CN103261421B - 镉含量降低的烟草 - Google Patents

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Abstract

一种烟草植物，包括：在HMA基因中的至少一个突变，其中未突变的HMA基因包括SEQ？ID？NO：1的核苷酸序列或同源序列，其中，所述突变导致由所述核苷酸序列编码的多肽中的至少一个氨基酸的取代或缺失或插入，且其中，相对于包括SEQ？ID？NO：1或同源物的植物的重金属吸收，所述突变使植物的叶子的重金属吸收降低至少30％。

Description

镉含量降低的烟草
背景技术
重金属天然存在于土壤中，并且以不同程度被植物吸收。一些重金属，例如锰或锌对于植物是必需的，这是由于它们充当酶活性所需的辅助因子。
然而，其他重金属对于植物不是必需的，而且，在一些情况下，植物或者植物的部分的重金属浓度的降低是有利的。例如，镉(Cd)是存在于土壤中的非必需重金属并且被植物的根部自然吸收。Cd在叶子中积累，例如在烟草植物(tobaccoplant)的叶子里积累(Lugon-Moulin等，2006)。在一些地方中，由于富Cd磷肥的使用以及镉污染的污泥，土壤中的Cd浓度增加(Karaivazoglou等，2007)。已经描述了植物对于重金属的吸收、分配以及积累的机制(Verbruggen等人，2009)。
降低烟草植物叶子的重金属含量是有利的，并且已经开发了产生这种结果的不同策略。
例如，在35S启动子的控制下，在烟草中表达哺乳动物的金属硫蛋白基因，引起在田间栽培的植物中的镉降低14％(Yeargan等，1992)或者在叶片中73％镉的降低量来改变的镉的组织分布(Dorlhac等，1998)。最近，来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的高容量二价转运体AtCAX2和AtCAX4已经成功地用于提高根部液泡Cd鳌合，因此得到在田间栽培的烟草的叶片中镉降低15至25％(Korenkov等，2009)。
在已经识别了在重金属已被根部吸收之后，用于使重金属分布在植物组织中的重金属ATP酶(HMA蛋白)家族，并且已经克隆了编码各个蛋白的基因。参与Cd输送至拟南芥的叶子以及Cd在叶子中积累的八种类型的HMA基因是已知的(Cobbet等，2003)。来自1、5、6、7和8型的拟南芥HMA为单价阳离子转运体(Cu+和Ag+；Seigneurin-Berny等，2006)，以及来自2、3和4型的HMA为二价阳离子转运体(Pb2+、Co2+、Zn2+、Cd2+；Hussain等，2004)。HMA3为在对Cd、Pb和Zn耐性中涉及的液泡转运体(Morel等人.2009)。
在其他植物中也已经识别了HMA基因，并且已经表明其用于生产转基因烟草植物，其中，通过RNAi抑制HMA基因的表达(WO2009/074325)。
然而，这些用于减少烟草植物中的重金属的方法基于转基因生物体(GMO)的应用。不基于转基因植物的方法将具有显著的优势。
突变育种已经长期用于在植物栽培种中修饰现有的遗传特征或用于产生新的有价值的遗传特征。近来，该项技术已经与高通量突变检测系统组合，并且已经证实对烟草植物的性能改变是有效的(Julio等，2008)。
现代的烟草为源自美花烟草(Nicotianasylvestris)(母本)和拟茸毛烟草(Nicotianatomentosiformis)(父本；Yukawa等，2006)的异源四倍体。烟草的四倍体性质(2n＝48)使得烟草系中的遗传特征的识别复杂化，并且烟草植物的种植显示出全新的遗传特征。
因此，仍然需要叶子的重金属含量降低的烟草植物。
发明内容
根据本发明，该问题是通过烟草植物来解决的，所述烟草植物包括HMA基因中的至少一个突变，其中，未突变的HMA基因包括SEQIDNO：1的核苷酸序列(HMA4基因的核苷酸序列)或所述SEQIDNO：1的同源物的核苷酸序列，其中所述突变导致由所述核苷酸序列编码的多肽中的至少一个氨基酸的取代或缺失或插入；并且其中，相对于包括SEQIDNO：1或同源物的植物的重金属吸收，所述突变使所述植物的叶子的重金属吸收降低至少30％。
本申请人已令人惊奇地发现：能够修饰烟草HMA4基因，使得在对植物无明显不利影响的情况下，抑制HMA4蛋白。换句话说，本发明提供能够用于商业用途的叶子中重金属含量显著降低的正常烟草植物。
根据本发明，SEQIDNO：1的序列的同源物是指与SEQIDNO：1的序列具有至少90％，优选至少95％的序列一致性的序列。相应的同源物或同源序列可体现各种烟草植物系之间或源自共同祖先的序列之间的差异。普通烟草为异源四倍体植物，并且各种植物包括来自美花烟草和拟茸毛烟草的基因。正如所显现的，SEQIDNO：1源自美花烟草，则源自拟茸毛烟草的HMA4序列代表了SEQIDNO：1的序列的同源物。源自于不同物种中存在的相似序列在本申请中也确定为同源序列，并且代表了同源序列的特殊形式。优选地，通过BLAST软件来测定一致性％，用于判定序列的一致性。
