UDP-g. La presente invención toma en cuenta que el diseño de las plantas para expresar una(s) proteína (s) heteróloga (s) , tal como TßPP o T6PS, que no pueden ser sometidas a regulación endógena, utilizando promotores constitutivos fuertes, retira los azúcares activados del metabolismo del carbono central. Esto desperdicia energía considerable y retarda el crecimiento. Por lo tanto, la composición y el método de la presente invención incluyen el uso de promotores que son inducibles por la sequía en el tejido vegetativo, que también pueden ser expresados de manera desarrollada en los granos maduros, enlazados operativamente a una molécula de ácido nucleico que cuando es expresada en una célula vegetal, inhibe la expresión del gen de' TßPP endógeno o los productos del mismo. Haciéndolo así, los azúcares son dirigidos a la síntesis del almidón y la sucrosa para verificar su disponibilidad para desarrollar granos cuando las plantas son sometidas a la tensión del medio ambiente. La presente invención utiliza la ingeniería genética para reducir o eliminar, por medio de la regulación descendente, la expresión de los genes de TßPP endógenos del maíz. Existen numerosos métodos conocidos por aquellos expertos en el arte para modificar la expresión de los genes endógenos. El silenciamiento del gen post-transcripcional (PTGS (por sus siglas en inglés) ) , el ácido nucleico formado de triplex, los ribozimas, las subunidades de proteína inactiva y los anticuerpos monoclonales de una sola hebra, todos pueden ser utilizados para eliminar o reprimir la expresión del gen, como se describe con mayor detalle posteriormente . En diversas eucariotas, incluyendo las plantas, el ARN de doble hebra (dsARN) desencadena la destrucción de cualquier secuencia de compartición del ARN con la molécula de ARN de doble hebra (Hutvagner y Zamore, 2002). La misma empieza con la conversión de dsARN en fragmentos de 21-23 nucleótidos cortos, por la enzima de ARNse III de dominios múltiples, Dicer (Lee et al., 2004; Pham et al., 2001). Estos ARNs de interferencia, pequeños (siARNs) dirigen la degradación de los ARNs de objetivo complementarios para la secuencia de siARN (Elbashir et al., 2001). Además, Dicer también segmenta las estructuras de ARN del bucle-vástago del precursor de aproximadamente 70 nt en los ARNs de 21-23 nt de una sola hebra conocidos como microARNs (miARNs ) (Grishok et al., 201; Reinhart et al., 2002). Esto es la base para la tecnología de interferencia de AR? (RNAi ) que es utilizada para suprimir la expresión de los genes endógenos y heterólogos de una manera específica para la secuencia (Fire et al., 1998; Carthew, 2001; Elbashir et al., 2001). Una construcción de supresión de R?Ai puede ser diseñada de varias maneras, por ejemplo, la transcripción de una repetición invertida que puede formar una molécula con forma de horquilla, larga, las repeticiones invertidas separadas por una secuencia espaciadora que podría ser una secuencia no relacionada tal como GUS o una secuencia del intrón. La presente invención también contempla la transcripción de las hebras de AR? de sentido y antisentido por promotores opuestos, o por la cotranscripción de los genes de sentido y antisentido.

La tecnología de ARN de antisentido también puede ser utilizada para la expresión de regulación descendente de un gen endógeno específico. Este es un método de regulación descendente utilizado para modificar un nivel o actividad deseada de la enzima de la planta. El AR? antisentido conduce a una regulación descendente al nivel traduccional del AR?. La regulación descendente por el ARN antisentido, como se describió por She maker et al. (1992) ha mostrado que va a ser efectiva con una variedad de genes de la planta (Rothstein et al., 1987; Smith et al., 1988; van der Krol et al., 1988; Bird et al., 1991; Bartley et al., 1992; Gray et al., 1992; Knutzon et al., 1992; Shimada et al., 1993; Kull, et al., 1995; Slabas and Elborough, 2000). En el núcleo, el ARN antisentido puede interferir directamente con la transcripción o formar duplexos con el ARN nuclear heterogéneo (hnARN) . Alternativamente, en el cicloplasma, el AR? antisentido puede formar una molécula de doble hebra con el AR?m complementario y puede prevenir la traducción del AR?m en la proteína . La co-supresión, como se describió por Seymour et al., (1993) es otro método aplicable para la regulación descendente de la expresión del gen de la planta. El ARN del co-supresor, en contraste con el ARN de antisentido, está en la misma orientación que el AR? transcrito desde el gen objetivo, es decir, la orientación de "sentido". El mismo ha sido utilizado extensamente para producir plantas transgénicas que tienen niveles de expresión del gen modificado (Napoli et al., 1990; Brusslan et al., 1993; Vaucheret et al., 1995; Jorgensen et al., 1996). El mecanismo de co-supresión se piensa que va a ser provocado por la producción del ARN antisentido por la transcripción por medio de la lectura de los promotores dístales localizados sobre la hebra opuesta del ADN cromosómico (Grierson et al. 1991). Se entiende ahora que existen características comunes asociadas con todas las formas del silenciamiento del gen mediado por ARN (Matzke et al., 2002; Tijsterman et al., 2002). Otro método de regulación descendente involucra el uso de la tecnología del ribozima (Atkins et al., 1995; De-Feyter et al., 1996). La tecnología del ribozima, semejante a las metodologías de antisentido, también trabaja en el nivel traduccional del ARN e involucra la fabricación de moléculas de ARN catalíticas que se aglutinan a, y segmentan el ARNm de interés. Los ribozimas se han mostrado recientemente como un método efectivo para la regulación descendente de las proteínas de las plantas (Waterhouse y Wang, 2002) y el control de los patógenos de las plantas (Atkins et al . , 2002) . Un método de regulación descendente adicional incluye el uso de ácidos nucleicos de "sentido" o co- supresores y dsARNs . Las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser construidas, las cuales se aglutinarán al ácido nucleico del duplexo ya sea en el gen o el complejo de AD?: ARN de la transcripción, para formar un ácido nucleico triplex o que contiene una triple hélice, estable, para inhibir la transcripción y/o expresión del gen objetivo (Frank-Kamenetskii y Mirkin, 1995) . Tales secuencias de ácido nucleico están construidas utilizando las reglas de formación de parejas base de la formación de la triple hélice y de la secuencia de nucleótidos del gen o del ARNm de interés. Estas secuencias de ácidos nucleicos pueden bloquear la actividad del tipo-gen objetivo de varias maneras, incluyendo la prevención de la transcripción del gen o por la aglutinación al ARNm cuando el mismo es transcrito por el gen. Un método genético dominante-negativo también puede ser utilizado para la regulación descendentemente los tipos específicos de las enzimas. La presencia de un rasgo dominante, es decir la expresión de un transgen, conduce a una reducción de la actividad de la enzima o a la producción reducida del producto final enzimático. Algunas enzimas son complejos de dos o más subunidades de proteínas. Tal actividad de la enzima está basada en el ensamble apropiado de estas subunidades para formar la enzima funcional. La expresión de una subunidad no funcional que puede interactuar con la(s) otra(s) subunidad (es) puede producir una enzima no funcional y por consiguiente reducir la actividad enzimática. El aspecto no funcional puede ser con respecto a, pero no está limitado a, la interacción de la subunidad, la aglutinación del substrato o la catálisis de la enzima, por ejemplo. Otro método para la regulación descendentemente las proteínas en las plantas está basado en el uso de los anticuerpos monoclonales (MAb) y/o los fragmentos funcionales de los mismos, tales como los anticuerpos de una sola cadena (SCAb) que reconocen específicamente y se aglutinan a los péptidos en tránsito (Sukhapinda et al., 2004). Como resultado, los niveles en estado permanente de las proteínas pasajeras, correspondientes, pueden ser reducidos. Las tecnologías descritas anteriormente u otras tecnologías conocidas por aquellos expertos en el arte para la regulación descendente de los genes, pueden ser utilizadas en la presente invención. La presente invención incluye la regulación descendente del gen de TßPP del maíz, endógeno, por la construcción de un polinucleótido quimérico que comprende un promotor que es inducible por la sequía en el tejido vegetativo enlazado operativamente a un ácido nucleico, en donde cuando se expresa en una célula vegetal, el ácido nucleico, o una porción del mismo, es capaz de reducir la expresión de un gen de TßPP endógeno de una célula vegetal.

En una modalidad de la invención, el promotor es inducible por la sequía en el tejido vegetativo. En otra modalidad de la invención, el promotor es derivado de la región 5' de un gen de Rabl7. La invención abarca el polipéptido que también tiene una secuencia terminadora derivada de la región 3 ' del gen Rabí7. Cuando se utiliza un promotor recombinante, el promotor también puede ser seleccionado para provocar la expresión de TßPP-RNAi de una manera que es diferente de la manera en que la proteína ZmTßPP-1 es expresada por la planta en su estado natural. Por ejemplo, el promotor puede no tener efecto sobre el nivel al cual la proteína de ZmT6PP-l es expresada, puede expresar la TßPP-RNAi sin que sea inducido por una tensión ambiental y/o expresar la TßPP-R?Ai en respuesta a una forma o grado diferente de la tensión ambiental que de otra manera podría ser necesaria para inducir la expresión de la proteína de Zm-T6PP-l. La presente invención reconoce que los promotores constitutivos fuertes no deben ser utilizados para provocar niveles reducidos de la expresión del gen de ZmTßPP-1. Los ejemplos de tales promotores constitutivos fuertes incluyen, pero no están limitados a, los promotores de la nopalina sintasa (NOS) y la octopina sintasa (OCS) (Jones et al., 1992), los promotores del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 19S y 35S (Odell et al., 1985) o los promotores de CaMV 35S mejorados (Kay et al., 1987). Constitutivamente, la regulación descendente de la ruta de la trehalosa ya se sabe que provoca defectos del crecimiento pleotrópico. La regulación descendente específica de TßPP para dirigir la fotosintasa al almidón y la sucrosa en la selección de las células, es deseable. Un promotor específico del tejido podría ser utilizado para alterar la expresión del gen ZmT6PP-l en los tejidos que son altamente sensibles a la tensión. Los promotores específicos del tejido, ejemplares, incluyen, pero no están limitados a, los promotores específicos para la semilla para el gen de napina de B . napus (Kridl y Knauf, 1995), el promotor 7S de la soya (Fujiwara y Beachy, 1994), el promotor de globulina (cruciferina) de Arabidopsis 12S (Pang et al., 1988), el promotor de la zeína de 27 kD del maíz (Ueda et al., 1992), y el promotor de la glutelina 1 del arroz (Goto et al., 1999), los promotores activos de la fruta tales como el promotor E8 de los tomates (Mehta et al., 2002), los promotores específicos de los tubérculos tales como el promotor de patatina (Kuehn et al., 2003), y el promotor para la subunidad pequeña de la ribulosa-1, 5-bis-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO) cuya expresión es activada en los tejidos fotosintéticos tales como las hojas (Laporte et al. , 2001) . Alternativamente, un promotor podría ser utilizado para inducir la expresión del gen de TßPP-RNAi solamente en un tiempo apropiado, tal como previo a que una sequía ocurra en o alrededor del tiempo de florecimiento, por lo cual se mejora la capacidad reproductiva del cultivo y se incrementa la productividad de la tierra. Esto puede ser efectuado aplicando un inductor exógeno por un agricultor en cualquier lugar que se desee (Chua y Aoyama, 2000; Caddock et al., 203). De manera semejante, un promotor puede ser utilizado, el cual se activa en una condición de deshidratación que es más húmeda que la condición de deshidratación en la cual la planta exhibe normalmente una tolerancia a la deshidratación. Esto podría hacer posible que el nivel al cual una planta responde a la deshidratación sea alterado. Los promotores que se sabe que o que se ha encontrado que provocan una transcripción inducible del ADN en el ARNm en las células vegetales, pueden ser utilizados en la presente invención. Tales promotores pueden ser obtenidos de una variedad de fuentes tales como una planta y fuentes microbianas inducibles, y pueden ser activados por una variedad de estímulos exógenos, tales como el frío, el calor, la deshidratación, la patogénesis y el tratamiento químico. El promotor particular seleccionado es preferible que sea capaz de provocar la expresión suficiente del TßPP-RNAi para mejorar la tolerancia de las plantas a las condiciones de tensión del medio ambiente tales como la falta de agua. Los ejemplos de los promotores que pueden ser utilizados incluyen, pero no están limitados a, el promotor para el gen dréb2a de la proteína de aglutinación de DRE (repetición de C) (Liu et al., 1998) que es activado por deshidratación y la tensión con alto contenido de sal; el promotor para la delta l-pirrolina-5-carboxilato sintetasa (P5CS) cuya expresión es inducida por la deshidratación, el alto contenido de sal y el tratamiento con el ácido abscísico de la hormona de la planta (ABA) (Yoshiba et al., 1995; Zhang et al., 1997); el promotor para el gen rd22 de Arabidopsis cuya transcripción es inducida por la tensión de la sal, la falta de agua y ABA endógena (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1993a); el promotor para el gen rd29b (Yamaguchi-Shinizaki y Shinozaki, 1993b) cuya expresión es inducida por la desecación, la tensión de la sal y el tratamiento ABA exógeno (Ishitani et al., 1998); el promotor para el gen rabl8, u otras deshidrinas, de Arabidopsis cuyas transcripciones se acumulan en las plantas expuestas a la falta de agua o al tratamiento de ABA exógeno (Nylander et al., 2001); el promotor Rabl7 del maíz que es inducido por la sequía en el tejido vegetativo y expresado en forma desarrollada en las semillas maduras (Vilardell et al., 1991); y el promotor para el gen de la proteína relacionada con la patogénesis la (PR-la) cuya expresión es inducida por los organismos de la patogénesis o por las substancias químicas tales como el ácido salicílico o el ácido poliacrílico (Uknes et al., 1993) .

