CN110214692A - 一种植物非固体组培培养基及植物非固体组培方法 - Google Patents

一种植物非固体组培培养基及植物非固体组培方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物非固体组培培养基及植物非固体组培方法，其中，所述非固体培养基中加入琼脂或琼脂糖或卡拉胶，琼脂的浓度为1～5.5g/L，琼脂糖的浓度为1～5g/L，卡拉胶浓度为1.5～6g/L；所述植物非固体组培方法包括如下步骤：(1)外植体的选择和获取；(2)配制非固体培养基，将培养基分装到组培容器中，高温高压灭菌,冷却后，打开组织容器瓶盖，再将高温高压灭菌过的滤纸、无纺布、海绵等支撑物平铺在液面上；(3)培养。本发明在现在的液体培养基配方基础上，加入琼脂或琼脂糖或卡拉胶，琼脂的浓度为1～5.5g/L，琼脂糖的浓度为1～5g/L，卡拉胶浓度为1.5～6g/L，使得培养基具备了一定的支撑能力，在植物非固体组培过程中对支撑物具有一定支撑能力，进一步提高了支撑物对外植体支撑能力，避免外植体被泡死，便于产业化推广。

Description

一种植物非固体组培培养基及植物非固体组培方法
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，涉及一种植物非固体组培培养基及植物非固体组培方法。
背景技术
目前，大多数的组培工厂采用的是植物固体组培方法，培养成本高，瓶苗生长速度慢，瓶苗根系难清洗且容易受损。而现有的非固体组培方法，根据相关文献和专利报道主要采用浅层液体培养，需要进行震荡培养，另外，也有专利报道将海绵放入营养液中浸泡，再将沾有营养液的海绵放入瓶中进行外植体的培养，该方法植物容易缺乏营养，需要中途开瓶补液，操作较复杂且污染风险大，不便于产业化推广。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种植物非固体组培方法，其通过向现有液体组培配方中加入凝固剂，并将凝固剂的浓度调至合适区间，使海绵、无纺布、滤纸等支撑物具有支撑能力的同时且能保证较好吸收营养的效果，外植体不易泡死，瓶苗生长速度快。另外，以滤纸作为支撑物还能更好解决瓶苗种植前根系难清洗且易伤根的难题，节约劳动力，提高效率，降低成本。
本发明采取的技术方案是：
一种非固体植物组培培养基，其特征在于，所述培养基为液体培养基中加入限定量的凝固剂的非固体培养基，凝固剂的浓度为0.25～6g/L。
为了更好的实现本发明，所述凝固剂为琼脂或琼脂糖或卡拉胶，琼脂的浓度为1～5.5g/L，琼脂糖的浓度为0.25～4.5g/L，卡拉胶浓度为1.5～6g/L。
为了更好的实现本发明，将高温高压灭菌过的滤纸或无纺布或海绵支撑物平铺在培养基液面上。
为了更好的实现本发明，其用于茎段育苗期，具体配方组成为：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.4～6.0。
为了更好的实现本发明，其用于丛生苗育苗时，具体配方组成为：丛生苗继代增殖期，培养基配方为：MS+TDZ 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.4～6.0；壮苗生根期，培养基配方为：MS+NAA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.4～6.0。
相应地，本发明还提供了一种植物非固体培养基的组培方法，包括如下步骤：
(1)外植体的选择和获取：以带芽茎段或丛生苗为外植体，选择外植体获取材料，进行预处理得到外植体；
(2)配制非固体培养基，所述非固定培养基为向液体培养基中加入限定量的凝固剂，凝固剂的浓度为0.25～6g/L，将非固体培养基倒入组培容器中，高温高压灭菌,冷却后，打开组织容器瓶盖，再将高温高压灭菌过的滤纸或无纺布或海绵等支撑物平铺在液面上；
(3)培养：将处理好的带芽茎段或从种子诱导获得的1～2cm丛生苗均匀平放在滤纸上，将接种好茎段或丛生苗的组培容器放置于培养架上进行培养，并按照各阶段培养的营养需求调整培养基配方，直至成苗。
为了更好的实现本发明，所述非固体培养基中加入限定量琼脂或琼脂糖或卡拉胶，琼脂的浓度为1～5.5g/L，琼脂糖的浓度为0.25～4.5g/L，卡拉胶浓度为1.5～6g/L。
本发明还提供了上述植物非固体组培方法在金线莲和霍山石斛液体组培快繁上的应用。
为了更好的实现本发明，上述植物非固体组培方法在金线莲组培快繁上应用时，选用金线莲茎段为外植体，采用非固体培养基进行一步成苗培养，所述非固体培养基配方为MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，培养基pH为：5.4～6.0；培养的具体条件为：25～28℃，光照强度50～60μmol·m-2·s-1，光周期10h/d。
为了更好的实现本发明，上述植物非固体组培方法在金线莲组培快繁上应用时，外植体获取材料的预处理方法为：在超净工作台上取出金线莲植株，去掉金线莲叶片和茎基部，将茎段切成1～2cm带芽茎段。
