KR100443487B1 - 암술 조직에 대한 특이적 활성을 지닌 프로모터 및 그의이용 - Google Patents

Abstract

암술 조직에 특이적인 발현 활성을 지닌 신규한 프로모터가 제공된다. 프로모터는 서열번호 1의 포지션(position) 1에서 2595까지의 DNA 서열, 서열번호 2의 포지션 1에서 2322까지의 DNA 서열 및 서열번호 3의 포지션 1에서 2012까지의 DNA 서열 및 그의 일부분의 어느 하나를 지닌다. 프로모터에 실시가능하게 연결된 이형적 유전자를 식물 내로 도입시킴으로서 변형된 특성을 지닌 식물을 생성하기 위한 방법 및 그 방법에 의해 생성된 변형된 특성을 지닌 식물이 더욱 제공된다.

Description

암술 조직에 대한 특이적 활성을 지닌 프로모터 및 그의 이용{Promoter having specific activity to pistil tissue}

식물의 특성(즉, 꽃의 형태발생)을 조절하기 위한 메카니즘은 아라비돕시스(Arabidosis)Arabidosis thaliana), 안티리늄(Antirrhinum)(Antirrhinum majus) 및 페튜니아(Petunia hybrida)를 이용하여 분자생물학 및 분자유전학의 계통분류법에서 연구되어왔다. 특히 페튜니아는 연구 재료로 자주 선택된다. 그 이유는 페튜니아가 정원 식물로 큰 가치가 있고, 다양하며, 형질전환하기 용이하고, 꽃이 크고 보이며, 예를 들어 Hiroshi Takatsuji, "Molecular Mechanism Determining Shpaes of Plants", Saibo-kogaku, Syokubutsu-saibo-kogaku Series(Syujyunsya), pp. 96-106(1994)와 같이 많은 축적된 유전적 지식이 있기 때문이다.

조직-특이적 발현 활성을 지닌 프로모터를 증명하는 것은 매우 중요하다. 예를 들어 이형적 유전자가 조직-특이적으로 발현되기를 원할 경우 발현 카세트는 관심있는 이형적 유전자가 타겟 조직에 특이적인 발현 활성을 지닌 프로모터의 하류에 연결되도록(즉, 관심있는 이형적 유전자가 프로모터의 조절 하에 발현되도록 정렬됨) 구조된다. 발현 카세트는 식물에 도입되어 타겟 조직 내에서 관심있는 이형적 유전자의 특이적 발현을 가능하게 한다. 관심있는 식물 조직 내에서의 이형적 유전자의 특이적 발현은 식물에 변형된 특성을 나타내도록 할 수 있고, 따라서 연구 및 원예에 있어서 중대한 가치를 지닌다.

예를 들어 조직-특이적 프로모터 활성이 암술 조직 내에서 발견될 수 있을 경우 이형적 유전자는 유전자를 프로모터로 실시가능하게 연결하고, 이를 식물 내로 도입함으로서 암술 조직 내에서 특이적으로 발현될 수 있다. 예를 들어 이러한 암술 조직-특이적 발현을 이용함으로서 자성(female) 불임 및 자가-불친화성(incompatibility)의 특성이 식물에 부여될 수 있다.

수분작용(pollination)은 시듦을 촉진시키고, 꽃의 수명을 단축시키는 에틸렌의 합성을 유도한다고 알려져 있다. 또한 일반적으로 수분작용이 자성-불임성 식물 내에서의 에틸렌 합성을 유도하지 못하고 따라서 이러한 꽃의 수명은 연장된다. 자성 불임을 정원 품종 개화 식물에 부여하는 것은 개화 식물의 수명을 증진시키게 된다. 따라서 자성 불임의 식물에 부여하기 위한 기술은 원예 산업에 매우 중요하다.

통상적으로 식물에 자성 불임의 특성을 부여하기 위해 헤비 이온 빔(heavy ion beam) 조사 방법과 같은 돌연변이 기술이 시도되었다. 또한 하기의 생물공학적 방법이 보고되었다 : (1) 브라시카(Brassica)의 주두 조직에 특이적인 프로모터를 이용한 디프테리아(diphtheria) 독소의 발현(Kandasamy, M.K. et al., Plant Cell, 5:263-275(1993)); 및 (2) 토바코(tobacco)의 주두 조직에 특이적인 프로모터를 이용한 바나제(barnase)(세포 사멸을 유발하는 활성을 지닌 효소)의 발현(Goldman, M.H. et al., EMBO J., 13:2976-2984(1994)).

자가-불친화성은 이종교배의 효율성에 있어서 중요한 특성이다. 토바코(Nicotina)에 자가-불친화성을 부여하기 위한 기술은 화분을 제거하는 능력을 지닌 유전자(S-RNase 유전자)가 토바코로부터 유도된 Chi2:1의 프로모터를 이용하여 암술 전달 조직 내에서 특이적으로 발현되도록 발달되었다(Harikrishna, K. et al., Plant Mol. Biol., 30:899-911(1996)).

상기에 기술된 바와 같이 암술 조직에 특이적인 발현 활성을 지닌 프로모터의 증명은 과학적 연구뿐만 아니라 실용적 적용에도 중요하다. 이러한 프로모터가 분리될 수 있을 경우 정원 품종과 같이 유용한 식물의 특성 변형을 위해 매우 유용할 수 있다.

발명의 요약

본 발명에서 아연 핑거(finger)-타입 전사 인자(ZPT2-10, ZPT2-11 및 ZPT3-3)를 인코딩하는 3개의 유전자의 각각의 상류 구역으로부터의 3개 단편을 분리하였고(DNA의 3개의 단편은 각각 서열번호 1의 포지션(position) 1에서 2595까지의 DNA 서열, 서열번호 2의 포지션 1에서 2322까지의 DNA 서열 및 서열번호 3의 포지션 1에서 2012까지의 DNA 서열을 지닌다), 이러한 DNA 단편을 위한 유전자 발현 조절 기능을 시험하였다. 그 결과로 이러한 3개의 상류 구역 DNA 단편이 전달 조직, 주두 및 도관 관속과 같은 암술 조직에 특이적인 명확한 프로모터 활성을 지닌다는 것을 발견하였다.