Se debe señalar que los promotores descritos anteriormente pueden ser modificados adicionalmente para alterar sus características de expresión. Por ejemplo, el promotor inducible por ABA/sequía para el gen rabl8 puede ser incorporado en los promotores específicos para la semilla de tal modo que el promotor rabl8 sea inducible por la sequía/ABA solamente en las semillas en desarrollo. De manera semejante, cualquier número de promotores quiméricos pueden ser creados por la ligadura de un fragmento de ADN suficiente para conferir la capacidad de inducción de la tensión ambiental de los promotores descritos anteriormente para constituir los promotores con otras especificidades tales como los promotores específicos para el tejido, los promotores reguladores de manera desarrollada, los promotores regulados por la luz, los promotores de respuesta a las hormonas, etc. Esto debe conducir a la creación de promotores quiméricos capaces de ser utilizados para provocar la expresión del gen de TßPP-RNAi en cualquier tejido de la planta o combinación de tejidos de las plantas. La expresión también se puede hacer que ocurra en ya sea un tiempo específico durante el ciclo de vida de una planta o de principio a fin del ciclo de vida de la planta. En una modalidad, el promotor de la presente invención modula la expresión de ZmT6PP-l en plantas que experimentan varias tensiones abióticas o del medio ambiente, incluyendo el frío, el calor, la deshidratación, y/o la tensión de la sal que afecta directamente las relaciones del agua de la planta. Estos promotores vienen de los genes, y semejantes, que incluyen, pero no están limitados a, la familia de CBF/DREB de los factores de transcripción mostrados que van a ser inducidos por el frío, la sal, y la tensión por deshidratación (Jaglo-Ottosen et al., 1998); el promotor Rabl7 del maíz que es inducible por la sequía en el tejido vegetativo y expresado de manera desarrollada en las semillas maduras (Vilardell et al., 1991); el gen inducido por la falta de agua LP3 (Wang et al., 2002); el gen CIPK13 de Arabidopsis que actúa en respuesta a las condiciones de ABA y tensión, incluyendo el frío, la alta concentración de sal, la cicatrización y la sequía (Kim et al., 2003); el gen HVA22 de la cebada (Hordeum vulgare) que es inducido por la deshidratación, la salinidad, las temperaturas extremas, y ABA (Brands y Ho, 2002); el gen de betaína aldehido deshidrogenasa (AcBADH) del halofito de Atriplex centralasiatica IIjin que es inducido por la sequía, la salinidad, la tensión en condiciones frías y ABA (Yin et al., 2002); y el gen Esi47 del trigo que es inducido por la tensión de la sal y ABA (Shen et al., 2001) . La expresión de los nucleótidos endógenos o exógenos bajo la dirección de un promotor inducido por la tensión, puede conducir al mantenimiento de un fenotipo deseable de la planta bajo condiciones ambientales adversas tales como la falta de agua. Los casetes de expresión que contienen los promotores anteriores pueden funcionar con un terminador de la transcripción. En muchos casos, el terminador de la nopalina sintasa (NOS) efectúa esta función. Muchos expertos en el arte consideran a este terminador adecuado para la mayoría de las aplicaciones (Lessard et al., 2002). Sin embargo, existen excepciones. En algunos casos, el funcionamiento del cásete de expresión mejora cuando el terminador de NOS es reemplazado con una secuencia semejante derivada del mismo gen en el que el promotor está basado (NO et al., 2000; Nuccio y Thomas, 2000; Moreno-Fonseca y Covarrubias, 2001). Estas excepciones surgen frecuentemente cuando el uso de las terminaciones de NOS produce resultados insatisfactorios. El papel que las secuencias terminadoras del gen desempeñan en la regulación total no está entendido completamente. Aquellos que reconocen este potencial y requieren la reproducción exacta de una configuración de la expresión del gen endógeno remplazarán el terminador NOS con una secuencia semejante derivada del gen utilizado para producir el promotor. De manera semejante, aquellos expertos en el arte también pueden elegir un terminador del gen derivado de un gen diferente de aquel utilizado para el promotor para construir un cásete de expresión con las propiedades reguladores deseadas .

La reducción del rendimiento inducido por la tensión en el maíz es más pronunciada cuando las plantas experimentan una tensión durante aproximadamente el período de dos semanas previo a la síntesis y durante la primera semana de la síntesis. Esto corresponde al período de V12-V18 del desarrollo del maíz (Ritchie et al., 1997). Durante este tiempo, la mazorca es formada, y el número y el arreglo de espigas pequeñas de la mazorca es determinado (Zinselmeier et al., 1995a), tal como la sequía. Un estudio mostró una correlación entre el agotamiento del almidón del óvulo y la propensión al aborto (Zinselmeier et al., 1999). Otro trabajo sugiere que el aborto del ovario puede ser invertido por el incremento de flujo de los carbohidratos a los óvulos durante los períodos de tensión (Zinselmeier et al., 1995b). La presente invención está dirigida a soluciones de ingeniería genética para reducir la tensión ambiental relacionada con la pérdida del rendimiento en el maíz por el incremento del flujo de carbohidratos a los granos en desarrollo cuando tales granos se están desarrollando durante períodos de tensión ambiental, utilizando un promotor que es inducible por la sequía en el tejido vegetativo y que también puede ser expresado de manera desarrollada en los granos maduros. Los ejemplos de las plantas adecuadas para las cuales se puede inducir la tolerancia a la tensión de acuerdo con los métodos de la presente invención y que pueden ser transformadas con los casetes de expresión de la invención, incluyen plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas tales como los cultivos del campo, cereales frutas y vegetales tales como: cañóla, girasol, tabaco, remolacha, algodón, soya, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomates, mangos, duraznos, manzanas, peras, fresas, bananas, melones, papas, zanahorias, lechugas, col y cebolla. Ejemplo 1: Identificación y adquisición del gen ZmTPPl Los primeros genes de la trehalosa-6-fosfato fosfatasa de la planta vascular fueron clonados a partir de Arabidopsis thaliana por el complemento de un mutante de la deleción de tps2 de la levadura (Vogel et al., 1998). Los genes designados AtTPPA y AtTPPB (accesos del GenBank AF007778 y AF007779) se mostró en el tiempo que tienen una actividad de la trehalosa-6-fosfato fosfatasa. Las secuencias de las proteínas de AtTPPA y de AtTTPB fueron utilizadas en las investigaciones de TBLASTN de las bases de datos de las secuencias del maíz y del arroz. Las alineaciones de las secuencias organizaron los valores exitosos en los genes individuales. Las Figuras 2A-2B, son un bosquejo que muestra la alineación que define ZmT6PP-l. Tres homólogos del maíz y dos homólogos del arroz de TßPP fueron identificados. Las secuencias de ADNc que corresponden a la secuencia de proteína predicha para cada gen - ZmT6PP-l, -2 y -3 y OsTßPP-1 y -2 - son mostradas por las SEC ID NOs. 1, 2, 3, 4, y 5, respectivamente. Estos T6PPS son mostrados en la alineación global de TßPPs de Arabidopsis en las Figuras 3A y 3B. La relación entre cada proteína con respecto a las otras, es analizada adicionalmente utilizando un árbol filogenético (Figura 4A) y una tabla de semejanza/divergencia (Figura 4B) . Los resultados sugieren que ZmT6PP-l es el homólogo probable del maíz de AtTPPA y ZmT6PP-2 es el homólogo probable del maíz de AtTPPB. El gen de ZmT6PP-l fue ubicado como objetivo para la inactivación a causa de que los datos de EST muestran que el mismo es expresado en una configuración consistente con AtTßPPA. Sin embargo, los datos de EST son limitados debido a una representación desigual del tejido entre las bibliotecas de EST del maíz. Para compensar, la secuencia de ADNc de OsT6PP-l fue utilizada para investigar los datos de la perfilación de la expresión. Los resultados, en la Figura 5, muestran que el OsTßPP-1 es expresado a un nivel relativamente bajo en la mayoría de los tejidos, lo cual está de acuerdo con los datos para AtTßPPA (Vogel et al., 1998) . Un ADNc de ZmTßPP-1 parcial (SEC ID NO. 13) fue amplificado a partir de una biblioteca de ADNc del tejido mezclado del maíz en dos etapas (Figura 6) . La biblioteca fue clonada en los sitios de restricción de Notl y Salí del vector pCMVSPORTß de Invitrogen. Un primer fragmento referido como T6PP1 fue producido en una mezcla de reacción de 50 µl que consiste de 1 µl de la biblioteca del ADNc del maíz, 200 µM de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, TTP) , 1 µl del cebador ZmTPP-lb de oligonucleótidos 20 µM (5 ' -TTCTCCCTATCTATGTTGGAG-3 ' ) (SEC ID ?O. 19), 1 µl del cebador ZmTPP-2 del oligonucleótido 20 µM (5'-CGCAACACAGTGAAACACTAGAAGG-3' ) (SEC ID ?O. 20), 1 µl del amortiguador de alta fidelidad Expand 10X y 1 µl de la polimerasa de alta fidelidad Expand (Roche Diagnostics, Cat. ?o. 1 759 078) . El programa de termociclización fue de 94 °C durante 2 minutos seguido por 40 ciclos de (94 °C durante 15 segundos, 58 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 1.0 minuto) seguido por 68 °C durante 5.0 minutos. Un segundo fragmento, referido como T6PP2 (SEC ID ?O . 14) fue producido en una mezcla de reacción de 50 µl que consiste de 1 µl de la biblioteca de AD?c del maíz, 200 µM de dNTPs , 1 µl del cebador ZmTPP-2r del oligonucleótido 20 µM (5'-CCTTCTAGTGTTTCACTGTGTTGCG-3' ) (SEC ID ?O . 