WO2000071704A1

WO2000071704A1 - Promoteur exerçant une activite specifique sur les tissus du pistil

Info

Publication number: WO2000071704A1
Application number: PCT/JP1999/002692
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Takatsuji
Original assignee: National Institute Of Agrobiological Sciences; Bio-Oriented Technology Research Advancement Institution
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2000-11-30
Also published as: KR100443487B1; JP4134281B2; CA2374375A1; AU775138B2; AU7253500A; US7098382B1; KR20020012224A

Description

明細書

雌しベの各組織に特異的な活性を有するプロモーターおよびその利用技術分野

本発明は、雌しベの組織に特異的な発現活性を有するプロモーターおよびその利用に関する。本発明は、特に、ペチュニア由来の新規プロモーターである PE ThyZPT2- 10遺伝子のプロモー夕一（ZPT2-10プロモーター）、 PEThyZPT3- 3遺伝子のプロモー夕一（ZPT3- 3プロモーター）、および PEThyZPT2-l l遺伝子のプロモ一ター（ΖΠ2 - 1 1プロモ一夕一）、ならびにそれらの利用に関する。背景技術

植物の形質、例えば、花の形態形成の制御機構を解明するために、シロイヌナズナ (Arab i dops i s thai i ana . キンギヨソゥ (An t i r rh i nmn maj us)、およひペチュニァ（Pe t un i a hybr i da)を用いて、分子生物学的および分子遣伝学的に研究が行われている。特に、ペチュニアは、研究材料として好んで使用されている。その理由として、ペチュニアは、園芸植物として価値が高く多種多様な品種が存在すること、形質転換し易いこと、花が大きくて見やすいこと、および遺伝学的な知見の蓄積が豊富であることが挙げられる（高辻博志、「植物の形を決める分子機構」、細胞工学、植物細胞工学シリーズ（秀潤社）、 9fi〜106頁（] 994) ) 。組識特異的な発現活性を有するプロモーターを同定することは、極めて重要である。例えば、ある異種遺伝子を、組識特異的に発現させることが所望される場合、目的の組識において特異的な発現活性を有するプロモーターの下流に目的の異種遺伝子が連結された（すなわち、このプロモーターの制御下で発現されるように、目的の異種遺伝子が配置された）発現カセットを構築する。この発現カセットを植物に導入することによって、目的の組識において、目的の異種遺伝子を特異的に発現させ得る。異種遺伝子を植物の所望の組識において特異的に発現させることは、改変された形質を植物に付与し得る点において研究上および園芸上、価値が高いと考えられる。

例えば、組織特異的なプロモータ一活性が、雌しベの各組識のいずれかにおいて観察される場合、ある異種遺伝子を，このプロモーターに作動可能に連結して、植物に導入することによって、その雌しベの組識に特異的に発現させ得る。雌しベの組織についての、このような発現特異性を利用して、例えば、雌性不稔形質および自家不和合性の形質を植物に付与し得ると考えられる。

受粉によって合成が誘導されるエチレンは、花の萎凋を促進し、花保ちを悪くすることが知られている。雌性不稔植物は、一般に、受粉によるエチレン合成誘導が生じないので、花保ちがよいことが知られている。園芸品種の花卉に雌性不稔形質を付与することによって、花卉の花保ちを改善し得ると考えられる。従つて、雌性不稔の形質を付与する技術が、園芸産業にもたらす効果は大きい。

従来、雌性不稔形質を植物に付与する方法として、重イオンビーム照射法などの突然変異技術が試みられている。また、バイオテクノロジーによる手法として、 ( 1 ) アブラナの柱頭組識に特異的なプロモーターを用いてジフテリア · トキシンを発現させたこと（Kandasamy, M.K.ら、 Plant Cell, δ, 263-275 (1993) ) 、および（2) タバコの柱頭組識に特異的なプロモーターを用いて、 barnase (細胞死を引き起こす活性を有する酵素の 1つ）を発現させたこと（Goldman, . H. ら、 EMBO J.,. 13, 2976-2984 (1994) ) が報告されている。

一方、自家不和合性は、交雑育種の効率の観点から、重要な形質である。夕バコ（Nicotiana) においては、トマトの Chi2:l (Harikr is na. ら、 Plant Mol. Biol. , 30， 899-911 (1996) ) のプロモーターを用いて、花粉を排除する機能を備える遺伝子（S-RNase遺伝子）を、雌しベの通道組織（transmitting tissu e) に特異的に発現させることによって、自家不和合性を付与する技術が開発されている。