본 발명은 :

(a) 서열번호 1에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2595까지의 서열을 지닌 DNA; 또는

(b) (a)의 서열의 일부분을 지니고, 적어도 하나 이상의 전달 조직 및 태좌 표면층에 특이적인 프로모터 활성을 지닌 DNA

로 구성된 프로모터에 관한 것이다.

또한 본 발명은 :

(c) 서열번호 2에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2322까지의 서열을 지닌 DNA; 또는

(d) (c)의 서열의 일부분을 지니고, 적어도 하나 이상의 전달 조직, 태좌 표면층, 주두 분비대 및 화탁에 특이적인 프로모터 활성을 지닌 DNA

로 구성된 프로모터에 관한 것이다.

또한 본 발명은 :

(e) 서열번호 3에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2012까지의 서열을 지닌 DNA; 또는

(f) (e)의 서열의 일부분을 지니고, 적어도 하나 이상의 암술 도관 관속 및 암술 화탁에 특이적인 프로모터 활성을 지닌 DNA

로 구성된 프로모터에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기에 기술된 프로모터 및 프로모터에 실시가능하게 연결된 이형적 유전자의 어느 하나로 구성된 발현 카세트에 관한 것이다.

또한 본 발명은 식물 세포 내로 상기 기술된 발현 카세트를 도입시키고; 발현 카세트가 식물체 내로 도입된 식물 세포를 재생시키는 단계로 구성된, 변형된 특성을 지닌 식물 생성 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 식물의 변형된 특성을 변형시키기 위한 발현 카세트의 이용에 관한 것이다. 발현 카세트는 식물 세포 내로 도입된다. 그 후 프로모터에 실시가능하게 연결된 이형적 유전자는 발현된다.

본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 기술된 특성은 번식성이고, 변형된 특성을 지닌 식물은 자성-불임성 식물이다.

본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 기술된 특성은 친화성이고, 변형된 특성을 지닌 식물은 자가-불친화성 식물이다.

본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 기술된 식물은 쌍자엽 식물이다. 바람직하게는 상기 쌍자엽 식물은 가지과 식물이고, 더욱 바람직하게는 페튜니아속 식물이다.

본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 기술된 이형적 유전자는 식물 발현 벡터 내로 통합된다.

또한 본 발명은 상기 기술된 방법의 어느 하나에 의해 생성된, 변형된 특성을 지닌 식물에 관한 것이다.

본 발명은 암술 조직에 대한 특이적 활성을 지닌 프로모터 및 그의 이용에 관한 것이다. 더욱 특별하게는 본 발명은 페튜니아(Petunia)로부터 유도된 신규한 프로모터인 PEThyZPT2-10 유전자의 프로모터(ZPT2-10 프로모터), PEThyZPT3-3 유전자의 프로모터(ZPT3-3 프로모터), 및 PEThyZPT2-11 유전자의 프로모터(ZPT2-11 프로모터) 및 그의 이용에 관한 것이다.

도 1은 PEThyZPT2-10(다음부터는 ZPT2-10으로 나타냄) 게노믹 유전자의 프로모터 구역, 코딩(coding) 구역 및 3'-비번역된 구역의 염기 서열 및 코딩 구역의 예견된 아미노산 서열을 나타낸 도식이다.

도 2는 PEThyZPT3-3(다음부터는 ZPT3-3으로 나타냄) 게노믹 유전자의 프로모터 구역, 코딩(coding) 구역 및 3'-비번역된 구역의 염기 서열 및 코딩 구역의 예견된 아미노산 서열을 나타낸 도식이다.

도 3은 PEThyZPT2-11(다음부터는 ZPT2-11로 나타냄) 게노믹 유전자의 프로모터 구역, 코딩(coding) 구역 및 3'-비번역된 구역의 염기 서열 및 코딩 구역의 예견된 아미노산 서열을 나타낸 도식이다.

도 4(a)∼(c)는 각각 (a) ZPT2-10 프로모터를 분석하기 위한 식물 발현 벡터(pBIN-ZPT2-10-GUS)의 구조, (b) ZPT3-3 프로모터를 분석하기 위한 식물 발현 벡터(pBIN-ZPT3-3-GUS)의 구조 및 (c) ZPT2-11 프로모터를 분석하기 위한 식물 발현 벡터(pBIN-ZPT2-11-GUS)의 구조의 개략도이다. 각각 GUS는 β-글루쿠로니다제(glucuronidase) 유전자를 나타내고, Pnos는 노팔린(nopaline) 합성효소 프로모터를 나타내고, Tnos는 노팔린 합성효소 종결자를 나타내고, NPTⅡ는 네오마이신(neomycin) 포스포트랜스퍼라제(phosphotransferase) 유전자를 나타낸다.

도 5(a)∼(c)는 (a) 주두 및 화주, (b) 자방 및 (c) pBIN-ZPT2-10-GUS이 도입된 페튜니아의 GUS-염색된 암술의 화주(횡단면)를 나타내는 사진이다.

도 6(a)∼(c)는 (a) 주두 및 화주, (b) 자방 및 (c) pBIN-ZPT3-3-GUS이 도입된 페튜니아의 GUS-염색된 암술의 화주(횡단면)를 나타내는 사진이다.

도 7(a)∼(c)는 (a) 주두 및 화주, (b) 자방 및 (c) pBIN-ZPT2-11-GUS이 도입된 페튜니아의 GUS-염색된 암술의 화주(횡단면; (d) 그의 확대면)를 나타내는 사진이다.

도 8(a)∼(c)는 (a) ZPT2-10 프로모터, (b) ZPT3-3 프로모터 및 (c) ZPT2-11 프로모터의 발현 사이트를 나타낸 도식이다.