在优选的实施方式中，SEQIDNO：1的序列或同源物的序列在核酸水平上仅含有一个突变或少量突变，例如1个、2个、3个或4个核苷酸改变。因此，该突变的序列仍然与HMA4基因的序列具有至少90％，优选至少95％并且最优选至少98％的一致性。例如，该突变可为错义突变、无义突变或剪接突变。
优选地，本发明的烟草植物为普通烟草(Nicotianatabacum)植物。
根据一个方面，本发明提供相应的烟草植物，在含有重金属的液体介质中在相同条件下栽培(grow)存在所述突变和不存在所述突变的烟草植物，并且将含有所述突变的烟草植物的叶、茎或芽中的所述重金属的浓度与不含有所述突变的烟草植物的叶、茎或芽中的所述重金属的浓度对比，来确定重金属吸收的降低。优选地是，除此之外，所述植物和参照植物在相同条件下栽培。在叶，茎或芽中的重金属的浓度可确定为相对于植物干重材料的量的重金属的量。
因此，术语“重金属吸收的降低”在本发明的全文中用来描述，与不具有上述突变但是在相同条件下栽培的植物的对应组织相比，具有HMA4基因中的突变的烟草植物的叶、茎或芽中的重金属浓度的降低。
本发明涵盖了在这些情况下显示出烟草植物的组织中的重金属浓度显著降低的植物。尤其优选的是：该突变使重金属的吸收降低至少40％，至少50％，至少75％或至少95％。
根据本发明，能够对一种或几种重金属但是不是全部重金属实现吸收的降低。如果对于一种重金属实现了显著降低，这便是足够的。优选的是本发明提供显示出镉、铅或砷的吸收降低的烟草植物。在最优选的实施方式中，本发明提供具有镉的吸收降低的烟草植物。
同样地，吸收的降低不需要完全消除在植物中或植物的组织中的重金属的含量。根据本发明，优选的是：重金属含量的降低在40％至70％，50％至80％，或60％至95％的范围内。
已经识别了HMA4基因中引起重金属吸收的显著降低的几个突变，并且将在下文进行描述。相应地，突变可表示为错义突变、无义突变或剪接突变。
在一个实施方式中，本发明的烟草植物包括选自图5/1和图5/2中示出的突变中的一个的突变。在优选的实施方式中，上述烟草植物包括SIFT分数小于0.05的图5/1和图5/2中示出的突变中的一个。在最优选的实施方式中，本发明的烟草植物包括选自包括SEQIDNO：1或同源物中的以下突变的组的突变：G294A、C576T、G406A、G347A、G363A、G553A、G290A、C374T、G964A、G1168A、G1211A、G1126A、C980T、G1195T、G1156A、G1070A、C2302T、G2208A、C2217T、G2190A、C2206T或C2277T。
根据本发明的一个实施方式，上述烟草植物可包括在多于一种HMA4基因中的突变。例如，烟草植物含有来自美花烟草和来自拟茸毛烟草的HMA4基因。在两种HMA4基因中均发生突变的植物在本发明中也被识别为双突变体。
本发明的烟草植物可同型结合(homozygous)或异型结合(heterozygous)形成上述HMA4基因之一中的任意一个突变。根据尤其优选的实施方式，可提供在两种HMA4基因中含有同型结合形成的突变的植物。
在另一实施方式中，提供可源自如上所述的烟草植物的烟草植物细胞。
本发明还涉及烟草植物的部分，其中，所述部分为叶子(leaf)、叶片(lamina)、剪叶(cut)和/或干叶(curedleaf)、根、芽、茎、花或种子。此外，对于本发明的所有目的，优选地，所述烟草植物的部分为普通烟草植物的一部分。如上所述烟草植物的种子代表了本发明的尤其优选的实施方式。
本发明的烟草植物或烟草植物的部分可被用于生产本领域熟知的烟草产品，包括如口含烟、鼻烟的无烟烟草产品，以及烟丝，烟草提取物或再造烟草(reconstitutedtobacco)。
在替代的实施方式中，本发明的烟草植物或烟草植物的部分被用于生产也代表本发明的实施方式的吸烟制品。吸烟制品是熟知的并且包括卷烟(cigarette)、小雪茄(smallcigar)、香烟(cigarillo)或雪茄(cigar)或含有烟草的模拟吸烟制品。
在另一个方面，本发明提供一种用于生产根据本发明的烟草植物的方法。各方法可包括下列步骤：
(a)筛选通过诱变在HMA基因中得到至少一个突变的烟草植物的文库，其中未突变的HMA基因包括SEQIDNO：1的核苷酸序列(HMA4基因的核苷酸序列)或SEQIDNO：1的同源物的核苷酸序列，其中上述突变导致由所述核苷酸序列编码的多肽中的至少一个氨基酸的取代或缺失或插入，并且其中，相对于包括SEQIDNO：1或所述同源物的植物的重金属吸收，所述突变使所述植物的叶子的重金属吸收降低至少30％；
(b)将具有HMA基因中的突变的烟草植物与商业的普通烟草生产植物杂交；以及
(c)识别具有所述HMA基因中的突变的子代；
(d)重复步骤(b)和(c)。