上記のように、雌しベの組織に特異的な発現活性を有するプロモーターを同定することは、学術研究のためだけでなく、実用上も重要である。このようなプ口モー夕一を単離できれば、園芸品種のような有用植物の形質を改変するにおいて非常に有用である。発明の開示

本発明者は、 3種のジンクフィンガー型転写因子（ZPT2- 10、 ZPT2-1K および ZPT3-3) をコードする遺伝子の上流領域 DNA (それぞれ、配列番号 1の 1位から 2 595位までの DNA配列、配列番号 2の 1位から 2322位までの DNA配列、.および配列番号 3の 1位から 2012位までの DNA配列）を単離し、遺伝子発現制御機能を試験した。その結果、本発明者は、これら 3種の上流領域 DNAは、通道組織、柱頭、維管束などの雌しベの組識について、互いに異なる、それぞれ特異的なプロモ一ター活性を有することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成された。本発明は、以下の（a ) または（b ) の DNAを含むプロモー夕一に関する：

( a ) 配列番号 1によって示される塩基配列の第 1位から第 2595位までの配列を有する DNA：または

( b ) ( a ) の一部の配列であって、通道組織および胎座表層のうちの少なくとも 1つに特異的なプロモーター活性を示す、 MA。

本発明はまた、以下の（c ) または（d ) の DNAを含むプロモーターに関する：

( c ) 配列番号 2によって示される塩基配列の第 1位から第 2322位までの配列を有する DNA；または

( d ) ( c ) の一部の配列であって、通道組織、胎座表層、柱頭分泌領域、および花托のうちの少なくとも 1つに特異的なプロモーター活性を示す、腿。

本発明はさらに、以下の（e ) または（ ί ) の DNAを含むプロモーターに関する：

( e ) 配列番号 3によって示される塩基配列の第 1位から第 2012位までの配列を有する DNA：または

( f ) ( e ) の一部の配列であって、雌しベの維管束および花托のうちの少なくとも 1つに特異的なプロモーター活性を示す、 DNA。

本発明はまた、上記のいずれかのプロモ一夕一と、このプロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む、発現カセッ卜に関する。

本発明はさらに、上記の発現カセットを植物細胞に導入する工程、および上記の発現カセッ卜が導入された植物細胞を植物体に再生する工程を包含する、形質が改変された植物を作出する方法に関する。

本発明はまたさらに、植物の形質を改変するための上記の発現カセッ卜の使用に関し、この発現カセットは植物細胞に導入され、上記のプロモー夕一に作動可能に連結された上記の異種遺伝子が発現される。

1つの実施態様において、上記の形質は稔性であり、形質が改変された植物は、雌性不稔植物である。

1つの実施態様において、上記の形質は和合性であり、形質が改変された植物は自家不和合性植物である。

1つの実施態様において、上記の植物は双子葉植物である。好ましくは、双子葉植物はナス科植物であり、より好ましくは、ペチュニア厲植物である。

1つの実施態様において、上記の異種遺伝子は植物発現用ベクターに組み込まれている。

本発明はさらに、上記のいずれかに記載の方法により作出された、植物の形質が改変された植物に関する。図面の簡単な説明

図 1は、 PEThyZP - 10 (以後、 ZPT2- 10と称する）ゲノム遺伝子のプロモー夕一領域、コード領域、および 3'非翻訳領域の塩基配列、ならびにコード領域の推定のアミノ酸配列を示す図である。

図 2は、 PEThyZPT3-3 (以後， ZPT3- 3と称する）ゲノム遺伝子のプロモー夕一領域、コード領域、および 3 '非翻訳領域の塩基配列、ならびにコード領域の推定のアミノ酸配列を示す図である。

図 3は、 PEThyZPT2-ll (以後、 ZPT2-11と称する）ゲノム遺伝子のプロモー夕

—領域、コード領域、および 3 '非翻訳領域の塩基配列、ならびにコード領域の推定のアミノ酸配列を示す図である。

図 4は、（ a) ZPT2- 10プロモーターを解析するための植物発現用べクタ一（pBI N-ZPT2-10-GUS)、（ b ) ΖΠ3- 3プロモ一夕一を解析するための植物発現用ベクター (pBIN- ZPT3- 3- GUS)、および（c) ZPT2- 11プロモーターを解析するための植物発現用ベクター（pBIN- ZPT2- 1卜 GUS)の構成をそれぞれ示す概略図である。 GUSは j3- グルクロニダーゼ遺伝子を、 Pnosはノパリン合成酵素プロモ一夕一を、 Tnosノパリン合成酵素ターミネ一夕一を、 NPTIIはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を、それぞれ示す。