도면에서 참조 숫자는 각각 화분(80), 화분관(80'), 주두(81), 분비대(82), 전달 조직(83), 화주(84), 자방(85), 배주(86), 태좌(87), 화탁(88) 및 도관 관속 조직(89)를 나타낸다. 각각의 프로모터의 발현 사이트는 두꺼운 비스듬한 선이 그어져있다.

본 발명은 하기에 더욱 상세히 기술될 것이다.

본 발명에 따라 암술 조직에 특이적인 발현 활성을 지닌 프로모터는 하기의 DNA의 어느 하나를 포함한다 :

(a) 서열번호 1에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2595까지의 서열을 지닌 DNA;

(b) (a)의 서열의 일부분을 지니고, 적어도 하나 이상의 전달 조직 및 태좌 표면층에 특이적인 프로모터 활성을 지닌 DNA;

(c) 서열번호 2에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2322까지의 서열을 지닌 DNA;

(d) (c)의 서열의 일부분을 지니고, 적어도 하나 이상의 전달 조직, 태좌 표면층, 주두 분비대 및 화탁에 특이적인 프로모터 활성을 지닌 DNA;

(e) 서열번호 3에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2012까지의 서열을 지닌DNA;

(f) (e)의 서열의 일부분을 지니고, 적어도 하나 이상의 암술 도관 관속 및 암술 화탁에 특이적인 프로모터 활성을 지닌 DNA.

바람직하게는 본 발명에 따른 프로모터는 하기의 DNA의 어느 하나를 포함한다 :

(a) 서열번호 1에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2595까지의 서열을 지닌 DNA;

(b)' (a)의 서열의 일부분을 지니고, 식물 내에서 발현될 경우 전달 조직 및 태좌 표면층에 특이적인 프로모터 활성을 지닌 DNA;

(c) 서열번호 2에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2322까지의 서열을 지닌 DNA;

(d)' (c)의 서열의 일부분을 지니고, 식물 내에서 발현될 경우 전달 조직, 태좌 표면층, 주두 분비대 및 화탁에 특이적인 프로모터 활성을 지닌 DNA;

(e) 서열번호 3에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2012까지의 서열을 지닌 DNA;

(f)' (e)의 서열의 일부분을 지니고, 식물 내에서 발현될 경우 암술 도관 관속 및 암술 화탁에 특이적인 프로모터 활성을 지닌 DNA.

특히 본 발명의 바람직한 프로모터는 페튜니아의 아연 핑거-타입 전사 인자를 인코딩하는 ZPT2-10, ZPT2-11 및 ZPT3-3 유전자의 프로모터이다. 이러한 프로모터는 각각 서열번호 1의 포지션 1에서 2595까지의 서열, 서열번호 2의 포지션 1에서 2322까지의 서열 및 서열번호 3의 포지션 1에서 2012까지의 서열을 지닌 DNA이다.

적어도 하나 이상의 암술 조직에 특이적인 프로모터 활성을 지니고, ZPT2-10, ZPT2-11 또는 ZPT3-3 유전자의 프로모터 구역 내에 있고, 조직-특이적 발현 활성에 비-필수적인 서열을 제거함으로서 수득되는 서열은 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 서열은 일반적으로 사용되는 방법에 따라 프로모터의 일부분을 삭제함으로서 수득된다. 간단히, 활성에 필수적인 구역이 증명될 수 있음으로서 ZPT2-10, ZPT2-11 및 ZPT3-3 유전자의 프로모터 구역의 다양한 삭제 돌연변이(즉, 각각 다양한 길이의 5'-상류 포지션으로부터 ZPT2-10, ZPT2-11 및 ZPT3-3 유전자의 프로모터 구역을 삭제함으로서 수득된 돌연변이)를 적당한 리포터 유전자(즉, GUS 유전자)와 융합한 플라스미드가 삭제 돌연변이의 조직-특이적 프로모터 활성을 측정하는데 사용된다.

프로모터 활성에 필수적인 구역이 증명되면 프로모터의 발현 활성은 강화되거나 또는 조직에 대한 발현 특이성은 상기 구역 또는 인접 구역의 서열을 더욱 변형함으로서 변형된다. 결과적인 변이체는 적어도 암술 조직에 특이적인 프로모터 활성을 지니는 한 본 발명의 범위 내에 있다.

여기 사용된 바와 같은 "조직-특이적 프로모터 활성"이라는 용어는 자연적으로-발생한 식물 또는 프로모터를 포함하는 발현 카세트가 도입된 식물 내에서의 어떤 특정 조직 내에서 특이적으로 발현되는 프로모터의 능력을 나타낸다. 여기서 "특이적으로"라는 용어는 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물체 내의 적어도 하나 이상의 다른 조직보다 특정한 조직 내에서 더 높다는 것을 나타낸다. 프로모터의 발현 활성의 수준은 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 미리측정된 조직 내에서의 프로모터의 발현 수준을 다른 조직 내에서 것과 비교함으로서 평가된다. 일반적으로 프로모터의 발현 수준은 프로모터의 조절 하에서 발현된 유전자 생성물의 생성량에 의해 측정된다. 여기서 사용된 바와 같은 프로모터의 "조직-특이적 발현 활성"이라는 용어 및 "조직-특이적 프로모터 활성"이라는 용어는 동일한 의미이다.

적어도 하나 이상의 암술 조직에 특이적인 발현 활성을 지니는 프로모터는 본 발명의 범위 내에 있다.

암술 조직의 예는 전달 조직, 태좌 표면충, 주두 분비대, 화탁 및 암술 도관 관속 및 그와 유사한 것을 포함한다(도 8 참조). 전달 조직 및 태좌 표면층은 배주에 닿기 위해 수분작용 후 화분이 화분관을 신장시키는 신장 통로이다. 주두 분비대는 화분이 부착되는 구역이다. 화탁은 꽃과 잎을 지닌 화경의 말단부이다.암술 도관 관속 시스템은 예를 들어 주두 분비대 내에서 암술의 기능에 필요한 물질(즉, 화분의 부착에 필요한 분비 생성물, 화분관의 신장 통로 내에서의 화분관의 확장을 촉진시키기 위한 내부 화합물 및 화주 및 주두에 필요한 영양분)을 공급하는데 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다.

