RU2788733C1 - Способ получения нетрансгенных мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина - Google Patents
Способ получения нетрансгенных мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788733C1 RU2788733C1 RU2021140026A RU2021140026A RU2788733C1 RU 2788733 C1 RU2788733 C1 RU 2788733C1 RU 2021140026 A RU2021140026 A RU 2021140026A RU 2021140026 A RU2021140026 A RU 2021140026A RU 2788733 C1 RU2788733 C1 RU 2788733C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tobacco plants
- plants
- carried out
- pmt
- tobacco
- Prior art date
Links
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 title claims abstract description 34
- 240000008962 Nicotiana tabacum Species 0.000 title claims abstract description 24
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 title claims abstract description 18
- 229960002715 Nicotine Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 229930015196 nicotine Natural products 0.000 title claims abstract description 18
- 230000002829 reduced Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 17
- 108091022065 Putrescine N-methyltransferases Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims abstract description 10
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims description 13
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 claims description 10
- 230000002068 genetic Effects 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 229920002391 Guide RNA Polymers 0.000 claims description 7
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 102100004985 GUSB Human genes 0.000 claims description 6
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 claims description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming Effects 0.000 claims description 5
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000001744 histochemical Effects 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 4
- 229920000033 CRISPR Polymers 0.000 claims description 3
- 108010082319 CRISPR-Associated Protein 9 Proteins 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 claims description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 claims description 3
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002609 media Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-Naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SOPPBXUYQGUQHE-JTQLQIEISA-N Anatabine Chemical compound C1C=CCN[C@@H]1C1=CC=CN=C1 SOPPBXUYQGUQHE-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 230000025458 RNA interference Effects 0.000 description 2
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002987 rna-interference Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010066133 EC 1.5.1.11 Proteins 0.000 description 1
- 210000002615 Epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 206010036618 Premenstrual syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloids Natural products 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000001488 breeding Effects 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000000888 organogenic Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000001743 silencing Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000391 smoking Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к генетической инженерии высших растений, в частности к способу получения нетрансгенных мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина путем нокаута генов семейства путресцин-N-метилтрансферазы (РМТ). Данный способ позволяет в поколениях от самоопыления получать нетрансгенные стабильные мутантные линии табака со сниженным содержанием никотина. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии высших растений, и касается способа получения низконикотиновых нетрансгенных мутантных растений табака путем нокаута генов семейства путресцин-N-метилтрансферазы (РМТ).
Табак является перспективной культурой в качестве системы синтеза рекомбинантных белков для фармацевтики, промышленности и ветеринарии, а никотин является загрязняющим веществом для таких систем. Снижение содержания никотина в растениях табака является актуальной задачей, поскольку в настоящее время нарастает тренд на отказ от никотина в курительном табаке, что порождает спрос на низконикотиновые сорта.
Известен способ получения растений табака со сниженным содержанием никотина путем сайленсинга генов семейства путресцин-N-метилтрансферазы [1]. Недостатком способа является повышение содержания анатабина в листьях модифицированных растений.
Наиболее близким к заявленному способу - прототипом, является способ получения растений табака со сниженным содержанием никотина путем РНК-интерференции [2]. В качестве мишени для подавления РНК был выбран фрагмент длиной 540 п.н. Фрагменты ДНК лигировали в вектор pHANNIBAL в прямой и обратной ориентации под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и терминатора октопинсинтазы (OCS). Экспрессионная кассета переносилась в вектор pCAMBIA1301, которая затем переносилась в штамм Agrobacterium tumefaciens ЕНА105, который затем использовали для трансформации листовых эксплантов табака.
К недостаткам РНК-интерференции методом агробактериальной трансформации относится получение регенерантов с очень широким спектром содержания никотина и нестабильностью супрессии.
Задачей настоящего изобретения является получение генетически-стабильных линий растений табака с нокаутом генов семейства путресцин-N-метилтрансферазы путем использования технологии геномного редактирования.
Технический результат: повышение эффективности способа получения табака со сниженным содержанием никотина за счет нокаута генов семейства РМТ, обеспечивающего получение стабильных линий.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
Осуществляют подбор (дизайн) специфической направляющей РНК (нРНК), имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 3.