21), 1 µl del cebador psport-delantero del oligonucleótido 20 µM (5'-GCCAGTGCCTAGCTTATAATACG-3' ) (SEC ID ?O . 22), 1 µl del amortiguador de alta fidelidad Expand 10X y 1 µl de la polimerasa de alta fidelidad Expand (Roche Diagnostics, Cat. ?o. 1 759 078) . El programa de termociclización fue de 94 °C durante 2 minutos seguido por 40 ciclos de (94 °C durante 15 minutos, 58 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 1.0 minuto) seguido por 68 °C durante 5.0 minutos. Los fragmentos de T6PP1 y de T6PP2 fueron unidos utilizando el empalme por el método de PCR de extensión de la superposición. La mezcla de reacción de 50 µl consistió de la mezcla de reacción de T6PP1 2 µl, la mezcla de reacción T6PP2 2 µl, dNTPs 200 µM, 1 µl del cebador ZmTPP-lb del oligonucleótido 20 µM, 1 µl del cebador psport-delantero de oligonucleótidos 20 µM, 1 µl del amortiguador de alta fidelidad de Expand 10X y 1 µl de la polimerasa de alta fidelidad Expand (Roche Diagnostics, Cat. ?o. 1 759 078). El programa de termociclización fue de 5 ciclos de (94 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 1.0 minuto) seguido por 35 ciclos de (94 °C durante 30 segundos, 58 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 1.0 minuto) seguido por 68 °C durante 7.0 minutos. Se clonó el producto del AD? de 0.8 Kb, que codifica el fragmento de ZmT6PP-l, con el kit de clonación TOPO TA para la secuenciación (Invitrogen, Cat. ?o . K4575-01) . 2.0 µl de la mezcla de reacción se transformaron en 50 µl de células competentes ToplO (Invitrogen, Cat. ?o . C4040-03) . Los recombinantes de pCR-4-TOPO-ZmT6PP-?S que contienen el fragmento de ZmTßPP-1 fueron identificados por la digestión de 5 µl del AD? miniprep pCR4-TOPO-ZmT6PP-?S (preparado utilizando el procedimiento Spin Miniprep de QIAprep de Qiagen, Cat. ?o. 27106) con EcoRI (?ew England Biolabs) en 20 µl de una reacción que contiene 2 µg de BSA y 2 µl del amortiguador de la endonucleasa de la restricción EcoRI 10X (?ew England Biolabs) . La reacción fue incubada a 37 °C durante 2 horas, luego los productos de pCR-4-TOPO- ZmT6PP-NS (EcoRI) fueron resueltos sobre TAE agarosa al 1 % . Los clones de pCR-4-TOPO-ZmT6PP-NS fueron secuenciados utilizando el kit de secuenciación del ciclo terminador del tinte ABI PRISM (Perkin Elmer) . El mapa de pCR-4-TOPO-ZmT6PP-NS es mostrado en la Figura 7. Ejemplo 2: Construcción del cásete de expresión de Rabl7 Un cásete de expresión basado en el gen Rabl7 del maíz se describió que va a ser inducible por la sequía (Vilardell et al., 1990) en el tejido vegetativo y expresado de manera desarrollada en las semillas maduras (Vilardell et al., 1991). Una modalidad de la presente invención es proporcionar una construcción de ácido nucleico que comprende un promotor que es inducible por la sequía en el tejido operativo, enlazado operativamente a una molécula de ácido nucleico, en donde cuando es expresado en una célula vegetal, la molécula del ácido nucleico es capaz de reducir la expresión de un gen de TßPP endógeno de una célula vegetal . La invención incluye una construcción de ácido nucleico que tiene un promotor derivado de la región 5' de un gen Rabl7 y que exhibe la actividad del promotor en las plantas . La invención también incluye la construcción de ácido nucleico que comprende la totalidad o una parte de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica TßPP-RNAi, en donde el promotor Rabl7 impulsa al cásete de expresión de TßPP-RNAi para crear un bloque condicional en la ruta de la trehalosa. El cásete de expresión de TßPP-RNAi de la invención re-dirige la síntesis del carbohidrato a la sucrosa o al almidón en el tejido reproductivo y en el tejido vegetativo durante los períodos de falta de agua. La construcción del ácido nucleico de la invención incluye además las regiones tanto 5' como 3' derivadas del gen de Rabl7 del maíz, en donde las regiones exhiben la actividad del promotor y del terminador en las plantas, respectivamente. En una modalidad de la invención, las regiones tanto de 5' como de 3' fueron utilizadas en la construcción del ácido nucleico para asegurar que la expresión del transgen imite la expresión de Rabl7 del maíz. Para empezar, la secuencia del ADNc fue agrupada, alineada y anotada. La secuencia de ADNg publicada (acceso del GenBank No. X159940) fue utilizada para investigar las bases de datos propias y públicas. La secuencia de ADNc de Rabl7 fue fragmentada en exones y alineada con el ADNg de Rabl7 para proporcionar la anotación requerida y para hacer un mapa de los codones de inicio y detención de la traducción sobre el ADNg. El promotor de ZmRabl7 fue amplificado del ADNg del maíz en una mezcla de reacción de 50 µl que consiste de 100 ng del ADNg del maíz, 200 µM de dNTPs, 1 µl del cebador 000426A del oligonucleótido 20 µM (5'- GGTACCAAGCTTAATTCGCCCTTATAAACT-3' ) (SEC ID NO . 33), 1 µl del cebador 000426B del oligonucleótido 20 µM (5'-ACTGCAGTTAGATCTAGTCTTCGTGCTTGTGT-3' ) (SEC ID NO. 24), 1 µl del amortiguador de alta fidelidad Expand 10X y 1 µl de la polimerasa de alta fidelidad Expand. El programa de termociclización fue de 94 °C durante 2 minutos seguido por 40 ciclos de (94 °C durante 15 segundos, 58 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 2.0 minutos) seguido por 68 °C durante 5.0 minutos. El producto de ADN de 0.6 kb que codifica el promotor de ZmRabl7 fue clonado con el kit de clonación de TOPO TA para la secuenciación siguiendo las instrucciones del fabricante. 2.0 µl de la mezcla de reacción se transformaron en células competentes ToplO de 50 µl siguiendo las instrucciones del fabricante. Los materiales recombinantes de pCR-4-TOPO-pZmRabl7 que contienen el promotor de ZmRabl7 fueron identificados digiriendo el ADN de Miniprep de pCR-4-TOPO-pZmRabl7 5 µl con EcoRI en una reacción de 20 µl que contiene 20 µg de BSA y 2 µl del amortiguador de endonucleasa de restricción EcoRI 10X. La reacción fue incubada a 37 °C durante 2 horas, luego los productos de pCR-4-TOPO-pZmRabl7 (EcoRI) fueron resueltos sobre una agarosa de TAE al 1 % . Los clones de pCR-4-TOPO-pZmRabl7 fueron secuenciados utilizando el kit de secuenciación del ciclo terminador del tinte ABI PRISM. La secuencia de pCR-4-TOPO-pZmRabl7 está dada como la SEC ID NO. 11. El terminador de ZmRabl7 fue amplificado a partir del ADNg del maíz en una mezcla de reacción de 50 µl que consiste de 100 ng del ADNg del maíz, 200 µM de dNTPs, 1 µl del cebador 000426C del oligonucleótido de 20 µM (5'-ACTGCAGTACGTGGCTGTGCTGTG-3' ) (SEC ID NO. 25), 1 µl del cebador 000426D del oligonucleótido de 20 µl (5'-CGGTACCAATTGCATGCGTCTAATCA-3' ) (SEC ID NO. 26), 1 µl del amortiguador de alta fidelidad Expand 10X y 1 µl de la polimerasa de alta fidelidad Expand. El programa de termociclización fue de 94 °C durante 2 minutos seguido por 40 ciclos de (94 °C durante 15 segundos, 58 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 2.0 minutos) seguido por 68 °C durante 5.0 minutos. El producto del ADN de 0.6 kb que codifica la terminación de ZmRabl7 fue clonado con el kit de clonación TOPO TA. 2.0 µl de la mezcla de reacción se transformaron en 50 µl de células competentes ToplO. Los materiales recombinantes de pCR-4-TOPO-tZmRabl7 que contienen el terminador de ZmRabl7 fueron identificados por la digestión de 5 µl el ADN miniprep de pCR-4-TOPO-tZmRabl7 con EcoRI en una reacción de 20 µl que contiene 2 µg de BSA y 2 µl del amortiguador de la endonucleasa de restricción EcoRI 10X. La reacción fue incubada a 37 °C durante 2 horas, luego los productos de pCR-4-TOPO-tZmRabl7 (EcoRI) fueron resueltos sobre TAE agarosa al 1 % . Los clones de pCR-4-TOPO-tZmRabl7 fueron secuenciados entonces. La secuencia de pCR-4-T0P0-tZmRabl7 está dada como la SEC ID NO. 12. pZmRabl7 y tZmRabl7 fueron amplificados a partir de pCR-4-TOPO-pZmRabl7 y pCR-4-TOPO-tZmRabl7 , respectivamente, como se describió anteriormente. Los productos de PCR fueron purificados con el kit de purificación PCR de MinElute (Qiagen, Cat No. 28004), se digieren en reacciones de 50 µl que contienen 5 µg de BSA, 5 µl del amortiguador de la endonucleasa de restricción 10X, 2.5 µl de Kpnl y 2.5 µl de PstI (New England Biolabs) . Las reacciones fueron incubadas a 37 °C durante más de 6 horas, luego a 70 °C durante 20 minutos. El pRABl7 de 0.5 kb (Kpnl/Pstl) y el ADN de tZmRabl7 de 0.7 kb (Kpnl/Pstl) fueron resueltos sobre TAE agarosa al 1.0 % y las bandas fueron escindidas. El ADN fue extraído y recuperado utilizando el kit de extracción QIAquick Gel (Qiagen, Cat. No. 28704). Cada fragmento fue eluido en 40 µl de ddH20. 40 µl de pRABl7 (Kpnl/Pstl) fueron ligados a 40 µl de tZmRabl7 (Kpnl/Pstl) en una reacción de 100 µl que contiene 10 µl del amortiguador de la ligasa del ADN de T4 10X (New England Biolabs) y 10 µl de la ligasa del ADN de T4 (400 unidades/µl - New England Biolabs) . La reacción de ligadura fue incubada más de 8 horas a 16 °C. La ligadura fue precipitada con 20 µg de glicógeno, 0.3 M de CH2COONa (pH 5.2) y 2.5 volúmenes de etanol a -20 °C durante más de 2 horas. Los productos de la ligadura fueron recuperados por micro-centrifugación, se lavan con etanol al 70 %, se secan bajo vacío y se vuelven a suspender en 14 µl de ddH20. Los productos de la ligadura fueron digeridos en 20 µl de la reacción que contiene 2 µg de BSA, 2 µl del amortiguador 1 de la endonucleasa de restricción 10X y 2 µl de Kpnl. La reacción se incuba a 37 °C durante más de 6 horas, luego a 70 °C durante 20 minutos. El ADN resuelto fue digerido sobre TAE agarosa al 1.0 % y se escindió la banda de pZmRabl7-tZmRabl7 (Kpnl) de 1.3 kb. El ADN de pZmRabl7-tZmRabl7 (Kpnl) fue extraído y recuperado utilizando el kit de extracción QIAquick Gel (Qiagen, Cat. No. 28704) . El ADN de pZmRabl7-tZmRabl7 (Kpnl) recuperado fue precipitado con 20 µg de glicógeno, CH2COONa 0.3 M (pH 5.2) y 2.5 volúmenes de etanol a -20 °C durante más de 2 horas. El ADN de pZmRabl7-tZmRabl7 (Kpnl) fue recuperado por micro-centrifugación, se lava con etanol al 70 %, se seca bajo vacío y se vuelve a suspender en 5 µl de ddH0. 