図 5は、 ρΒΙΝ-ΖΡΠ- 10- GUSを導入したペチュニアの GUS染色した雌しベの

(a) 柱頭および花柱、（b) 子房、および（c) 花柱（横断面）を撮影した、生物の形態を示す写真である。

図 6は、 pBIN- ZPT3- 3- GUSを導入したペチュニアの GUS染色した雌しベの（a) 柱頭および花柱、（b) 子房、および（c) 花柱（横断面）を撮影した、生物の形態を示す写真である。

図 7は、 pBIN- ZPT2-1卜 GUSを導入したペチュニアの GUS染色した雌しベの (a) 柱頭および花柱、（b) 子房、および（c) 花柱（横断面；（d) はその拡大図である）を撮影した、生物の形態を示す写真である。

図 8は、（ a ) ΖΡΠ- 10プロモーター、（b) ZPT3- 3プロモーター、および (c) ZPT2- 11プロモーターの発現部位を示す模式図である。図中の符号は、それぞれ、花粉（80) 、花粉管（80' ) 、柱頭（81) 、分泌頜域（82) 、通道組織 (83) 、花柱（84) 、子房（85) 、胚珠（86) 、胎座（87) 、花托（88) 、および維管束組織（89) を示す。各プロモータ一の発現部位を、濃い斜線で示す。発明を実施するための最良の形態

本発明について、以下に、より詳細に説明する。

本発明における、雌しベの各組織のレ ^ずれかに組織特異的な発現活性を有するプロモーターは、以下の DNAのいずれかを含み得る：

(a) 配列番号 1によって示される塩基配列の第 1位から第 2595位までの配列を有する DNA；

(b) (a) の一部の配列であって、植物において発現される場合，通道組織および胎座表層のうちの少なくとも 1つに特異的なプロモーター活性を示す、 DN A；

(c) 配列番号 2によって示される塩基配列の第 1位から第 2322位までの配列を有する DNA；

(d) (c) の一部の配列であって、植物において発現される場合、通道組織、胎座表層、柱頭分泌領域、および花托のうちの少なくとも 1つに特異的なプロモ一ター活性を示す、 DNA；

(e) 配列番号 3によって示される塩基配列の第 1位から第 2012位までの配列を有する DNA；または

( f ) (e) の一部の配列であって、かつ植物において発現される場合、雌しベの維管束および花托のうちの少なくとも 1つに特異的なプロモーター活性を示す、好ましくは、本発明におけるプロモーターは、以下の DNAのいずれかを含み得る：

(b) ' (a) の一部の配列であって、植物において発現される場合、通道組織および胎座表層に、特異的なプロモーター活性を示す、飄；

(d) ' (c) の一部の配列であって、植物において発現される場合、通道組織、胎座表層、柱頭分泌領域、および花托に、特異的なプロモーター活性を示す、 DN

A；

0 ( f ) ' ( e ) の一部の配列であって、かつ植物において発現される場合、雌しベの維管束および花托に、特異的なプロモーター活性を示す、 DNA。

本発明において特に好ましいプロモーターは、ペチュニアのジンクフィンガー型転写因子をコードする ZPT2- 10、 ZPT2- 1 K および ΖΡΤ3- 3遺伝子のプロモーターである。このプロモーターは、それぞれ、配列番号 1の 1位から 2595位までの配列、配列番号 2の 1位から 2322位までの配列、および配列番号 3の 1位から 201 2 位までの配列を有する DNAである。