식물의 특정에 있어서 여기서 사용된 바와 같은 "변형"이라는 용어는 형질전환 전 식물(야생형 또는 정원 품종)은 지니지 않은 특성이 형질전환 후 식물에 부여되거나 또는 형질전환 전 식물(야생형 또는 정원 품종)은 지니지 않은 식물 특성의 수준이 증가되거나 감소되는 것을 나타낸다. 이러한 특성 변형은 하기와 같이 수득된다 : 본 발명에 따라 프로모터에 실시가능하게 연결된 이형적 유전자가 식물에 도입되고; 이러한 형질전환된 식물 내에서 이형적 유전자가 본 발명의 프로모터의 조절 하에 조직-특이적으로 발현된다. 특성 변형의 수준은 식물의 특성(야생형 또는 정원 품종)을 형질전환 후와 형질전환 전을 비교함으로서 평가된다.

변형된 바람직한 특성의 예로 자성 불임성, 자가-불친화성 및 해충 저항성을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

본 발명의 프로모터는 예를 들어 프로브로서 알려진 cDNA를 이용하여 식물 게노믹 라이브러리를 스크린하고, 상응하는 게노믹 클론을 분리함으로서 수득된다. 이러한 cDNA의 예는 페튜니아-유도 아연 핑거-타입 전사 인자 ZPT2-10, ZPT2-11 및ZPT3-3을 포함한다.

게노믹 라이브러리를 준비하기 위한 방법, 프로브와의 하이브리디제이션을 위한 스트린전트 조건 및 유전자 클로닝을 위한 방법은 당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어 Maniatis et al., "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1998)을 참조하시오.

결과 유전자의 염기 서열은 당 분야에 알려진 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 방법에 의해 또는 통상적으로 유용한 자동 서열기를 이용하여 결정된다.

본 발명의 프로모터는 분리된 자연적으로-발생한 프로모터에 한정되지 않고, 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 합성된 폴리뉴클레오타이드는 당 분야 숙련자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 서열 또는 상기에 기술된 바와 같은 서열을 지닌 프로모터의 활성 구역을 합성하거나 변형함으로서 수득된다.

본 발명의 프로모터는 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 발현 카세트를 생성하도록 고안된 이형적 유전자에 실시가능하게 연결된다. 발현 카세트는 잘 알려진 재조합 기술을 이용하여 식물 세포 내로 도입된다. 도입된 발현 카세트는 식물 세포의 DNA 내로 통합된다. 식물 세포의 DNA는 염색체뿐만아니라 식물 세포 내의 다양한 세포 기관(즉, 미토콘드리아 및 엽록체) 내에 포함된 DNA를 포함한다.

여기서 사용된 바와 같은 "식물"이라는 용어는 단자엽 식물이나 쌍자엽 식물을 포함한다. 바람직한 식물은 쌍자엽 식물이다. 쌍자엽 식물은 고생화피식물아강(Archichlamiidae) 및 합판화아강(Sympetalidae)를 포함한다. 바람직한 아강은 합판화아강이다. 합판화아강은 용담목(Gentianales), 가지목(Solanales), 광대수염목(Lamiales), 칼리트리칼레스(Callitrichales), 질경이목(Plantaginales), 초롱꽃목(Campanulales), 능소화목(Scrophulariales), 루비알레스(Rubiales), 산토끼꽃목(Dipsacales) 및 아스테랄레스(Asterales)를 포함한다. 바람직한 목은 가지목이다. 가지목은 가지과(Solanaceae), 하이드로필라세(Hydrophyllaceae), 꽃고비과(Polemoinaceae), 새삼과(Cuscutaceae) 및 메꽃과(Convolvulaceae)를 포함한다. 바람직한 과는 가지과이다. 가지과는 페튜니아속, 가시독말풀속(Datura), 담배속(Nicotiana), 가지속(Solanum), 토마토속(Lycopersicon), 고추속(Capsicum), 꽈리속(Physalis) 및 라이시움(Lycium)을 포함한다. 바람직한 속은 페튜니아속, 가시독말풀속 및 담배속이고, 더욱 바람직하게는 페튜니아속이다. 페튜니아속은 페튜니아 하이브리다(P. hybrida), 페튜니아 악실라리스(P. axillaris), 페튜니아 인플라타(P. inflata), 페튜니아 비올라세(P. violacea) 및 그와 유사한 것을 포함한다. 바람직한 종은 페튜니아 하이브리다이다. "식물"이라는 용어는 특정화되지 않은 경우 식물체로부터 수득된 꽃 및 종자를 포함한 식물체를 나타낸다.

"식물 세포"의 예는 꽃, 잎 및 뿌리; 캘러스(callus); 및 현탁 배양 세포와 같은 식물 기관 내 조직의 세포를 포함한다.

여기에 사용된 바와 같은 "발현 카세트"라는 용어는 본 발명의 프로모터 및 프로모터에 실시가능하게 연결된 이형적 유전자(즉, 인 프레임으로(in frame))를 포함하는 핵산 서열을 나타낸다.

여기에 사용된 바와 같은 "이형적 유전자"라는 용어는 하기의 유전자의 어느 하나를 나타낸다 : ZPT2-10, ZPT2-11 및 ZPT3-3 이외의 페튜니아 내의 내생적 유전자; 또다른 식물의 내생적 유전자; 또는 식물 이외의 생물체로부터 유도된 외부 유전자(즉, 동물, 곤충, 박테리아 및 진균으로부터 유도된 유전자). 유전자 생성물의 발현은 암술 조직 내에서 고안된다.

