JP4562127B2 - 遺伝子導入による植物の交雑特性の改変 - Google Patents
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Description
〔1〕下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAまたは該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物に導入遺伝子依存性不和合性を付与する薬剤。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA
〔2〕下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAまたは該DNAを含むベクターが導入された、導入遺伝子依存性不和合性を示す植物体を再生しうる植物細胞。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA
〔3〕〔2〕に記載の植物細胞から再生された、導入遺伝子依存性不和合性を示す植物体。
〔4〕〔3〕に記載の植物体の子孫またはクローンである、導入遺伝子依存性不和合性を示す植物体。
〔5〕〔3〕または〔4〕に記載の導入遺伝子依存性不和合性を示す植物体の繁殖材料。
〔6〕導入遺伝子依存性不和合性を示す植物体の生産方法であって、
(i)下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAまたは該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、および
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA
(ii)工程(i)においてDNAまたはベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
を含む方法。
(SK2:ZPT2-10融合遺伝子の作製)
ジャガイモ・キチナーゼ遺伝子SK2のプロモーター領域配列を含むDNA断片(940 bp)はRichard D. Thompson博士(Max Planc Institute, Germany)より分譲されたプラスミドpSK2/1(Ficker. et al. Plant Mol. Biol. 35, 1997, 425-431.)からXbaI、NcoIで切り出した。一方、pUC19ベクター中にZPT2-10 cDNA (1200 bp/配列番号:1)(Kubo. et al. Nucleic Acids res. 26, 1998, 608-616.)とNos terminator配列を含むプラスミドpUC-ZPT2-10-NTを鋳型に、ZPT2-10コード配列の開始ATGコドンの前にNcoIサイトを導入するようデザインした上流プライマー(5’-CAT GCC ATG GAT CTT CTA CAA GAT-3’/配列番号:3)とベクター中のM13(-20)プライマー(Stratagene)とを用いてPCRを行い、NcoI-ZPT2-10:Nos-terminator断片を得た。次に、SK2プロモーター断片と、NcoI-ZPT2-10::Nos-terminator断片を、順番にpBluescript SK+に挿入してSK2::ZPT2-10::Nos-terminator遺伝子を作製し、これをpGreen0029バイナリーベクター(Hellens. et al., Plant Mol. Biol. 42, 2000, 819-832.)に導入し、pGreen-SK2::ZPT2-10を得た(図1)。
(SK2:ZPT2-10融合遺伝子のペチュニア細胞への導入)
Hellensらの記述(Hellens. et al., Plant Mol. Biol. 42, 2000, 819-832.)に従い、pGreen-SK2::ZPT2-10を、pSoupプラスミドと混合し、エレクトロポレーション法によってAgrobacterium tumefaciens GV3101株に形質転換した。得られた形質転換アグロバクテリウムを用い、リーフディスク法によってペチュニアへ導入した(Jorgensen, R.A., Cluster, P.D., English, J., Que, Q., and Napoli, C.A. Plant Mol. Biol. 31, 1996, 957-973.)。
(交雑特性の検定)
SK2::ZPT2-10遺伝子導入ペチュニアの開花1-2日後の花の葯から花粉を採集し、同植物体中のあらかじめ除雄した長さ5 cm以上のつぼみ(開花1日前)の柱頭に授粉して自家受粉を行った。その結果、いずれの個体も正常な種子を生じた。一方、SK2::ZPT2-10遺伝子導入ペチュニアの花粉を野生株の雌しべに受粉した場合、およびその逆の組み合わせによる受粉を行った場合、3つの独立な形質転換系統において、結実が全く認めらないという現象が認められた(表1および図2)。この現象を導入遺伝子依存性不和合性(TDI: Transgene-Dependent Incompatibility)、このような交配特性を示す系統をTDI系統と呼ぶことにした。TDI系統のペチュニアは、交雑特性以外の形質には異常が認められない。
(TDI形質の遺伝)
TDI系統のT1世代を得るには独立な3系統のTDI系統T0個体の間で交配を行って種子を得た。T1世代について導入遺伝子と交雑形質を検定し、両者の連鎖について調査した。導入SK2::ZPT2-10遺伝子の遺伝を調べるには、各個体からゲノムDNAを抽出し、ZPT2-10遺伝子のcDNAをプローブとして用いてサザンブロット解析(Sambrook et al., Molecular Cloning., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)を行い、導入遺伝子特異的バンドの有無を調べた。その結果、T1個体の中には、SK2::ZPT2-10遺伝子を両親からそれぞれ遺伝したもの、片方の親から遺伝したもの、およびいずれからも遺伝しなかったものが、それぞれ存在することが判った(図3)。これらの各T1個体を用いて実施例3と同様の交配受粉を行い、交雑特性を検定した。その結果、TDI系統の親からSK2::ZPT2-10遺伝子を遺伝したすべてのT1個体が、親個体と同様、自家受粉および他のTDI系統との間の交配では稔性を示すが、野生株との交配においては不稔性を示すことがわかった(表2)。一方で、SK2::ZPT2-10遺伝子を遺伝しなかった個体では、一個体を除き、いずれの交配においても種子を生じ、全く正常な交配特性を示した。これらの結果は、TDI形質は、導入されたSK2::ZPT2-10遺伝子と強く連鎖し、後代に安定して遺伝することを示している。
TDI個体と非形質転換体の間での不和合性受粉において、受粉以降のどの段階における異常が不稔性の原因であるかを調査した結果、花粉管伸長過程での阻害は見られず、花粉管は正常に胚珠に到達するが、受精後の胚発生が中断されるために致死となることが判った(図4)。
Claims (6)
- ペチュニアに導入遺伝子依存性不和合性を付与する機能を有している下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAまたは該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、ペチュニアに導入遺伝子依存性不和合性を付与する薬剤。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1もしくは10アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:1に記載の塩基配列と96%以上の相同性を有するDNA。 - ペチュニアに導入遺伝子依存性不和合性を付与する機能を有している下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAまたは該DNAを含むベクターが導入された、導入遺伝子依存性不和合性を示すペチュニアを再生しうるペチュニア細胞。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1もしくは10アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:1に記載の塩基配列と96%以上の相同性を有するDNA。 - 請求項2に記載のペチュニア細胞から再生された、導入遺伝子依存性不和合性を示すペチュニア。
- 請求項3に記載のペチュニアの子孫またはクローンである、導入遺伝子依存性不和合性を示すペチュニア。
- 請求項3または4に記載の導入遺伝子依存性不和合性を示すペチュニアの繁殖材料。
- 導入遺伝子依存性不和合性を示すペチュニアの生産方法であって、
(i)ペチュニアに導入遺伝子依存性不和合性を付与する機能を有している下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAまたは該DNAを含むベクターをペチュニア細胞に導入する工程、および
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1もしくは10アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:1に記載の塩基配列と96%以上の相同性を有するDNA
(ii)工程(i)においてDNAまたはベクターが導入されたペチュニア細胞からペチュニアを再生する工程、
を含む方法。
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