CN110169358A - 一种胚状体培养基及其制备拐枣人工种子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胚状体培养基，包括胚性细胞培养基和细胞胚培养基。通过胚性细胞培养基的制备和细胞胚培养基的制备可获得胚状体，从而获得人工种子，胚性细胞胚培养基和细胞胚培养基的配方简单，制备过程中操作容易，其成本低廉，得到的胚状体具有繁殖速度快和结构完整的特点。还公开了一种采用胚状体培养基制备拐枣人工种子的方法，包括胚状体的制备、人工胚乳的制备以及人工种皮的制备。解决了种子休眠时间长的问题，提高了种子发芽率，达到了快速育苗的目的。

Description

一种胚状体培养基及其制备拐枣人工种子的方法

技术领域

本发明涉及组织培养与林木植物快繁脱毒技术领域，具体涉及一种胚状体培养基，还涉及一种采用胚状体培养基制备拐枣人工种子的方法。

背景技术

植物试管苗技术即无菌组织培养技术，是在人为创造的无菌条件下将生活的离体器官(如根、茎、叶、茎段以及原生质体)、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术。试管苗具有体积小，重量轻，生产不受季节限制，设备简单、成本低以及便于工厂化生产以及长途运输等优点。组织培养技术已经普遍应用于花卉、经济作物、林木的生产、保存、纯化、脱病毒以及快速繁殖及新品种选育等过程。

人工种子是农业生产中使用的天然种子，一般都是由种皮、胚乳以及胚三部分构成。种皮通常在种子的外层起保护作用；胚乳含有大量的营养物质，是种苗萌发生长不可缺少的营养来源；胚由胚芽、胚轴、胚根以及子叶构成，将来发成植株。农业生物技术的发展，通过组织培养技术，可把植物组织的细胞培养成在形态及生理上与天然种子胚相似的胚状体，也叫作体细胞胚。这种体细胞胚有子叶、根以及茎分生组织的结构。科学家把体细胞胚包埋在胶囊内形成球状结构，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造的代替天然种子的颗粒体，可以直接播种于田间。

拐枣(Hovenia acerba Lindl)原产于黄河和长江流域，印度、尼泊尔、不丹以及缅甸北部等地也有分布，广泛栽培至中国华北、华东、中南、西北、西南以及华南各省。拐枣果柄具有丰富的食用价值，其种子也具有清热利尿、治风湿麻木等药用价值。国内拐枣研究最早于肖玲对拐枣果序梗发育的解剖学方面。此后，拐枣的研究主要侧重于优化果汁提取工艺、法以及提高果实加工产量等方面。

在生产上，拐枣主要采用种子、扦插以及分檗等方法进行繁殖。李定康报道了拐枣种子沙藏的适宜时间为11月初至翌年清明。李英等对拐枣种子在适宜条件下进行萌发试验，测定拐枣种子30天的发芽率仅为4％，证明了种子具有休眠习性，同时发现将拐枣种子低温层积75天，其发芽率达到72％，而在低温层积90天后，拐枣种子的发芽率能达到76％。由此可见，拐枣种子休眠期长，难以达到生产上所要求的快速育苗。

本研究旨在通过人工种子的制备方法解决拐枣种子的休眠的问题，通过组织培养的方法可以获得数量很多的胚状体，而且繁殖速度快，结构完整，人工种子比采用试管苗的繁殖方法更能降低成本，而且方便机械化播种，可节省劳动力，生产人工种子不受季节限制。

制作拐枣的人工种子的方法主要在于将拐枣的胚状体制作出来，体细胞胚是制作人工种子的起始材料。它既可由外植体的表皮细胞直接产生，也可由愈伤组织的表层细胞产生。先通过外植体消毒灭菌，将外植体移植到培养基内，获得无菌苗，然后使用组织培养基和无菌苗茎段诱导愈伤组织，使用获得的愈伤组织诱导培养胚性细胞，再使用胚性细胞诱导体细胞胚即获得原材料。