如上，通过在含有重金属的液体介质中在相同条件下栽培存在和不存在上述突变的烟草植物，并且将含有上述突变的烟草植物的叶、茎或芽的重金属的浓度与不含有上述突变的烟草植物的叶、茎或芽的重金属的浓度对比，来确定重金属吸收的降低。
优选地，本发明的方法使重金属吸收降低至少30％、至少50％、至少75％或至少95％。
该方法可被用于降低一种或几种重金属的吸收。优选的是，降低镉、铅或砷的吸收。
根据优选的实施方式，该方法的步骤(a)和/或(c)采用分析烟草(普通烟草)植物的核苷酸序列的试验。用于核苷酸分析的各种试验是分子生物学领域中熟知的，并且包括基于PCR的技术、DNA测序、杂交和/或RFLP技术。
本发明进一步提供一种用于生产烟草产品或吸烟制品的方法，所述方法包括如上所述的生产烟草植物的方法。通过进一步收获叶、茎和/或芽并且由它们生产烟草产品或吸烟制品来由根据该方法生产的植物得到烟草产品或吸烟制品。
附图说明
图1：普通烟草、美花烟草和拟茸毛烟草中的A部分扩增的部分序列比对。
第一序列为基准叠连群(contig)。在该比对中，存在三种不同序列：普通烟草和美花烟草之间共有序列1、2、3、9、10、11。普通烟草和拟茸毛烟草之间共有序列6、7、8、12、13、14、15、16。序列4和5是美花烟草特有的。
图2：普通烟草中的HMA直系同源物的拷贝1和2的dscDNA扩增。
设计在A部分的外显子区域中退火的特异性引物被用于测试根部(R)和芽(S)中的两个拷贝的表达。HmaAS-F/HmaA-RT-R引物对扩增美花烟草来源的序列(拷贝S)以及HmaAT-F/HmaA-RT-R引物对扩增拟茸毛烟草来源的序列(拷贝T)。在普通烟草中表达这两个拷贝。
图3：全叠连群序列(SEQIDNO：1)的CODDLE分析。
第一行：HMA4蛋白的氨基酸序列
第二行：HMA4基因的DNA序列
第三行：各个核苷酸下方为能够用EMS诱变检测的改变的指示。
图4：用引物Hma4-BF/Hma4-BR来PCR扩增DNA突变体库(collection)得到的CE-SSCP谱图。
用FAM荧光团标记HmaA4-BF引物，并且DNA链显示为蓝色。由VIC荧光团标记Hma-BR引物，并且DNA链显示为绿色。
1：野生型DNA的DNA谱图
2：突变体DNA的DNA谱图(库的E1-276家族)，由与突变的DNA链(红箭头)对应的额外的峰来表征。
图5：总结在克隆和测序后在HMA靶点中发现的突变的表
a＝如上述库中描述的突变体家族的识别数目。
b＝如对叠连群1的CODDLE分析所述的核苷酸或氨基酸改变和突变的位置(原始核苷酸/氨基酸+位置+新核苷酸/氨基酸)。
“＝”代表同义突变，“*”代表终止密码子。
c＝对叠连群1用生物学信息学程序SIFT(来自Tolerant的SortingIntolerant)得到SIFT分数。SIFT分数＜0.05暗示对蛋白有害。
*非EMS突变(G/C至A/T)
图6：与野生型(BB16NN)相比，三种M3E1-276突变体系(276B5；276B8；278B18)中的镉含量。
在芽(A)或根部(B)中测量镉。在左侧，图代表在每g干重中镉积累(μg)。在右侧，图代表用野生型镉积累标称的(normalized)突变体中的镉积累。
芽中的镉含量：在柱状图中的字母“A”和“B”代表对这些样品进行的学生“T”分布检验中的两个不同的组别。
根部中的镉积累：在柱状图中的字母“A”表明了该图中的所有方式属于相同的统计组别。
误差柱表示标准偏差。
图7：显示出突变体的存活能力的突变体E1-276-B18和工业化烤烟烟草植物之间的F1杂交体的图片。
图8：在EMS系的芽中的镉积累(M突变的植物；Htz异型结合形成的突变体植物；S野生型植物；DW干重)。在左侧的图表示了在芽中的镉积累的量。误差柱反映标准误差。在右侧，在突变的系中的镉的积累表示为相对于其野生型的百分比。
图9：EMS系的统计分析。在该表中列出的p-值来自学生t分布检验(http://www.graphpad.com)。当p-值低于0.05(95％置信度)时，在各个突变的系和其野生型之间观察到的差异是统计上相关的。
图10：RNA转录物在RNAi系中的积累。柱状图表示了相对于参照基因亲环蛋白和L2的转录物积累，HMAα或HMAβ中任一个的转录物的积累的平均值。每个系使用3株植物。误差柱代表标准误差。字母A和B代表用开放软件“R”识别的由学生t分布检验发现的两个组别。
图11：在RNAi系的芽中的金属积累。对于各个系，分析4株植物(对于pGreen只有3株)。在顶部表示了镉积累。在左侧，用平均数来表示镉积累。在顶部右侧，这些平均数被表示为野生型的百分比。在底部，表示了在芽中的铁和锌的积累。误差柱表示标准误差。字母A和B代表用开放软件“R”识别的统计组。在各个图表中各字母是独立的。
图12：在烟草突变体之间进行杂交以在一个基因组中积累两个突变的拷贝。首先突变体与野生型回交，并且然后在它们之间杂交以得到F1代。F1名称被描述为F1CD2，以下的数字代表两种突变体鉴定。
图13：EMS系。这些系用它们所来自的库以及影响一个基因或另一个基因的突变表示。