2 µg de pBluescript II (KS-) —aka pBS—ADN (procedimiento QIAprep Spin Miniprep de Qiagen, Cat. No. 27106) fueron digeridos en 20 µl de una reacción que contiene 2 µg de BSA, 2 µl del amortiguador 1 de la endonucleasa de restricción 10X y 2 µl de Kpnl. Se incubó la reacción a 37 °C durante más de 6 horas, luego a 70 °C durante 20 minutos. Se agregaron 1 µl del amortiguador de la endonucleasa de restricción 10X, 1 µl de fosfatasa alcalina intestinal del ternero 1 unidad/µl y 8 µl de ddH0 a la reacción y se incuba a 37 °C durante 30 minutos. El ADN de pBS (Kpnl/CIP) se resolvió sobre TAE agarosa al 1.0 % y se escindió la banda de pBS de 3.0 kb (Kpnl/CIP) . El ADN de pBS (Kpnl/CIP) fue recuperado y precipitado con 20 µg de glicógeno, CH2COONa 0.3 M (pH 5.2) y 2.5 volúmenes de etanol a -20 °C durante más de 2 horas. El ADN de pBS (Kpnl/CIP) fue recuperado por micro-centrifugación, se lava con 70 % de etanol, se seca bajo vacío y se vuelve a suspender en 5 µl de ddH20. 4.0 µl de pZmRabl7-tZmRabl7 (Kpnl) fueron ligados a 4.0 µl de pBS (Kpnl/CIP) en una reacción de 10 µl que contiene 1 µl del amortiguador de la ligasa de ADN 10X T4 y 1 µl de la T4 ADN ligasa (400 unidades/µl) y se incuba durante más de 8 horas a 16 °C. 5.0 µl de la mezcla de la ligadura fueron transformados en 50 µl de células competentes ToplO. Los materiales recombinantes de pBS-pZmRabl7/tZmRabl7 fueron verificados por la digestión de 2 µl del ADN miniprep de pBS-pZmRabl7/tZmRabl7 con 1.0 µl de Kpnl en reacciones de 10 µl que contienen 1 µg de BSA y 1 µl del amortiguador 1 de la endonucleasa de restricción 10X. Las reacciones fueron incubadas a 37 °C durante 2 horas, luego el ADN de pBS-pZmRabl7/tZmRabl7 (Kpnl) fue resuelto sobre TAE agarosa al 1 %. Los clones de pBS-pZmRabl7/tZmRabl7 fueron secuenciados entonces. La secuencia de pBS-pZmRabl7/tZmRabl7 fue designada como pNOV3010 (SEC ID NO.17). El mapa de pNOV3010 es mostrado en la Figura 8. pNOV3010 carece de flexibilidad para clonar los genes de interés. Se agregaron sitios de restricción adicional en la unión de pZmRabl7/tZmRabl7 para incrementar la flexibilidad por la ligadura de un adaptador sintético al vector. El adaptador (adaptador sintético I) se hizo combinando 40 µl del oligonucleótido 000809A 50 µM (5'-PGATCGGCGCGCCTGTTAATTAATTGCGGCCGC-3' ) (SEC ID NO. 27), 40 µl del oligonucleótido 000809B 50 µM (5'-PGATCGCGGCCGCAATTAATTAACAGGCGCGCC-3' ) (SEC ID NO. 28)-- en donde P es un grupo de 5' fosfato -- en una mezcla de 100 µl que es de 25 mM en Tris-HCl (pH 8.0) y 10 mM en MgCl2. La mezcla fue hervida durante 5 minutos, se retira del calor y se enfría de manera natural hasta la temperatura ambiente (aproximadamente 60 minutos) . Esto produce una solución del adaptador sintético I de 20 µM. La pNOV3010 fue preparada por la digestión de 14 µl del ADN de pNOV3010 miniprep con 2 µl de Bglll en 20 µl de una reacción que contiene 2 µg de BSA y 2 µl del amortiguador 3 de la endonucleasa de restricción 10X. La reacción fue incubada a 37 °C durante 6 horas, luego a 70 °C durante 20 minutos . Se agregan 1 µl del amortiguador 3 de la endonucleasa de restricción 10X, 1 µl de 1 unidad/µl de la fosfatasa alcalina intestinal del ternero (CIP-New England Biolabs) y 8 µl de ddH20 a la reacción y luego se incuba a 37 °C durante 30 minutos. Los productos de la digestión de PNOV3010 (BglII/CIP) fueron resueltos sobre TAE agarosa al 1 %, la banda de ADN de pNOV3010 (BglII/CIP) fue extraída y recuperada. El ADN de pNOV3010 (BglII/CIP) fue precipitado entonces con 20 µg de glicógeno, CH2COONa 0.3 M (pH 5.2) y 2.5 volúmenes de etanol a -20 °C durante más de 2 horas. El ADN de pNOV3010 (BglII/CIP) fue recuperado por micro-centrifugación, se lava con 70 % de etanol, se seca bajo vacío y se vuelve a suspender en 5 µl de ddH20. 4.5 µl del adaptador I sintético fueron ligados a 2.5 µl de pNOV3010 (BglII/CIP) en una reacción de 10 µl que contiene 1 µl del amortiguador de la ligasa del ADN 10X T4 (New England Biolabs) y 1 µl de la ligasa del ADN T4 (400 U/µl - New England Biolabs) y se incuba más de 8 horas a 16 °C. 4 µl de la ligadura fueron transformados en 50 µl de las células supercompetentes de XL-1 (Stratagene, Cat. No. 200236) . Los materiales recombinantes fueron verificados por la digestión de 5 µl del ADN miniprep en 20 µl de una reacción que contiene 2 µg de BSA, 2 µl del amortiguador 4 de la endonucleasa de restricción 10X y 1 µl de Ascl. Los productos fueron resueltos sobre TAE agarosa al 1.0 %. El clon terminado fue designado como PNOV3232 (SEC ID NO .7 ) . El mapa para el pNOV3232 es mostrado en la Figura .

Ejemplo 3: Construcción del cásete de expresión TßPP-RNAi Los cebadores utilizados para producir el gen de TßPP-RNAi son mostrados en la Figura 6. Dos fragmentos de PCR fueron producidos a partir del molde de pCR-4-TOPO-ZmT6PP-?S (Figura 7) . El fragmento 1 (SEC ID ?O . 15) contiene una porción del vector de CMVpSPORTß que funciona como el bucle en el producto del gen de TßPP-R Ai . La PCR de alta fidelidad fue utilizada para amplificar el Fragmento 1 del pCR-4-T0P0-ZmT6PP-l en 50 µl de una mezcla de reacción que consiste de 1 µl del AD? miniprep de pCR-4-TOPO-ZmT6PP-?S, 200 µM de dNTPs , el cebador 001L del oligonucleótido 20 µM (5'-ATAGGCGCGCCATGTTGGAGATGACAGAACAGATC-3' ) (SEC ID ?O . 38), el cebador 002R del oligonucleótido 20 µM (5'-ATACCGCGGGGACTGTCCTGCAGGTTTAAACG-3' ) (SEC ID ?O . 39), 5 µl del amortiguador de Pfu clonado 10X y 2.5 unidades de la polimerasa del AD? de Pfuturbo (Stratagene, Cat. ?o . 600252) en un volumen final de 50 ul . El programa de termociclización fue de 95 °C durante 30 segundos, luego 40 ciclos de (95 °C durante 10 segundos, 65 °C durante 60 segundos, 72 °C durante 2 minutos) luego 72 °C durante 10 minutos. El producto de AD? del Fragmento 1 fue recuperado y el AD? fue precipitado con etanol con el portador de glicógeno. El AD? del Fragmento 1 fue recuperado por micro centrifugación, se lava con 70 % de etanol, se seca bajo vacío y se vuelve a suspender en 14 µl de ddH20.

El fragmento 2 es provisto como la SEC ID NO. 16. La PCR de alta fidelidad fue utilizada para amplificar el Fragmento 2 de pCR-4-TOPO-ZmT6PP-NS en una mezcla de reacción de 50 µl que consiste de 1 µl de ADN miniprep de pCR-4-TOPO-ZmT6PP-NS, 200 µM de dNTPs, 20 µM del cebador 003L del oligonucleótido ( 5 ' -GCGTTAATTAAATGTTGGAGATGACAGAACAGATC-3 ' ) (SEC ID NO. 40), 20 µM del cebador 004R del oligonucleótido (5'-ATACCGCGGCGCAACACAGTGAAACACTAGAAGG-3' ) (SEC ID NO . 41), 5 µl del amortiguador de Pfu clonado 10X y 2.5 unidades de la polimerasa del ADN de Pfuturbo en un volumen final de 50 µl . El programa de termociclización fue de 95 °C durante 30 segundos, luego 40 ciclos de (95 °C durante 10 segundos, 65 °C durante 60 segundos, 72 °c durante 2 minutos) luego 72 °C durante 10 minutos. El producto de ADN del Fragmento 2 fue recuperado y el ADN fue precipitado con etanol con el portador de glicógeno. El ADN del Fragmento 2 fue recuperado por micro-centrifugación, se lava con 70 % de etanol, se seca bajo vacío y se vuelve a suspender en 14 µl de ddH20. El ADN del Fragmento 1 y del Fragmento 2 fue digerido, separadamente, en 20 µl de las mezclas de reacción que contienen 2 µg de BSA, 2 µg del amortiguador de la endonucleasa de restricción 10X y 2 µl de SacII. Los materiales digeridos fueron incubados a 37 °C durante 2 horas. La enzima fue inactivada por incubación durante 15 minutos a 65 °C. 4.0 µl del ADN del Fragmento 1 (SacII) fueron ligados a 4.0 µl del ADN del Fragmento 2 (SacII) en una mezcla de ligadura de 10 µl que contiene 1 µl del amortiguador de la ligasa del ADN de 10X T4 y 1 µl de la ligasa del ADN de T4 (400 unidades/µl) , que fueron incubados más de 24 horas a 16 °C. La enzima fue inactivada por incubación durante 15 minutos a 65 °C. Esto produjo el gen de TßPP-RNAi (SEC ID NO. 6) . El gen de TßPP-RNAi fue digerido en una mezcla de reacción de 20 µl que contiene 2 µg de BSA, 2 µl del amortiguador de la endonucleasa de restricción 10X, 1 µl de Pací y 1 µl de Ascl. El material digerido fue incubado a 37 °C durante 2 horas. El plásmido del cásete de expresión ZmRabl7, p?OV3232 (Figura 9) (SEC ID ?O. 7), fue digerido en una mezcla de reacción de 20 µl que contiene 2 µg de BSA, 2 µl del amortiguador de la endonucleasa de restricción 10X, 1 µl de Pací y 1 µl de Ascl. Se resolvieron los productos de la digestión del gen de TßPP-RNAi (AscI/PacI) y p?OV3232 (AscI/PacI) sobre TAE agarosa al 1 %, se extrae el gen de TßPP-RNAi de 1136 pb (AscI/PacI) y las bandas de AD? de p?OV3232 de 4262 pb (AscI/PacI) y se recuperaron los AD?s . Los AD?s recuperados fueron precipitados con 20 µg del glicógeno, CH2COO?a 0.3 M (pH 5.2) y 2.5 volúmenes de etanol a -20 °C durante más de 2 horas. Los AD?s fueron recuperados por micro-centrifugación, se lavan con 70 % de etanol, se secan bajo vacío y se vuelven a suspender cada uno en 5 µl de ddH20. 