科学工作者们花费巨大的劳动，进行大量的筛选才能获得体细胞胚、人工胚乳是包埋体细胞胚的胶状介质。美国的一个研究组花了近两年时间，从百余种材料中筛选到广泛使用的人工种子包埋介质海藻酸钠。这种物质在0.1M氯化钙溶液中可以迅速固化成透明的小胶球。海藻酸钠价格低廉，质地柔软无毒性，还可人为地在其中加入各种营养物质和生长调节剂，因此是一种迄今为止已发现的比较理想的体细胞胚包埋剂。但这种物质作人工胚乳还存在一些缺点，如营养物质易泄漏，保水性差，而且胶球很易粘连等。为此，科学家又设想在胶球外包一层薄膜——人工种皮。我们的发明正是结合这些科学家的经验以及我们的研究探索解决现在拐枣存在的问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是根据拐枣人工种子的建立过程和特点，提供一种胚状体培养基，具有成本低廉和提高拐枣的发芽率的特点。

为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：

一种胚状体培养基，包括胚性细胞培养基和细胞胚培养基。胚性细胞培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS(一种培养基的代号，以下简称MS)、玉米素0.1-1.0mg/L、α-萘乙酸0.08-0.3mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉2-10g/L以及纯净水补足余量。

细胞胚培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤0.4-1.0mg/L、激动素0.2-1.0mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-50g/L、琼脂粉2-10g/L以及纯净水补足余量。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

通过胚性细胞培养基和细胞胚培养基的组分可获得胚状体，从而获得人工种子。细胞胚培养基和细胞胚培养基的配方简单，制备过程中操作容易，得到的胚状体具有繁殖速度快和结构完整的特点。

进一步优选为：胚性细胞培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、玉米素0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.08-0.3mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉4-6g/L以及纯净水补足余量。

细胞胚培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤0.1-2.0mg/L、激动素0.4-0.6mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉4-6g/L以及纯净水补足余量。

采用上述技术方案，提供了胚性细胞培养基和细胞胚培养基的更优选的配方，实现了胚状体的制备。

进一步优选为：1/2MS配方为：

大量元素：硝酸铵NH₄NO₃ 825mg/L、硝酸钾KNO3 950mg/L、二水氯化钙氯化钙·2H2O 220mg/L、七水硫酸镁MgSO4·7H2O 185mg/L以及磷酸二氢钾KH2PO4 85mg/L。

微量元素：碘化钾KI 0.415mg/L、硼酸H3BO3 3.1mg/L、四水硫酸锰MnSO4·4H2O11.15mg/L、七水硫酸锌ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、二水钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L、五水硫酸铜CuSO4·5H2O 0.0125mg/L以及六水氯化钴CoCl2·6H2O 0.0125mg/L。

铁盐：七水硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8mg/L和二水乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L。

有机物质：肌醇100mg/L、烟酸VB5或VPP 0.5mg/L、盐酸吡哆醇VB60.5mg/L、盐酸硫胺素VB1 0.1mg/L以及甘氨酸2.0mg/L。

蔗糖30g/L。

琼脂7g/L。

采用上述技术方案，1/2MS中无机盐的种类和离子浓度较多，溶液中离子比较平衡，稳定性强，有利于胚性细胞培养基和细胞胚培养基的制备。

本发明还提供了一种采用胚状体培养基制备拐枣人工种子的方法，具体的技术方案是：

一种采用胚状体培养基制备拐枣人工种子的方法，包括胚状体的制备、人工胚乳的制备以及人工种皮的制备，包括如下步骤：

胚性细胞培养基的制备：

称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸。取0.1升10倍1/2MS母液与玉米素、α-萘乙酸以及活性炭溶解后加入锅中。称量蔗糖加入锅中并让其溶解，纯净水定容到1.0升。用盐酸和氢氧化钠调节pH在5.8-6.0。分装后，进行高温高压灭菌20分钟。冷却成固体，接愈伤组织进行无菌培养。

