ES2574311T3

ES2574311T3 - Tabaco con contenido de cadmio reducido

Info

Publication number: ES2574311T3
Application number: ES11761618.5T
Authority: ES
Inventors: Emilie Julio; Francois Dorlhac De Borne; Victor Hermand
Original assignee: Societe Nationale dExploitation Industrielle des Tabacs et Allumettes SAS
Current assignee: Societe Nationale dExploitation Industrielle des Tabacs et Allumettes SAS
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2011-09-28
Publication date: 2016-06-16
Anticipated expiration: 2031-09-28
Also published as: EP2622081B9; EP2622081B1; US20140311502A1; EP2622081A1; WO2012041913A1; CN103261421A; PL2622081T3; CN103261421B

Abstract

Planta de tabaco que comprende por lo menos una mutación en un gen HMA, en la que el gen HMA no mutado comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº:1 o una secuencia homóloga con una identidad de por lo menos 90% respecto a la secuencia de SEC ID nº:1, en la que la mutación provoca una sustitución o una supresión o una inserción de por lo menos un aminoácido en el polipéptido codificado por la secuencia nucleotídica y en la que la mutación reduce la absorción de metal pesado por las hojas de la planta en por lo menos 30% en relación con la absorción de metal pesado de plantas que comprenden SEC ID nº:1 o la homóloga.

Description

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DESCRIPCION

Tabaco con contenido de cadmio reducido.

Los metales pesados estan presentes de forma natural en el suelo y son absorbidos por las plantas en grados diferentes. Algunos metales pesados, tales como manganeso o cinc, son esenciales para las plantas, puesto que representan cofactores requeridos para la actividad enzimatica.

Sin embargo, otros metales pesados no son esenciales para las plantas, y en algunos casos seria ventajosa una reduccion en la concentracion de metales pesados de plantas o partes de las plantas. Por ejemplo, el cadmio (Cd) es un metal pesado no esencial presente en el suelo y absorbido de forma natural por las raices de las plantas. Cd se acumula en las hojas, por ejemplo en hojas de plantas de tabaco (Lugon-Moulin et al., 2006). En algunos lugares, las concentraciones de Cd en el suelo estan incrementadas debido al uso de fertilizantes de fosfato ricos en Cd o lodos de aguas residuales contaminados con Cd (Karaivazoglou et al., 2007). Se han descrito los mecanismos usados por las plantas para la absorcion, reparto y acumulacion de metales pesados (Verbruggen et al., 2009).

Seria ventajoso reducir el contenido de metales pesados de las hojas de plantas de tabaco, y se han desarrollado diferentes estrategias que conducen a este resultado.

Por ejemplo, un gen de metalotioneina de mamifero bajo el control del promotor 35S se expreso en tabaco, provocando una disminucion de 14% de cadmio en planta que se hace crecer en el campo (Yeargan et al., 1992) o una distribucion tisular alterada del cadmio con una reduccion del 73% de cadmio en la lamina (Dorlhac et al., 1998). Mas recientemente, se han usado con exito antiportadores divalentes de capacidad elevada, AtCAX2 y AtCAX4, de Arabidopsis thaliana para potenciar el secuestro de Cd de las vacuolas de la raiz, obteniendo asi una disminucion de 15-25% de Cd en la lamina de tabaco que se hace crecer en el campo (Korenkov et al., 2009).

Se ha identificado una familia de ATPasas de metales pesados (proteinas HMA) responsables de distribuir metales pesados en los tejidos vegetales despues de que los metales han sido absorbidos, y se han clonado los genes que codifican las proteinas respectivas. Se conocen ocho tipos de genes HMA implicados en el transporte de Cd hacia y la acumulacion de Cd en las hojas de Arabidopsis thaliana (Cobbet et al., 2003). En A. thaliana, las HMA del tipo 1, 5, 6, 7 y 8 son transportadores de cationes monovalentes (Cu+ y Ag+; Seigneurin-Berny et al., 2006), y las HMA del tipo 2, 3 y 4 son transportadores de cationes bivalentes (Pb2+, Co2+, Zn2+, Cd2+; Hussain et al., 2004). HMA3 es un transportador vacuolar implicado en la tolerancia a Cd, Pb y Zn (Morel et al. 2009).

Los genes HMA tambien se han identificado en otras plantas, y se ha sugerido como generar plantas de tabaco geneticamente modificadas, en las que la expresion de un gen HMA esta inhibida por ribointerferencia (iARN) (documento WO2009/074325).

Sin embargo, estos enfoques para reducir metal pesado en plantas de tabaco se basan en el uso de organismos geneticamente modificados (GMO). Un enfoque que no se base en plantas geneticamente modificadas tendria ventajas significativas.

El cultivo de mutacion se ha usado desde hace mucho tiempo para modificar rasgos existentes o para crear nuevos rasgos valiosos en una variedad de cultivo vegetal. Recientemente, esta tecnica se ha combinado con un sistema de deteccion de mutaciones de alto rendimiento y ha demostrado ser eficiente para la modificacion de propiedades en plantas de tabaco (Julio et al., 2008).

El tabaco moderno es un alotetraploide de Nicotiana sylvestris (contribuyente materno) y Nicotiana tomentosiformis (contribuyente paterno; Yukawa et al., 2006). La naturaleza tetraploide del tabaco (2n = 48) complica la identificacion de rasgos en lineas de tabaco y la preparacion de plantas de tabaco que muestren rasgos completamente nuevos.

De este modo, todavia existe la necesidad de plantas de tabaco con contenido reducido de metales pesados en las hojas.

Segun la presente invencion, este problema se resuelve mediante plantas de tabaco que comprenden al menos una mutacion en un gen HMA, en las que el gen HMA no mutado comprende la secuencia nucleotidica de SEC ID NO:1 (secuencia nucleotidica del gen hMa 4) o un homologo de la misma, en las que la mutacion provoca una sustitucion o una supresion o una insercion de al menos un aminoacido en el polipeptido codificado por la secuencia nucleotidica, y en las que la mutacion reduce la absorcion de metales pesados por las hojas de la planta en al menos 30% en relacion con la absorcion de metales pesados de plantas que comprenden SEC ID NO:1 o el homologo.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que un gen HMA 4 del tabaco se puede modificar de manera que la proteina HMA 4 se inhibe sin efectos perjudiciales significativos para las plantas. En otras palabras, la presente invencion proporciona plantas de tabaco normales que se pueden usar para fines comerciales con contenido significativamente reducido de metales pesados en las hojas.

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Segun la presente invencion, un homologo de la secuencia de SEC ID NO:1 se refiere a una secuencia con al menos 90%, preferentemente por lo menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de SEC ID NO:1. Las secuencias de los homologos o secuencias homologas respectivas pueden representar diferencias entre diversas lineas de plantas de tabaco o secuencias derivadas de un ancestro comun. N. tabacum es una planta alotetraploide, y cada planta contiene un genoma de Nicotiana sylvestris y Nicotiana tomentosiformis. Puesto que parece que SEC ID NO:1 deriva de N. sylvestris, la secuencia de HMA 4 derivada de N. tomentosiformis representa un homologo de la secuencia de SEC ID NO:1. Secuencias similares derivadas presentes en especies diferentes tambien se identifican en esta solicitud como secuencias ortologas, y representan una forma especifica de una secuencia homologa. El % de identidad se determina preferentemente mediante el software de BLAST para determinar la identidad de secuencia.

En una forma de realizacion preferida, la secuencia de SEC ID NO:1 o del homologo contiene solamente una o un numero pequeno de mutaciones a nivel del acido nucleico, por ejemplo 1, 2, 3 o 4 cambios nucleotidicos. La secuencia mutada tiene aun de este modo una identidad de al menos 90%, preferentemente por lo menos 95%, y todavia mas preferentemente por lo menos 98% con la secuencia del gen HMA 4. La mutacion puede ser, por ejemplo, una mutacion de sentido alterado, una mutacion sin sentido, o una mutacion de corte y empalme.

Las plantas de tabaco de la presente invencion son preferentemente plantas de Nicotiana tabacum.

Segun un aspecto, la presente invencion proporciona plantas de tabaco respectivas, en las que la reduccion de la absorcion de metales pesados se determina haciendo crecer plantas de tabaco con y sin la mutacion en condiciones identicas en un medio liquido que contiene el metal pesado y comparando la concentracion del metal pesado en la hoja, tallo o brote de la planta de tabaco con la mutacion con la concentracion del metal pesado en la hoja, tallo o brote de la planta de tabaco que no tiene la mutacion. Se prefiere que la planta y la planta de referencia se hagan crecer de otro modo en las mismas condiciones. La concentracion del metal pesado en la hoja, tallo o brote se puede identificar en cantidad de metal pesado en relacion con la cantidad de material de peso seco de la planta.

La expresion “reduccion de la absorcion de metales pesados” se usa por lo tanto en el contexto de la presente invencion para describir una reduccion en la concentracion de metales pesados en una hoja, tallo o brote de una planta de tabaco que presenta una mutacion en el gen HMA 4 en comparacion con el tejido correspondiente de una planta que no presenta la mutacion pero que se ha hecho crecer de otro modo en las mismas condiciones.