为了更好的实现本发明，上述植物非固体组培方法在霍山石斛组培快繁上应用时，选用霍山石斛种子诱导出来的丛生苗为外植体，丛生苗继代增殖期，培养基配方为：MS+TDZ 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.4～6.0；壮苗生根期，培养基配方为：MS+NAA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.4～6.0；培养的具体条件为：25～28℃，光照强度50～60μmol·m-2·s-1，光周期10h/d。
为了更好的实现本发明，上述植物非固体组培方法在霍山石斛组培快繁上应用时，外植体获取材料的预处理方法为：将果荚用自来水冲洗干净，对果荚进行表面消毒：75％酒精消毒15～30s，0.1％升汞消毒3～5min，然后用解剖刀将果荚切开，取出种子，种子无菌播种在培养基上诱导丛生苗。
与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果：
1.本发明在现在的液体培养基配方基础上，加入琼脂或琼脂糖或卡拉胶，并调整液体培养基中琼脂的浓度为1～5.5g/L，琼脂糖的浓度为0.25～4.5g/L，卡拉胶浓度为1.5～6g/L，使得培养基具备了一定的支撑能力，在植物非固体组培过程中对支撑物具有一定支撑能力，进一步提高了支撑物对外植体支撑能力，避免外植体被泡死。
2.本发明可以较好实现海绵、无纺布、滤纸等支撑物的支撑效果，外植体能充分吸收营养，瓶苗生长速度快，出瓶率高，节约成本，易操作。另外以滤纸为支撑物，后期瓶苗种植，根系易清洗且不伤根，节约劳动力，效率高。
3.本发明只需在现有各植物液体组培配方基础上，合理调配液体组培配方中原料的含量使液体培养基具有一定的支撑能力即可实现，适用植物范围广，便于推广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1
一种金线莲非固体组培快繁方法，包括以下处理步骤：
1、外植体的选择和获取：在超净工作台上，将金线莲无菌苗剪成1～2cm带芽茎段。
2、配制非固体培养基，具体配方组成为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂1g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，培养基的pH为：5.4～6.0，将非固体培养基倒入组培容器中，高温高压灭菌，冷却后，打开组培容器瓶盖，再将高温高压灭菌过的支撑物平铺在液面上；所述支撑物有50g/m2无纺布、70g/m2无纺布、100g/m2无纺布、海绵。
3、将处理好的带芽茎段均匀平放在支撑物上，将接种好茎段的组培容器放置于培养架上进行培养，并按照各阶段培养的营养需求调整培养基配方，直至成苗。
试验结果：采用不同支撑物对金线莲液体组培瓶苗生长的影响如表1所示；
表1
不同支撑物 单株重(g) 株高(cm) 茎粗(mm) 叶宽(cm) 叶长(cm)
50g/m<sup>2</sup>无纺布 2.24 8b 3.72a 2.46b 3.65b
70g/m<sup>2</sup>无纺布 2.42 7.86b 3.55b 2.67a 3.91a
100g/m<sup>2</sup>无纺布 1.8 7.78b 3.78a 2.23c 3.33c
海绵 2.12 9.34a 3.40b 2.55b 3.71b
从表1可以看出，无纺布和海绵对金线莲茎段液体组培都有一定的支撑能力，不同规格的无纺布支撑效果不一样，100g/m2无纺布容易下沉；海绵的支撑效果较好且能保证植物有较充足的营养供应，但是根系容易扎到海绵中，瓶苗种植前不好清洗。传统金线莲固体组培培养5个月后，瓶苗单株均重1.6g，金线莲非固体组培，不论采用无纺布或者海绵等支撑物，相同培养条件下，瓶苗单株重可达到2.12g以上，单株重提高30％以上。
实施例2
一种金线莲非固体组培快繁方法，包括以下处理步骤：
1、外植体的选择和获取：在超净工作台上，将金线莲无菌苗剪成1～2cm带芽茎段。
2、配制非固体培养基，具体配方组成为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂1.5～3.0g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，培养基的pH为：5.4～6.0，其中琼脂的浓度分别为1.5g/L、1.8g/L、2.0g/L、2.2g/L、2.4g/L、2.6g/L。将非固体培养基倒入组培容器中，高温高压灭菌,冷却后，打开组织容器瓶盖，再将高温高压灭菌过的滤纸平铺在液面上；
3、将处理好的带芽茎段均匀平放在支撑物上，将接种好茎段的组培容器放置于培养架上进行培养，并按照各阶段培养的营养需求调整培养基配方，直至成苗。
试验结果：以滤纸为支撑物，采用不同琼脂浓度对金线莲液体组培瓶苗生长的影响如表2所示；
表2
从表2可以看出，琼脂浓度在1.5～2.6g/L，滤纸均具有一定的支撑效果，且金线莲组培瓶苗能正常生长，单株均重高于传统固体组培，且以滤纸作为支撑物，瓶苗种植前容易清洗。
实施例3
一种霍山石斛非固体组培快繁方法，包括以下处理步骤：
(1)采集7～8成熟未开裂的果荚，自来水冲洗干净，对果荚进行表面消毒，75％酒精消毒15s，0.1％升汞消毒3min，用解剖刀将果荚切开，取出种子，将种子播种在MS培养基上诱导获1～2cm的丛生苗；