细胞胚培养基的制备：

称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸。取0.1升10倍1/2MS母液与苄氨基嘌呤、激动素以及活性炭溶解后加入锅中。称量蔗糖加入锅中并让其溶解，纯净水定容到1.0升。调节pH在5.8-6.0。分装后，进行高温高压灭菌。冷却成固体，接胚性细胞组织进行无菌培养。

人工胚乳的制备：

在碳源基础上分别添加激素，共有3种组合。

在碳源与激素组合基础上添加抗菌剂和吸附剂，形成所述人工胚乳。

人工种皮的制备：

按比例依次加入3％的海藻酸钠、2％的氯化钙以及0.05％的氯化铜制备人工种皮。

与现有技术对比，本方案具有的优点是：通过对胚状体、人工胚乳以及人工种皮的制备方法，解决了拐枣种子的休眠的问题，通过胚状体的制备方法可以获得数量很多的胚状体，具有繁殖速度快、结构完整以及成本低廉的特点。不但方便进行机械化播种，节省劳动力，而且生产人工种子不受季节限制，达到了满足生产要求和快速育苗的良好效果。

进一步优选为：碳源包括蔗糖或淀粉或蔗糖和淀粉。

采用上述技术方案，制备的人工胚乳为胚性细胞的生长和分裂提供物质基础，为细胞胚的发育提供营养。

进一步优选为：激素是指α-萘乙酸或脱落酸或α-萘乙酸和脱落酸。

采用上述技术方案，为制备人工胚乳提供了全面的植物激素。

进一步优选为：人工胚乳为9种胚乳配方。

采用上述技术方案，为制备人工胚乳提供全面的配方。

进一步优选为：锅中纯净水的量为0.7-0.8升。

采用上述技术方案，无需蒸发太多的纯净水，容易可制备适合细胞胚生长的培养基，节省了制备培养基的时间。

进一步优选为：胚性细胞培养基的制备中的高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.10MPa-0.14MPa，灭菌20分钟。

采用上述技术方案，通过该灭菌条件，可实现高效灭菌的目的，为制备胚性细胞培养基做好前期准备工作。

进一步优选为：细胞胚培养基的制备中的高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.1MPa，灭菌20分钟。

采用上述技术方案，通过该灭菌条件，可实现高效灭菌的目的，为制备细胞胚培养基做好前期准备工作。

具体实施方式

实施例1

(1)胚性细胞培养基组分及含量的确定

胚性细胞培养以已有的拐枣愈伤组织作为原料，根据愈伤组织在不同培养基的胚性细胞生长状况，筛选合适的胚性细胞培养基。

根据培养要求，试验以MS、1/2MS、1/4MS、改良WPM以及Read这5种培养基为基本培养基，以愈伤组织进行预培养。每个处理接种20个材料，试验重复3次。每天观察、记录外植体生长情况，连续观察3个月，得到的胚性细胞培养基以1/2MS为宜。

以1/2MS培养基为基本培养基，附加玉米素、苄氨基嘌呤、异戊烯腺嘌呤三种细胞分裂素和α-萘乙酸，每个处理接种60个材料，试验重复3次。初选后的每升胚性细胞培养基的制备组分及各组分含量如下：1/2MS、玉米素0.1-1.0mg/L、α-萘乙酸0.08-0.3mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉2-10g/L、纯净水补足余量。可制备适合胚性细胞培养的培养基。

备选的胚性细胞培养基的制备组分及各组分含量如下：1/2MS、玉米素0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.08-0.3mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉4-6g/L以及纯净水补足余量，提供了胚性细胞培养基更优选的配方，制备适合胚性细胞培养的培养基。

(2)细胞胚培养基组分及含量的确定

根据苄氨基嘌呤、激动素、α-萘乙酸浓度以及蔗糖含量对拐枣细胞胚生长和定芽增殖系数的影响，初选后的每升细胞胚的培养基的主要组分及各组分的含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤0.4-1.0mg/L、激动素0.2-1.0mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-50g/L、琼脂粉2-10g/L以及纯净水补足余量，该组分可制作适合细胞胚培养基。