La invencion comprende las plantas que en estas circunstancias muestran una reduccion significativa de la concentracion de metales pesados en tejidos de una planta de tabaco. Se prefiere particularmente que la mutacion reduzca la absorcion de un metal pesado en por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 75%, o por lo menos 95%.

Segun la presente invencion, se puede lograr una reduccion de la absorcion para uno o varios metales pesados, pero no se tiene que lograr para todos los metales pesados. Es suficiente si se logra una reduccion significativa para un metal pesado. Se prefiere que la invencion proporcione plantas de tabaco que muestran una absorcion reducida de cadmio, plomo o arsenico. En su forma de realizacion mas preferida, la presente invencion proporciona plantas de tabaco que tienen una absorcion reducida de cadmio.

De forma similar, la reduccion de la absorcion no necesita eliminar completamente el contenido del metal pesado en la planta o tejido vegetal. Segun la presente invencion, se prefiere que la reduccion del contenido de metales pesados se encuentre en el intervalo de 40% a 70%, 50% a 80%, o 60% a 95%.

Se han identificado varias mutaciones en el gen HMA 4 que provocan una reduccion significativa de la absorcion de metales pesados, y se describen a continuacion. En consecuencia, la mutacion puede representar una mutacion de sentido alterado, una mutacion sin sentido, o una mutacion de corte y empalme.

En una forma de realizacion, las plantas de tabaco de la presente invencion comprenden una mutacion seleccionada de una de las mutaciones mostradas en la figura 5/1 y figura 5/2. En una forma de realizacion preferida, las plantas de tabaco comprenden una de las mutaciones mostradas en la figura 5/1 o 5/2 con una puntuacion SIFT menor que 0,05. En la forma de realizacion mas preferida, las plantas de tabaco de la presente invencion comprenden una mutacion seleccionada de entre el grupo que comprende las mutaciones: G294A, C576T, G406A, G347A, G363A, G553A, C374T, G290A, G964A, G1168A, G1211A, G1126A, C980T, G1195T, G1156A, G1070A, C2302T, G2208A, C2217T, G2190A, C2206T o C2277T en SEC ID NO:1 o el homologo de la misma.

Segun una forma de realizacion de la presente invencion, las plantas de tabaco pueden comprender una mutacion en mas de un gen HMA 4. Como se indico, las plantas de tabaco contienen genes HMA 4 procedentes de N. Sylvestrisand y de N. tomentosiformis. Las plantas que estan mutadas en ambos genes HMA 4 tambien se identifican como mutantes dobles en la presente invencion.

Las plantas de tabaco de la presente invencion pueden ser homocigotas o heterocigotas para una mutacion

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cualquiera en uno de los genes HMA 4. Segun una forma de realizacion particularmente preferida, se proporcionan plantas que contienen mutaciones homocigotas en ambos genes HMA 4.

La presente invencion tambien se refiere a una parte de una planta de tabaco como se describe anteriormente, en la que la parte es una hoja, una lamina, una hoja cortada y/o curada, raiz, brote, tallo, flor o semilla. Nuevamente, en el contexto de la presente invencion, la parte de una planta de tabaco es preferentemente una parte de una planta de Nicotiana tabacum. La semilla de una planta de tabaco como se describe anteriormente representa una forma de realizacion particularmente preferida de la presente invencion.

Las plantas de tabaco de la presente invencion, o sus partes, se pueden usar para generar productos de tabaco bien conocidos en la tecnica, incluyendo productos de tabaco que no se fuma como tabaco de mascar de tipo snus, rape y tabaco picado, extracto de tabaco o tabaco reconstituido.

En una forma de realizacion alternativa, las plantas de tabaco de la presente invencion, o sus partes, se usan para generar articulos para fumar que tambien representan una realizacion de la invencion. Los articulos para fumar son bien conocidos, e incluyen un cigarrillo ("cigarette"), un purito ("small cigar"), un cigarrito ("cigarillo") o un puro ("cigar"), o articulos para fumar simuladamente que contienen tabaco.

Las plantas de la presente invencion se pueden obtener por metodos que comprenden las siguientes etapas:

(a) cribar una genoteca de plantas de tabaco obtenidas mediante mutagenesis para al menos una mutacion en un gen HMA, en las que el gen HMA no mutado comprende la secuencia nucleotidica de SEC ID NO:1 (secuencia nucleotidica del gen HMA 4) o un homologo de la misma, en las que la mutacion provoca una sustitucion o una supresion o una insercion de al menos un aminoacido en el polipeptido codificado por la secuencia nucleotidica, y en las que la mutacion reduce la absorcion de metales pesados por las hojas de la planta de tabaco en por lo menos 30% en relacion con la absorcion de metales pesados de plantas que comprenden SEC ID NO:1 o el homologo;

(b) cruzar la planta de tabaco que presenta una mutacion en el gen HMA con una planta de produccion de Nicotiana tabacum comercial; y

(c) identificar la descendencia con la mutacion en el gen HMA;

(d) repetir las etapas (b) y (c).

Como anteriormente, la reduccion de la absorcion de metales pesados se puede determinar haciendo crecer plantas de tabaco con y sin la mutacion en condiciones identicas en un medio liquido que contiene el metal pesado y comparando la concentracion del metal pesado en la hoja, tallo o brote de la planta de tabaco con la mutacion con la concentracion del metal pesado en la hoja, tallo o brote de la planta de tabaco que no tiene la mutacion.

Los metodos producen plantas con absorcion reducida del metal pesado en por lo menos 30%, por lo menos 50%, por lo menos 75%, o por lo menos 95%.

Las plantas pueden tener una absorcion reducida de uno o varios metales pesados. Se prefiere que se reduzca la absorcion de cadmio, plomo o arsenico.

Segun una forma de realizacion preferida, las etapas (a) y/o (c) del metodo usan un ensayo que analiza la secuencia nucleotidica de la planta de tabaco (Nicotiana tabacum). Los ensayos respectivos para analisis nucleotidicos son bien conocidos en la tecnica de biologia molecular, e incluyen tecnicas a base de PCR, secuenciacion del ADN, hibridacion y/o tecnicas de RFLP.

Un producto de tabaco o un articulo para fumar se puede obtener a partir de las plantas de la presente invencion

cosechando las hojas, tallos y/o brotes y produciendo un producto de tabaco o articulo para fumar a partir de los

mismos.

Breve descripcion de las figuras

figura 1: Alineamiento parcial de secuencias de la amplificacion de la parte A en N. tabacum, N. sylvestris y N. tomentosiformis.

La primera secuencia es el contigo de referencia. En este alineamiento, estan presentes tres

secuencias diferentes: las secuencias 1, 2, 3, 9, 10, 11 estan compartidas entre N. tabacum y N.

sylvestris. Las secuencias 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 16 estan compartidas entre N. tabacum y N. tomentosiformis. Las secuencias 4 y 5 son especificas de N. sylvestris.

figura 2: Amplificacion del ADNc bc de las copias 1 y 2 de los ortologos de HMA en N. tabacum.

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figura 3: figura 4:

figura 5:

figura 6:

figura 7: figura 8:

Se usaron cebadores especificos disenados para hibridarse en las regiones exonicas de la parte A para evaluar la expresion de las dos copias en raices (R) y brotes (S). El par de cebadores HmaAS- F/HmaA-RT-R amplifica la secuencia origen de N. sylvestris (Copia S), y el par de cebadores HmaAT-F/HmaA-RT-R amplifica la secuencia origen de N. tomentosiformis (Copia T). Ambas copias se expresan en N. tabacum.

Analisis CODDLE de toda la secuencia del contigo (SEC ID NO:1).

Primera linea: secuencia de aminoacidos de la proteina HMA4 Segunda linea: secuencia de ADN del gen HMA4

Tercera linea: debajo de cada nucleotido hay una indicacion de los cambios que se pueden detectar con mutagenesis mediante EMS.

Perfil mediante CE-SSCP obtenido mediante amplificacion por PCR de la coleccion de mutantes de ADN con cebadores Hma4-BF/Hma4-BR. El cebador HmaA4-BF esta marcado con el fluoroforo FAM, y la hebra de ADN aparece en azul. El cebador Hma-BR esta marcado con el fluoroforo VIC, y la hebra de ADN aparece en verde.

1: Perfil de ADN de un ADN de tipo natural

2: Perfil de ADN de un ADN mutante (familia E1-276 de la coleccion), caracterizado por un pico

adicional que corresponde a la hebra de ADN mutado (flecha roja).

Tabla que resume las mutaciones encontradas en dianas de HMA tras la clonacion y secuenciacion.

a = Numero de identificacion de la familia mutante como se describe en la coleccion.

b = Cambio nucleotidico o de aminoacido y posicion de la mutacion como se describe con el analisis CODDLe en el contigo 1 (nucleotido/aminoacido original + posicion + nuevo nucleotido(aminoacido).