图14：amiRNA构建物。利用在线软件得到所有的靶向序列和它们相对应的引物序列(http://www.weigelworld.org/)。
图15：发夹构建物(hairpinconstruct)的靶向序列。引物对(A)被设计用于扩增HMA基因(B)的相同部分，但是它们携带不同的限制位点。
图16：pHannibal载体。该载体含有被内含子隔开的2组限制位点。
图17：在芽中的金属积累；通过Tukey的多重比对方法得到图解结果。误差柱表示标准误差。字母A、B、C和D代表由开放软件“R”识别的用于镉分析的统计组别。
图18：在芽中的金属积累；通过Tukey的多重比对方法得到图解结果。
具体实施方式
以下实施例阐述了本发明的具体的实施方式：
实施例1
烟草突变体库
植物材料
三种烟草系BB16NN(Delon等，1999；InstitutduTabacdeBergerac，AccessionN°1139)、BY02和V4K1的种子被用于产生普通烟草突变体文库。BB16NN和BY02为白肋型烟草，以及V4K1为烤烟型烟草。
为了拷贝数目评估，比较烟草系ITB645(拟茸毛烟草)和ITB626(美花烟草)与祖先的序列。
EMS诱变
在Julio等，2008中已经描述了突变体库。简短来说，称为L1和L2的两个烟草EMS(乙基甲烷磺酸酯)突变体文库通过将烟草BB16NN种子(每个文库6000粒种子)浸泡在0.8％EMS(L1)或0.6％EMS(L2)溶液中过夜(16h)，并随后在振动下在水中进行30分钟的12次清洗来构建。此外，L1文库种子在EMS处理前，进行2天的预发芽。
由用0.7％EMS处理并且不进行预发芽的BY02(称为L3)和V4K1(称为L4)的种子来建立另外的两个库。
在温室中，诱变的M1种子生长为M1苗，并且转移至田间中以通过自花授粉来产生M2代。从各个M1植株收集M2种子并且储藏直至使用。从播种在温室中的一个罐中的8个M2种子收集叶子材料，并且合并(pooled)(每个植株两个8mm直径的圆盘，即每个家族100mg的鲜重)以构建合并的M2家族。根据制造商的说明，利用QIAGENDneasy96植物试剂盒从叶子材料中提取DNA。
实施例2
拷贝数评估
PCR扩增
在SEQIDNO：1中示出了普通烟草基因的HMA4的基因序列的一部分。
普通烟草为包括来自美花烟草和拟茸毛烟草的基因组的异源四倍体植物。表现为SEQIDNO：1源自美花烟草。
被标记为部分A、B、C和D的该HMA4基因的四个基因区域利用相应的引物对在普通烟草、美花烟草和拟茸毛烟草中扩增：
部分A-F(CTACCGCTGCTATGTCATCAC)SEQIDNO：2和
部分A-R(TAGCACACTTGTCGATGTATC)SEQIDNO：3；
部分B-F(GATACATCGACAAGTGTGCTA)SEQIDNO：4和
部分B-R(CTCCTTTAGTTATAGTCCCTG)SEQIDNO：5；
部分C-F(AGTAAATACTGAATTGTCTAGTG)SEQIDNO：6和
部分C-R(GATGTTTTATCTCTACTATGAGC)SEQIDNO：7；
部分D-F(GACCTGTTTAGCACTAATGCG)SEQIDNO：8和
部分D-R(TTATAATCATTTCAGCGTAATGCAG)SEQIDNO：9。
在含有1μlDNA，10XAmpliTaq缓冲液(AppliedBiosystems，福斯特城，美国)，1μldNTPs(AppliedBiosystems，各2.5mM)，50ng的各个引物以及0.05U的AmpliTaq聚合酶(AppliedBiosystems)的20μl体积中进行PCR扩增。利用热循环仪(PCRSystem2700，AppliedBiosystems)如下进行PCR：94℃下持续30s、62℃下持续45s、72℃下持续1分钟的35个循环，然后在72℃下持续7分钟进行最后的延展(extension)。
结果
在普通烟草、拟茸毛烟草和美花烟草中扩增SEQIDNO：1中示出的叠连群序列的四个部分。部分A近似对应于外显子4至5，部分B近似对应于外显子6，部分C近似对应于外显子7，且部分D对应于外显子8。对每个PCR产物，测序六至十个克隆体。在图1中示出了部分A中的序列比对的实例。一些序列在普通烟草和其祖先(美花烟草和拟茸毛烟草)之间是相同的；其他对于一个祖先是特异性的。结果总结在表1中，如下：
表1：在克隆和测序用引物HmaA-F/R(部分A)、HmaB-F/R(部分B)、HmaC-F/R(部分C)和HmaD-F/R(部分D)扩增的PCR产物后所得到的结果
由于每个PCR产物测序了六至十个克隆体，因此结果表示为存在的拷贝的最小数目。
n.f.＝未发现
这些结果表明了：普通烟草含有至少两个HMA4位点，一个位点来自于两个祖先中的每一个。因此，任何普通烟草植物可含有至少四个不同的HMA4等位基因。
RNA提取和双链cDNA测试