Фрагмент ДНК, кодирующий нРНК, синтезируют с помощью гибридизации пары специфических F (прямой) и R (обратный) олигонуклеотидов: PMT_RGEN_F, имеющего последовательность SEQ ID NO 1 и PMT_RGEN_R, имеющего последовательность SEQ ID NO 2.
В табл. 1 (см. в графической части) представлена структура используемых олигонуклеотидов и направляющей РНК. В перечне последовательностей представлены нуклеотидные последовательности используемых олигонуклеотидов и направляющей РНК.
Далее конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК (рМТ) путем клонирования фрагментов ДНК, кодирующих специфичную направляющую РНК (нРНК) в вектор, содержащий систему для редактирования генома, pSI57 [3]. В результате получают рекомбинантную плазмидную ДНК рМТ (размером 9265 п.н.), обеспечивающую мутагенез.
Плазмида состоит из следующих элементов (фиг. 1):
- фрагмента ДНК векторной плазмиды (pSI57) размером 9244 п.н.;
- фрагмента ДНК, содержащего последовательность направляющей РНК размером 21 п.н. (нРНК).
Созданную генетическую конструкцию используют для мутагенеза генов семейства путресцин-N-метилтрансферазы. Для этого смешивают полученную плазмиду рМТ с плазмидой pBi 121, несущей ген устойчивости к канамицину и ген-репортер β-глюкуронидазы (GUS) Е. coli. Далее иммобилизуют смесь плазмид на золотых частицах и проводят трансформацию листовых эксплантов табака (Nicotiana tabacum) путем бомбардировки золотыми частицами при помощи генной пушки. Получают растения-регенеранты путем селекции на средах с добавлением канамицина. Отбор трансформантов осуществляют при помощи метода гистохимического окрашивания с реактивом X-Gluc, а отбор мутантных растений-регенерантов осуществляют при помощи секвенирования по Сэнгеру [4].
Определяющими отличительными признаками заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
- вместо интерферирующей РНК для подавления функции генов путресцин-N-метилтрансферазы используют мутагенез методом геномного редактирования, что позволяет получить генетически-стабильные низконикотиновые растения табака.
- трансформацию растений табака осуществляют при помощи генной пушки (вместо агробактериальной трансформации), что позволяет использовать сразу несколько плазмид (рМТ для внесения направленных мутаций и pBi121 для осуществления селективного отбора растений-регенерантов);
- отбор растений-регенерантов осуществляют при помощи метода гистохимического окрашивания с реактивом X-Gluc, что позволяет быстро обнаружить функциональную встройку трансгена.
- конструкции для селективного отбора и конструкции для геномного редактирования собирают в разных плазмидах, что позволяет существенно снизить вероятность получения генетических химер, и развития нежелательных побочных эффектов за счет того, что при использовании данного метода, конструкции для геномного редактирования экспрессируются транзиентно.
Предлагаемый способ позволяет в поколениях от самоопыления получить нетрансгенные стабильные мутантные линии табака со стабильно сниженным содержанием никотина.
Изобретение поясняется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1. Конструирование генетической конструкции рМТ.
Клонирование фрагментов ДНК, кодирующих сайт-специфические последовательности нРНК, в составе вектора pSI57 осуществляли в один этап посредством лигирования.
В конструкцию собирали два фрагмента: фрагмент ДНК, кодирующий специфичную нРНК, и фрагмент плазмиды pSI57, содержащий ген нуклеазы Cas9, ген каркаса нРНК и ген устойчивости к ампициллину. Полученную плазмиду обозначали как рМТ.
Для синтеза фрагментов ДНК, кодирующих специфичную нРНК, производили реакцию гибридизации пары F и R олигонуклеотидов, структура которых представлена в таблице 1.
Программа: Денатурация (95°С, 5 мин), отжиг (95-85°С - 2°С/сек, 85-25°С - 0,1°С/сек). Параллельно с гибридизацией олигонуклеотидов обрабатывали плазмиду pSI57 рестриктазой BstV2I (2 ч при температуре 55°С). Очищали набором для очистки ДНК от реакционной смеси (БиоСилика).