“=“ representa mutacion silenciosa, “*” representa codon de parada.

c = La puntuacion de SIFT se obtuvo con el programa bioinformatico SIFT (Clasificacion Intolerante de Tolerante) en el contigo 1. Se predice que las puntuaciones de SIFT < 0,05 son daninas para la proteina.

* Ninguna mutacion por EMS (G/C a A/T)

Contenido de cadmio en tres lineas mutantes M3 E1-276 (276B5; 276B8, 278B18) en comparacion con el tipo natural (BB16NN).

El cadmio se midio en brotes (A) o raices (B). A la izquierda, las graficas representan la acumulacion de cadmio en pg por g de pesos secos. A la derecha, las graficas representan la acumulacion de cadmio normalizada en mutantes con acumulacion de cadmio en tipo natural.

Contenido de cadmio en brotes: las letras “A” y “B” en las barras representan dos grupos distintos en un ensayo de la “T” de Student realizado en estas muestras.

Acumulacion de cadmio en raices: la letra “A” en las barras indica que todas las medias en esta grafica pertenecen al mismo grupo estadistico.

Las barras de error representan desviacion estandar.

Foto de un cruce F1 entre el mutante E1-276-B18 y una planta de tabaco curada en chimenea industrial que muestra la viabilidad de los mutantes.

Acumulacion de cadmio en brotes de las lineas de EMS (M plantas mutadas; Htz plantas mutantes heterocigotas; S plantas de tipo natural; DW peso seco). Las graficas a la izquierda representan la cantidad de cadmio acumulada en los brotes. Las barras de error reflejan el error estandar. En el lado derecho, la acumulacion de cadmio en la linea mutada se representa como un porcentaje con respecto a su tipo natural.

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figura 9: Analisis estadistico de las lineas de EMS. Los valores p presentados en esta tabla derivan del ensayo de la t de Student (
http://www.graphpad.com). Las diferencias observadas entre cada linea mutada y su tipo natural es estadisticamente relevante cuando el valor p es menor que 0,05 (95% de confianza).

figura 10: Acumulacion de transcritos de ARN en lineas iARN. Las barras representan la media de la acumulacion de transcritos de HMA alfa o HMA beta con respecto a la acumulacion de transcritos del gen de referencia ciclofilina y L2. Se usaron tres plantas por linea. Las barras de error representan error estandar. Las letras A y B representan los dos grupos encontrados por el ensayo de la t de Student realizado con el software abierto “R”.

figura 11: Acumulacion de metal en brotes de lineas iARN. Para cada linea, se analizaron 4 plantas (solamente 3 para pGreen). La acumulacion de cadmio se representa en la parte superior. En la izquierda, la acumulacion de cadmio se expresa como una media. En la parte superior derecha, esas medias se expresan como porcentaje de tipo natural. En la parte inferior, se representa la acumulacion de hierro y de cinc en los brotes. Las barras de error representan error estandar. Las letras A y B representan grupos estadisticos realizados con el software abierto “R”. Las letras son independientes en cada grafica.

figura 12: Cruces realizados entre mutantes de tabaco para acumular ambas copias mutadas en un genoma.

Los mutantes se retrocruzaron primeramente con tipo natural, y despues se cruzaron entre ellos para obtener la generacion F1. El nombre F1 se describe como F1CD2, representando los numeros siguientes ambas identificaciones mutantes.

figura 13: Lineas de EMS. Las lineas se presentan con la coleccion a partir de la que se originan y la mutacion que afecta a un gen o al otro.

figura 14: Constructos de miARNa. Todas las secuencias seleccionadas como dianas y sus secuencias cebadoras correspondientes se obtuvieron usando software en linea (
http://www.weigelworld.org/).

figura 15: Secuencia seleccionada como diana del constructo de horquilla. Los pares de cebadores (A) se disenaron para amplificar la misma porcion del gen HMA (B), pero portan diferentes sitios de restriccion.

figura 16:

Vector pHannibal. Este vector contiene 2 conjuntos de sitios de restriccion separados mediante un intron.

figura 17: Acumulacion de metal en brotes; resultados graficos obtenidos mediante comparacion multiple de Tukey de las medias. Las barras de error representan error estandar. Las letras A, B, C y D representan grupos estadisticos obtenidos con el software abierto “R” para analisis de cadmio.

figura 18: Acumulacion de metal en brotes; los resultados graficos se obtienen mediante comparaciones multiples de Tukey de las medias.

Ejemplo 1

Coleccion de mutantes de tabaco

Material vegetal

Se usaron semillas de tres lineas de tabaco BB16NN (Delon et al. 1999; Institut du Tabac de Bergerac, n° de Acceso 1139), BY02 y V4K1 para crear genotecas de mutantes de Nicotiana tabacum. BB16NN y BY02 son tabacos de tipo Burley, y V4K1 es un tabaco de tipo curado en chimenea.

Para la evaluacion del numero de copias, se realizo la comparacion de secuencias con los ancestros con lineas de tabaco ITB 645 (Nicotiana tomentosiformis) y ITB 626 (Nicotiana sylvestris).

Mutagenesis por EMS

La coleccion de mutantes se ha descrito en Julio et al., 2008. De forma breve, se construyeron dos genotecas de mutantes por EMS (metanosulfonato de etilo) de tabaco, denominadas L1 y L2, empapando semillas de tabaco BB16NN (6000 semillas por genoteca) toda la noche (16 h) en disoluciones de EMS al 0,8% (L1) o de EMS al 0,6% (L2), seguido de 12 lavados durante 30 min. en agua con agitacion. Ademas, las semillas de la genoteca L1 se germinaron previamente durante 2 dias antes del tratamiento con EMS.

Se desarrollaron otras dos colecciones a partir de semillas BY02 (denominada L3) y V4K1 (denominada L4) con un

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tratamiento con EMS al 0,7% y sin germinacion previa.

Las semillas M1 mutagenizadas se hicieron crecer hasta plantulas M1 en un invernadero, y se transfirieron al campo para dar la generacion M2 mediante autopolinizacion. Las semillas M2 se recogieron de cada planta M1 y se almacenaron hasta el uso. El material foliar se recogio de 8 semillas M2 sembradas en una sola maceta en el invernadero y reunidas (dos discos de 8 mm de diametro para cada planta, es decir, ~ 100 mg de peso fresco por familia) para constituir la familia M2 reunida. El ADN se extrajo del material foliar usando el kit para plantas QIAGEN Dneasy 96, segun las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 2

Evaluation del numero de copias Amplificacion mediante PCR

En SEC ID NO:1 se muestra parte de la secuencia genomica de una HMA 4 del gen de Nicotiana tabacum.

N. tabacum es una planta alotetraploide que comprende un genoma de Nicotiana sylvestris y Nicotiana tomentosiformis. Parece que SEC ID NO:1 deriva de N. sylvestris.

Cuatro regiones genomicas de este gen HMA 4, identificadas como parte A, B, C y D, se amplificaron en N. tabacum, N. sylvestris y N. tomentosiformis usando los pares de cebadores respectivos:

Parte A-F (CTACCGCTGCTATGTCATCAC) SEC ID NO:2 y Parte A-R (TAGCACACTTGTCGATGTATC) SEC ID NO:3;

Parte B-F (GATACATCGACAAGTGTGCTA) SEC ID NO:4 y Parte B-R (CTCCTTTAGTTATAGTCCCTG) SEC ID NO:5;

Parte C-F (AGTAAATACTGAATTGTCTAGTG) SEC ID NO:6 y Parte C-R (GATGTTTTATCTCTACTATGAGC) SEC ID NO:7;

Parte D-F (GACCTGTTTAGCACTAATGCG) SEC ID NO:8 y Parte D-R (TTATAATCATTTCAGCGTAATGCAG) SEC ID NO:9.

Las amplificaciones mediante PCR se llevaron a cabo en un volumen de 20 pl que contiene 1 pl de ADN, 10X de tampon AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, USA), 1 pl de dNTPs (Applied Biosystems, 2,5 mM cada uno), 50 ng de cada cebador, y 0,05 U de AmpliTaq Polymerase (Applied Biosystems). La PCR se llevo a cabo usando un ciclador termico (GeneAmp® PCR System 2700, Applied Biosystems) segun lo siguiente: 35 ciclos de 94°C durante 30 s, 62°C durante 45 s, 72°C durante 1 min., seguido de 7 min. a 72°C para el alargamiento final.

Resultados

Cuatro partes de la secuencia del contigo mostrada en SEC ID NO: 1 se amplificaron en N. tabacum, N. tomentosiformis y N. sylvestris. La parte A corresponde aproximadamente a los exones 4 a 5, la parte B corresponde aproximadamente al exon 6, la parte C corresponde al exon 7, y la parte D corresponde al exon 8. Se secuenciaron seis a diez clones para cada producto de la PCR. En la figura 1 se muestra un ejemplo de alineamiento de secuencias en la parte A. Algunas secuencias fueron comunes entre N. tabacum y sus ancestros (N. sylvestris y N. tomentosiformis); otras son especificas de un ancestro. Los resultados se resumen en la Tabla 1, a continuacion.