根据制造商的说明(Qiagen)利用RNeasy植物试剂盒，从两月龄的植株的根部和芽中提取RNA。根据制造商的说明利用来自Evrogen的MINTcDNA合成试剂盒来制备cDNA和dscDNA。
通过用在部分A外显子区域的基础上设计的特异性引物扩增来自普通烟草根部和芽的dscDNA来检验两个位点的表达。HmaAS-F/HmaA-RT-R用于扩增美花烟草来源的序列，并且HmaAT-F/HMA-RT-R用于扩增拟茸毛烟草来源的序列。如图2中所示，对该基因的两个拷贝(美花烟草和拟茸毛烟草)扩增各片段，这支持存在于两个位点处的序列在普通烟草的根部和芽中均有表达的结论。
在区域A中用特异性的未标记的引物对测试已表达的序列中的两个拷贝的扩增：
正向引物Hma-AS-FGGTGAATAGCATTCTTGCTGTGSEQIDNO：19；和HmaAT-F，GTTGAATAGCATTCTTGCTGTTSEQIDNO：21；以及
设计来在外显子区域中结合的新的常用的反向引物HmaA-RT-R，CTTGTTCTGAGCATCTTCGACSEQIDNO：20。
在与进行拷贝数目评估相同的条件下进行PCR。在UV下，在含EtBr(溴乙锭)的1.5％的琼脂糖凝胶上观测PCR产物。
实施例3
通过PCR筛选突变体
设计新的引物以特异性地扩增待用于筛选突变体的区域。根据三个标准来选择引物：
内含子和外显子的位置：优选外显子的区域，即使引物可被设计在基因内区域。
EMS突变对蛋白序列的高影响：通过CODDLe软件(ChoosingcodonstoOptimizeDiscoveryofDeleteriousLEsions)评估突变对蛋白功能的影响。CODDLe识别操作者选定的基因以及其编码序列(CDS)的区域，在这些区域预期的点突变最有可能对基因的功能产生有害影响(Till等，2003)。在图3中示出了对整个叠连群序列的CODDLe结果。
序列的长度：用于CE-SSCP筛选的序列的最大长度是500bp。大的序列对最大化发现突变体的机会是优选的。
设计以下新的引物对用于扩增：
区域A：HmaAS-F/HmaA-R引物对扩增美花烟草来源的序列，且HmaAT-F/HMA-R扩增拟茸毛烟草来源的序列。
区域B：HmaB-F/HmaB-R引物对。
区域D：HmaDS-F/HmaDS-R引物对扩增美花烟草来源的序列，且HmaDT-F/HmaDT-R引物对扩增拟茸毛烟草来源的序列。
通过对十个PCR产物进行克隆和测序来检查引物对的特异性。
荧光标记的引物(6-FAM(蓝色)，VIC(绿色)，NED(黄色)；均来自AppliedBiosystems)被用于毛细管电泳-单链构象多态性分析(CE-SSCP)。在与拷贝数目评估中使用的相同条件下进行PCR反应。
在区域A中用以下引物扩增两个不同的410bp拷贝：
正向引物HmaAS-F(VIC-GGTGAATAGCATTCTTGCTGTG)SEQIDNO：10；或
正向引物HmaAT-F(NED-GTTGAATAGCATTCTTGCTGTT)SEQIDNO：12；以及
常见反向引物HmaA-R(6FAM-GCACAACATAAGATTCACTAAC)SEQIDNO：11。
在区域B中用以下引物扩增一个386bp序列：
正向引物HmaB-F6FAM-GTCTGATTTCGACTGGTGATGSEQIDNO：13；以及
反向引物HmaB-RVIC-AAGAATATGTATGAGTGGTAACCSEQIDNO：14。
在区域D中用以下引物分别扩增两个283bp拷贝：
引物对HmaDT-F，6FAM-GAAATAGAGGGTGATAGTTTCCSEQIDNO：15，以及
HmaDT-R，NED-CATTTCAGCGTAATGCAGAATTTSEQIDNO：16，用于第一拷贝；
以及
HmaDS-F，VIC-GAAATAGAGGGTGATAGTTTCASEQIDNO：17，和HmaDS-R，6FAM-CATTTCAGCGTAATGCAGAATTASEQIDNO：18，用于另一个拷贝。
毛细管电泳
在CE-SSCP分析之前，在水中将荧光标记的PCR产物稀释1/20。在装载至3130(AppliedBiosystems，福斯特城，美国)之前，将1μl稀释的样品加入至10μl甲酰胺(AppliedBiosystems)和0.1μlGenescan-500LIZSizeStandard(AppliedBiosystems)中。在94℃持续3min的变性步骤后，在冰上进行冷却以用于单链构象分析。
在3130上的运行条件如下：36cm毛细管阵列(16根毛细管)，22℃的运行温度，用15s进行1kV的样品注射以及用40min进行15kV的分离。未变性的分离介质为含有EDTA(AppliedBiosystems)的1X缓冲液(10X)中的5％POP构象分析聚合物(AppliedBiosystems)，10％丙三醇(Sigma-Aldrich)。运行的缓冲液为在含有EDTA的1X缓冲液(10X)中10％丙三醇。用GeneMapper4.0(AppliedBiosystems)软件分析结果。