Следующим этапом проводили реакцию лигирования. Состав реакционной смеси: 50 нг порезанной и очищенной плазмиды рМТ, 10 пмоль гибридизованных олигонуклеотидов (см. Таблицу 1), 1 мкл 10х лигазного буфера (СибЭнзим), 0,5 мкл Т4 лигазы, вода (H2O) до V=10 мкл. Инкубировали смесь 3 ч при температуре 16°С.
Полученной лигазной смесью трансформировали хемокомпетентные клетки Е. coli DH10B стандартным способом [5].
Трансформированные бактерии выращивали в чашках Петри на агаризованной среде LB с добавлением антибиотика ампициллина (200 мкг/мл) в течение 12 ч при температуре 37°С. Далее полученные колонии переносили в жидкую среду LB (с ампициллином 200 мкг/мл) и выращивали ночную культуру в термостатируемом шейкере при температуре 37°С.
После выделения плазмиды рМТ из ночной культуры клеток проводили их скрининг на наличие встройки методом рестрикционного анализа. Для рестрикционного анализа проводили гидролиз исходного вектора и всех выделенных плазмид по сайтам рестрикции BstV2I и Sfr274I. После рестрикционного анализа проверяли наличие встройки секвенированием по Сэнгеру.
Пример 2. Получение нетрансгенных мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина.
Полученную по примеру 1 конструкцию рМТ, несущую фрагмент, кодирующий направляющую РНК, которая нацеливает нуклеазу Cas9 на гены семейства путресцин-N-метилтрансферазы, использовали для трансформации растений табака (Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana линии SRI) с помощью генной пушки. Для биобаллистики брали крупные, здоровые листья растений табака из культуры in vitro без признаков некроза. Готовили смесь из двух генетических векторов, содержащую плазмиду рМТ и вектор pBi121, несущий ген устойчивости к канамицину и ген-репортер β-глюкуронидазы (GUS) Е. coli. Полученную смесь наносили на золотые частицы и доставляли в клетки эпидермиса нижней стороны листьев растений табака при помощи генной пушки (Bio-Rad PDS-1000 Не) при следующих условиях: размер золотых частиц 1 мкм, разрывной диск 1100 пси, расстояние 6 см, вакуум при выстреле 27 мм рт.ст.
Трансформированные экспланты инкубировали на каллусообразующей питательной среде (MS), содержащей 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) (Sigma-Aldrich) и 0,1 мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК) (Sigma-Aldrich) с добавлением селектирующего агента канамицина (100 мг/л) до каллусообразования. Полученные каллусы перемещали на среду MS с добавлением 0,1 мг/л БАП без канамицина для органогенеза и регенерации, затем получали первичные растения-регенеранты. Полученные растения были пересажены на среду MS (Murashige and Skoog) без гормонов и проанализированы на наличие мутаций в целевых локусах генов семейства путресцин-N-метилтрансферазы. Трансгенность полученных каллусов и регенерантов проверяли методом гистохимического окрашивания с реактивом X-Gluc для выявления активности гена β-глюкуронидазы. Ткани каллусов и регенерантов помещали в раствор, содержащий 950 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и 50 мкл X-Gluc и осуществляли инфильтрацию путем вакуумирования. Далее инкубировали образцы (ткани каллусов) в течение 24 ч при температуре 37°С. После инкубирования образцы промывали 70% этанолом 3-кратно и проводили визуальную оценку окрашивания тканей каллусов и регенерантов.