Tabla 1. Resultados obtenidos tras clonar y secuenciar productos de la PCR amplificados con los cebadores HmaA- F/R (parte A), HmaB-F/R (parte B), HmaC-F/R (parte C) y HmaD-F/R (parte D).

: Parte A Parte B Parte C Parte D

: Especifico Comun con N. tabacum Especifico Comun con N. tabacum Especifico Comun con N. tabacum Especifico Comun con N. tabacum

N. sylvestris: 2 1 n.f. 1 n.f. 1 n.f 1

N. tomentosiformis: n.f. 1 1 n.f. 1 n.f. n.f. 1

Puesto que se secuenciaron 6 a 10 clones por producto de la PCR, los resultados se expresan como un numero minimo de copias existentes.

n.f. = no encontrado

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Estos resultados muestran que Nicotiana tabacum contiene al menos dos loci de HMA4, un locus de cada uno de los dos ancestros. Como consecuencia, cualquier planta de Nicotiana tabacum puede contener al menos cuatro alelos de HMA 4 diferentes.

Extraccion de ARN y ensayo de ADNc bc

El ARN se extrajo de las raices y brotes de plantas de dos meses con el kit para plantas Rneasy segun las instrucciones del fabricante (Qiagen). El ADNc y el ADNc bc se prepararon segun las instrucciones del fabricante usando el kit de sintesis de ADNc MINT de Evrogen.

La expresion de ambos loci se evaluo amplificando ADNc bc que procede de raices y brotes de N. tabacum con cebadores especificos disenados en base a las regiones exonicas de la parte A. Se uso HmaAS-F/HmaA-RT-R para amplificar la secuencia origen de N. sylvestris, y HmaAT-F/HMA-RT-R para la secuencia origen de N. tomentosiformis. Los fragmentos se amplificaron para ambas copias (N. sylvestris y N. tomentosiformis) del gen, como se demuestra en la figura 2, apoyando la conclusion de que las secuencias presentes en ambos loci son expresadas en raices y brotes de N. tabacum.

La amplificacion de las dos copias en secuencias expresadas se ensayo en la region A, con pares de cebadores no marcados especificos:

• cebadores directos Hma-AS-F GGTGAATAGCATTCTTGCTGTG SEC ID NO:19; y HmaAT-F, GTTGAATAGCATTCTTGCTGTT SEC ID NO:21; y

• un nuevo cebador inverso comun HmaA-RT-R, CTTGTTCTGAGCATCTTCGAC SEC ID NO:20, disenado para unirse en la region exonica.

La PCR se llevo a cabo en las mismas condiciones que para la evaluacion del numero de copias. Los productos de la PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1,5% con EtBr (bromuro de etidio) bajo UV.

Ejemplo 3

Identificacion de mutantes via PCR

Se disenaron nuevos cebadores para amplificar especificamente las regiones a usar para la identificacion de los mutantes. Los cebadores se seleccionaron segun tres criterios:

- Posiciones de intron y exon: se prefieren regiones exonicas, incluso si los cebadores se pueden disenar en regiones intronicas.

- Impacto elevado de las mutaciones por EMS en la secuencia proteica: el impacto de la mutacion sobre la funcion proteica se evaluo mediante el software CODDLe [Escogiendo Codones para Optimizar el Descubrimiento de Lesiones Daninas]. CODDLe identifica la region o regiones de un gen seleccionado por el usuario y de su secuencia codificante [CDS] en la que las mutaciones de punto anticipadas muy probablemente den como resultado efectos daninos sobre la funcion del gen (Till et al., 2003). Los resultados de CODDLe sobre toda la secuencia de contigos se muestra en la figura 3.

- Longitud de la secuencia: la longitud maxima de la secuencia para la identificacion mediante CE-SSCP es 500 pb. Se prefiere una secuencia grande para maximizar la posibilidad de descubrir mutantes.

Los nuevos pares de cebadores siguientes se disenaron para amplificar:

Region A: el par de cebadores HmaAS-F/HmaA-R amplifica la secuencia origen de N. sylvestris, y HmaAT- F/HMA-R amplifica la secuencia origen de N. tomentosiformis.

Region B: par de cebadores HmaB-F/HmaB-R

Region D: el par de cebadores HmaDS-F/HmaDS-R amplifica la secuencia origen de N. sylvestris, y el par de cebadores HmaDT-F/HmaDT-R amplifica la secuencia origen de N. tomentosiformis.

La especificidad de los pares de cebadores se comprobo clonando y secuenciando diez productos de la PCR.

Se usaron cebadores marcados fluorescentemente (6-FAM (azul), VIC (verde), NED (amarillo); todos de Applied Biosystems) para el analisis de polimorfismo de conformacion de hebra sencilla con electroforesis capilar (CE- SSCP). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en las mismas condiciones como se usan para la evaluacion del numero de copias.

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Se amplificaron dos copias de 410 pb diferentes en las regiones A con:

• cebador directo HmaAS-F (VIC-GGTGAATAGCATTCTTGCTGTG) SEC ID NO:10; o

• cebador directo HmaAT-F (NED-GTT GAAT AGCATTCTT GCTGTT) SEC ID NO:12; y

• cebador inverso comun HmaA-R (6FAM-GCACAACATAAGATTCACTAAC) SEC ID NO:11.

Se amplifico una unica secuencia de 386 pb en la region B con:

• cebador directo HmaB-F 6FAM-GTCTGATTTCGACTGGTGATG SEC ID NO:13; y

• cebador inverso HmaB-R VIC-AAGAATATGTATGAGTGGTAACC SEC ID NO:14.

Se amplificaron separadamente dos copias de 293 pb en la region D con:

• par de cebadores HmaDT-F, 6FAM-GAAATAGAGGGTGATAGTTTCC SEC ID NO:15, y HmaDT-R, NED- CATTTCAGCGTAATGCAGAATTT SEC ID NO:16, para la primera copia; y

• HmaDS-F, VIC-GAAAT AGAGGGT GAT AGTTT CA SEC ID NO:17, y HmaDS-R, 6FAM-

CATTTCAGCGTAATGCAGAATTA SEC ID NO:18, para la otra copia.

Electroforesis capilar

Los productos de la PCR marcados fluorescentemente se diluyeron 1/20 en agua antes del analisis mediante CE- SSCP. Antes de la carga en un ABI Prism® 3130 (Applied Biosystems, Foster City, USA), se anadio 1 pl de muestra diluida a 10 pl de formamida (Applied Biosystems) y 0,1 pl de Genescan-500 LIZ Size Standard (Applied Biosystems). Para el analisis de conformacion de hebra sencilla se uso una etapa de desnaturalizacion de 94°C durante 3 min., seguido de enfriamiento en hielo.

Las condiciones de paso en ABI Prism® 3130 fueron las siguientes: matriz capilar 36 cm (16 capilares), temperatura de paso de 22°C, inyeccion de la muestra de 1 kV durante 15 s y separacion de 15 kV durante 40 min. El medio de separacion no desnaturalizante fue POP Conformational Analysis Polymer (Applied Biosystems) 5%, glicerol (Sigma- Aldrich) 10% en tampon 1X (10X) con EDTA (Applied Biosystems). El tampon de pasada fue glicerol 10% en tampon 1X (10X) con EDTA. Los resultados se analizaron con el software GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems).

Clonacion y secuenciacion

Los productos de la PCR se clonaron en pGEM-T vector Systems (Promega, Madison, USA) y se transformaron en E. coli segun las instrucciones del fabricante. Se secuenciaron diez clones para cada familia, usando el kit de secuenciacion BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) y ABI Prism® 3130 (Applied Biosystems). Las secuencias nucleotidicas se alinearon con Multalin (
http://npsa-pbil.ibcp.fr/NPSA/npsa multalinan.html).

Resultados

identification de mutantes en los ortologos de HMA4 en tabaco

Los cebadores se marcaron fluorescentemente y se usaron para amplificar el ADN de la coleccion de mutantes. Los productos de la PCR marcados fluorescentemente se analizaron mediante CE-SSCP como se describe anteriormente.

Los mutantes se detectaron mediante la presencia de picos adicionales en el perfil del analisis, en comparacion con el control (ADN de un tabaco no mutado). En la figura 4 se muestra un ejemplo con cebadores Hma4-BF/Hma4-BR.

Los productos de la PCR de mutantes se clonaron y secuenciaron para caracterizar la posicion de la mutacion. Las secuencias obtenidas se alinearon y se compararon con el control. El impacto de las mutaciones sobre la funcion proteica se analizo mediante el programa Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT) (Ng y Henikoff 2003).

Los resultados completos de las mutaciones obtenidas en Hma-AS, Hma-AT, Hma-B, Hma-DS y Hma-DT se resumen en la Tabla mostrada en la figura 5/1 y 5/2.