克隆和测序
根据制造商的说明，将PCR产物克隆到pGEM-T载体系统(Promega，麦迪逊，美国)中，并转化成E.coli。利用BigDye终止子测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems)和3130(AppliedBiosystems)，对各个家族测序十个克隆体。用Multalin比对核苷酸序列(http://npsa-pbil.ibcp.fr/NPSA/npsamultalinan.html)。
结果
在烟草的HMA4直系同源物中筛选突变体
引物用荧光标记，并且用于扩增突变体库的DNA。如上所述用CE-SSCP分析荧光标记的PCR产物。
通过与对照(未突变的烟草的DNA)相比，分析谱图上的额外的峰的存在来检测突变体。在图4中示出了采用引物Hma4-BF/Hma4-BR的实例。
对突变体的PCR产物进行克隆并测序以表征突变的位置。比对得到的序列并与对照相比较。通过SortingIntolerantFromTolerant(SIFT)程序(Ng和Henikoff2003)分析突变对蛋白功能的影响。
在Hma-AS、Hma-AT、Hma-B、Hma-DS以及Hma-DT中得到的突变的完整结果总结在图5/1和5/2示出的表中。
对于Hma-AS靶点得到19个突变，对于Hma-AT得到18个突变，对于Hma-B得到20个突变，对于Hma-DT得到11个突变，且对于Hma-DS得到3个突变。
对于Hma-AS和Hma-DT可得到无义突变。如表2中所示，同义突变和错义突变分别为总突变数的9％至33％以及61％至81％。在Hma-B靶点中可发现在剪接区域中的一个突变。可发现影响同一个氨基酸的多个突变。在Hma-AT中发现两个确定的冗余突变(redundantmutation)，在Hma-AS中发现一个冗余突变，在Hma-B中发现三个冗余突变且在Hma-DT中发现一个冗余突变。在得到的71个突变中观察到2个颠换(transversion)(2.8％)(代替经过EMS处理预期的G/C至T/A的转变)。
总数 同义 错义 无义 基因内区 剪接
Hma-AS 19 31，6 63，2 5，3 0，0 0，0
Hma-AT 21 22，2 57，1 0，0 9，5 0，0
Hma-B 20 20，0 70，0 0，0 5，0 5，0
Hma-DT 11 9，1 81，8 9，1 0，0 0，0
Hma-DS 3 33，3 66，7 0，0 0，0 0，0
表2：根据靶点和突变类型的突变百分比
实施例4
重金属迁移
无土栽培
在温室的土壤中栽培选择的M2EMS系以得到同型结合形成的突变体的种子。从2月龄的植株中提取DNA用于通过CE-SSCP基因分型。使上述同型结合形成的突变体系自花授粉以得到同型结合形成的突变体种子(M3)。M3种子在用源自荷格伦特的溶液(KNO32.5mM；NaH2PO40.5mM；Ca(NO3)22.5mM；MgSO40.5mM；FeNaEDTA0.1mM；H3BO350μM；MnSO450μM；ZnSO415μM；MoO4Na23μM；KI2.5μM；CuSO450μM；CoCl244μM)浸泡的Whatman纸上发芽。3周后，将植株转移至源自荷格伦特的溶液培养基中，并在溶液培养基中生长持续2周。用最终浓度为10μM的CdCl2补给该溶液培养基。在处理一周后，将植株切成两个部分，即根部和芽，并分别收获。
温室测试
在Whatman纸上播种M2系直至发芽，并且将30株突变体幼苗转移至浮动盘(20cmx30cm)中，在该盘中随便放置有5株对照植株(未诱变的原始系)。从1月龄的植株中提取DNA用于CE-SSCP基因分型，从而表征HMA突变的同型结合形成的植株，异型结合形成的植株和野生型植株。在一个半月之后，用最终浓度为1μM至5μM的CdCl2补充溶液培养基。在处理的一周后，用CaCl2(1mM)冲洗根部，并且将植株切成三个部分：根部，茎和芽。根据它们的基因型以每个基因型四株植株来合并样品。
通过ICP-MS检测镉
将样品在80℃下干燥72小时，并测量干重。在75℃下在盐酸(1mM)中提取金属含量1小时。
用安捷伦(7500cx系列)的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)来进行盐酸中的金属含量定量(dose)。基于粒子的质荷比来分析离子(Newman，1996)。该技术已经在许多领域中用于痕量元素的分析(例如Kelly等，2002)并且能够检测低至10ppt的痕量镉。
定量溶液的浓度乘以稀释因子(这给出样品中的金属的量)并除以样品质量来得到镉含量。在芽中的金属的量除以整个植株中的金属的量(在根部的金属加上在芽中的金属)来得到转移率。
统计分析
对于各个系，计算平均值和标准偏差。使用统计学软件“R”来进行学生“T”分布检验以比较这些均值(http://www.r-project.org/)。