"식물 발현 벡터"라는 용어는 발현 카세트 내의 프로모터 외에 숙주 식물의 세포 내에서 작동하도록 연결된 다양한 조절적 요소를 포함한 핵산을 나타낸다. 바람직하게는 조절적 요소의 예는 종결자, 약물-저항성 유전자 및 인핸서를 포함한다. 사용된 식물 발현 벡터의 타입 및 조절적 요소의 종류는 숙주 세포에 따라 다르다는 것은 당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 사용된 식물 발현 벡터는 T-DNA 구역을 더욱 포함한다. T-DNA 구역은 특히 아그로박테리움이 형질전환 식물로 사용될 경우 유전자 도입의 효율성을 증가시키는데 중요한 역할을 한다.

"종결자"라는 용어는 단백질을 인코딩하는 유전자의 구역의 하류에 위치한 서열을 나타내고, DNA에서 RNA로의 전사의 종결 및 폴리(poly)-A 서열의 첨가를 포함한다. 종결자는 mRNA의 안정성에 기여하고, 유전자의 발현양에 영향을 미친다고 알려져 있다. 종결자의 예는 CaMV35S 종결자 및 노팔린 합성효소 유전자의 종결자(Tnos)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

바람직한 "약물-저항성 유전자"는 형질전환된 유전자의 스크리닝을 촉진시킨다. 바람직하게는 약물-저항성 유전자의 예는 카나마이신(kanamycin)-저항성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제Ⅱ(NPTⅡ) 유전자 및 하이그로마이신(hygromycin)-저항성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

"인핸서"는 관심있는 유전자의 발현 효율성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 인핸서의 예는 CaMV35S 프로모터의 상류 서열을 포함하는 인핸서 구역을 포함한다. 다수의 인핸서는 단일 식물 발현 벡터에 사용될 수 있다.

본 발명의 식물 발현 벡터는 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 유전자 재조합기술에 의해 생성된다. 식물 발현 벡터를 구조하기 위해 예를 들어 pBI 타입 벡터 또는 pUC 타입 벡터가 바람직하게 사용되나 본 발명은 이들 벡터에 한정적인 것은 아니다.

식물 세포 내로 식물 발현 벡터를 도입하기 위한 당 분양의 숙련자에게 잘 알려진 방법은 예를 들어 아그로박테리움에 의해 매개된 방법 또는 세포 내로 벡터를 직접 도입하는 방법을 포함한다. 아그로박테리움에 의해 매개된 방법의 예는 Nagel et al.(FEMS Microbiol. Lett., 67:325(1990))에 의해 발달된 방법을 포함한다. 이러한 방법에서 아그로박테리움은 먼저 식물 발현 벡터를 이용하여 형질전환되고(즉, 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해), 그 후 형질전환된 아그로박테리움은 잎 디스크(disk) 방법과 같은 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 식물 세포 내로 도입된다. 식물 발현 벡터를 세포 내로 직접 도입하기 위한 방법의 예는 일렉트로포레이션 방법, 입자 총(particle gun) 방법, 인산칼슘 방법 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 방법을 포함한다. 이러한 방법은 당 분야에서 잘 알려져 있다. 형질전환되는 식물에 적당한 방법은 당 분야의 숙련자에 의해 이러한 방법으로부터 선택될 수 있다.

식물 발현 벡터가 도입된 세포는 카나마이신-저항성과 같은 약물-저항성에 의해 선택된다. 선택된 세포는 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 식물체 내로 재생된다.

재생된 식물체 내에서 관심있는 이형적 유전자의 발현은 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 확인된다. 이는 예를 들어 노던 블럿팅(northern blotting) 분석에 의해 수행된다. 특히 모든 RNA는 본 발명의 프로모터가 특이적으로 발현하는 조직으로부터 추출되고, 변성된-아가로스(agarose) 전기영동이 행해지게 되고, 적당한 멤브레인(membrane) 상에 블럿(blot)된다. 블럿된 멤브레인은 관심있는 이형적 유전자의 일부분에 상보적인 표지된 RNA 프로브를 이용하여 하이브리디제이션된다. 따라서 관심있는 이형적 유전자가 검출될 수 있다. 이형적 유전자가 형질전환된 식물에 내생적인 경우 본 발명의 프로모터가 특이적으로 발현하는 조직 내 관심있는 이형적 유전자의 mRNA의 양은 형질전환되지 않은 대조군 식물의 동일한 조직 내의 관심있는 이형적 유전자의 mRNA 양과 비교될 수 있고, 그에 의해 관심있는 이형적 유전자의 발현양에 있어서의 변화를 평가할 수 있다.

본 발명의 프로모터의 조직-특이적 발현 활성은 상기-기술된 방법을 이용하여 확인된다. 예를 들어 본 발명의 프로모터 및 GUS 유전자가 실시가능하게 연결된 발현 벡터를 이용한 형질전환된 식물의 GUS 활성 분포는 일반적으로 사용되는 조직화학적 염색 방법을 이용하여 시험될 수 있고, 그에 의해 프로모터의 조직-특이적 발현 활성을 증명할 수 있다.

본 발명에 따른 식물은 상기-기술된 방법에 의해 본 발명의 프로모터에 실시가능하게 연결된 관심있는 유전자를 이용하여 형질전환된 식물이다. 식물 내에서 관심있는 이형적 유전자는 본 발명의 프로모터의 조절 하에서 조직-특이적으로 발현되고, 식물 특성의 변형을 유발한다. 변형된 특성의 예는 번식성, 친화성 및 해충-저항성을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

본 발명에 따라 암술 조직에 특이적인 발현 활성을 지닌 페튜니아로부터 유도된 특정한 프로모터가 제공된다. 본 발명의 프로모터는 식물의 특성을 변형시키는데 이용된다. 예를 들어 이러한 프로모터의 조절 하에서 암술 조직(즉, 전달 조직, 태좌 표면층, 주두 분비대, 화탁 및 암술 도관 관속)을 손상시킬 수 있는 유전자 생성물이 조직 내에서 특이적으로 발현하고, 그에 따라 조직은 파괴되고 암술의 재생 기능은 억제된다. 그 결과로 식물은 자성 불임성의 특성이 부여된다. 또한 항-해충 활성을 지닌 단백질은 주두 내에서 발현되어 주두와 접촉하는 해충을 죽이거나 쫓아버릴 수 있는 해충-저항성 식물을 생성하는 것이 가능하게 한다.