ZPT2- 1 0 , ΖΡΤ2- 1 1、および ΖΡΤ3-3遺伝子のプロモーター領域の、組識特異的な発現活性に必須でない配列を除去して得られる、雌しベの組織の少なくとも 1つに特異的な発現活性を有する配列は、本発明の範囲内にある。このような配列は、常法に従ってプロモーターのデリーション実験を行うことによって、得ることができる。簡潔には、 ZPT2- 10、 ZPT 2- 1 K および ΖΡ Τ3 - 3遺伝子のプロモーター領域の様々な欠失変異体（例えば、 ΖΡΠ- 10、 ΖΡΤ 2 - 1 1、および ΖΡΤ3-3遺伝子のプロモ一夕一領域を、 5 ' 上流側から種々の長さに欠失させた変異体）と、適切なレポ一ター遺伝子（例えば、 GUS遺伝子）とを融合したプラスミドを用いて、欠失変異体の組識特異的プロモー夕一活性を測定することによって、その活性に必須な領域を特定し得る。いったんプロモーター活性に必須の領域が特定されると、さらにその領域内の配列または隣接配列を改変して、プロモーターの発現活性の程度を高めたり、発現する組織についての特異性を変更させることも可能である。このようにして得られる改変体もまた、雌しベの組織の少なくとも 1つに特異的なプロモーター活性を示す限り、本発明の範囲内にある。

本明細書において、用語「組識特異的なプロモーター活性」とは、プロモ一夕一が、天然の植物中で、または発現カセットに組み込まれて植物に導入されたときに示す、ある組識において特異的に発現する能力を意味する。ここで、発現が「特異的」であるとは、ある組識において、同じ植物体の他の組織のうちの少なくとも 1つにおけるよりも、プロモーターの発現活性が高いことをいう。プロモータ一の発現活性の程度は、常法に従って、所定の組識におけるプロモーターの発現レベルと、他の組識における同じプロモー夕の発現レベルとを比較することによって、評価され得る。プロモーターの発現レベルは、通常、そのプロモーターの制御下で発現される遺伝子産物の産生量によって決定される。プロモーターの「組織特異的な発現活性」はまた、「組織特異的なプロモーター活性」と同義であるとして本明細書中で使用される。雌しベの組織のうちの少なくとも 1つに特異的な発現活性を示すプロモーターは、本発明において意図されるプロモータ一である。

雌しベの組織としては、通道組織、胎座表層、柱頭分泌領域、花托、および雌しべの維管束などが挙げられる（図 8を参照）。通道組織および胎座表層は、受粉後の花粉から伸長する花粉管が、胚珠に到達する際に通過する伸長経路である。柱頭分泌領域は、花粉が接着する領域である。花托は、花柄の先端の花および葉をつける部分である。雌しベの維管束系は、柱頭分泌領域において、雌しベの機能発現に必要な物質（例えば、花粉の接着に必要な分泌物、花粉管の伸長経路において花粉管の伸長を促進する充填化合物、花柱および柱頭への栄養物）の供給などにおいて重要な役割を果たすことが推測される組識である。

本明細書において、植物の形質について使用される用語「改変」とは、形質転換後の植物が、形質転換前の植物（野生種または園芸品種）には存在しない形質を付与されること、または形質転換前の植物（野生種または園芸品種）において存在する形質の程度が増強もしくは低減されることをいう。このような形質の改変は、本発明におけるプロモーターと作動可能に連結された任意の異種遺伝子が、この遺伝子を導入された形質転換植物において、本発明におけるプロモーターの制御下で組織特異的に発現された結果として生じ得る。この形質の改変の程度は、形質転換後の植物の形質を、形質転換前の植物（野生種または園芸品種）の形質と比較することにより評価され得る。

改変される好ましい形質としては、雌性不稔、自家不和合性、および害虫抵抗性などが挙げられる力これらに限定されない。

本発明のプロモーターは、例えば、公知の cDNAをプローブとして用いて、植物のゲノミックライブラリーをスクリーニングし、そして対応のゲノミッククロ一ンを単離することにより得ることができる。そのような cDNAの例としては、ペチュニァ由来のジンクフィンガー型転写因子である ZPT2- 10、 ZPT2- 1 1、および ZPT3 -3の cDNAが挙げられる。

ゲノムライブラリーの作製法、プローブとのハイブリダイゼ一シヨンに使用するストリンジェン卜な条件、および遺伝子のクロ一ニング法は、当業者に周知である。例えば、マニアテイスらの Mo l ecu l ar C l on i ng, A Labora t ory Manua l , 第 2版、 Co l d Spr i ng Harbo r Labora t ory Press , Co l d Spr i ng Harbor, New York ( 1989) を参照のこと。

得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自動シーケンサ一により決定し得る。

本発明におけるプロモーターは、天然から単離されたものに限定されず、合成ポリヌクレオチドも含み得る。合成ポリヌクレオチドは、例えば、上記のようにして配列決定されたプロモーターの配列またはその活性領域を、当業者に周知の手法によって合成または改変することにより入手し得る。