Было получено два органогенных каллуса, один из которых, обозначенный РМТ(1), дал начало популяции клонов-регенерантов, поддерживаемых in vitro. Данная линия была проанализирована методом ПЦР-секвенирования по Сэнгеру на предмет мутаций в генах РМТ, и показано присутствие мутаций, приводящих к нокауту генов РМТ в полученной линии. Клоны-регенеранты выращивали в гидропонном комплексе до формирования соцветий, созревания и достижения максимального размера. Полученные из семян mut PMT поколения Т1 выращивали in vitro и отбирали нетрансгенные растения. Нетрансгенные мутантные растения поколения Т1 были проанализированы на содержание никотина в листовой ткани методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Для измерения использовали растения, выращенные в условиях гидропонного комплекса, одного возраста при достижении максимального размера, с каждого растения отбирали созревшие листья на трех уровнях: первый уровень - 2-й лист снизу; второй уровень - средний лист на стебле и третий уровень - 2-й лист вниз от соцветия). Собранные листья растений табака мелко нарезали, удаляли жилки, помещали во флаконы и замораживали в жидком азоте. Высушивание листьев табака проводили в лиофильной сушилке ИНЕЙ-4, производительность 40 г воды/час, вакуум 7 Па, температура - 30°С. Время высушивания составляло от 6 до 16 часов. Лиофильно высушенное сырье измельчали, навеску (0.2÷0.5 г) заливали 0.1% HCl в 40% водном метаноле и экстрагировали на качалке с перемешиванием в течение 24 ч при температуре 25°С. Осадок отделяли центрифугированием, экстракт анализировали с использованием системы ВЭЖХ Agilent Infinity 1260. Результаты измерений приведены в таблице 2 (см. в графической части).
В качестве контрольных растений использовалась исходная линия табака Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana линии SRI.
Из представленных в таблице 2 данных видно, что полученные нетрансгенные мутантные растения табака имеют пониженный в 2 раза уровень содержания никотина, по сравнению с контрольными растениями.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать стабильные линии нетрансгенных мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина, что упрощает использование табака в качестве модельного растения в биоинженерии и в производстве рекомбинантных белков, где никотин и подобные ему алкалоиды нежелательны.
Источники информации
1. Y. Chintapakorn and J.D. Hamil. (2003) Antisense-mediated down-regulation of putrescine N-methyltransferase activity in transgenic Nicotiana tabacum L. can lead to elevated levels of anatabine at the expense of nicotine. Plant Molecular Biology 53: 87-105.
2. Wang, P., Liang, Z., Zeng, J., Li, W., Sun, X., Miao, Z., and Tang, K. (2008) Generation of tobacco lines with widely different reduction in nicotine levels via RNA silencing approaches. J. Biosci., 33, 177-184.
3. Костина H.E., и др. Создание линии табака со сниженными антифидантными свойствами по отношению к колорадскому жуку. Биотехнология и селекция растений. 2020;3(1):24-30).
4. Sanger F., S. Nicklen, and A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12:5463-5467.
5. Мазин A.B. Методы молекулярной генетики и генной инженерии: научное издание / А.В. Мазин, К.Д. Кузнеделов, А.С. Краев: АН СССР. Сиб. отд-е. Ин-т цитологии и генетики. - Новосибирск: Наука. Сиб. отд-е, 1990. - 247 с.
Перечень последовательностей
| <110> | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук» (ИЦиГ СО РАН) |
| <120> | Способ получения нетрансгенных мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина |
| <160> | Номер SEQ ID NO 1 |
| <210> | 1 |
| <211> | 25 |
| <212> | Олигонуклеотид |
| <213> | Искусственная последовательность |
| <400> | 1 |
attgacctcaaagagcatgacatct
| <160> | Номер SEQ ID NO 2 |
| <210> | 2 |
| <211> | 25 |
| <212> | Олигонуклеотид |
| <213> | Искусственная последовательность |
| <400> | 2 |
aaacagatgtcatgctctttgaggt
| <160> | Номер SEQ ID NO 3 |
| <210> | 3 |
| <211> | 21 |
| <212> | Олигонуклеотид |
| <213> | Искусственная последовательность |
| <400> | 3 |
acctcaaagagcatgacatct
Claims (3)