하기에서 본 발명은 실시예에 의해 기술될 것이다. 본 발명의 범위는 이러한 실시예에만 한정되지 않는다. 본 발명에 이용된 제한 효소, 플라스미드 및 그와 유사한 것들은 상업적으로 유용하다.

(실시예 1) ZPT2-10 프로모터 구역의 분리 및 GUS 리포터 유전자의 결찰

방사성동위원소-표지된 프로브를 생성하기 위해 ZPT2-10의 cDNA(Kubo, K. et al., Nucleic Acids Research, 26:608-616(1998))이 일반적인 무작위 프라이머 방법(Smabrook et al., supra)을 이용하여 [α-³²P]dCTP로 표지되었다. EMBL3 벡터(Stratagene에 의해 제조된) 내에서 생성된 페튜니아(Petunia hybrida var Mitchell)의 게노믹 라이브러리는 표지된 프로브를 이용하여 스크린되었다. 결과 클론으로부터 유전자의 상류 구역을 포함하는 약 3.0 kb의 게노믹 DNA 단편이 pBluescriptSK 벡터 내의 EcoRV-XbaⅠ 사이트 내로 서브클론(subclone)되었고, 서브클론되었으며(pBS-ZPT2-10EX), 게노믹 DNA 단편의 염기 서열(서열번호: 1)의 서열화되었다(도 1 참조). 그 후 이러한 플라스미드는 BamHI 인식 서열(CCGGGGATCCATCATCTTGTAGAAGATCCAT; 서열번호: 4) 및 상업적으로 유용한 M13-20 프라이머가 사용되는 PCR을 수행하는데 주형으로서 이용되었다. 따라서 BamHI 사이트는 ZPT2-10 단백질의 번역 개시 포인트의 바로 하류에 도입되었다(도 1에 나타난 염기 서열의 포지션 2595). PCR에 의해 생성된 단편은 EcoRV 및 BamHI 사이트에서 분열되고, 결과적인 제한 단편은 pBluescript 벡터 내로 클론되어 단편이 서열화되었다. 그 후 클론된 벡터는 SalI 및 BamHI로 분열되었다. 결과적 DNA 단편은 상업적으로 유용한 pUCAPGUSNT의 GUS 코딩 구역의 상류에삽입되었다(pUCAP-ZPT2-10-GUS-NT). 따라서 GUS 구역은 ZPT2-10 유전자의 코딩 구역의 N-말단의 근접 구역에 인 프레임으로 연결되었다. 또한 pBIN-ZPT2-10-GUS를 수득하기 위해 AscI 및 EcoRI로 pUCAP-ZPT2-10-GUS-NT를 분열시킴으로서 수득된 DNA 단편(ZPT2-10의 프로모터, GUS, NOS 및 종결자를 포함한)은 pBINPLUS 벡터 내로 삽입되었다(도 4a).

(실시예 2) ZPT3-3 프로모터 구역의 분리 및 GUS 리포터 유전자의 결찰

실시예 1과 유사하게 ZPT3-3의 게노믹 DNA가 분리되었다. ZPT3-3의 상류 구역을 포함하는 약 2.5 kb의 DNA 단편(KpnI-EcoRI)이 pBluescriptSK 벡터 내로 서브클론되었다(pBS-ZPT3-3-KE). 그 후 DNA 단편의 염기 서열이 결정되었다(서열번호: 2)(도 2 참조). 플라스미드는 BamHI 인식 서열(CCGGGGATCCACATGACTTGTGTTTCT

CCAT; 서열번호: 5) 및 상업적으로 유용한 M13-20 프라이머가 사용되는 PCR을 수행하는데 주형으로서 이용되었고, 그에 의해 BamHI 사이트가 ZPT3-3 단백질의 번역 개시 포인트의 바로 하류에 도입되었다(도 1에 나타난 염기 서열의 포지션 2322). 이렇게-수득된 DNA 단편의 결찰은 ZPT3-3 및 GUS가 인 프레임으로 되도록 수행되었다. 실시예 1과 유사한 방식으로 pBIN-ZPT3-3-GUS가 생성되었다(도 4b).

(실시예 3) ZPT2-11 프로모터 구역의 분리 및 GUS 리포터 유전자의 결찰

실시예 1과 유사하게 ZPT2-11의 게노믹 DNA가 분리되었다. ZPT2-11의 상류 구역을 포함하는 약 2.1 kb의 DNA 단편(EcoRV-EcoRI)이 pBluescriptSK 벡터 내로 서브클론되었다(pBS-ZPT2-11-EE). 그 후 DNA 단편의 염기 서열이 결정되었다(서열번호: 3)(도 3 참조). 플라스미드는 BamHI 인식 서열(CCGGGGATCCTTCTTGCATTTGAACTTCCAT; 서열번호: 6) 및 상업적으로 유용한 M13-20 프라이머가 사용되는 PCR을 수행하는데 주형으로서 이용되었고, 그에 의해 BamHI 사이트가 ZPT2-11 단백질의 번역 개시 포인트의 바로 하류에 도입되었다(도 1에 나타난 염기 서열의 2012-포지션). 이렇게-수득된 DNA 단편의 결찰은 ZPT2-11 및 GUS가 인 프레임으로 되도록 수행되었다. 실시예 1과 유사한 방식으로 pBIN-ZPT2-11-GUS가 생성되었다(도 4C).