根据分析得出增殖系数最高的组分及含量是：苄氨基嘌呤0.2mg/L、激动素0.45mg/L、α-萘乙酸0mg/L、蔗糖20g/L，其增殖系数为6.79；增殖系数最低的组分及含量是：苄氨基嘌呤0.6mg/L、激动素0.45mg、α-萘乙酸0.2mg/L、蔗糖0g/L，增殖系数为0.17。

进一步优化后的每升细胞胚的培养基的组分及各组分的含量范围如下：

1/2MS、苄氨基嘌呤0.1-2.0mg/L、激动素0.4-0.6mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉4-6g/L以及纯净水补足余量。提供了细胞胚培养基的更优选的配方，可制备适合细胞胚培养的培养基。

通过胚性细胞培养基和细胞胚培养基可获得胚状体，从而获得人工种子。细胞胚培养基和细胞胚培养基的配方简单，制备过程中操作容易，得到的胚状体具有繁殖速度快和结构完整的特点。

本发明提供的1/2MS配方为：大量元素：硝酸铵NH₄NO₃ 825mg/L、硝酸钾KNO3950mg/L、二水氯化钙氯化钙·2H2O 220mg/L、七水硫酸镁MgSO4·7H2O 185mg/L、磷酸二氢钾KH2PO4 85mg/L。

微量元素：碘化钾KI 0.415mg/L、硼酸H3BO3 3.1mg/L、四水硫酸锰MnSO4·4H2O11.15mg/L、七水硫酸锌ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、二水钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L、五水硫酸铜CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、六水氯化钴CoCl2·6H2O 0.0125mg/L。

铁盐：七水硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8mg/L、二水乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L。

有机物质：肌醇100mg/L、烟酸VB5或VPP 0.5mg/L、盐酸吡哆醇VB60.5mg/L、盐酸硫胺素VB1 0.1mg/L、甘氨酸2.0mg/L。蔗糖30g/L。琼脂7g/L。

从以上配方可看出，1/2MS中无机盐的种类和离子浓度较多，溶液中离子比较平衡，稳定性强，有利于胚性细胞培养基和细胞胚培养基的制备。

实施例2

拐枣人工种子的制备方法，包括如下步骤：

1.胚状体的制备

(1)胚性细胞培养基的制备

根据胚性细胞培养基的制备组分及各组分含量称取如下含量：1/2MS、玉米素0.5mg/L、α-萘乙酸0.1mg/L、活性炭1g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉5g/L以及纯净水补足余量。

称量琼脂粉加入装有0.7-0.8升纯净水的锅中煮沸，无需蒸发太多的纯净水，容易可制备适合细胞胚生长的培养基，节省了制备培养基的时间。

称取0.1升10倍1/2MS母液、玉米素0.5mg、α-萘乙酸0.1mg以及活性炭1g溶解后加入锅中，并称量蔗糖20g加入锅中并让其溶解形成溶液。

纯净水定容到1.0升。用盐酸氢和氧化钠调整溶液pH值在5.8-6.0之间。分装成20瓶后，进行高温120℃，高压0.1MPa-0.14MPa灭菌20分钟。通过该灭菌条件，可实现高效灭菌的目的，为制备胚性细胞培养基做好前期准备工作。然后冷却成固体形成胚性细胞培养基。接愈伤组织外表皮进行无菌培养。

(2)细胞胚的培养基的制备

根据实际需要确定细胞胚培养基的组分及各组分含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤1.0mg/L、激动素0.45mg/L、活性炭1g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉5g/L、纯净水补足余量。以此在本发明中进行细胞胚培养基的制备。

称量琼脂粉加入装有0.7-0.8升纯净水的锅中煮沸。

取0.1升10倍1/2MS母液、苄氨基嘌呤1.0mg、激动素0.45mg以及活性炭1g溶解后加入锅中形成溶液。

称量蔗糖20g加入锅中并让其溶解，纯净水定容到1.0升。用盐酸氢和氧化钠调整溶液pH值在5.8-6.0之间。分装成20瓶后，进行高温120℃，高压0.1MPa，灭菌20分钟。通过该灭菌条件，可实现高效灭菌的目的，为制备细胞胚培养基做好前期准备工作冷却成固体形成细胞胚的培养基。接(1)中胚性细胞进行无菌培养。