本発明におけるプロモーターは、当業者に周知の方法を用いて、所望の異種遺伝子と作動可能に連結された発現カセットとして，公知の遺伝子組換え技術を用いて、植物細胞に導入され得る。導入された発現カセットは、植物細胞中の DNA に組み込まれて存在する。なお、植物細胞中の DNAとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）に含まれる DNAをも含む。

本明細書において、用語「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物は、双子葉植物である。双子葉植物は、離弁花亜綱および合弁花亜綱のいずれも含む。好ましい亜綱は、合弁花亜綱である。合弁花亜綱は、リンドウ目、ナス目、シソ目、ァヮゴケ目、ォォバコ目、キキヨウ目、ゴマノハグサ目、ァカネ目，マツムシソゥ目、およびキク目のいずれも含む。好ましい目は、ナス目である。ナス目は、ナス科、ハゼリソゥ科、ハナシノブ科、ネナシ力ズラ科、およびヒルガオ科のいずれも含む。好ましい科は、ナス科である。ナス科は、ペチュニア属、チョウセンアサガオ属、タバコ属、ナス属、トマト属、トゥガラシ属、ホオズキ属、およびクコ属などを含む。好ましい属は、ペチュニア属、チョウセンアサガオ属、およびタバコ属であり、より好ましくは、ペチュニァ属である。ペチュニア属は、 P. hybr i da種、 P. ax i 1 l ar i s種、 P. in f l a i a種、および P. v i o l acea種などを含む。好ましい種は、 P. hybr i da種である。「植物」は、特に他で示さない限り、花を有する植物体および植物体から得られる種子を意味する。

「植物細胞」の例としては、花、葉、および根などの植物器官における各組織の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられる。

本明細書において、用語「発現カセット」とは，本発明におけるプロモー夕一と、このプロモーターに作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含む、核酸配列をいう。

本明細書において、用語「異種遺伝子」とは、 10遺伝子、 ZPT2- 1 1遺伝子、および ZPT3- 3遺伝子以外のペチュニアにおける内因性遺伝子、もしくは他の植物における内因性遺伝子、または植物に対して外来の遺伝子（例えば、動物、昆虫、細菌、および真菌に由来する遺伝子）であって、その遺伝子産物の発現が雌しベの各組織のいずれかにおいて所望される任意の遺伝子をいう。

「植物発現用ベクター」は、発現カセットにおけるプロモーターに加えて、さらに種々の調節エレメントが、宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。好適には、夕一ミネ一夕一、薬剤耐性遺伝子、およびェンハンサーを含み得る。植物発現用ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現用べクタ一は、さらに T- DNA領域を有し得る。 T-DNA領域は、特にァグロパクテリゥムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。

「夕一ミネ一夕一」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、 DNAが mRNAに転写される際の転写の終結、およびポリ A配列の付加に関与する配列である。夕一ミネ一夕一は、 mRNAの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネータ一の例としては、 CaMV35S夕一ミネ一夕一、およびノパリン合成酵素遺伝子の夕一ミネ一夕一（Tnos) が挙げられるが、これらに限定されない。

「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ Π (NPT I I )遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。

「ェンハンサ一」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。ェンハンサ一としては、 CaMV35Sプロモ一夕一内の上流側の配列を含むェンハンサ一領域が好適である。ェンハンサ一は、 1つの植物発現用ベクターあたり複数個用いられ得る。

本発明における植物発現用ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植物発現用ベクターの構築には、例えば、 pB I系のベクタ一または pUC系のベクターが好適に用いられるが、これらに限定されない。

植物細胞への植物発現用ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、ァグロパクテリゥムを介する方法、および直接細胞に導入する方法が用いられ得る。ァグロパクテリゥムを介する方法としては、例えば、 Nage lらの方法（FEMS M i c rob i o l . Le t t . , 67, 325 ( 1 990) )が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現用ベクターで（例えば、エレクトロボレ一シヨンによって）ァグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたァグロバクテリウムをリ一フディスク法などの周知の方法により植物細胞に導入する方法である。植物発現用ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクト口ポレーシヨン法、パーティクルガン、リン酸カルシウム法、およびポリエチレングリコール法などがある。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。