(실시예 4) ZPT2-10, ZPT3-3 및 ZPT2-11 프로모터 및 GUS의 융합된 유전자의 페튜니아 내로의 도입

(1) 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주(CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, CA)는 28℃에서 250㎍/ml의 스트렙토마이신(streptomycin) 및 50㎍/ml의 리팜피신(rifampicin)을 포함하는 L 배지 내에서 배양되었다. Nagel et al.'s 방법(supra)에 따라 세포 현탁액이 준비되었다. 실시예 1, 2 및 3에서 수행된 각각의 플라스미드 벡터를 균주 내로 각각 도입시키기 위해 일렉트로포레이션이 세포 현탁액 내에서 수행되었다.

(2) ZPT2-10, ZPT3-3 및 ZPT2-11 프로모터 및 GUS의 융합된 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기의 방법을 이용하여 페튜니아 세포 내로 도입되었다. 절차 (1)에서 수득된 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404 균주는 YEB 배지 내에서 진탕하면서 배양되었다(DNA Cloning, Vol. 2, p.78, D.M. Glover Ed., IRL Press, 1985)(28℃, 200 rpm). 그 후 결과 배양 배지는 멸균수로 20 인자에 의해 희석되었다. 희석된 배지는 페튜니아(Petunia hybrida var Mitchell) 잎의 조각과 동시-배양되었다. 2∼3일 후 잎 조각은 항생제를 포함하는 배지 내에서 배양되었고, 이로 인해 상기-기술된 박테리아를 제거하였다. 잎 조각은 2주 기본으로 선택적 배지 상에서 서브-배양되었다(subculture). 형질전환된 페튜니아 세포는 상기-기술된 3개의 융합된 유전자와 동반하여 도입된 pBINPLUS로부터 유도된 NPTⅡ 유전자의 발현에 기인한 카나마이신 저항성의 존재 및 부재에 따라 선택되었다. 선택된 세포는 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 캘러스 내로 도입되었고, 식물체 내로 재분화(redifferentiation)되었다.

(실시예 5) ZPT2-10 프로모터 활성의 조직 특이성

ZPT2-10 유전자의 상류 구역 및 GUS의 융합된 유전자는 식물 내로 도입되었다. 결과적 형질전환체의 꽃은 기질로서 X-GUS를 이용하여 GUS 활성의 분포에 대해 평가되었다(Gallagher, S.R. (Ed.). GUS 프로토콜(protocol) : 유전자 발현의리포터 유전자로서 GUS 유전자를 이용, Academic Press, Inc., San Die해(1992)). 그 결과로서 GUS 활성은 주두의 전달 조직의 세포층 및 암술 태좌의 최상층 내(즉, 태좌 표면층)에서 특이적으로 검출되었다(도 5 및 8(a)).

(실시예 6) ZPT3-3 프로모터 활성의 조직 특이성

ZPT3-3 유전자의 상류 구역 및 GUS의 융합된 유전자는 식물 내로 도입되었다. 결과적 형질전환체의 꽃은 실시예 5에서와 같이 GUS 활성의 분포를 평가하는데 이용되었다. 그 결과로서 GUS 활성은 주두 분비대, 주두의 전달 조직, 태좌 표면층 및 암술의 화탁 내에서 특이적으로 검출되었다(도 6 및 8(b)).

(실시예 7) ZPT2-11 프로모터 활성의 조직 특이성

ZPT2-11 유전자의 상류 구역 및 GUS의 융합된 유전자는 식물 내로 도입되었다. 결과적 형질전환체의 꽃은 실시예 5에서와 같이 GUS 활성의 분포를 평가하는데 이용되었다. 그 결과로서 GUS 활성은 주두에서 화주까지의 도관 관속 조직, 암술의 태좌 및 화탁 내에서 특이적으로 검출되었다(도 5 및 8(c)).

본 발명의 페튜니아-유도된 결과적 ZPT2-10, ZPT2-11 및 ZPT3-3 프로모터는 암술 조직에 특이적인 프로모터 활성을 나타낸다. 이러한 프로모터는 암술 조직을 유전적으로 설계함으로서 식물 특성의 변형에 유용하다.

본 발명은 출원전 발명자들의 불가피한 사정에 의해 공지되었는바 이에 대한 신규성 상실의 예외 규정의 적용을 요구합니다. 본 발명은 제21회 일본 분자생물학회 연회 프로그램 및 강연 요지집에 일부 개시되어 있고, 동 학회는 1998년 12월 16일부터 1998년 12월 19일까지 파시피코 요코하마에서 개최되었으며 이러한 프로그램과 강연 요지의 간행은 1998년 11월 25일자로 발간되었습니다. 동 간행은 제21회 일본 분자생물학회 편집위원회와 동경대학 의과학연구소에서 간행하였으며 그 연락처는 재단법인 학회센터 간사이 오피스이고, 그 주소는 일본국 도요나가시 신센리 히가시마치 1-4-2의 센리라이프사이언스센터빌딩 14층이며 전화번호는 (06)6873-2301이며 팩시밀리번호는 (06)6873-2300입니다.