实施例5
突变回交至骨干系
含有目的突变的突变体与原始未诱变的植株回交，以去除基因组剩余部分中存在的额外的突变，而与镉转移无关。在图7中示出了工业化的烤烟型烟草和E1-276-B18突变体的F1杂交的实例。在浮动床的温室中栽培来自库和骨干系的突变体。提取每个突变体家族的30株植株的DNA，并通过CE-SSCP进行分析。将异型结合形成的植株和骨干系一起转移至5升的罐中。在开花后，将突变体的花粉转移至已经清除了雄蕊的原始系(BB16NN，BY02或V4K1)的花上。通过回交的突变体植株(BCxS1和BCxS2)的自花授粉的两个循环固定突变之前，可进行几个循环的回交(BC1，BC2......)。
实施例6
重金属迁移
无土栽培
A.突变体E200K
用BB16NN库的E1-276系中序列的B区域中的突变E200K来进行实验。使同型结合形成的M2突变体系自花授粉以得到同型结合形成的突变体种子(M3)。在M3幼苗上进行该实验。
结果
同型结合形成的M3E1-276突变体系中的镉含量显著降低。图6描述了在根部和芽中所得到的关于镉积累的结果。在芽中，镉含量降低至不同的程度，且与野生型相比，在本发明的系中可降低超过50％。如图6可见，例如，镉含量在芽中降低超过60％，在一些植株中甚至超过70％。
B.突变体E3-277
用同型结合形成突变体E3-277的植株进行关于Cd和Zn的吸收的进一步的实验。
结果
在以下的表3中示出了结果，并且显示出与对照植株相比，同型结合形成的E3-277植株中的镉含量显著降低，而Zn的含量略微降低。
表3：与野生型系E3-277和BB16NN对照系相比，同型结合形成的E3-277突变系中的镉和锌含量
实施例7
在该实施例中，测试普通烟草植物的芽的镉吸收。这些芽来自在源自美花烟草的HMA4基因中突变的或在源自拟茸毛烟草的HMA4中突变的经EMS处理的植物系。
还测试了转基因普通烟草植物的芽的镉吸收。这些转基因植物系表达设计用于使两个HMA4基因中的一个或两个沉默的RNAi构建体。
材料和方法
EMS系
在图13中总结了在该实施例中分析的所有的EMS系。在测试的系中，在源自美花烟草的HMA4基因中突变的有3个系(在图13中标记为α基因)，并且2个系在源自拟茸毛烟草的HMA4中携带突变(在图13中标记为β基因)。
将系90和425回交两次。回交使额外突变的量降低了75％。
将系277回交一次，但是对于该系，此突变存在于在异型结合的状态中。所有的其他系携带同型结合形成的突变。这些其他系不进行回交。
利用上述方案在镉的存在下，栽培所有的系，除了在该实施例中，镉的浓度为1μM而不是10μM。在还含有相应野生型植物(即，在基因组中携带相同组别的额外突变但是在相应的HMA基因中缺乏突变的植物)的槽里培养各个系。
转基因系
1)RNAi构建体
根据在Ossowski等，2008中描述的方法制备五个amiRNA构建体。使用在线资源(http://www.weigelworld.org/)来选择靶向序列并设计相应的引物。在图14中表示结果。
在含有“70S启动子”(其中一些增强区域重复的35S启动子)和终止子(rbos)的载体中亚克隆amiRNA。将启动子-amiRNA-终止子构建体插入至允许原位(inplanta)表达的二元载体中(pGreen)。
2)发夹构建体(hairpinconstruct)
设计发夹构建体以使两个HMA4基因沉默。图15中描述了靶向序列和用于扩增该靶向序列的引物。将这些序列克隆到pHannibal载体中(图16)。pHannibal含有合适的限制位点以在正义链方向和反义链方向克隆靶向序列。
然后，将得到的发夹构建体亚克隆两次，并插入至带有用于amiRNA构建体的相同启动子和终止子的pGreen载体。
3)植物转化
用如Horsch等，1984中所述的五种amiRNA构建体、发夹构建体以及空白pGreen载体转化植物。
4)生长条件
测试的转基因RNAi系为在植物转化后再生的植物的子代。
在与用于液体培养的相同的但是用1％琼脂增补的源自荷格伦特的培养基上培养RNAi系。通过在每升培养基中加入200mg的潮霉素来消除通过种族隔离(segregation)丢失它们的构建体的植物。在选定的培养基上栽培两周后，转移植物至含有浓度为1μM的镉的培养基上。
在含有镉的培养基上培养两周后，收集植物材料。在液氮中冷冻约1g的根部以通过qPCR分析转录物积累。将芽放置在一旁用于通过ICP-MS进行金属含量的分析。
5)RNA提取和cDNA合成
利用研钵和杵捣碎根部。利用Rneasy试剂盒(Qiagen)结合DNase的可选步骤得到RNA。根据制造商所述，用M-MLV逆转录酶来进行cDNA合成。
6)Q-PCR分析
利用Roche480Lightcycler(罗氏)进行分析。用于扩增α基因(Fw-ACAAAGTGCTCGGACACCAA；Rev-CTTCTCGGTTGCAGAGTCCT)或β基因(Fw-ACAAAGTGCTCGGACACCAA；Rev-CTTCTCGGTTGCAGAGTCTA)的引物对被设计用于特异性扩增靶向基因，而不是其同源物。利用其中被引物靶向的区域经克隆的载体测试引物的特异性和有效性。