4.0 µl del gen de TßPP-RNAi (AscI/PacI) fueron ligados a 4.0 µl de p?OV3232 (AscI/PacI) en 10 µl de una reacción que contiene 1 µl del amortiguador de la ligasa del AD? de 10X T4 y 1 µl de la ligasa de AD? de T4 (400 unidades/µl) y se incubó más de 8 horas a 16 °C. 5.0 µl de la mezcla de la ligadura se transformaron en 50 µl de las células competentes de ToplO. Los materiales recombinantes de pRabl7 -TßPP-RNAi fueron verificados por la digestión de 2 µl del AD? de miniprep pRabl7 -TßPP-RNAi con 1.0 µl de Kpnl en reacciones de 10 µl que contienen 1 µg de BSA y 1 µl del amortiguador 1 de la endonucleasa de restricción 10X. Las reacciones fueron incubadas a 37 °C durante 2 horas, luego el AD? de pRabl7 -TßPP-RNAi (Kpnl) fue resuelto sobre TAE agarosa al 1 %. La secuencia del AD? de pRabl7 -TßPP-RNAi fue verificada y la construcción designada como la SEC ID ?O. 8. El mapa del cásete de expresión de pRabl7-T6PP-RNAi es mostrado en la Figura 10. Ejemplo 4: Construcción de un cásete de expresión de Rabl7-TßPP-R?Ai modificado Para mejorar el funcionamiento de los rasgos, la secuencia del promotor de Rabl7 del maíz fue modificada para incorporar 5 ' -UTR de Rabl7 completo, el primer intrón del gen de Rabl7 del maíz y aproximadamente 15 nucleótidos del segundo exón Rabl7 del maíz. Esta secuencia 5 ' -reguladora modificada de la invención fue diseñada para reemplazar el promotor de Rabl7 en pNOV3240. Los cambios específicos hechos en la secuencia 5 ' -reguladora de Rabl7 (SEC ID NO. 7) para construir el promotor modificado son: (1) la "G" en el nucleótido 604 fue cambiada a "C", (2) la "A" en el nucleótido 665 fue cambiada a "T", (3) la "A" en el nucleótido 718 fue cambiada a "T", (4) la "A" en el nucleótido 748 fue cambiada a "T" y (5) la "G" en el nucleótido 783 fue cambiada a "C" . Finalmente, para facilitar los procedimientos de ADN recombinante, los sitios de la endonucleasa de restricción de Pací y AscI fueron agregados después de los nucleótidos de ' ...TCGGAGGAC del exón 2 de Rabí7. La secuencia 5 ' -reguladora de Rabl7 del maíz fue amplificada a partir del ADNg utilizando la PCR de alta fidelidad. Una mezcla de reacción de 50 µl contiene 100 ng del ADNg del maíz (Cv. 6N615), 200 µM de dNTPs , 1 µl del prRabl7-F3 20 µM (5 ' -TCAAAACTATAGTATTTTAAAATTGC-3 ' ) (SEC ID ?O. 29), 1 µl del prRabl7-R3 20 µM (5 ' -GTCCTCCGACTTAAACACG-3') (SEC ID ?O. 30), 5 µl del amortiguador de alta fidelidad Expand 10X y 1 µl de la polimerasa de alta fidelidad Expand. El programa de termociclización de 95 °C durante 2 minutos seguido por 40 ciclos de (94 °C durante 15 segundos, 68 °C durante 7.5 minutos) seguido por 68 °C durante 10 minutos. La secuencia 5 ' -reguladora de Rabl7 fue clonada con el kit de clonación de TOPO XL PCR. Los materiales recombinantes de pCR-XL-T0P0-Rabl7-ADNg fueron identificados por la digestión de 5 µl del ADN de miniprep de pCR-XL-T0P0-Rabl7-ADNg en reacciones de 20 µl que contienen 2 µl de BSA y 2 µl del amortiguador de la endonucleasa de restricción 10X EcoRI . Las reacciones fueron incubadas a 37 °C durante 2 horas y los productos de pCR-XL-TOPO-Rabl7-ADNg (EcoRI) son resueltos sobre TAE agarosa al 1 %. El clon de pCR-XL-TOPO-Rabl7-ADNg fue secuenciado entonces. El promotor de Rabl7 modificado requirió varios cambios de secuencia. En primer lugar, los codones de inicio de la traducción, potenciales, fueron eliminados. En primer lugar, los codones de inicio de la traducción, potenciales, fueron eliminados utilizando el kit de mutagénesis dirigida a sitios múltiples QuikChange de Stratagene (Cat. No. 200513). Los cebadores que fueron utilizados para fabricar los cambios son: RabATGl (5'-CGTGCAAGCATCATCGAGTACGGTCAGCAG-3' ) (SEC ID NO. 31) , RabATG2 (5 ' -CGCCACGGGCCTTGTCGACCAGTACG-3 ' ) (SEC ID NO . 32), RabATG3 ( 5 ' -GCACCGGCGGCTTGAGGCACGGCA-3 ' ) (SEC ID NO. 33), RabATG4 (5 ' -CCACCGGCGGCTTGGGCCAGCTGG-3 ' ) (SEC ID NO. 34), y RabATG5 (5 ' -GGCGCTGGCATCGGTGGCGGGCAG-3 ' ) (SEC ID NO . 35). El PCR de alta fidelidad fue utilizado para fijar los sitios de la endonucleasa de restricción al promotor de Rabl7 modificado. La mezcla de reacción de 50 µl contuvo 1 µl del ADN mini-prep de pCR-XL-T0P0-Rabl7-ADNg, dNTPs 300 µM, 1 µl de Ascl-Rabl7 20 µM (5'-TTAATTAAGGCGCGCCTTCAAAACTATAGTATTTTAAAATTGC-3' ) (SEC ID NO. 36), 1 µl de Rabl7-Paci-Asc-3 20 µM (5'-TTGGCGCGCCTTAATTAAGTCCTCCGACTTAAACAC-3' ) (SEC ID NO . 37), 5 µl del amortiguador de alta fidelidad 10X Proofstart, 10 µl de la solución Q y 2 µl de la polimerasa de alta fidelidad Proofstart. El programa de termociclización fue de 95 °C durante 5 minutos seguido por 45 ciclos de (94 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 4 minutos) seguido por 72 °C durante 15 minutos. El producto de PCR fue purificado y digerido en reacciones de 50 µl que contienen 5 µg de BSA, 5 µl del amortiguador 4 de la endonucleasa de restricción 10X y 5.0 µl de Ascl. La reacción fue incubada a 37 °C durante más de 6 horas, luego a 70 °C durante 20 minutos. El pRabl7-mod de 1.0 kb (AscI) fue resuelto sobre TAE agarosa al 1.0 % y la banda fue escindida. El ADN fue extraído y recuperado. El ADN de pRabl7-mod (AscI) recuperado fue precipitado en etanol con el portador de glicógeno. El fragmento de ADN de pRabl7-mod (AscI) fue recuperado por micro-centrifugación, se lava con 70 % de etanol, se seca bajo vacío y se vuelve a suspender en 5 µl de ddH20. 2 µg del ADN miniprep de pNOV3240 fueron digeridos en una mezcla de reacción de 20 µl que contiene 2 µg de BSA, 2 µl del amortiguador 4 de la endonucleasa de restricción 10X y 2 µl de Ascl. La mezcla de reacción fue incubada a 37 °C durante más de 6 horas, luego a 70 °C durante 20 minutos. Luego se agregaron 1 ml del amortiguador 4 de la endonucleasa de restricción, 1 µl de la fosfatasa alcalina intestinal de bovino 1 unidad/µl y 8 µl de ddH20 a la mezcla de reacción y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. El ADN de pNOV3240 (AscI/CIP) fue resuelto sobre TAE agarosa al 1.0 % y la banda de pNOV3240 de 11 kb (AscI/CIP) fue escindida. El ADN de pNOV3240 (AscI/CIP) fue extraído y recuperado. El ADN de pNOV3240 (AscI/CIP) recuperado fue precipitado con etanol con el portador de glicógeno. El ADN de pNOV3240 (AscI/CIP) fue recuperado por micro-centrifugación, lavado con 70 % de etanol, y secado bajo vacío y resuspendido en 5 µl de ddH20. 4.0 µl de pRabl7-mod (AscI) fueron ligados a 4.0 µl de pNOV3240 (AscI/CIP) en 10 µl de una mezcla de ligadura que contiene 1 µl del amortiguador de la ligasa de ADN de 10X T4 y 1 µl de la ligasa de ADN de T4 (400 unidades/µl) . La mezcla de la ligadura fue incubada durante más de 8 horas a 16 °C. 5.0 µl de la mezcla de ligadura se transformaron en 50 µl de las células competentes ToplO. Los materiales recombinantes de pNOV3240 modificados fueron verificados por la digestión de 2 µl del ADN miniprep pNOV3240 modificado con 1 µl de Salí en reacciones de 10 µl que contienen 1 µg de BSA y 1 µl del amortiguador de la endonucleasa de restricción 10X apropiado.

Los materiales digeridos fueron incubados a 37 °C durante 2 horas, luego se resolvieron sobre TAE agarosa al 1 % . Los materiales recombinantes de pNOV3240 modificados positivamente fueron secuenciados. La secuencia de nucleótidos del cásete de expresión de Rabl7-T6PP-RNAi modificado es mostrada en la SEC ID ?O. 18. Ejemplo 5: Construcción del plásmido de Agrobacterium tumefaciens binario 2 µg de p?OV2117 (Figura HA) fueron digeridos en 20 µl de una reacción que contiene 2 µg de BSA, 2 µl del amortiguador 1 de la endonucleasa de restricción 10X y 2 µl de Kpnl. La reacción fue incubada a 37 °C durante más de ß horas, luego a 70 °C durante 20 minutos. 1 µl del amortiguador 1 de la endonucleasa de restricción 10X, 1 µl de la fosfatasa alcalina intestinal del ternero 1 unidad/µl (CIP) y 8 µl de ddH20, fueron agregados entonces e incubados a 37 °C durante 30 minutos. 2 µg del AD? miniprep pRabl7-TßPP-RNAi fueron digeridos en 20 µl de una reacción que contiene 2 µg de BSA, 2 µl del amortiguador 1 de la endonucleasa de restricción 10X y 2 µl de Kpnl. La reacción se incuba a 37 °C durante más de 6 horas. Los AD?s del plásmido digerido, p?OV2117 (Kpnl/CIP) y pRabl7-T6PP-R?Ai (Kpnl) , fueron resueltos sobre TAE agarosa al 1.0 % y las bandas de AD? de p?OV2117 de 9.2 kb (Kpnl/CIP) y pRabl7-T6PP-R?Ai (Kpnl) de 2.5 kb fueron escindidas. Los ADNs de pNOV2117 (Kpnl/CIP) y pRabl7 -TßPP-RNAi (Kpnl) fueron extraídos y luego precipitados con 20 µg de glicógeno, CH2COO?a 0.3 M (pH 5.2) y 2.5 volúmenes de etanol a -20 °C durante más de 2 horas. Los fragmentos de AD? de p?OV2117 (KnpI/CIP) y pRabl7 -TßPP-RNAi (Kpnl) fueron recuperados por micro-centrifugación, se lavan con 70 % de etanol, se secan bajo vacío y se resuspenden cada uno en 5 µl de ddH20. 4.0 µl de p?0V2117 (Kpnl/CIP) fueron ligados a 4.0 µl de pRabl7-T6PP-R?Ai (Kpnl) en 10 µl de una reacción que contiene 1 µl del amortiguador de la ligasa de AD? de 10X T4 y 1 µl de la ligasa de AD? de T4 (400 U/µl) y se incuba más de 8 horas a 16 °C. 5.0 µl de la mezcla de ligadura fueron transformados en 50 µl de las células competentes de ToplO. Los materiales recombinantes de p?OV2117 -pRabl7-T6PP-RNAi fueron identificados por la digestión de 7.5 µl del AD? miniprep de p?OV2117-pRabl7 -TßPP-RNAi con 1.0 µl de Kpnl en reacciones de 10 µl que contienen 1 µg de BSA y 1 µl del amortiguador 1 de la endonucleasa de restricción 10X. Las reacciones fueron incubadas a 37 °C durante 2 horas y luego los productos de AD? de p?OV2117-pRabl7 -T6PP-RNAi (Kpnl) fueron resueltos sobre TAE agarosa al 1 %. La secuencia de unión de p?OV2117-pRabl7 -TßPP-RNAi fue verificada y la misma fue designada como p?OV3240. Su mapa es mostrado en la Figura 11B.