Se obtuvieron 19 mutaciones para la diana Hma-AS, 18 para Hma-AT, 20 para Hma-B, 11 para Hma-DT y 3 para Hma-DS.

Las mutaciones sin sentido se pudieron obtener para Hma-AS y Hma-DT. Las mutaciones silenciosas y de sentido alterado representan respectivamente 9% a 33% y 61% a 81% del numero total de mutaciones, como se presenta en la tabla 2. Una mutacion en una region de corte y empalme se pudo encontrar en la diana Hma-B. Se pudieron

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encontrar mutaciones que afectan al mismo aminoacido. Se encontraron dos mutaciones exactamente redundantes en Hma-AT, una en Hma-AS, 3 en Hma-B y una en Hma-DT. De las 71 mutaciones obtenidas, se observaron 2 transversiones (2,8%) (en lugar de las transiciones G/C a T/A esperadas con el tratamiento con EMS).

Tabla 2: Porcentaje de mutacion segun la diana y el tipo de mutacion.

: Total Silenciosa Sentido alterado Sin sentido Intron Ayuste

Hma-AS: 19 31,6 63,2 5,3 0,0 0,0

Hma-AT: 21 22,2 57,1 0,0 9,5 0,0

Hma-B: 20 20,0 70,0 0,0 5,0 5,0

Hma-DT: 11 9,1 81,8 9,1 0,0 0,0

Hma-DS: 3 33,3 66,7 0,0 0,0 0,0

Ejemplo 4

Translocacion de metales pesados Cultivo hidroponico

Las lineas M2 EMS seleccionadas se hicieron crecer en tierra en un invernadero a fin de obtener semillas mutantes homocigotas. Se extrajo ADN de plantas de 2 meses para el genotipado mediante CE-SSCP. Las lineas mutantes homocigotas se autopolinizaron para obtener semillas mutantes homocigotas (M3). Las semillas M3 se hicieron germinar en papel Whatman empapado con una disolucion derivada de Hoagland (KNO3 2,5mM; NaH2PO 4 0,5 mM; Ca(NO3)2 2,5 mM; MgSO4 0,5 mM; FeNaEDTA 0,1 mM; H3BO3 50 pM; MnSO4 50 pM; ZnSO4 15 pM; MoO4Na2 3 pM; KI 2,5pM; CuSO4 50 pM; CoCl2 44 pM). Despues de 3 semanas, las plantas se transfirieron al medio de disolucion derivado de Hoagland en el que su crecimiento se prolongo durante 2 semanas. El medio de disolucion se complemento entonces con una concentracion final de 10 pM de CdCl2. Despues de una semana de tratamientos, las plantas se cortaron en dos partes: raices y brotes, y se cosecharon independientemente.

Ensayo en invernadero

Las lineas M2 se sembraron en papel Whatman hasta germinacion, y 30 plantulas mutantes se transfirieron a bandejas flotantes (20 cm x 30 cm), con cinco plantas de control colocadas aleatoriamente en la bandeja (lineas originales no mutagenizadas). Se extrajo ADN de plantas de 1 mes para el genotipado mediante CE-SSCP, para caracterizar plantas homocigotas, heterocigotas y de tipo natural para la mutacion de HMA. Despues de mes y medio, el medio de disolucion se complemento con una concentracion final de 1 pM a 5 pM de CdCl2. Despues de una semana de tratamientos, las raices se enjuagaron con CaCl2 (1 mM), y las plantas se cortaron en tres partes: raices, tallo y brotes. Las muestras se reunieron segun su genotipo, con cuatro plantas por genotipo.

Deteccion de cadmio mediante ICP-MS

Las muestras se secaron a 80°C durante 72 horas, y se midio el peso seco. Los contenidos de metales se extrajeron en acido clorhidrico (1 mM) durante 1 hora a 75°C.

Los contenidos de metales en el acido clorhidrico se dosifico mediante espectrometria de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) de Agilent (serie 7500cx). Los iones se analizaron sobre la base de sus relaciones de masa a carga (Newman, 1996). Esta tecnica ya se ha usado para el analisis de oligoelementos en muchos campos (por ejemplo, Kelly et al., 2002), y permite detectar trazas de cadmio tan bajas como 10 ppt.

Para obtener el contenido de cadmio, la concentracion de la disolucion dosificada se multiplica por el factor de dilucion (esto da la cantidad de metal en la muestra) y se divide entre la masa de la muestra. Para obtener la translocacion, la cantidad de metal en los brotes se divide entre la cantidad de metal en toda la planta (metal en raices mas metal en brotes).

Analisis estadistico

Para cada linea, se calculo el valor de la media y la desviacion estandar. Se uso el software estadistico “R” para llevar a cabo una prueba de la “T” de Student para comparar esas medias (
http://www.r-project.org/).

Ejemplo 5

Retrocruzamientos de mutacion en lineas de elite

Los mutantes que contienen una mutacion interesante se retrocruzaron con la planta no mutagenizada original a fin de eliminar mutaciones adicionales presentes en el resto del genoma, no relacionadas con la transferencia de

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cadmio. En la figura 7 se muestra un ejemplo de un cruce F1 de un tabaco curado en chimenea industrial y el mutante E1-276-B18. Los mutantes procedentes de la coleccion y lineas de elite se hicieron crecer en invernadero en lechos flotantes. El ADN de 30 plantas por familia mutante se extrajo y se analizo mediante CE-SSCP. Las plantas heterocigotas se transfirieron en macetas de 5 litros, junto con las lineas de elite. En el momento de la floracion, polen de mutante se transfirio a la flor de la linea original (BB16NN, BY02 o V4K1), sin su estambre. Se pueden realizar varios ciclos de retrocruzamientos (BC1, BC2...) antes de fijar la mutacion mediante dos ciclos de autopolinizacion de plantas mutantes retrocruzadas (BCxS1 y BCxS2).

Ejemplo 6

Translocacion de metales pesados Cultivo hidroponico A. Mutacion E200K

Se realizaron experimentos con la mutacion E200K, en la region B de la secuencia, en la linea E1-276 de la coleccion BB16NN. Las lineas mutantes M2 homocigotas se autopolinizaron para obtener semillas mutantes homocigotas (M3). El experimento se realizo en plantulas M3 jovenes.

Resultados

El contenido de cadmio en la linea mutante M3 E1-276 homocigota esta significativamente reducido. La figura 6 describe los resultados obtenidos en terminos de acumulacion de cadmio en raices y en brotes. En brotes, el contenido de cadmio esta reducido en diferentes grados, y se puede reducir en mas de 50% en las lineas de la presente invencion en comparacion con el tipo natural. Como se puede observar en la figura 6, el contenido de cadmio se reduce en brotes, por ejemplo en mas de 60%, y en algunas plantas incluso en mas de 70%.

B. Mutacion E3-277

Se realizaron experimentos adicionales con respecto a la absorcion de Cd y Zn con plantas homocigotas para la mutacion E3-277.

Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 3, a continuacion, y muestran que el contenido de cadmio en las plantas E3- 277 homocigotas esta significativamente reducido, mientras que el contenido de Zn esta ligeramente reducido en comparacion con las plantas de control.


: Organo Cd [pg/g d.w.b.l Zn [pg/g d.w.b.l

E3-277-tipo natural: WT-Planta 1 Hoja 103 78,2

WT-Planta 1: Raiz 767 318

WT-Planta 2: Hoja 84,0 138

WT-Planta 2: Raiz 310 256

WT-Planta 3: Hoja 60,1 61,1

WT-Planta 3: Raiz 289 225

WT-Planta 4: Hoja 122 90,7

WT-Planta 4: Raiz 338,4 276

E3-277-Mutante: M-Planta 1 Hoja 4,9 76,5

M-Planta 1: Raiz 33,3 53,7

M-Planta 2: Hoja 9,5 48,0

M-Planta 2: Raiz 66,7 625

BB16NN Control: Control-Planta 1 Hoja 172,7 101

Control-Planta 1: Raiz 526 206

Control-Planta 2: Hoja 178 116

Control-Planta 2: Raiz 344 244

Control-Planta 3: Hoja 151 108

Control-Planta 3: Raiz 500 254

Control-Planta 4: Hoja 189 111

Control-Planta 4: Raiz 639 285

Tabla 3: Contenido de cadmio y de cinc en linea mutante E3-277 homocigota en comparacion con la linea de tipo natural E3-277 y la linea de control BB16NN.

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Ejemplo 7

En este ejemplo se evaluo la absorcion de cadmio de brotes de plantas de N. tabacum. Estos brotes proceden de lineas de plantas tratadas con EMS mutadas en el gen HMA 4 derivado de N. sylvestris o en el gen HMA 4 derivado de N. tomentosiformis.

Tambien se evaluo la absorcion de cadmio de brotes de plantas de N. tabacum transgenicas. Estas lineas de plantas transgenicas expresan un constructo de iARN disenado para silenciar uno o ambos de los dos genes HMA 4.