1. Способ получения нетрансгенных мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина путем мутагенеза генов семейства путресцин-N-метилтрансферазы, включающий дизайн специфической РНК, клонирование фрагмента ДНК, кодирующего специфическую РНК, в вектор, последующую трансформацию растений табака полученной плазмидой, регенерацию их на селективной среде и отбор трансформантов, отличающийся тем, что проводят прямой мутагенез генов семейства путресцин-N-метилтрансферазы методом геномного редактирования посредством нуклеазы Cas9, при этом трансформацию листовых эксплантов табака осуществляют путем бомбардировки золотыми частицами при помощи генной пушки, для чего готовят смесь из двух генетических векторов, содержащую плазмиду рМТ и вектор pBi121, несущий ген устойчивости к канамицину и ген-репортер β-глюкуронидазы Е. coli, полученную смесь наносят на золотые частицы и доставляют в клетки эпидермиса нижней стороны листьев растений табака при помощи генной пушки, а отбор трансформантов выполняют при помощи гистохимического окрашивания с реактивом X-Gluc, при этом плазмиду рМТ конструируют с использованием специфической направляющей РНК (нРНК), имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 3, а фрагмент ДНК, кодирующий нРНК, синтезируют с помощью гибридизации пары специфических олигонуклеотидов, имеющих последовательности SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бомбардировку проводят золотыми частицами размером 1 мкм, разрывной диск 1100 пси, расстояние 6 см, вакуум при выстреле 27 мм рт.ст.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отбор мутантных растений-регенерантов осуществляют при помощи секвенирования по Сэнгеру.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2788733C1 true RU2788733C1 (ru) | 2023-01-24 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WANG P. et al., Generation of tobacco lines with widely different reduction in nicotine levels via RNA silencing approaches. J Biosci. 2008. Vol. 33. No. 2. Pp. 177-184. STEPPUHN A. et al., Nicotine's defensive function in nature. PLoS Biol. 2004. Vol. 2. No. 8. Art. E217. КОСТИНА Н.Е. и др., Создание линии табака со сниженными антифидантными свойствами по отношению к колорадскому жуку. Биотехнология и селекция растений. 2020. Том. 3. N. 1. Стр. 24-30. CARTER M., SHIEH J. Gene Delivery Strategies. Chapter 11. In: Guide to Research Techniques in Neuroscience (Second Edition). Eds: Matt Carter, Jennifer Shieh. Academic Press: 2015, pp. 239-252. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8383891B2 (en) | Wuschel (WUS) gene homologs | |
| EP1959725B1 (en) | Increased seed size and seed number through transgenic over expression of a growth and/or development related gene during early embryo development | |
| US20050198702A1 (en) | Seed-preferred promoter from maize | |
| US6407315B1 (en) | Seed-preferred promoter from barley | |
| JP2011101653A (ja) | 植物において導入遺伝子を発現するための方法および組成物 | |
| JPH11510056A (ja) | 根皮層に特異的な遺伝子プロモーター | |
| JP2003529353A (ja) | ケストルムイエローリーフカーリングウイルスプロモーター | |
| JP2013537412A (ja) | 植物形質転換率を高めるように改変されたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株 | |
| US7321031B2 (en) | Seed preferred regulatory elements | |
| CN116058286A (zh) | 烟草植物体及其制备方法 | |
| US7151170B1 (en) | Use of the BNM3 transcriptional activator to control plant embryogenesis and regeneration processes | |
| US7022894B2 (en) | Methods of transforming plants and identifying parental origin of a chromosome in those plants | |
| El-Shemy et al. | Isolation of soybean plants with stable transgene expression by visual selection based on green fluorescent protein | |
| KR100443487B1 (ko) | 암술 조직에 대한 특이적 활성을 지닌 프로모터 및 그의이용 | |
| RU2788733C1 (ru) | Способ получения нетрансгенных мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина | |
| RU2803332C2 (ru) | Способ получения мутантных растений табака со сниженным содержанием никотина | |
| US7659447B2 (en) | Increasing host plant susceptibility to agrobacterium infection by overexpression of the arabidopsis VIP1 gene | |
| US7560612B2 (en) | Early-inflorescence-preferred regulatory elements and uses thereof | |
| US7081566B2 (en) | Seed preferred regulatory elements | |
| EP2348109A1 (en) | Genes having activity of promoting endoreduplication | |
| JP2004528854A (ja) | 新規構成的植物プロモーター | |
| JP2001517450A (ja) | 花弁特異的プロモーターおよび花弁のない花を有する植物を作出する方法 | |
| US20030018995A1 (en) | Plants with a modified flower and seed development | |
| NZ566723A (en) | Isolated polynuceotides from Lolium species encoding the flowering inhibiting gene terminal flower | |
| KR100455620B1 (ko) | 벽판-특이적 아연 핑거 전사 인자 유전자를 이용한 화분수정률의 감소 방법 |