Ejemplo ß: Transformación del maíz Ya se conocen numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación de la planta por aquellos con experiencia ordinaria en las artes de la transformación de las plantas, y los genes pertinentes para esta invención pueden ser utilizados en conjunción con cualquiera de tales vectores. La selección del vector depende de la técnica de transformación preferida y las especies objetivo para la transformación. Para ciertas especies objetivo, se prefieren diferentes marcadores de selección antibióticos o herbicidas. Los marcadores de selección utilizados rutinariamente en la transformación incluyen el gen nptll, que confiere resistencia a la kanamicina y los antibióticos relacionados (Vieira y Messing, 1982; Bevan et al., 1983), el gen bar, el cual confiere resistencia a la fosfinotricina herbicida (White et al., 1990; Spencer et al., 1990), el gen hph, el cual confiere resistencia a la higromicina antibiótica (Blochlinger y Diggelmann, 1984) , el gen manA, el cual permite la selección positiva en la presencia de mañosa (Miles y Guest, 1984; Bojsen et al., 1998), y el gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Bourouis y Bruno, 1983), y el gen de EPSPS, el cual confiere resistencia al glifosato (Shah et al., 1990; 1993). Muchos vectores están disponibles para la transformación utilizando Agrobacterium tumefaciens . Estos típicamente llevan al menos una secuencia de frontera de T-ADN e incluyen vectores tales como bBINl9 (Bevan, 1984) . Los vectores típicos adecuados para la transformación de Agrobacterium incluyen los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001, así como el vector binario pCIBlO y los derivados de selección de la higromicina de los mismos. (Véase, por ejemplo, Ligón et al., 1997). Otros vectores están disponibles para la transformación sin Agrobacterium tumefaciens . La transformación sin el uso de Agrobacterium tumefaciens evita el requerimiento de las secuencias de T-ADN en el vector de transformación elegido y en consecuencia, los vectores que carecen de estas secuencias son utilizados además de los vectores tales como los descritos anteriormente que contienen las secuencias de T-ADN. Las técnicas de transformación que no están basadas en Agrobacterium incluyen la transformación por medio del bombardeo de partículas, la absorción de protoplastos (por ejemplo por PEG y electroporación) y la microinyección. La elección del vector depende ampliamente de la selección preferida para las especies que son transformadas. Los vectores típicos adecuados para la transformación sin Agrobacterium incluyen PCIB3064, pS0G19, y pSOG35. (Véase, por ejemplo, Ligón et al. , 1997) . Una vez que la secuencia del ADN de interés es clonada en un sistema de expresión, la misma es transformada en una célula vegetal. Los métodos para la transformación y regeneración de las plantas son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, los vectores del plásmido Ti han sido utilizados para el suministro del ADN extraño, así como para la absorción directa del ADN, los liposomas, electroporación, microinyección, y microproyectiles. Además, las bacterias del género Agrobacterium pueden ser utilizadas para transformar las células vegetales. Las técnicas de transformación para los dicotiledones son bien conocidas en el arte e incluyen las técnicas a base de Agrobacterium y las técnicas que no requieren Agrobacterium . Las técnicas sin Agrobacterium involucran la absorción del material genético exógeno directamente por los protoplastos o las células. Esto es efectuado por la absorción mediada por PEG o electroporación, el suministro mediado por el bombardeo de partículas, o la microinyección. En cada caso, las células transformadas son regeneradas a las plantas enteras utilizando las técnicas estándares conocidas en el arte. La transformación de la mayoría de las especies monocotiledóneas también ha llegado a ser ahora algo rutinario. Las técnicas preferidas incluyen la transferencia directa del gen en los protoplastos utilizando las técnicas de PEG o electroporación, el bombardeo de partículas en el tejido del callo, así como la transformación mediada por Agroba cterium. Las plantas de los eventos de transformación se hacen crecer, se propagan y se cruzan para proporcionar la progenie con el rasgo deseado, y las semillas son obtenidas con el rasgo deseado, utilizando los procesos bien conocidos en el arte. Una vez que una secuencia de ácidos nucleicos de la invención ha sido clonada en un sistema de expresión, la misma es transformada en una célula vegetal. Los casetes de expresión del receptor y del objetivo de la presente invención pueden ser introducidos en la célula vegetal en un número de maneras reconocidas en el arte. Los métodos para la regeneración de las plantas también son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, los vectores del plásmido de Ti han sido utilizados para el suministro del ADN extraño, así como para la absorción directa del ADN por medio de electroporación, microinyección, y microproyectiles. Además, las bacterias del género Agrobacterium pueden ser utilizadas para transformar las células vegetales. Posteriormente se dan las descripciones de las técnicas representativas para transformar las plantas tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, así como una técnica de transformación representativa de los plástidos. Las técnicas de transformación para las plantas dicotiledóneas son bien conocidas en el arte e incluyen las técnicas a base de Agrobacterium y las técnicas que no requieren Agrobacterium . Las técnicas sin Agrobacterium involucran la absorción del material genético exógeno directamente por los protoplastos o las células. Esto puede ser efectuado por la absorción mediada por PEG o electroporación, el suministro mediado por el bombardeo de partículas, o microinyección. Los ejemplos de estas técnicas son descritos (Paszkowski et al., 1984; Potrykus et al., 1985; Reich et al., 1986; Klein et al., 1987). En cada caso, las células transformadas son regeneradas hasta las plantas totales utilizando las técnicas estándares conocidas en el arte. La transformación mediada por Agrobacterium es una técnica preferida para la transformación de las plantas dicotiledóneas a causa de su eficiencia elevada de la transformación y su amplia utilidad con muchas especies diferentes. La transformación de Agrobacterium típicamente involucra la transferencia del vector binario que lleva el ADN extraño de interés (por ejemplo pCIB200 o pCIB2001) a una cepa de Agrobacterium apropiada. Esto puede depender del complemento de los genes Vir llevados por la cepa hospedera de Agrobacterium ya sea sobre un plásmido de Ti co-residente o sobre el cromosoma (por ejemplo la cepa (CIB542 para PCIB200 y pCIB2001 (Uknes et al., 1993)). La transferencia del vector binario recombinante a Agrobacterium es efectuada por un procedimiento de acoplamiento triparental utilizando E. coli que lleva el vector binario recombinante, una cepa de E. coli auxiliadora que lleva un plásmido tal como pRK2013 y que es capaz de movilizar el vector binario recombinante hasta la cepa de Agrobacterium objetivo. Alternativamente, el vector binario recombinante puede ser transferido a Agrobacterium por la transformación del ADN (Hófgen y Willmitzer, 1988) . La transformación de las especies de las plantas objetivo por Agrobacterium recombinante usualmente involucra el co-cultivo de la Agrobacterium con los explantes de las plantas que van a ser transformadas y sigue los protocolos bien conocidos en el arte. El tejido transformado es regenerado sobre el medio de selección que contiene el antibiótico, herbicida u otro compuesto que el marcador seleccionable, presente entre las fronteras de T-ADN del plásmido binario, está diseñado para proporcionar resistencia. Otro método para transformar las células vegetales con un gen involucra propulsar partículas activas biológicamente o inertes en los tejidos y las células de las plantas. Esta técnica es descrita en Sanford et al. (1990; 1991; 1992). En general, este procedimiento involucra propulsar partículas activas biológicamente o inertes en las células bajo condiciones efectivas para penetrar la superficie externa de la célula y producir la incorporación dentro del interior de la misma. Cuando las partículas inertes son utilizadas, el vector puede ser introducido en la célula por el recubrimiento de las partículas con el vector que contiene el gen deseado. Alternativamente, la célula objetivo puede ser rodeada por el vector de modo que el vector sea llevado dentro de la célula por el crecimiento de la partícula. Las partículas activas biológicamente (por ejemplo, las células de levadura secas, de la bacteria seca o de un bacteriófago, que contiene cada una el ADN que se piensa que va a ser introducido) también pueden ser propulsadas dentro del tejido de la célula vegetal. La transformación de la mayoría de las especies monocotiledóneas ahora también ha llegado a ser algo rutinario. Las técnicas preferidas incluyen la transferencia directa del gen en los protoplatos utilizando las técnicas de PEG o electroporación, y el bombardeo de partículas en el tejido del callo. Las transformaciones pueden ser entendidas con una especie de ADN única o especies múltiples de ADN (es decir co-transformación) y ambas de estas técnicas son adecuadas para su uso con esta invención. La cotransformación puede tener la ventaja de evitar la construcción del vector completo y de generar las plantas transgénicas con los sitios no enlazados para el gen de interés y el marcador seleccionable, que hacen posible la eliminación del marcador seleccionable en las generaciones subsiguientes, en el caso de que esto sea deseable. Sin embargo, una desventaja del uso de la co-transformación es la frecuencia menor que el 100 % con la cual las especies de ADN separadas son integradas en el genoma (Schocher et al., 1986). Varias patentes U.S. describen técnicas para la preparación del callo y los protoplastos a partir de una línea endogámica de élite del maíz, la transformación de protoplastos utilizando PEG o electroporación, y la regeneración de las plantas de maíz a partir de los protoplastos transformados (Tomes et al., 1999; Dudits et al., 2001; Koziel et al., 2002). Gordon-Kamm et al. (1990) y Fromm et al., (1990) han publicado técnicas para la transformación de las líneas de maíz derivadas de A188 utilizando el bombardeo de partículas. Además, Koziel et al., (1993, 2002) describe técnicas para la transformación de las líneas endogámicas de élite del maíz por el bombardeo de partículas. Esta técnica utiliza embriones de maíz inmaduros de 1.5-2.5 mm de longitud retirados de una mazorca de maíz de 14-15 días después de la polinización y un dispositivo PDS-lOOOHe Biolistics para el bombardeo. La transformación del arroz puede ser emprendida por técnicas de transferencia directa de los genes utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación mediada por los protoplastos ha sido descrita para los tipos de Japónica y los tipos de Indica (Zhang et al., 1988; Shimamoto et al., 1989; Datta et al., 1990). Ambos tipos también se pueden transformar rutinariamente utilizando el bombardeo de partículas (Christou et al., 1991). Además, Gobel y Nakakido (1993) describen técnicas para la transformación del arroz por medio de la electroporación. Hom et al. (1989) describe técnicas para la generación, transformación y regeneración de los protoplastos de Pooideae. Estas técnicas permiten la transformación de Dactilis y del trigo. Además, la transformación del trigo ha sido descrita por Vasil et al. (1992) utilizando el bombardeo de partículas en las células del callo regenerables a largo plazo del tipo C, y también por Vasil et al. (1993) y Weeks et al. (1993) utilizando el bombardeo de partículas de los embriones inmaduros y el callo derivado del embrión inmaduro. Una técnica preferida para la transformación del trigo, sin embargo, involucra la transformación del trigo por el bombardeo de partículas de los embriones inmaduros e incluye una etapa ya sea con un nivel elevado de sucrosa o un nivel elevado de maltosa previo al suministro del gen. Previo al bombardeo, los embriones de 0.75-1.0 milímetros son colocados en placas sobre el medio de MS con 3 % de sucrosa (Murashige y Skoog, 1962) y 3 mg/l de 2,4-D para la inducción de los embriones somáticos, lo cual procede en la obscuridad. El día elegido del bombardeo, los embriones son removidos del medio de inducción y colocados sobre el osmoticum (medio de inducción con sucrosa o maltosa agregada a la concentración deseada, típicamente 15 %) . Los embriones se plasmolizan durante 2-3 horas, luego los mismos son bombardeados. Aunque no es crítico, cada placa objetivo usualmente contiene veinte embriones . Un plásmido que lleva el gen apropiado (tal como pCIB3064 o pSG35) es precipitado sobre las partículas de oro del tamaño de micrómetros utilizando los procedimientos estándares. Cada placa de embriones es disparada con el dispositivo de helio DuPont Biolistics® utilizando una presión de estallido de 70.37 kg/cm2 (-1000 psi) utilizando un tamiz de malla 80 estándar. Después del bombardeo, los embriones (todavía sobre el osmoticum) son colocados de regreso a la obscuridad para que se recuperen durante aproximadamente 24 horas. Luego los embriones son removidos del osmoticum y colocados de regreso sobre el medio de inducción en donde los mismos permanecen durante aproximadamente un mes antes de la regeneración. Los explantes de los embriones con el callo embriogénico en desarrollo son transferidos entonces al medio de regeneración (MS + 1 mg/l NAA, 5 mg/l GA) , y que contiene además el agente de selección apropiado (10 mg/l de Basta en el caso de pCIB3064 y 2 mg/l de metotrexato en el caso de pSOG35) . Después de aproximadamente un mes, los brotes desarrollados son transferidos a recipientes estériles más grandes conocidos como "GA7s" que contienen MS (por sus siglas en inglés) de resistencia media, sucrosa al 2 %, y la misma concentración del agente de selección. La transformación de las plantas monocotiledóneas utilizando Agrobacterium también ha sido descrita (Véase, Hici y Komari, 1994; 1997; y Negrotto et al., 2000) incorporada aquí para referencia. El plásmido, pNOV3240, fue introducido en Agrobacterium tumefaciens utilizando la electroporación. Las células de Agrobacterium transformadas fueron utilizadas para transferir el cásete de expresión de Rabl7-T6PP-RNAi en el genoma del maíz (Al88xHiII) . El T-ADN hace posible la identificación positiva de los agentes de transformación por medio de la regeneración sobre el medio que contiene mañosa. Sesenta y tres eventos fueron generados. De estos, el análisis de Taqman identificó 15 eventos con una copia única del transgen y ninguna secuencia más allá del límite. Cuando fue posible, las plantas TO fueron auto-polinizadas; de otra manera, las mismas fueron polinizadas con JHAF031. Ejemplo 7: Condiciones de crecimiento en el invernadero La semilla del maíz se hace crecer en macetas de 2.5 SVD (Classic 600, recipientes de enfermería de 7.57 1 (~ 2 galones) en una mezcla universal (Sungrow Horticulture, Pine Bluff, AR) . La mezcla