植物発現用ベクターを導入された細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生され得る。

再生した植物体において、当業者に周知の手法を用いて、目的の異種遺伝子の発現を確認し得る。この確認は、例えば、ノーザンプロット解析を用いて行い得る。具体的には、本発明におけるプロモーターが特異的に発現する組識から全 RN Aを抽出し、変性ァガロースでの電気泳動の後、適切なメンブランにブロットする。このプロットに、目的の異種遺伝子の一部分と相補的な標識した RNAプロ一ブをハイブリダィズさせることにより、目的の異種遺伝子の mRMを検出し得る。異種遺伝子が、導入される植物について内因性である場合、本発明におけるプロモーターが特異的ヒ発現する組識における目的の異種遺伝子の mRNA量と、形質転換されていないコントロールの植物の同じ組識における目的の異種遺伝子の mRNA 量とを比較することによって、目的の異種遺伝子の発現量の変化を評価し得る。本発明におけるプロモーターの組織特異的な発現活性の確認は、上記の手法を利用して行われ得る。例えば、本発明におけるプロモータと、 GUS遺伝子とが作動可能に連結された発現べク夕一で形質転換された植物における GUS活性の分布を、常法により組識化学的染色を行って調べることにより、プロモー夕一の組識特異的な発現活性を同定し得る。

本発明における植物は、上記の手法によって、本発明におけるプロモーターと作動可能に連結された目的の異種遺伝子によつて形質転換された植物であり、目的の異種遺伝子が、植物において、本発明におけるプロモーターの制御下で組織特異的に発現する結果として、形質が改変される。改変される形質としては、稔性、和合性、および害虫抵抗性などが挙げられるがこれらに限定されない。

本発明により、ペチュニアの遺伝子に由来する、雌しベの組織のいずれかにおいて特異的な発現活性を有する，実用的なプロモーターが提供される。本発明のプロモーターは、植物の形質を改変するために利用され得る。例えば、このプロモーターの制御下で、雌しベの組識（例えば、通道組織、胎座表層、柱頭分泌領域、花托、および雌しベの維管束）のいずれかにおいて、その組織に損傷を与え得る遺伝子産物（例えば、細胞死を引き起こす活性を有する酵素）を特異的に発現させることによって、これらの組識を破壤して、雌しベの生殖機能を阻害することができる。その結果、植物は雌性不稔の形質を付与され得る。あるいは、特定の遺伝子型をもつ花粉を排除する機能を備える遺伝子（例えば、 S- RNase遺伝子）を、適切な組織、特に通道組織において発現させることができる。その結果、植物は自家不和合性の形質を付与され得る。あるいは、抗害虫活性を有するタンパク質を柱頭において発現させることによって、柱頭に接触する害虫を殺傷しまたは忌避し得る害虫抵抗性植物を作出し得る。

(実施例）

以下に、実施例に基づいて本発明を説明する。本発明の範囲は，実施例のみに限定されるものではない。実施例で使用される制限酵素、プラスミドなどは、商業的な供給源から入手可能である。実施例 1 ： ΖΡΠ- 10プロモ一夕一領域の単離および GUSレポ一夕一遺伝子との連結