利用亲环蛋白基因(Fw-CTCTATGCCGACACCGTTCC；Rev-TCACACGGTGGAAGGTTGAG)以及L2基因(Fw-GGCGAAATGGGTCGTTTGATC；Rev-CGTTCCGTTCGCCGAAGTCG)标称该结果。这两个参照基因选自在Nicot等，2005中描述的基因。
结果
EMS系
在五个测试系的三个中，芽中的镉的积累降低非常显著，即，超过50％(图8示出了选出的实施例)。这些结果利用学生t分布检验统计学地证实了系277和425(图9)。
RNAi系
1.在根部中的转录物积累
在图10中展示了通过qPCR测量的转录物积累。与表达空白载体的系相比，对发夹系观察到转录物水平没有减少。
然而，对6a中的两个基因以及对系11b中的源自拟茸毛烟草的HMA4基因均观察到了HMA4转录物的积累的减少。在不同的统计组中的表达水平，野生型植物的表达水平。
2.在芽中的金属积累
镉的积累在所有分析的转基因系中降低(图11)。在系6b和发夹中降低超过40％。在系6a和11b中降低超过60％。对这些样品进行的学生t分布检验示出了：与野生型植物相比，在系6a和11b中观察到的差异是显著的。在不同系之间未检测到关于镉积累和锌积累的统计学差异。
结论
该实施例证实了：两个HMA基因对芽中的镉积累起作用。通过使HMA4基因中的一个沉默能容易实现镉积累的显著降低。通过使这两个基因沉默，可得到镉积累的进一步降低。
实施例8
在该实施例中，分析并比较几株植株的芽中的镉积累。为此，将系90、416、276和425回交两次并通过自花授粉固定以得到选择形成突变(M)或无突变(W)的BC2S2植物。因此，在该实施例中鉴定为野生型植物(或W)的植物为也进行了EMS处理并在它们的基因组中携带相同组的额外突变但在相应的HMA基因中缺少突变的植物。
首先，将种子灭菌并直接播种在试管内(invitro)的固体培养基中。这些系在含有1μM镉的带有琼脂的源自荷格伦特的培养基上生长。源自荷格伦特的培养基含有0.1nMFe和15μMZn。
分析突变体系(M)、异型结合形成的突变体系(Htz)以及相应的野生型(S)系。这些实验也包括对照植物BB16NN或BY02(C)(野生型，工业化种子)以及烟草RNAi系(如实施例7中描述得到)。
如前所述，在一个月后收集叶子并且提取金属。对每个基因型的4至12株植物进行Cd、Zn、Fe的分析。
结果
在图17和图18中示出了上述结果，并且证实了那些植物在芽中具有的镉量显著降低(图17B)。同时，能够表示出：这些植物仍然能够吸收对于植物生长必需的金属，诸如Fe和Zn(图18)。
结论
该实施例证实了根据本发明使HMA基因沉默并不会对植物生长和发育所需的金属的吸收具有负面影响。
实施例9
为了开发在叶中具有的镉含量降低的商业化烟草种类，在不同烟草突变体之间进行杂交。具体地，在来自美花烟草的HMA4基因中具有突变的植物与在来自美花烟草的HMA4基因中具有突变的植物杂交。
为此，两种突变体均与骨干系回交以消除剩余的基因组中载有的会导致子代繁殖力问题的突变。然后，使所得到的BC1植物杂交，以得到F1家族，以异型结合的状态进行两次突变的拷贝。在图12中描述了所有的F1杂交体。
从突变体之间杂交产生的F1植物将经自花授粉得到F2代，其中将存在包括同型结合形成的两种突变型拷贝/或野生型拷贝的植物。这些植物可回交至骨干系，以得到同型结合形成的双突变商业植物系。
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Claims (5)

1.一种烟草产品，所述烟草产品为烟丝、烟草提取物或再造烟草，或为无烟烟草产品，
其中，所述烟草产品是由普通烟草植物或普通烟草植物的一部分生产的，
其中，所述普通烟草植物或其一部分包括HMA基因中的至少一个突变，
其中，未突变的HMA基因由SEQIDNO:1的核苷酸序列组成，其中的突变导致由所述核苷酸序列编码的多肽中的至少一个氨基酸的取代或缺失或插入；并且
其中，相对于包括SEQIDNO:1的植物的镉吸收，所述突变使植物的叶子的镉吸收降低至少30％，
其中，所述突变选自在SEQIDNO:1中的突变的组：C576T、G406A、G1168A、C2217T或C2277T。
2.根据权利要求1所述的烟草产品，其中，所述无烟烟草产品是口含烟或鼻烟。
3.根据权利要求1或2所述的烟草产品，其中，所述植物同型结合形成所述HMA4基因中的突变。
4.根据权利要求1或2所述的烟草产品，其中，所述产品是吸烟制品。
5.根据权利要求4所述的烟草产品，所述吸烟制品为卷烟、小雪茄、香烟、雪茄或含有烟草的模拟吸烟制品。
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