通过对胚状体、人工胚乳以及人工种皮的制备方法，解决了拐枣种子的休眠的问题，通过胚状体的制备方法可以获得数量很多的胚状体，具有繁殖速度快、结构完整以及成本低廉的特点。不但方便进行机械化播种，节省劳动力，而且生产人工种子不受季节限制，达到了满足生产要求和快速育苗的良好效果。

2.人工胚乳的制备

根据现有研究，人工胚乳成分为“1/2MS+激素+抗菌剂+吸附剂+碳源+海藻酸钠，pH5.8～6.0”。配方设计分两步进行：(1)在碳源(蔗糖或淀粉或蔗糖+淀粉)基础上分别添加激素(α-萘乙酸、脱落酸或二者组合)，共有3种组合，为制备人工胚乳提供了全面的植物激素。以此制备的人工胚乳为胚性细胞的生长和分裂提供物质基础，为细胞胚的发育提供营养。(2)在碳源、激素组合基础上添加抗菌剂(菌多灵)和吸附剂(活性炭)，共有3种组合，总计9种胚乳配方，为制备人工胚乳提供全面的配方。

配方中各相关成分的取值为各种文献报道的最佳浓度的平均值，分别为蔗糖3％、淀粉1％、α-萘乙酸0.2mg/L、脱落酸1.0mg/L、活性炭0.5％、菌多灵0.3％、海藻酸钠3％。分别称取上述成分，混合均匀后用蒸馏水定容，调pH在5.8～6.0范围内后分装到三角瓶或培养瓶中，在121℃高温下灭菌15～20分钟，其中，脱落酸需进行过滤灭菌，并在胚乳配方成分灭菌后再加入。灭菌完成后放置于超净工作台备用。

3.人工种皮的制备

内膜：3％的海藻酸钠、2％的氯化钙以及0.05％氯化铜

海藻酸钠的亲水性好，所以一般用于内层膜的制备，按比例加入3％的海藻酸钠，溶解后加入2％的氯化钙，最后加入0.05％氯化铜,制备成内膜。

外膜：用Elvax做外膜(Elvax直译易万事，即用乙烯乙酸和丙烯酸三种物质聚合的一种树脂)，为现有树脂，可直接购买。

4.人工种子的制备

将制备好的胚状体混入40℃的人工胚乳溶液中，滴入到4mm直径的微滴板上，待3分钟左右，凝聚成小球状，再将其倒入人工种皮内膜液中，过程极短，瞬间捞出，稍等10秒后再将其倒入外膜液中，瞬间取出晾干至合适湿度即可保存，包装，备用。

胚状体培养基的制备过程操作容易，其成本低廉，得到的胚状体具有繁殖速度快和结构完整的特点。

实施例3

对比例1：将拐枣种子直接在适宜的条件下种植，观测30天内的发芽状况。

对比例2：将拐枣种子在低温层积90天后种植萌发，观察发芽状况。

以类型1-6这6类人工种子配方为例进行实验14天，观察发芽状况，并与对比例1和对比例2进行对比分析，该6类人工种子的配方如表1所示：

1类型1-6人工种子配方表

在试验过程中观察类型1-6人工种子、对比例1以及对比例2的发芽情况，实验结束后统计种子发芽率并形成对照表，如表2所示：

种子类型	类型1	类型2	类型3	类型4	类型5	类型6	对比例1	对比例2
									实验时间(天)	14	14	14	14	14	14	30	75-90
发芽率(％)	76	74	80	90	88	96	4	70

表2种子发芽率对照表

结合表1和表2，与对比例1对比分析可得出，类型1-6人工种子的发芽率均比直接种植拐枣种子的发芽率高得多，而且缩短了种子休眠时间。与对比例2对比分析可得出，类型1-6人工种子的发芽率比在低温层积较长时间的发芽率高，也缩短了种子的休眠时间。