universal es de 45 % de turba en polvo, 45 % de cebada, 5 % de perlita, 5 % de vermiculita. Las condiciones ambientales para el cultivo del maíz en el invernadero son típicamente de 16 horas al día (promedio de intensidad de la luz de 600 µmol rtf2s~2) , la temperatura del tiempo del día fue de 26.6-30.0 aC (80-86 °F) , la temperatura del tiempo de la noche fue de 21.1-24.4 2C (70-76 °F) y la humedad relativa fue mayor que el 50 %. Las plantas son colocadas sobre plataformas de 5.08 cm (2") para evitar el contacto con el piso del invernadero. Las plantas son provistas de agua manualmente hasta que la irrigación diaria es requerida, luego las mismas son colocadas sobre un goteo de irrigación. El programa de irrigación es de 4 minutos cada día. Las plantas fueron tratadas rutinariamente con insecticidas para controlar las plagas . Ejemplo 8: Evaluación del maíz transgénico que expresa Rabl7-TßPP-RNAi en el invernadero La evaluación en el invernadero es un experimento de tensión controlada del agua que cuantifica la viabilidad del óvulo en las plantas con tensión y sin tensión de agua. Los datos de las plantas no sometidas a tensión representan el potencial del genotipo para endurecer la semilla bajo las condiciones ideales. Los datos de las plantas sometidas a la tensión del agua cuantifican el aborto del grano que resulta de la sequía en el tiempo de florecimiento. Los resultados de estos experimentos pueden ser predictivos del funcionamiento en el campo. Se utiliza esta herramienta para seleccionar los eventos transgénicos para las evaluaciones en el campo. Las semillas de las plantas puras fueron sembradas como anteriormente. El análisis de Taqman fue utilizado para dividir el hemicigoto de la progenie (que contiene Rabl7-TßPP-RNAi ) y los grupos de acigotos (con el Rabl7 -TßPP-RNAi faltante) . Las plantas salidas de las semillas fueron transferidas a 600 macetas, y mantenidas utilizando los procedimientos estándares de invernadero anteriores hasta que las mismas alcanzaron la etapa de crecimiento Vß (Ritchie et al., 1997) . Todas las plantas fueron tratadas con el pesticida sistémico, Marathón, para reducir la susceptibilidad a las plagas. La tensión del agua fue impuesta gradualmente, utilizando una sal como el osmoticum (?uccio et al. 1998) . La sal consistió de cloruro de sodio/cloruro de calcio a una proporción molar de 10:1, suministrada en la solución de Hoagland 0.5X, para prevenir la alteración inducida por el sodio de la absorción del potasio. La concentración de la sal en el elemento de irrigación fue incrementada desde 50 mM hasta 100 mM o hasta 150 mM cada tres días para dar tiempo a las plantas para ajustarse a la sal. Las plantas fueron mantenidas sobre una solución de la sal 150 mM a través del período de florecimiento, típicamente de dos semanas, después de lo cual las macetas fueron inundadas completamente con agua y las plantas fueron regresadas a la irrigación normal. Este protocolo típicamente redujo el endurecimiento de la semilla en 40-60 %, comparado con las plantas de control que no recibieron la sal. La capacidad de cada planta para ajustarse a la tensión del agua impuesta fue medida por el muestreo de la primera hoja expandida totalmente, en su punto medio, para verificar el potencial del soluto. Tres muestras obtenidas por punzón de la hoja, circulares, de 1.90 cm (3/4 pulgadas), fueron colectadas y analizadas para verificar el potencial del soluto de la hoja-savia utilizando un osmómetro de presión de vapor del punto de rocío. Las plantas fueron muestreadas tres días después del tratamiento con una sal 150 mM entre 10:00-11:00 AM. Los potenciales del soluto de la hoja-savia fueron comparados con los potenciales del soluto para el suelo, para determinar qué tan bien se ajustan las plantas a la tensión del agua. Típicamente, las plantas no difieren en su ajuste a la tensión del agua impuesta. Típicamente, 15-20 semillas por evento transgénico se hicieron sembrar para dar 7-10 individuos acigóticos y 7-10 individuos cigóticos. Las plantas fueron arregladas en un diseño de bloques aleatorio, completo, que consiste de tres duplicados por tratamiento. Las mazorcas en desarrollo fueron cubiertas con las bolsas de polinización antes de la salida del estigma. Los datos del polen dispersado y de la salida del estigma fueron registrados y las mazorcas individuales fueron polinizadas manualmente 2-3 veces con el polen del donador en los días sucesivos. Las bolsas de polinización fueron removidas después del complemento de todas las polinizaciones. Las mazorcas fueron colectadas 30 días después de las polinizaciones, y se secaron durante 4 días a un contenido de humedad del 15 % . Las mazorcas fueron descortezadas y los granos fueron contados y pesados . Ejemplo 9: Experimento 1 en el invernadero Ocho eventos de Rabl7 -TßPP-RNAi fueron estudiados para verificar su capacidad para endurecer la semilla bajo la tensión del agua. Veinticuatro semillas Ti de cada evento (un origen TO puro) fueron germinadas. El análisis de Taqman fue utilizado para analizar la cigosidad en cada planta salida de la semilla. Los homocigotos fueron puestos a un lado para la formación de bulbos de la semilla. Los hemicigotos y los acigotos fueron analizados utilizando el protocolo de tensión del agua del invernadero anterior (Ejemplo 8) . En este experimento, las plantas A188 no transformadas sirvieron como la marca fija. Los datos de endurecimiento del grano, resumidos en la Figura 12, muestran que cada evento es único. El protocolo de tensión del agua fue algo severo porque las plantas A188 con la marca fija sufrieron una reducción mayor que el 70 % en el endurecimiento del grano. En general, la presencia del transgen mejora el endurecimiento del grano en las plantas sometidas a la tensión por el agua, la mejora promedio a través de todos los eventos transgénicos fue del 39 %. En particular, en el evento 81A10B, los hemicigotos tuvieron más del doble de endurecimiento del grano de los acigotos correspondientes. También, los hemicigotos sometidos a la tensión por el agua del evento 78A18B se endurecen seis veces más que los granos de los acigotos. Los datos indican que el cásete de expresión de Rabl7 -TßPP-RNAi mejora el endurecimiento del grano en el maíz. Ejemplo 10: Experimento 2 en el invernadero Dos eventos de Rabl7 -TßPP-RNAi , 78A18B(13) y 81A10B(10) fueron estudiados para verificar su capacidad para endurecer la semilla bajo la tensión del agua. Noventa y seis semillas de T2 de cada evento (de un origen TI puro) fueron germinadas. El análisis de Taqman fue utilizado para establecer la cigocidad en cada planta salida de la semilla.

Los hemicigotos y acigotos fueron analizados utilizando el protocolo de la tensión del agua en el invernadero, anterior (Ejemplo 8). En este experimento, los acigotos de 81A10B(10) sirvieron como la marca fija. El protocolo de la tensión del agua fue efectivo porque los acigotos 81A10B(10) con la marca fija sufrieron una reducción de aproximadamente 45 % en el endurecimiento del grano. En general, la presencia del transgen puede reducir el endurecimiento del grano en las plantas bien provistas de agua. Sin embargo, el transgen ya sea tiene un efecto pequeño sobre, o mejora ligeramente el endurecimiento del grano en las plantas sometidas a la tensión del agua. Ejemplo 11: Evaluación del maíz transgénico que expresa Rabl7-TßPP-RNAi en el campo Las evaluaciones del campo fueron llevadas a cabo para probar el funcionamiento del transgen bajo condiciones utilizadas típicamente por los agricultores. Los criterios generales del campo fueron de parcelas de cuatro surcos, de 5.33 m (17.5 pies) de longitud separadas por valles de 0.6-0.91 m (2-3) pies con aproximadamente 40 plantas por surco. Los surcos exteriores fueron plantados con los acigotos y los surcos internos fueron plantados con los elementos transgénicos de segregación. El campo fue dividido en un bloque de tratamiento bien provisto de agua y un bloque de tratamiento sometido a la tensión del agua, y la irrigación por goteo fue utilizada para suministrar agua a los campos. Cada bloque tuvo un colector de irrigación destinado. Para mantener la uniformidad, la parcela más alejada estuvo a menos de 30.48 m (100 pies) desde el colector de irrigación. Existieron 3 parcelas por evento por tratamiento (un total de seis por evento) . Las parcelas de los eventos fueron plantadas a una distancia diferente desde el colector de irrigación en un diseño de bloque completo, aleatorio. Los bloques de tratamiento bien provistos de agua y sometidos a la tensión del agua, estuvieron separados por 16 surcos (15.24 m (50 pies) ) . Las semillas homocigóticas TI del evento 78A18B y del evento 81A10B fueron reto-cruzadas dos veces con JHAF031, y las semillas de segregación 1:1 fueron plantadas en el verano del 2003 en Hawai. El sitio de la plantación tuvo un suelo arenoso bien drenado y típicamente proporciona menos de 7.62 mm (3 pulgadas) de agua de lluvia durante el verano. El análisis de Taqman de la planta salida de la semilla fue efectuado para establecer la presencia del transgen. De esta manera, los acigotos y los hemicigotos fueron dispersados aleatoriamente en cada parcela. El bloque bien provisto de agua fue irrigado de manera óptima de principio a fin del experimento. El bloque sometido a la tensión del agua fue provisto de agua óptimamente hasta que las plantas alcanzaron aproximadamente V6, tiempo en el cual el agua fue retenida. Las plantas fueron regresadas a la irrigación óptima después de una salida del estigma del 90 %. La cantidad del agua aplicada al campo y el agua de la lluvia fue registrada. Después de que las plantas tuvieron la transición hasta el desarrollo reproductivo, el polen se dispersó y los datos de salida del estigma fueron registrados para cada planta. La respuesta de la planta a la falta de agua también fue registrada por la verificación de la aparición de los síntomas de tensión fisiológica tales como la aparición del color gris y el curveado de las hojas, y el muestreo del tejido de la hoja para medir el potencial del soluto. La capacidad de cada planta para ajustarse a la tensión del agua impuesta fue medida por el muestreo de la primera hoja totalmente expandida, en su punto medio, para verificar el potencial del soluto. Tres muestras obtenidas por punzón de la hoja, circulares, de 1.90 cm (3/4 pulgadas), fueron colectadas y analizadas para verificar el potencial del soluto de la hoja-savia utilizando un osmómetro de presión de vapor en el punto de rocío. Las plantas en el bloque sometido a la tensión del agua fueron muestreadas durante el período de tensión máxima. Las plantas en el bloque bien provisto de agua fueron muestreadas algunos días después del bloque sometido a la tensión del agua. El muestreo se llevó a cabo entre las 8:00-10:00 AM. Los potenciales del soluto de la hoja-savia para las plantas dentro de cada parcela fueron comparados para establecer la uniformidad en el campo. Las mazorcas de cada planta fueron colectadas y descortezadas . Los granos f eron contados y pesados . Los datos de los individuos hemicigotos fueron comparados con los individuos acigotos para medir el efecto del transgen sobre el endurecimiento del grano. Los resultados para los dos eventos de Rabl7-T6PP-RNAi son resumidos en las Figuras 14 y . En promedio, el endurecimiento del grano reducido por la tensión del agua en los individuos azigóticos A78A18B (Figura 14) fue del 47 %, mientras que los individuos hemicigotos sufrieron solamente una reducción del rendimiento del 30 % bajo las mismas condiciones. La Figura 15 muestra que los individuos hemicigotos A81A10B padecieron una reducción del rendimiento inducida por la sequía ligeramente más grande que los acigotos correspondientes (30% contra 25 %, respectivamente) . Sin embargo, esta reducción en el rendimiento está desviada significativamente por más del 10 % de la mejora del rendimiento producido por el transgen. Los resultados de este experimento del campo demuestran la efectividad del transgen de Rabl7 -T6PP-RNAi en la estabilización del endurecimiento del grano en el maíz sometido a tensión por la sequía. Ejemplo 12: Aplicación de Rabl7 -T6PP-RNAi a otras especies de plantas La actividad de silenciamiento del gen de un ARN de doble hebra es específica para la secuencia. Los estudios en las plantas, insectos, nemátodos, mamíferos y otros sistemas eucarióticos indican que una secuencia de 21-23 bases, homologa, es suficiente para provocar el silenciamiento del gen (Waterhouse y Helliwell, 2003; McManus y Sharp, 2002). El requerimiento de la longitud de 21 bases es un límite inferior y existe evidencia de que las desigualdades pueden ser toleradas (McManus y Sharp, 2002) . Teniendo esto en cuenta, es claro que un silenciamiento del gen mediado por ARN más efectivo, es logrado con los moldes más largos (Thomas et al., 2001). La secuencia reguladora del gen, adicional, funciona de una manera predecible a través de las fronteras de las especies (Véase, por ejemplo, ?uccio y Thomas, 2000) . Las construcciones transgénicas de la presente invención pueden ser utilizadas para reducir la expresión de TßPP en otras especies de plantas. La eficacia de las especies cruzadas fue establecida por la investigación de las bases de datos de AD?c públicas y propias para identificar las secuencias de codificación de TßPP en otras especies de plantas. Los "valores exitosos" fueron alineados y utilizados para generar elementos contiguos como se describe en las Figuras 2A y 2B. Los homólogos de TßPP del sorgo, cebada, trigo, caña de azúcar y centeno fueron identificados. Los fragmentos de la secuencia de cada gen que corresponden al fragmento de TßPP-RNAi fueron comparados por la alineación (Figuras 16A y 16B) y semejanza (Figura 17) . Para comparación, los aminoácidos 334-393 de ZmTßPP-1, en las Figuras 3A y 3B, son codificados por los nucleótidos 1-180 del AD?c de ZmT6PP-l en la Figura 16. Los resultados demuestran allí que la construcción transgénica de la presente invención funcionará para silenciar el TßPP en otras especies del cultivo. Esto muestra que la construcción puede ser utilizada para mejorar la tolerancia a la tensión ambiental no solamente en el maíz, sino también en otros cultivos de cereales importantes. Referencias Aeschbacher, R.A. , Müller, J., Boller, T. , Wiemken, A. (1999) . Purification of the trehalase GMTREl from Soybean nodules and cloning of its cDNA. GMTREl is expressed at a low level in múltiple tissues. Plant Physiol. 119, 489-495. Atkins, D., Young, M. , Uzzell, S., Kelly, L., Fillatti, J., Gerlach, W.L. (1995). The expression of antisense and ribozyme genes targeting citrus exocortis viroid in transgenic plants. J. Gen. Virol. 76, 1781-1790. Atkins, D.G., Gerlach, W.L., Young, M.J. (2002). Ribozyme nucleic acids and methods of use thereof for controlling viral pathogens . U.S. Patent 6,451,603. 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Starch and the control of kernel number in maize at low water potentials. Plant Physiol. 121, 25-25. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducible por tensión en el tejido vegetativo, caracterizada porque el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de T6PP.
2. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido es mostrado por la SEC ID NO. 6.
3. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido comprende al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID NO. 6.
4. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido está colocado en una orientación de sentido con relación al promotor .
5. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido está colocado en una orientación de antisentido con relación al promotor .
6. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el polinucleótido es un complemento con respecto a los 21 pares base consecutivos.
7. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el polinucleótido está colocado en una orientación de sentido con relación al promotor.
8. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el polinucleótido está colocado en una orientación antisentido con relación al promotor.
9. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el promotor es derivado de la región 5 ' de un gen de Rabl7 y exhibe la actividad del promotor en las plantas.
10. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además una región 3 ' derivada de un gen de Rabl7 y exhibe la actividad terminadora en las plantas .
11. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el promotor comprende aproximadamente 100-1649 nucleótidos contiguos del ADN, en donde los nucleótidos contiguos del ADN tienen desde 85 % hasta 100 % de identidad con respecto a aproximadamente 100 hasta 1649 nucleótidos contiguos del ADN que tienen la secuencia de la SEC ID NO. 42.
12. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico es capaz de conformarse en un ARN de doble hebra.
13. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico comprende el AR? co-supresor.
14. La molécula de AD? de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico comprende el ARN catalítico.
15. La molécula de AD? de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico es capaz de conformarse en un ácido nucleico triplex.
16. La molécula de AD? de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el promotor también es expresado en el tejido de la semilla.
17. Una célula vegetal, caracterizada porque comprende la molécula de AD? de conformidad con la reivindicación 1.
18. Una planta transgénica, o una parte de la misma, caracterizada porque comprende la célula vegetal de conformidad con la reivindicación 17.
19. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 comprende al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID NO. 6.
20. La planta transgénica, o una parte de la misma, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el polinucleótido de la reivindicación 1 comprende al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID NO. 6.
21. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es una planta monocotiledónea.
22. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es una planta de cebada, arroz, maíz, trigo, sorgo, caña de azúcar o centeno.
23. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es una planta de maí z .
24. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico es expresado en el tejido de la semilla.
25. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es mostrada por la SEC ID NO. 8 o la SEC ID NO. 18.
26. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el promotor también es expresado en forma desarrollada en los granos de la planta transgénica .
27. Una molécula de ADN aislado, caracterizada porque comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en el tejido vegetativo y que codifica una proteína de TPP o un anticuerpo capaz de la regulación descendente de un gen de TPP.
28. La molécula de ADN aislado de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el promotor es expresado en el tejido de la semilla.
29. Una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ARNi, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en el tejido vegetativo, caracterizada porque el RNAi es capaz de la regulación descendente de la expresión de un gen de TßPP.
30. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el polinucleótido es mostrado por la SEC ID NO. 6.
31. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el polinucleótido comprende al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID NO . 6.
32. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el polinucleótido es un complemento para los 21 pares base consecutivos.
33. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el promotor es derivado de la región 5' de un gen de Rabl7 y exhibe una actividad promotora en las plantas.
34. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende una región 3 ' derivada de un gen de Rabl7 y exhibe una actividad terminadora en las plantas .
35. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el promotor comprende aproximadamente 100-1649 nucleótidos contiguos de ADN, en donde los nucleótidos contiguos de ADN tienen desde 85 % hasta 100 % de identidad con respecto a aproximadamente 100 hasta 1649 nucleótidos contiguos de ADN que tienen la secuencia de la SEC ID NO. 42.
36. Una célula vegetal, caracterizada porque comprende la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 29.
37. Una planta transgénica, o una parte de la misma, caracterizada porque comprende la célula vegetal de conformidad con la reivindicación 36.
38. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el polinucleótido de la reivindicación 29 comprende al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID NO. 1.
39. La planta transgénica, o una parte de la misma, de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el polinucleótido de la reivindicación 29 comprende al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID NO. 6.
40. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la planta es una planta monocotiledónea.
41. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque es una planta de cebada, arroz, maíz, trigo, sorgo, caña de azúcar o cebada .
42. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque es mostrada por la SEC ID NO. 8 o la SEC ID NO. 18.
43. Un método para incrementar el contenido de almidón en el grano de una planta, caracterizado porque comprende las etapas de : a) transformar una célula vegetal con la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1; b) generar una planta a partir de la célula vegetal; c) inducir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 1 en el tejido vegetativo de la planta cuando la planta es sometida a condiciones de sequía durante su etapa reproductiva; y d) incrementar el contenido de almidón en el grano comparado con el contenido de almidón en el grano de una planta isogénica que no contiene la molécula de ADN cuando la planta transgénica y la planta isogénica se hacen crecer substancialmente bajo las mismas condiciones de sequía.
44. El método para incrementar el contenido de almidón en el grano de una planta de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el promotor es endógeno con respecto a las especies de las plantas.
45. El método para incrementar el contenido de almidón en el grano de una planta de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el promotor comprende la región reguladora 5' no codificante de un gen de Rabí7.
46. El método para incrementar el contenido de almidón en el grano de una planta de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la secuencia de ácidos nucleicos comprende además la región no codificante del terminador 3 ' de un gen de Rabl7. 47. Una planta transgénica, caracterizada porque es preparada por el método de conformidad con la reivindicación 43. 48. Semillas transgénicas, caracterizadas porque son derivadas de la planta de conformidad con la reivindicación
47. 49. Una molécula de ácido nucleico de interferencia, corta, de doble hebra ( siARN) , que regula descendentemente la I expresión de un gen de T6PP en el tejido vegetativo de una planta, caracterizada porque la molécula de siARN comprende al menos aproximadamente 21 pares base. 50. La molécula de siARN de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque una de las hebras de la molécula de siARN de doble hebra comprende una secuencia de nucleótidos substancialmente semejante a la secuencia de nucleótidos de un gen de TßPP o una porción del mismo y, en donde la segunda hebra de la molécula de siARN de doble hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una secuencia de nucleótidos de la primera hebra. 51. La molécula de siARN de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque es codificada por al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID ?O. 6. 52. La molécula de siARN de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque comprende ribonucleótidos . 53. Una molécula de AD? aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducido por la sequía en el tejido vegetativo, caracterizada porque el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de TßPP. 54. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el polinucleótido es mostrado por la SEC ID NO. 6. 55. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el polinucleótido comprende al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID NO . 6. 56. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el polinucleótido está colocado en una orientación de sentido con relación al promotor . 57. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el polinucleótido está colocado en una orientación de antisentido con relación al promotor. 58. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el polinucleótido es un complemento para los 21 pares base consecutivos. 59. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el polinucleótido está colocado en una orientación de sentido con relación al promotor. 60. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el polinucleótido está colocado en una orientación de antisentido con relación al promotor . 61. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el promotor es derivado de la región 5 ' de un gen de Rabl7 y exhibe la actividad del promotor en las plantas. 62. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque comprende además una región 3 ' derivada de un gen de Rabl7 y exhibe la actividad terminadora en las plantas . 63. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el promotor comprende aproximadamente 100-1649 nucleótidos contiguos del ADN, en donde los nucleótidos contiguos del ADN tienen desde 85 % hasta 100 % de identidad con respecto a aproximadamente 100 hasta 1649 nucleótidos contiguos del ADN que tienen la secuencia de la SEC ID NO. 42. 64. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el ácido nucleico es capaz de conformación en un ARN de doble hebra. 65. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el polinucleótido comprende el ARN co-supresor. 66. La molécula de AD? de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el polinucleótido comprende el ARN catalítico. 67. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el polinucleótido es capaz de conformación en un ácido nucleico triplex. 68. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el promotor también es expresado en el tejido de la semilla. 69. Una célula vegetal, caracterizada porque comprende la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53. 70. Una planta transgénica, o una parte de la misma, caracterizada porgue comprende la célula vegetal de conformidad con la reivindicación 69. 71. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 53 comprende al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID No. 6. 72. La planta transgénica, o una parte de la misma, de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 53 comprende al menos aproximadamente 21 pares base consecutivos de la SEC ID NO. 6. 73. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque la planta es una planta monocotiledónea. 74. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque es una planta de cebada, arroz, maíz, trigo, sorgo, caña de azúcar o centeno. 75. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque es una planta de maíz . 76. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el ácido nucleico es expresado en el tejido de la semilla. 77. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque es mostrada por la SEC ID NO. 8 o la SEC ID NO. 18. 78. Un método para incrementar el contenido de almidón en el grano de una planta, caracterizado porque comprende las etapas de: a) obtener una planta que comprende la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1; b) hacer crecer la planta bajo condiciones de sequía; c) inducir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 1 en el tejido vegetativo de la planta cuando la planta es sometida a condiciones de sequía durante su etapa reproductiva; y d) incrementar el contenido de almidón en el grano de la planta comparado con el contenido de almidón en el grano de una planta isogénica que no contiene la molécula de ADN cuando la planta y la planta isogénica se hacen crecer bajo substancialmente las mismas condiciones de sequía. 79. Una molécula de ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica un ácido nucleico, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor que es inducible por la tensión en el tejido vegetativo de una planta y expresado de manera desarrollada en los granos de la planta, caracterizada porque el ácido nucleico es capaz de la regulación descendente de un gen de T6PP.