(2)丛生苗继代增殖：对组培容器进行121℃高温高压灭菌30min，冷却后备用，配制非固体培养基，培养基配方为：MS+TDZ 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+琼脂1g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.8～6.0；将配制好的培养基分装到组培容器中。在超净工作台上打开配制好的培养基，将高压灭菌过的滤纸、无纺布、海绵等支撑物铺在液面上，将2株/丛的丛生苗平铺在支撑物上，25～28℃，光照强度52μmol·m-2·s-1，光周期10h/d；所述MS培养基包括以下用量的各原料混合组成：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、硫酸镁370mg/L、二水合氯化钙440mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水合硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、烟酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸硫胺素0.5mg/L。
(3)壮苗生根培养：选1.5～2.0cm高、3～5片叶，健康、正常发育的芽，接种到铺有滤纸的非固体培养基中，培养基配方为：MS+NAA 0.3mg/L+琼脂5.5g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.8～6.0，每瓶接种40株；接种后，将组培容器放置于培养架上，25～28℃，光照强度52μmol·m-2·s-1，光周期10h/d，进行壮苗生根培养，直至成苗。
实施例4
一种霍山石斛非固体组培快繁方法，包括以下处理步骤：
(1)采集7～8成熟未开裂的果荚，自来水冲洗干净，对果荚进行表面消毒，75％酒精消毒23s，0.1％升汞消毒4min，用解剖刀将果荚切开，取出种子，将种子播种在MS培养基上诱导获1～2cm的丛生苗；
(2)丛生苗继代增殖：对组培容器进行121℃高温高压灭菌30min，冷却后备用，配制非固体培养基，培养基配方为：MS+TDZ 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+琼脂糖0.25g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.8～6.0；将配制好的培养基分装到组培容器中。在超净工作台上打开配制好的培养基，将高压灭菌过的滤纸、无纺布、海绵等支撑物铺在液面上，将3株/丛的丛生苗平铺在支撑物上，25～28℃，光照强度56μmol·m-2·s-1，光周期10h/d；所述MS培养基包括以下用量的各原料混合组成：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、硫酸镁370mg/L、二水合氯化钙440mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水合硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、烟酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸硫胺素0.5mg/L。
(3)壮苗生根培养：选1.5～2.0cm高、3～5片叶，健康、正常发育的芽，接种到铺有滤纸的非固体培养基中，培养基配方为：MS+NAA 0.3mg/L+琼脂糖4.5g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.8～6.0，每瓶接种40株；接种后，将组培容器放置于培养架上，25～28℃，光照强度56μmol·m-2·s-1，光周期10h/d，进行壮苗生根培养，直至成苗。
实施例5
一种霍山石斛非固体组培快繁方法，包括以下处理步骤：
(1)采集7～8成熟未开裂的果荚，自来水冲洗干净，对果荚进行表面消毒，75％酒精消毒30s，0.1％升汞消毒5min，用解剖刀将果荚切开，取出种子，将种子播种在MS培养基上诱导获1～2cm的丛生苗；
(2)丛生苗继代增殖：对组培容器进行121℃高温高压灭菌30min，冷却后备用，配制非固体培养基，培养基配方为：MS+TDZ 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+卡拉胶1.5g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.8～6.0；将配制好的培养基分装到组培容器中。在超净工作台上打开配制好的培养基，将高压灭菌过的滤纸、无纺布、海绵等支撑物铺在液面上，将3株/丛的丛生苗平铺在支撑物上，25～28℃，光照强度59μmol·m-2·s-1，光周期10h/d；所述MS培养基包括以下用量的各原料混合组成：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、硫酸镁370mg/L、二水合氯化钙440mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水合硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、烟酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸硫胺素0.5mg/L。