<110> National Institute of Agrobiological Sciences Bio-oriented Technology Research Advancement Institution <120> Promoter having specific activity to pistil tissue <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3723 <212> DNA <213> Petunia hybrida <220> <221> promoter <222> (1)..(2595) <400> 1 gatatcgctt cactaccgtc tgttggtggc ccaatgacat ttagggggtc ggcgaaatta 60 actatttcac caccaatgat cacggtggtg gtggtggtgg cggcagcagg aatttcatcg 120 ccagaatggc tgctagagtt ctgagcagaa ttggtggcag acttcttctt tttttacaaa 180 gaagcttgtg attacgactt taattataga tttcaataag cacaaatagg aatttctctt 240 gcttcgaaat tgctacagtt ggaataagat aaagtaaaaa tggtggtgtg attaagtggg 300 catttatatg tgagaagtca tcattgtctt gggaaggagg acgaaatggc gcaacctttc 360 caacggtcgc cgcgtgtaac ggatgggaag gtgaagcgat ggctaccttt ttgaattact 420 tggcacacga gcagccacac cacttctccc gcttgttttt cattccactc ctcgggcact 480 ctggcaattg ctcgaggagt agggggacta tctgtactgg gcaaaatatg atttgcacac 540 gtagccgccg aagcataaag ttcgggatac tttttgcaag attcacaagt tggatgaggt 600 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atatatttcc acactccatt 840 atcactccaa ctaatttttt gtttctccaa aaataacaaa cgatttctct tctaatgcat 900 agctagcatc attgtaatta gatatatcta aagaaaattt acatgacaaa cttgtgatct 960 tatcagcaat taagatttaa gtctcatcaa gctctttcat tttccttttt actacttcta 1020 ccgctgctac tccaaatgaa aaaaacttgc ataaacactt ttgataggta agcaaatcgc 1080 acctatgaac ttttttaaaa taatttaatg gtgttgttcg agctactatt ttgtacacat 1140 ctaaattatt ttatatgtac tatctcacag gtattgaata attttgtcca ccaaaattta 1200 tcggtatatt gaaagaaatc atctaatgaa ttttacctta atttgtttgg atcatttcac 1260 ttcattcagt gttaggcgac gtccttttag gctatagaat tatacttatg gacttggcaa 1320 ttaaatttag tcattcttaa tgacaactga agctaaggta gttaattagt atttgatgat 1380 atatttaaaa aatgcttcaa actgtgaagt aacttaaagg gtgtgaaatt aaagagagat 1440 ttatttttct tctgtatttt ttaattgaag gcgcaaattg tgtggtgcca ggcttgcact 1500 ccaatcctcc acaaggtatc gttggcataa agtaatgggg tttgcttcaa agccaaccga 1560 atcttactcc tttcctcacc tcctcatact tctcattact cattacattg catcttcccc 1620 cccccccccc cccccccacg tccccaaacc ataacctcta tatacatata catataatca 1680 ccttatatat ataactatat atatcattgc ctatatatat aacttgcaaa gtttgtaagt 1740 gcaagaaaac agtgaacatt ttcaagatca ctattcacgg gggcggcttc tttttcactt 1800 tacctaaaat ctccctttca ttcactacca ctcttccaaa acacatatat acactcactg 1860 tgttacatcg ttttctccat tccctttgtg aaataaaaca tacctttgcc tcttcttttt 1920 gtttcttttt ccccacctct tgaaaaaggt cagtgacctt tgaattataa aaaaagacaa 1980 aggcactaca atggaagttc aaatgcaaga agatcatgat catcacatga atatggtgat 2040 caaaagaagg agaactaaaa gaccaagacc atcttctcct ctagctttaa caattgctac 2100 tagctcatgt agcaccgtgg aagggactca tgctggtgaa ttggacggac atgtggcgaa 2160 ttcgtcgtct tcgccttcaa attctgggat tgatatactt atcagaaata gagaagaaga 2220 agatatggct aattgtttga ttcttttagc acaaggtcat aataaccaaa agccgtctcc 2280 ttctcattct ccattggatg tctaccaatg caaaacatgc aaccgttgtt tcccttcgtt 2340 tcaagcactt ggtggacata gagcaagtca taaaaaacca aaactaccaa ccaacttaga 2400 agagaaaaat tcaaagccaa ttgaacatgt tgagaattgt tccaagtcga acgaggatca 2460 tgtcacaact ttgtcacttc aaatttcgaa caataatatt aacaacaaca acagcaacaa 2520 caacaacaac aataacatca tcaagaataa gaatagggtt catgaatgtt cgatttgtgg 2580 agcggaattt acttcagggc aagcattagg aggacacatg agacgacata gaccattacc 2640 aaatagtatt gcaattgcaa gtactagcca tgaattagag tcttctcatg aaataaagaa 2700 cacaaggaat ttcttgtcac tggaccttaa tctaccggcg cctgaagacg atcatcggcc 2760 agaaacgaaa ttctcatttg catcaaaaga acaagtcatc gtcttctcag cttctccttt 2820 ggttgattgc cattactaaa tcaacacact ggccctttat ttatttttcg ctattttttt 2880 tttttttgta tttcttgatt tattttaatc atgacacaat tgtgaattat tgttaacacc 2940 ttatttttat tattgtacat tcaacaattt attaatagac ataattcttt g 2991 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer <400> 4 ccggggatcc atcatcttgt agaagatcca t 31 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer <400> 5 ccggggatcc acatgacttg tgtttctcca t 31 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer <400> 6 ccggggatcc ttcttgcatt tgaacttcca t 31

Claims (19)

1. 서열번호 1에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2595까지의 서열을 지닌 DNA로 구성된 프로모터
2. 서열번호 2에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2322까지의 서열을 지닌 DNA로 구성된 프로모터
3. 서열번호 3에 나타난 염기 서열의 포지션 1에서 2012까지의 서열을 지닌 DNA로 구성된 프로모터
4. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 따른 프로모터와 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이형적 유전자로 구성된 식물 발현 카세트
5. 제 4항에 따른 발현 카세트를 식물 세포 내로 도입시키고; 발현 카세트가 식물체 내로 도입된 식물 세포를 식물체 내로 재생시키는 단계로 구성된 : 변형된 특성을 지닌 식물을 생성하기 위한 방법
6. 제 5항에 있어서, 상기 특성은 번식성이고, 변형된 특성을 지닌 식물은 자성-불임성 식물임을 특징으로 하는 방법
7. 제 5항에 있어서, 상기 특성은 친화성이고, 변형된 특성을 지닌 식물은 자가-불친화성 식물임을 특징으로 하는 방법
8. 제 5항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 식물임을 특징으로 하는 방법
9. 제 8항에 있어서, 상기 식물은 가지과 식물임을 특징으로 하는 방법
10. 제 9항에 있어서, 상기 식물은 페튜니아속 식물임을 특징으로 하는 방법
11. 제 5항에 있어서, 상기 발현 카세트는 식물 발현 벡터 내로 통합됨을 특징으로 하는 방법
12. 제 5항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 변형된 특성을 지닌 식물세포
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