Materiales y metodos

Lineas de EMS

Todas las lineas de EMS analizadas en este ejemplo se resumen en la figura 13. Entre las lineas ensayadas, 3 estan mutadas en el gen HMA 4 derivado de N. sylvestris (identificado como gen alfa en la figura 13), y 2 portadoras de mutaciones en el gen HMA 4 derivado de N. tomentosiformis (identificado como gen beta en la figura 13).

Las lineas 90 y 425 se retrocruzaron 2 veces. El retrocruzamiento redujo la cantidad de mutaciones adicionales en un 75%.

La linea 277 se retrocruzo una vez, pero la mutacion esta en el estado heterocigoto para esta linea. Todas las otras lineas son portadoras de mutaciones homocigotas. Las otras lineas no se retrocruzaron.

Todas las lineas se hicieron crecer en presencia de cadmio usando el protocolo descrito anteriormente, excepto que en este Ejemplo la concentracion de cadmio fue 1 pM en lugar de 10 pM. Cada linea se cultivo en un bol que tambien contiene la planta de tipo natural correspondiente, es decir, una planta portadora del mismo conjunto de mutaciones adicionales en su genoma pero que carece de la mutacion en el gen HMA correspondiente.

Lineas transgenicas

1) Constructos de iARN

Se obtuvieron cinco constructos de miARNa siguiendo el metodo descrito en Ossowski et al, 2008. Se uso una fuente en linea (
http://www.weigelworld.org/) para seleccionar las secuencias seleccionadas como diana y disenar los cebadores correspondientes. El resultado se presenta en la figura 14.

Los miARNa se subclonaron en un vector que contiene el “promotor 70S” (promotor 35S en el que se repiten algunas regiones potenciadoras) y un terminador (rbos). El constructo promotor-miARNa-terminador se inserto en un vector binario (pGreen) que permite la expresion in planta.

2) Constructos de horquilla

El constructo de horquilla se disena para silenciar ambos genes HMA 4. Las secuencias seleccionadas como diana asi como los cebadores usados para amplificarlas se describen en la figura 15. Las secuencias se clonaron en el vector pHannibal (figura 16). pHannibal contiene los sitios de restriccion apropiados para clonar las secuencias seleccionadas como diana en orientacion tanto sentido como antisentido.

El constructo de horquilla obtenido se subclono entonces dos veces y se inserto en el vector pGreen con el mismo promotor y terminador usados para los constructos de miARNa.

3) Transformacion de las plantas

Las plantas se transformaron con los cinco constructos de miARNa, el constructo de horquilla y el vector pGreen vacio, como se describe en Horsch et al, 1984.

4) Condiciones de crecimiento

Las lineas de iARN transgenicas ensayadas son la descendencia de las plantas regeneradas tras la transformacion de las plantas.

Las lineas de iARN se cultivaron en el mismo medio derivado de Hoagland usado para el cultivo hidroponico pero suplementado con 1% de agar. Las plantas que perdieron su constructo a traves de la segregacion se eliminaron mediante adicion de 200 mg de higromicina por litro de medio. Despues de dos semanas de crecimiento en medio de seleccion, las plantas se transfirieron a un medio que contiene cadmio a una concentracion de 1 pM.

Despues de dos semanas de cultivo en el medio que contiene cadmio, se recogio el material vegetal.

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Aproximadamente 1 g de raiz se congelo en nitrogeno liquido para analizar la acumulacion de transcrito mediante qPCR. Los brotes se apartaron para analizarlos para determinar el contenido metalico mediante ICP-MS.

5) Extraccion de ARN y sintesis de ADNc

Las raices se molieron usando un mortero y una mano de mortero. El ARN se obtuvo usando el kit RNeasy (Qiagen) acoplado con una etapa opcional de ADNasa. La sintesis de ADNc se llevo a cabo con transcriptasa inversa M-MLV (Promega), como se describe por el fabricante.

6) Analisis mediante Q-PCR

Los analisis se llevaron a cabo usando un Roche 480 Lightcycler (Roche). Los pares de cebadores usados para amplificar el gen alfa (Fw - ACAAAGTGCTCGGACACCAA; Rev - CTTCTCGGTTGCAGAGTCCT) o el gen beta (Fw - ACAAAGTGCTCGGACACCAA; Rev - CTTCTCGGTTGCAGAGTCTA) se disenaron para amplificar especificamente el gen seleccionado como diana y no su homologo. Esta especificidad y la eficiencia de los cebadores se ensayo usando un vector en el que se clono la region seleccionada como diana por los cebadores.

Los resultados se normalizaron usando el gen de ciclofilina (Fw - CTCTATGCCGACACCGTTCC; Rev - TCACACGGTGGAAGGTTGAG) y el gen L2 (Fw - GGCGAAATGGGTCGTTTGATC; Rev - CGTTCCGTTCGCCGAAGTCG). Estos dos genes de referencia se seleccionaron de los genes descritos en Nicot et al, 2005.

Resultados

Lineas de EMS

En 3 de las 5 lineas ensayadas, la acumulacion de cadmio en los brotes esta reducida muy significativamente, a saber, en mas de 50% (la figura 8 muestra ejemplos seleccionados). Estos resultados se validaron estadisticamente para las lineas 277 y 425 usando la prueba de la t de Student (figura 9).

Lineas de iARN

1. Acumulacion de transcritos en raices

En la figura 10 se presenta la acumulacion de transcritos medida mediante qPCR. No se observo disminucion en el nivel de transcritos para la linea de horquilla, en comparacion con la linea que expresa el vector vacio.

Sin embargo, se observa una disminucion de acumulacion de transcritos de HMA 4 para ambos genes en la linea 6a y para el gen HMA 4 derivado de N. tomentosiformis en la linea 11b. Los niveles de expresion estan en un grupo estatico diferente del nivel de expresion de las plantas de tipo natural.

2. Acumulacion de metal en brotes

La acumulacion de cadmio se reduce en todas las lineas transgenicas analizadas (figura 11). Se reduce en mas de 40% en las lineas 6b y horquilla. Se reduce en mas de 60% en las lineas 6a y 11b. Una prueba de la t de Student llevada a cabo en esas muestras mostro que la diferencia observada en las lineas 6a y 11b en comparacion con las plantas de tipo natural es significativa. No se determinaron diferentes estadisticas entre las diferentes lineas en terminos de acumulacion de cadmio y acumulacion de cinc.

Conclusion

Este Ejemplo demuestra que ambos genes HMA desempenan un papel en la acumulacion de cadmio en brotes. Ya se puede lograr una reduccion significativa de la reduccion de cadmio silenciando uno de los genes HMA 4. Se puede obtener una reduccion adicional de la acumulacion de cadmio silenciando ambos genes.

Ejemplo 8

En este Ejemplo, se analizo y se comparo la acumulacion de cadmio en brotes de varias plantas. Para este fin, las lineas 90, 416, 276 y 425 se retrocruzaron 2 veces y se fijaron mediante dos autopolinizaciones para obtener plantas BC2S2, seleccionadas para la mutacion (M) o no (W). Las plantas identificadas en este Ejemplo como plantas de tipo natural (o W) son asi plantas que tambien han sido sometidas a tratamiento con EMS y portadoras del mismo conjunto de mutaciones adicionales en su genoma pero carecen de la mutacion en el gen HMA correspondiente.

En primer lugar se esterilizaron semillas y se sembraron directamente en medio solido in vitro. Las lineas se hicieron crecer en medio derivado de Hoagland con agar, que contiene 1 pM de cadmio. El medio derivado de Hoagland contiene 0,1 mM de Fe y 15 pM de Zn.

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Se analizaron las lineas mutantes (M), una linea mutante heterocigota (Htz), y las lineas de tipo natural (S) correspondientes. Los experimentos tambien incluyeron plantas de control BB16NN o BY02 (C) (semillas industriales, tipo natural) y una linea de tabaco de iARN (obtenida como se describe en el Ejemplo 7).

Las hojas se recogieron despues de un mes, y se extrajeron los metales como se describio anteriormente. Los analisis se llevaron a cabo en 4 a 12 plantas por genotipo para Cd, Zn, Fe.

Resultados

Los resultados se muestran en las figuras 17 y 18 y confirman que estas plantas tienen una cantidad significativamente reducida de cadmio en los brotes (figura 17B). Al mismo tiempo, se pudo mostrar que las plantas todavia son capaces de absorber metales tales como Fe y Zn que son necesarios para el crecimiento de la planta (figura 18).

Conclusion

Este Ejemplo demuestra que el silenciamiento de genes HMA segun la presente invencion no tiene necesariamente un efecto negativo sobre la absorcion de metales que son necesarios para el crecimiento y desarrollo de las plantas.

Ejemplo 9

Para desarrollar variedades comerciales de tabaco con contenido reducido de cadmio en la hoja, se llevaron a cabo cruzamientos entre diferentes mutantes de tabaco. En particular, plantas con una mutacion en el gen HMA 4 de N. sylvestris se cruzaron con plantas con una mutacion en el gen HMA 4 de N. tomentosiformis.