(3)壮苗生根培养：选1.5～2.0cm高、3～5片叶，健康、正常发育的芽，接种到铺有滤纸的非固体培养基中，培养基配方为：MS+NAA 0.3mg/L+卡拉胶6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.8～6.0，每瓶接种40株；接种后，将组培容器放置于培养架上，25～28℃，光照强度59μmol·m-2·s-1，光周期10h/d，进行壮苗生根培养，直至成苗。
应当指出的是，以上实施例仅是本发明的优选实施方式，上述实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限制的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种非固体植物组培培养基，其特征在于，所述培养基为液体培养基中加入限定量的凝固剂的非固体培养基，凝固剂的浓度为0.25～6g/L。
2.根据权利要求1所述一种非固体植物组培培养基，其特征在于，所述凝固剂为琼脂或琼脂糖或卡拉胶，琼脂的浓度为1～5.5g/L，琼脂糖的浓度为0.25～4.5g/L，卡拉胶浓度为1.5～6g/L。
3.根据权利要求1或2所述一种非固体植物组培培养基，其特征在于，将高温高压灭菌过的滤纸或无纺布或海绵支撑物平铺在培养基液面上。
4.根据权利要求2所述一种非固体植物组培培养基，其特征在于，其用于茎段育苗期，具体配方组成为：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.4～6.0。
5.根据权利要求2所述一种非固体植物组培培养基，其特征在于，其用于丛生苗育苗时，具体配方组成为：丛生苗继代增殖期，培养基配方为：MS+TDZ 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.4～6.0；壮苗生根期，培养基配方为：MS+NAA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.4～6.0。
6.一种植物非固体培养基的组培方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外植体的选择和获取：以带芽茎段或丛生苗为外植体，选择外植体获取材料，进行预处理得到外植体；
(2)配制非固体培养基，所述非固定培养基为向液体培养基中加入限定量的凝固剂，凝固剂的浓度为0.25～6g/L，将非固体培养基倒入组培容器中，高温高压灭菌，冷却后为液态，打开组织容器瓶盖，再将高温高压灭菌过的滤纸或无纺布或海绵支撑物平铺在液面上；
(3)培养：将处理好的带芽茎段或1～2cm丛生苗均匀平放在支撑物上，将接种好茎段或丛生苗的组培容器放置于培养架上进行培养，并按照各阶段培养的营养需求调整培养基配方，直至成苗。
7.根据权利要求6所述一种植物非固体组培方法，其特征在于，所述凝固剂为琼脂或琼脂糖或卡拉胶，琼脂的浓度为1～5.5g/L，琼脂糖的浓度为0.25～4.5g/L，卡拉胶浓度为1.5～6g/L。
8.用权利要求6～7任意一种所述植物非固体组培方法应用在金线莲和霍山石斛组培快繁上。
9.根据权利要求8所述植物非固体组培方法在金线莲液体组培快繁上的应用，其特征在于，选用金线莲茎段为外植体，采用非固体培养基进行一步成苗培养，所述非固体培养基配方为MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，培养基pH为：5.4～6.0；培养的具体条件为：25～28℃，光照强度50～60μmol·m-2·s-1，光周期10h/d。
10.根据权利要求9所述植物非固体组培方法在金线莲组培快繁上的应用，其特征在于，外植体获取材料的预处理方法为：在超净工作台上取出金线莲植株，去掉金线莲叶片和茎基部，将茎段切成1～2cm带芽茎段。
11.根据权利要求8所述植物非固体组培方法在霍山石斛组培快繁上的应用，其特征在于，选用霍山石斛果荚种子诱导出来的丛生苗为外植体，丛生苗继代增殖期，培养基配方为：MS+TDZ 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.4～6.0；壮苗生根期，培养基配方为：MS+NAA0.3mg/L+琼脂1～5.5g/L或琼脂糖0.25～4.5g/L或卡拉胶1.5～6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.1％，pH为：5.4～6.0；培养的具体条件为：25～28℃，光照强度50～60μmol·m-2·s-1，光周期10h/d。
12.根据权利要求11所述植物非固体组培方法在霍山石斛组培快繁上应用时，其特征在于，外植体获取材料的预处理方法为：将果荚用自来水冲洗干净，对果荚进行表面消毒：75％酒精消毒15～30s，0.1％升汞消毒3～5min，然后用解剖刀将果荚切开，取出种子，种子无菌播种在培养基上诱导丛生苗。
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