ZPT2- 10の c腿 (Kubo, K.ら、 ucleic Acids Research, 26， 608-616(1998)) を、通常のランダムプライム法（Sambrookら、上述）を用いて、 [a- ³²P]dCTPで標識することによって、放射性標識プローブを作製する。この標識プローブを使用して、 EMBL3ベクタ一（Stratagene社製）中に作製したペチュニア（Petunia h ybrida var. Mi tchel 1) のゲノムライブラリ一をスクリーニングした。得られたクローンから、遺伝子上流領域を含む約 3. Okbのゲノム DNA断片を、 pBluescnptS Kベクターの EcoRV-Xbal部位にサブクローニングし（pBS- ZPT2-10EX) 、そして塩基配列を決定した（配列番号 1) (図 1) 。次に、このプラスミドを錶型として用い、 BamHI認識配列を含むプライマ一（CCGGGGATCCATCATCTTGTAGAAGATCCAT；配列番号 4) および市販の M13- 20プライマーを用いて PCRを行った。これによつて、 Z PT2- 10タンパク質翻訳開始点のすぐ下流（図 1の塩基配列の第 2595位）に BamHI 部位を導入した。 PCRによって得られた DNA断片を、 EcoRVおよび BamHI部位で切断し、次いで得られた制限断片を pBluescriptベクターにクローニングして、配列を確認した。その後、クロ一ニングしたベクターを、 Sailおよび BamHIで切断することにより得られた DNA断片を、市販の pUCAPGUSNTの GUSコード領域の上流に揷入した（pUCAP- ZPT2- 10- GUS- NT) 。これによつて、 ZPT2- 10遺伝子のコード領域の N末端近傍の領域でインフレームに GUS領域を連結した。さらに、 PUCAP-ZPT2 - lO-GUS- NTを、 Asclおよび EcoR [で切断して得られる DNA断片（ΖΡΠ- 10のプロモー夕一、 GUS、 iN0S、および夕一ミネ一夕一を含む）を、 pBINPLUSベクターに挿入して、 pBIN- ZPT2-10- GUSを得た（図 4 a) 。実施例 2 ： ZPT3- 3プロモータ一領域の単離および GUSレポーター遺伝子との連結実施例 1と同様に、 ZPT3-3のゲノム DNAを単離した。 ZPT3- 3遺伝子の上流領域を含む約 2.5kbの DNA断片（Kpnl- EcoRl) を、 pBluescriptSKベクターにサブクロ一エングし（PBS-ZPT3- 3- KE) 、次いでこの DNA断片の塩基配列を決定した（配列番号 2) (図 2) 。このプラスミドを铸型として用いて、 BamHI認識配列を含むプライマー（CCGGGGATCCACATGACTTGTGTTTCTCCAT；配列番号 5 ) および市販の M13- 2 0プライマーとともに PCRを行って、 ZPT3- 3タンパク質翻訳開始点のすぐ下流（図 1の塩基配列の第 2322位）に BamHI部位を導入した。こうして作製した DNA断片を、 ZPT3- 3と GUSとがインフレームになるように連結し、実施例 1と同様にして、 pBN - ZPT3- 3- GUSを作製した（図 4 b) 。実施例 3 ： ZPT2- 11プロモーター領域の単離および GUSレポーター遺伝子との連結実施例 1と同様に、 ZPT2-11のゲノム DNAを単離した。 ZPT2- 11遺伝子の上流領域を含む約 2. lkbの DNA断片（EcoRV- EcoRI) を、 pBluescriptSKベクターにサブクローニングし（PBS-ZPT2-11- EE) 、次いでこの DNA断片の塩基配列を決定した（配列番号 3) (図 3) 。このプラスミドを鐯型として用い、 BamHI認識配列を含むプライマー（CCGGGGATCCTTCTTGCATTTGAACTTCCAT；配列番号 6 ) および市販の M13-2 0プライマーとともに PCRを行い、 ZPT2-11タンパク質翻訳開始点のすぐ下流（図 1の塩基配列の第 2012位）に BamHI部位を導入した。こうして作製した DNA断片を、 ZPT2- 11と GUSとがインフレームになるように連結し、実施例 1と同様にして、 pB !S^T- ZPT2-11- GUSを作製した（図 4 c) 。実施例 4 ： ZPT2-10、 ΖΡΤ3-3、および ZPT2-11のプロモ一夕一と GUSとの融合遣伝子のペチュニアへの導入

( 1) Agrobacterium tumefaciens LBA4404株 (CL0NTECH Laboratories In c. , Palo Alto, CA) を、 250;Ug/inlのストレプトマイシンと 50 g/mlのリファンピシンを含む L培地中、 28でで培養した。 Nagelら（上述）の方法に従って、細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液中でのエレクトロボレ一シヨンにより、実施例 1、 2、および 3で構築したプラスミドベクターを、それぞれこの菌株に導入した。

(2) ZPT2- 10、 ZPT3-3, および ZPT2-11プロモーターと GUSとの融合遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、以下の方法によってペチュニア細胞へ導入した：上記（1) で得られた、形質転換 Agrobacterium tumefaciens LBA4404株を、 YEB培地（DNA Clonin 第 2卷、 78頁、 D.M.Glover編、 IRL Press, 1985) で振とう培養（28°C、 200rpm) した。次いで得られた培養液を、滅菌水で 20倍に希釈したものを、ペチュニア（Petunia hybrida var.Mitchel 1) の葉片とともに共存培養した。 2〜3日後、この葉片を抗生物質を含む培地で培養することによって、上記細菌を除去した。葉片を、 2週間毎に選択培地で継代し、上記 3種類の融合遺伝子と共に導入された、 pBINPLUS由来の NPTII遺伝子の発現に起因するカナマイシン抵抗性の有無に基づいて、形質転換されたペチュニア細胞を選抜した。選抜した細胞を、常法によりカルスを誘導した後、植物体に再分化した。実施例 5 ： ZPT2- 10プロモーター活性の組識特異性