Para este fin, ambos mutantes se retrocruzaron con las lineas de elite para eliminar la carga de mutacion en el resto del genoma, que puede provocar problemas con la fertilidad en la progenie. Las plantas BC1 resultantes se cruzaron entonces para obtener la familia F1, que posee dos copias mutadas en estado heterocigoto. Todos los cruces F1 se describen en la figura 12.

Las plantas F1 que resultan del cruce entre mutantes se autopolinizaran para obtener una generacion F2, en la que estaran presentes plantas homocigotas para copias tanto mutadas y/o de tipo natural, incluyendo plantas mutantes dobles homocigotas. Estas plantas se pueden retrocruzar en las lineas de elite para obtener lineas de plantas comerciales mutantes dobles homocigotas.

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Listado de secuencias

<110> Societe Nationale d'Exploitation Industrielle des Tabacs et Aullumettes - S.E.I.T.A.

<120> Tabaco con contenido reducido de cadmio <130> P82537 <160> 59

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 3032 <212> ADN

<213> Nicotiana sylvestris <400> 1

cataagccta

caaactttgt

attgtatatg

tgctatgtca

agtcgtaaat

tatacctatt

aggcgagtcg

tgcttatctt

agcacactga

gataaagcat

tcactggtca

gttgatgaag

gatggagttg

tttccagttt

ttcttacttt

actttgtaac

tctgataaat

atatagtccc

tcaaggtgaa

tagtggaagg

ctaagcaaag

ttagcaatgc

ataactccgt

gaaaaccttt

tccaacagca

tagcattctt

ggaatgtgac

agattcaacg

taaatattag

gtctttattt

atggttatgt

gttttagctg

gctgtgaaag

gtggacgaga

gtctgggctg

gtcctaacta

tctcactgat

aggctaccgc

aaagcggaga

ctggtgaaac

aaacactgac

gcactacaaa

60

120

180

240

300

360

420

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

tctaaatggt

ttgtttgtta

tggctgaaga

aatcaaaaac

tcttatgttg

ttatgaatca

gaatcccttc

cctctcagcc

tttttatttc

gcagcaattg

aatcgaaatg

cttgttctat

cttctgttta

gacaaaacag

gatggtttta

ttatgttgcc

gatataacat

tcacattctc

acatatagac

atacattgag

ttataatcta

gaatagaagc

aatactgaat

tccgatggca

tagagttgag

ggaaatctat

gttgaatcat

atgatttctc

tggatgtttg

gatacatatt

ttggtgtaaa

ctggtgattg

ttacgctgaa

aactcttatt

agaacgtatt

tgtgatgtga

atataagata

tcttcacata

aagattagca

ccaggggcgg

tcacttcata

gaacccataa

ttaggtggag

atcaagggtt

agtatagtat

atgttatttg

ttgtgcggtg

ccaaagatac

tgccacatca

cgtcactatc

ttcggaagct

tgcctgcagt

taatactttc

tggctatatc

aatggtatcg

ctacaccagt

aaggagcaga

ggactataac

gtctcaatac

aaagagaatt

gattgattta

atattgaagt

acaacgtcag

gacacataaa

aaattcttca

cttgttcgtg

tgtctagtga

gccgctctgg

cagtttcaaa

gtcgggaata

ttcttatgct

cagttaattt

aatttcagta

tttgggatca

agaagcaatg

ttatgcagct

atgattataa

gtttccttct

accaagtaag

agatgaaggt

tgctattgtt

tgaaacctac

tgatgattta

aactagtgtt

tgtatttaaa

actcaaaatc

ctttggatga

ttcagaagga

ttcttcatgc

ctcaattctt

gctaggatgg

atcgacaagt

agtcaaaaaa

ctctcccttt

tgccagcata

catgggcgtc

ctgctctttg

agcttctttg

cttggctttg

tgccatgtgt

gtaccttgag

taaaggagaa

actgctttac

caaaatctta

tatcatatat

ttctgaaatg

ccgtctgata

agtacttggt

aatattcttg

tctaaaacat

atattttcag

tggactatgc

attttcctgg

ggaaaatttc

catagtagag

tgctgttaga

ccagaaatag

tctccagctg

agagaactga

gccaaccatg

aaccctttgg

tctatcatca

tgctttatct

taaatgttga

ctccaataat

atcagacgta

agctgaatct

gtgcttagag

taatttatcc

atagatccac

atttcaagca

agctccaaca

ttcatttatt

caggctatat

cacagcttgt

gtgctaaata

tgcacgtacc

tcgatatgag

gaagtctatc

gcactactat

tgtatgtctg

gcaattgttc

gtcacattgg

tgcgcacttt

actctagcta

tttatggtga

tggtaaaggt

actgattatc

tcataaaaga

gctctaatgg

ttcagaactt

catataaatt

atactgcaat

cgttgtggtc

ggtttcaagc

acaatcaaat

tgaagggata

ttcaagagct

ataaaacatc

ttttctttga

agggtgatag

gaattttcag

agcagatggg

tgcaggatca

attattgttt

acattggtta

ttacagggtc

tctggataaa

tggacgattt

catgacacgc

gaatttcaag

gtctcaaaca

agagcagtga

ctctgattgt

gaactcctac

gc

tagtgctgaa

cagtgttaag

cgaagatgct

ttatacacca

gtgtgaactt

atttccctaa

agtcctttca

attgctcttt

atttcgactg

ctactgcatt

tgagtgcatg

caaaagcagc

aaatcaaaat

ccgagttcaa

taccactcat

tttcacggca

tgaaataggg

ttcaccatag

agatggaata

ttagaaacat

aacaaaagca

taaaacattc

attgagagca

tccgttgagc

tttggaagaa

ggatgtacca

agagttataa

cctgtttagc

tttcaaagga

tctttccgat

tatcaaaacc

ggtatattaa

agtcttaaga

aacatttcat

atataaaata

ccaagttatt

tcggacgtac

tatgtttagc

tatctattct

ttgtatttgt

gccatatttt

aagtcgaaac

cagaggacaa

acttcaagta

actacggctt

cagaacaaga

ggttagtgaa

gttctttgtc

ggtgtcatat

cttgacccgc

cgtttaaaac

gtgatgtttt

aagagttcac

tccgtgtgca

aacgtccggt

catggctttt

gtctctgatt

acatattctt

cattgatagt

agtgccacat

agccaaaata

gttggatctt

aatcaatgta

catgcacact

gtttagagta

agtcaggtca

caaagcctga

ttgatggaat

caggtaaatg

ttataagtat

actaatgcgg

aagtctgttg

gtttgtcgaa

gcgatgctta

taattctgca

attttcactg

ctaaatttag

cttaagacag

atcacaacta

gacgtacaat

ataaagagtc

tgtattgtac

gttaaaaaat

ttagaatcca

aattatgcag

ggcaacaatc

<210> 2 <211> 21 <212> ADN

<213> Nicotiana sp. <400> 2

ctaccgctgc tatgtcatca c

<210> 3 <211> 21 <212> ADN

<213> Nicotiana sp. <400> 3

tagcacactt gtcgatgtat c 21

<210> 4 5 <211> 21

<212> ADN

<213> Nicotiana sp.

<400> 4

10

gatacatcga caagtgtgct a 21

<210> 5 <211> 21 15 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

<400> 5

20 ctcctttagt tatagtccct g 21

<210> 6 <211> 23 <212> ADN

25 <213> Nicotiana sp.

<400> 6

agtaaatact gaattgtcta gtg 23

30

<210> 7 <211> 23 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

35

<400> 7

gatgttttat ctctactatg agc 23

40 <210> 8

<211> 21 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

45 <4 00> 8

gacctgttta gcactaatgc g 21

<210> 9 50 <211> 25

<212> ADN

<213> Nicotiana sp.

<400> 9 55

<210> 10 <211> 22 60 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

<400> 10

5 ggtgaatagc attcttgctg tg 22

<210> 11 <211> 22 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

10

<400> 11

gcacaacata agattcacta ac 22

15 <210> 12

<211> 22 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

20 <4 0 0> 12

gttgaatagc attcttgctg tt 22

<210> 13 25 <211> 21

<212> ADN

<213> Nicotiana sp.

<400> 13 30

gtctgatttc gactggtgat g 21

<210> 14 <211> 23 35 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

<400> 14

40 aagaatatgt atgagtggta acc 23

<210> 15 <211> 22 <212> ADN

45 <213> Nicotiana sp.

<400> 15

gaaatagagg gtgatagttt cc 22

50

<210> 16 <211> 23 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

55

<400> 16

<211> 22 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

5 <400> 17

gaaatagagg gtgatagttt ca

<210> 18 10 <211> 23

<212> ADN

<213> Nicotiana sp.

<400> 18 15

catttcagcg taatgcagaa tta

<210> 19 <211> 22 20 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

<400> 19

25 ggtgaatagc attcttgctg tg

<210> 20 <211> 21 <212> ADN

30 <213> Nicotiana sp.