因此，采用胚状体培养基制备的拐枣人工种子，解决了种子休眠时间长，提高了种子发芽率，达到了快速育苗的目的。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读。完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的保护范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种胚状体培养基，包括胚性细胞培养基和细胞胚培养基；其特征在于：

所述胚性细胞培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、玉米素0.1-1.0mg/L、α-萘乙酸0.08-0.3mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉2-10g/L以及纯净水补足余量；

所述细胞胚培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤0.4-1.0mg/L、激动素0.2-1.0mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-50g/L、琼脂粉2-10g/L以及纯净水补足余量。

2.根据权利要求1所述的胚状体培养基，其特征在于：所述胚性细胞培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、玉米素0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.08-0.3mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉4-6g/L以及纯净水补足余量；

所述细胞胚培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤0.1-2.0mg/L、激动素0.4-0.6mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉4-6g/L以及纯净水补足余量。

3.根据权利要求1所述的胚状体培养基，其特征在于：所述1/2MS配方为：

大量元素：硝酸铵NH₄NO₃ 825mg/L、硝酸钾KNO3 950mg/L、二水氯化钙CaCl2·2H2O220mg/L、七水硫酸镁MgSO4·7H2O 185mg/L以及磷酸二氢钾KH2PO4 85mg/L；

微量元素：碘化钾KI 0.415mg/L、硼酸H3BO3 3.1mg/L、四水硫酸锰MnSO4·4H2O11.15mg/L、七水硫酸锌ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、二水钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L、五水硫酸铜CuSO4·5H2O 0.0125mg/L以及六水氯化钴CoCl2·6H2O 0.0125mg/L；

铁盐：七水硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8mg/L和二水乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L；

有机物质：肌醇100mg/L、烟酸VB5或VPP 0.5mg/L、盐酸吡哆醇VB6 0.5mg/L、盐酸硫胺素VB1 0.1mg/L以及甘氨酸2.0mg/L；

蔗糖 30g/L；

琼脂 7g/L。

4.一种采用胚状体培养基制备拐枣人工种子的方法，包括胚状体的制备、人工胚乳的制备以及人工种皮的制备；其特征在于：包括如下步骤：

所述胚性细胞培养基的制备：

称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；1/2MS母液与玉米素、α-萘乙酸、活性炭溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；用盐酸和氢氧化钠调节pH在5.8-6.0之间；分装后进行高温高压灭菌；冷却成固体；接愈伤组织进行无菌培养；

所述细胞胚培养基的制备：

称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与苄氨基嘌呤、激动素以及活性炭溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；调节pH在5.8-6.0；分装后进行高温高压灭菌；冷却成固体；接胚性细胞组织进行无菌培养；

所述人工胚乳的制备：

在碳源基础上分别添加激素，共有3种组合；

在碳源与激素组合基础上添加抗菌剂和吸附剂，形成所述人工胚乳；

所述人工种皮的制备：

按比例依次加入3％的海藻酸钠、2％的氯化钙以及0.05％的氯化铜制备所述人工种皮。

5.根据权利要求4所述的拐枣人工种子的制备方法，其特征在于：所述碳源包括蔗糖或淀粉或蔗糖和淀粉。

6.根据权利要求4所述的拐枣人工种子的制备方法，其特征在于：所述激素是指α-萘乙酸或脱落酸或α-萘乙酸和脱落酸。

7.根据权利要求4所述的拐枣人工种子的制备方法，其特征在于：所述人工胚乳为9种胚乳配方。

8.根据权利要求4所述的拐枣人工种子的制备方法，其特征在于：所述锅中纯净水的量为0.7-0.8升。

9.根据权利要求4所述的拐枣人工种子的制备方法，其特征在于：所述胚性细胞培养基的制备中的所述高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.10MPa-0.14MPa，灭菌20分钟。

10.根据权利要求4所述的拐枣人工种子的制备方法，其特征在于：所述细胞胚培养基的制备中的所述高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.1MPa，灭菌20分钟。