ZPT2-10遺伝子の上流領域と GUSとの融合遺伝子を導入して得られた形質転換体の花について、 X-GUSを基質として用いて GUS活性の分布を調べた（Gallagher, S. R. (編) GDS protocols： using the GUS gene as a reporter of gene express i n、 Academic Press, Inc. , San Diego (1992)) 。その結果、 GUS活性は、雌しベの花柱の通道組織および胚座の最上層（すなわち、胚座表層）の細胞層に特異的に検出された（図 5および図 8 (a)) 。実施例 6 ： ZPT3- 3プロモーター活性の組識特異性

ZPT3- 3遺伝子の上流領域と GUSとの融合遣伝子を導入して得られた形質転換体の花を用い、実施例 5と同様にして GUS活性の分布を調べた。その結果、 GUS活性は、雌しベの柱頭の分泌組識、花柱の通道組織、胚座表層、および花托に特異的に検出された（図 6および図 8 (b)) 。実施例 7 ： ZPT2- 11プロモーター活性の組識特異性

ZPT2-11遺伝子の上流領域と GUSとの融合遺伝子を導入して得られた形質転換体の花を用い、実施例 5と同様にして GUS活性の分布を調べた。その結果、 GUS活性は、雌しベの柱頭から花柱および胚座にかけての維管束組識、ならびに花托に特異的に検出された（図 7および図 8 (c)) 。産業上の利用可能性

本発明におけるペチュニア由来の ZPT2- 10、 ZPT2-1K および ZPT3- 3プロモ一夕一は、雌しベの組織において特異的なプロモー夕一活性を示す。これらのプロモーターは、雌しベの組織の遺伝子操作によって、植物の形質を改変するために有用である。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（a) または（b) の DNAを含むプロモータ一：

(a) 配列番号 1によって示される塩基配列の第 1位から第 2595位までの配列を有する DNA；または

(b) (a) の一部の配列を有し、通道組織および胎座表層のうちの少なくとも 1つに特異的なプロモー夕一活性を示す、 DNA。

2. 以下の（c) または（d) の DNAを含むプロモーター：

または

(d) (c) の一部の配列を有し、通道組織、胎座表層、柱頭分泌領域、および花托のうちの少なくとも 1つに特異的なプロモーター活性を示す、 DNA。

3. 以下の（e) または（ f) の DNAを含むプロモー夕一：

( f ) (e) の一部の配列を有し、雌しベの維管束および花托のうちの少なくとも 1つに特異的なプロモータ一活性を示す、 DNA。

4. 請求項 1から 3のいずれかに記載のプロモ一夕一と、該プロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む、植物発現カセット。

5. 請求項 4に記載の発現カセットを植物細胞に導入する工程、および該発現力セッ卜が導入された植物細胞を植物体に再生する工程を包含する、形質が改変された植物を作出する方法。

6. 前記形質は稔性であり、形質が改変された植物は、雌性不稔植物である、請求項 5に記載の方法。

7. 前記形質は和合性であり、形質が改変された植物は自家不和合性植物である、請求項 5に記載の方法。

8. 前記植物が双子葉植物である、請求項 5に記載の方法。

9. 前記植物がナス科植物である、請求項 8に記載の方法。

1 0. 前記植物がペチュニア属植物である、請求項 9に記載の方法。

1 1. 前記発現カセットが植物発現ベクターに組み込まれている、請求項 5に記載の方法

1 2. 請求項 5から 1 1のいずれかに記載の方法により作出された、植物の形質が改変された植物。

1 3. 植物の形質を改変するための請求項 4に記載の発現カセットの使用であつて、該発現カセットは植物細胞に導入され、前記プロモーターに作動可能に連結された前記異種遺伝子が、該植物細胞から再生された植物において発現される、使用。

14. 前記形質は稔性であり、形質が改変された植物は、雌性不稔植物である、請求項 1 5に記載の使用。

1 5. 前記形質は和合性であり、形質が改変された植物は自家不和合性植物である、請求項 1 5に記載の使用。

16. 前記植物が双子葉植物である、請求項 1 3に記載の使用。

1 7. 植物がナス科植物である、請求項 16に記載の使用。

1 8. 前記植物がペチュニア属植物である、請求項 1 7に記載の使用。

1 9. 前記発現カセッ卜が植物発現ベクターに組み込まれている、請求項 1 5に記載の使用。