<400> 20

cttgttctga gcatcttcga c 35

<210> 21 <211> 22 <212> ADN

<213> Nicotiana sp.

40

<400> 21

gttgaatagc attcttgctg tt

45 <210> 22

<211> 20 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 50 <4 00> 22

acaaagtgct cggacaccaa

55

<210> 23 <211> 20 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

22

23

22

21

22

cttctcggtt gcagagtcct 20

<210> 24 <211> 20 5 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 24

10 acaaagtgct cggacaccaa 20

<210> 25 <211> 20 <212> ADN

15 <213> Nicotiana tabacum

<400> 25

cttctcggtt gcagagtcta 20

20

<210> 26 <211> 20 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 25

<400> 26

ctctatgccg acaccgttcc 20

30 <210> 27

<211> 20 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 35 <4 00> 27

tcacacggtg gaaggttgag 20

<210> 28 40 <211> 21

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 28 45

ggcgaaatgg gtcgtttgat c 21

<210> 29 <211> 20 50 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 29

55 cgttccgttc gccgaagtcg 20

<210> 30 <211> 21 <212> ADN

60 <213> Nicotiana tabacum

<400> 30

tgactcttat tatttccgca t 21

5

<210> 31 <211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

10

<400> 31

gatgactctt attatttccg cattctctct tttgtattcc 40

15 <210> 32

<211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 20 <4 00> 32

gaatgcggaa ataataagag tcatcaaaga gaatcaatga 40

<210> 33 25 <211> 40

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 33 30

gaatacggaa ataattagag tcttcacagg tcgtgatatg 40

<210> 34 <211> 40 35 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 34

40 gaagactcta attatttccg tattctacat atatattcct 40

<210> 35 <211> 21 <212> ADN

45 <213> Nicotiana tabacum

<400> 35

tggatcttat catttccgca t 21

50

<210> 36 <211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 55

<400> 36

<211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

5 <400> 37

gaatgcggaa atgataagat ccatcaaaga gaatcaatga

<210> 38 10 <211> 40

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 38 15

gaatacggaa atgattagat ccttcacagg tcgtgatatg

<210> 39 <211> 40 20 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 39

25 gaaggatcta atcatttccg tattctacat atatattcct

<210> 40 <211> 21 <212> ADN

30 <213> Nicotiana tabacum

<400> 40

ttcattagta taacatggcc t 35

<210> 41 <211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 40

<400> 41

gattcattag tataacatgg ccttctctct tttgtattcc

45 <210> 42

<211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 50 <4 00> 42

gaaggccatg ttatactaat gaatcaaaga gaatcaatga

55

<210> 43 <211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

40

21

40

gaagaccatg ttatagtaat gattcacagg tcgtgatatg 40

<210> 44 <211> 40 5 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 44

10 gaatcattac tataacatgg tcttctacat atatattcct 40

<210> 45 <211> 21 <212> ADN

15 <213> Nicotiana tabacum

<400> 45

tgattttagc tagagtctca a 21

20

<210> 46 <211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 25

<400> 46

gatgatttta gctagagtct caatctctct tttgtattcc 40

30 <210> 47

<211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 35 <4 00> 47

gattgagact ctagctaaaa tcatcaaaga gaatcaatga 40

<210> 48 40 <211> 40

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 48 45

gaagattttt gctagagtct taatctacat atatattcct 40

<210> 49 <211> 40 50 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 49

55 gattaagact ctagcaaaaa tcttcacagg tcgtgatatg 40

<210> 50 <211> 21 <212> ADN

60 <213> Nicotiana tabacum

<400> 50

tgattttagc aagagtctca a 21

5

<210> 51 <211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

10

<400> 51

gatgatttta gcaagagtct caatctctct tttgtattcc 40

15 <210> 52

<211> 40 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 20 <4 00> 52

gattgagact cttgctaaaa tcatcaaaga gaatcaatga 40

<210> 53 25 <211> 40

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 53 30

gattaagact cttgcaaaaa tcttcacagg tcgtgatatg 40

<210> 54 <211> 40 35 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 54

40 gaagattttt gcaagagtct taatctacat atatattcct 40

<210> 55 <211> 33 <212> ADN

45 <213> Nicotiana tabacum

<400> 55

cccgctcgag tgagagcaag tcaggtcatc cga 33

50

<210> 56 <211> 31 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 55

<400> 56

5

10

15

20

25

<211> 32 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum <400> 57

tgctctagat gagagcaagt caggtcatcc ga

<210> 58 <211> 31 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum <400> 58

cccatcgatc tgtggtacat ccagctcttg a

<210> 59 <211> 192 <212> ADN

<213> Nicotiana tabacum <400> 59

tgagagcaag tcaggtcatc cgatggcagc cgctctggtg gactatgcac aatcaaattc cgttgagcca aagcctgata gagttgagca gtttcaaaat tttcctggtg aagggatatt tggaagaatt gatggaatgg aaatctatgt cgggaatagg aaaatttctt caagagctgg atgtaccaca gg

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

REIVINDICACIONES

1. Planta de tabaco que comprende por lo menos una mutacion en un gen HMA, en la que el gen HMA no mutado comprende la secuencia nucleotfdica de SEC ID n°:1 o una secuencia homologa con una identidad de por lo menos 90% respecto a la secuencia de SEC ID n°:1, en la que la mutacion provoca una sustitucion o una supresion o una insercion de por lo menos un aminoacido en el polipeptido codificado por la secuencia nucleotfdica y en la que la mutacion reduce la absorcion de metal pesado por las hojas de la planta en por lo menos 30% en relacion con la absorcion de metal pesado de plantas que comprenden SEC ID n°:1 o la homologa.
2. Planta de tabaco segun la reivindicacion 1, en la que la planta de tabaco es una planta de Nicotiana tabacum.
3. Planta de tabaco segun la reivindicacion 1 o 2, en la que la reduccion de la absorcion de metal pesado se determina haciendo crecer plantas de tabaco con y sin la mutacion en condiciones identicas sobre un medio lfquido que contiene el metal pesado y comparando la concentracion del metal pesado en la hoja, tallo o brote de la planta de tabaco con la mutacion con la concentracion del metal pesado en la hoja, tallo o brote de la planta de tabaco que no presenta la mutacion.
4. Planta de tabaco segun una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la mutacion reduce la absorcion del metal pesado en por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 75% o por lo menos 95%.
5. Planta de tabaco segun una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la mutacion reduce la absorcion de cadmio, plomo o arsenico.
6. Planta de tabaco segun una de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la mutacion es una mutacion de sentido erroneo, una mutacion sin sentido o una mutacion de corte y empalme.
7. Planta de tabaco segun la reivindicacion 6, en la que la mutacion se selecciona de entre el grupo que comprende las mutaciones: G294A, C576T, G406A, G347A, G363A, G553A, G290A, C374T, G964A, G1168A, G1211A, G1126A, C980T, G1195T, G1156A, G1070A, C2302T, G2208A, C2217T, G2190A, C2206T o C2277T en SEC ID n°:1 o la homologa.
8. Planta de tabaco segun una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la planta comprende una mutacion en mas de un gen HMA 4.

9 Planta de tabaco segun una de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la planta es homocigotica para la mutacion en el gen HMA 4.
10. Planta de tabaco segun una de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la planta es homocigotica para mutaciones en ambos genes HMA 4.
11. Parte de una planta de tabaco segun una de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la parte es una hoja, una lamina, una hoja, rafz, brote, tallo, flor o semilla cortados y/o curados, y en la que la parte comprende por lo menos una mutacion en un gen HMA, en la que el gen HMA no mutado comprende la secuencia nucleotfdica de SEC ID n°:1 o una secuencia homologa con una identidad de por lo menos 90% respecto a la secuencia de SEC ID n°:1, en la que la mutacion provoca una sustitucion o una supresion o una insercion de por lo menos un aminoacido en el polipeptido codificado por la secuencia nucleotfdica, y en la que la mutacion reduce la absorcion de metal pesado por las hojas de la planta en por lo menos 30% en relacion con la absorcion de metal pesado de las plantas que comprenden SEC ID n°:1 o la homologa.

12 Parte de una planta de tabaco segun la reivindicacion 11, en la que la planta de tabaco es una planta de Nicotiana tabacum.
13. Producto de tabaco que comprende una planta de tabaco segun una de las reivindicaciones 1 a 10 o una parte de una planta de tabaco segun la reivindicacion 11 o 12.
14. Producto de tabaco segun la reivindicacion 13, en el que el producto de tabaco es un tabaco cortado, extracto de tabaco o tabaco reconstituido, o un producto de tabaco sin humo, como tabaco de mascar de tipo snus o rape.
15. Artfculo para fumar que comprende plantas de tabaco segun una de las reivindicaciones 1 a 10 o partes de una planta de tabaco segun las reivindicaciones 11 a 12.
16. Artfculo para fumar segun la reivindicacion 15, que es un cigarrillo, un purito, cigarrito, un puro o un artfculo para fumar simulado que contiene tabaco.