CN107960322A - 一种三七的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，具体公开了一种三七的组织培养方法。本发明三七的组织培养方法包括以下步骤：(1)三七外植体的选取与预处理：剪取的叶片作为外植体，并用多菌灵溶液浸泡；(2)灭菌：用酒精浸泡后，再用氯化汞溶液浸泡；(3)外植体诱导培养：将上述灭菌后的外植体接种于初代培养基中进行暗培养，得愈伤组织；(4)增殖培养：将上述得到的愈伤组织接种于增殖培养基中进行培养；(5)分化培养：将上述经过增殖培养获得的愈伤组织接种于分化培养基中进行培养，即可得到分化的组培苗。用本发明的组织培养方法来对三七植株的外植体进行培养，愈伤组织的诱导率高、愈伤组织生长状态好，同时，愈伤组织的分化效果好并能实现生根。
Description
【技术领域】
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种三七的组织培养方法。
【背景技术】
三七是我国传统珍贵的中药材，其为五加科属多年生直立草本植物。三七全身是宝，其茎、叶、花、果实在民间也作为药，具有较高的药用价值，但主要是以根为药，晒干的根性温，味道干苦回甜，其含有24种三七皂苷、17种氨基酸以及三七多糖、三七黄酮等多种生理活性物质，具有散瘀、消肿、止痛等多种外用功效作用，并具有降血糖和降血脂的功效。
但是目前三七野生资源难以满足日益增长的医药领域的需求，而在三七人工种植产业中，缺乏优质三七苗，病虫害严重，种植困难，产量低。
采用生物技术可以获得三七愈伤组织，进而可以进行三七组织培养、细胞培养、原生质体培养等研究，对三七种质资源的利用与保护，三七生理、生化、遗传、病理等研究有重要作用。而目前关于三七愈伤组织培养的研究较少。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种三七的组织培养方法。用本发明的组织培养方法来对三七植株的外植体进行培养，愈伤组织的诱导率高、愈伤组织生长状态好，同时，愈伤组织的分化效果好并能实现生根，因此，本发明的组织培养方法操作简便、成本低，可有效为进一步繁殖三七种苗提供技术支持，促进三七产业的发展。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种三七的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)三七外植体的选取与预处理：选取新鲜嫩绿、健康的三七植株，剪取三七植株的叶片作为外植体，并置于烧杯中；使用干净的软毛刷在水中轻刷上述剪取的叶片的表面后，采用质量分数为0.1％的多菌灵溶液浸泡10-20min；倒出多菌灵溶液并用纱布包住烧杯口后，用流水冲洗10-30min；
(2)灭菌：采用体积分数为75％的酒精浸泡上述经过预处理的外植体20-40s后，用无菌水冲洗3次，再用质量分数为0.1％的氯化汞溶液浸泡7～10min，最后再用无菌水冲洗5次；
(3)外植体诱导培养：将上述灭菌后的外植体接种于初代培养基中进行暗培养，得愈伤组织；所述初代培养基组成为：在MS培养基中添加1.8-2.3mg/L的2,4-D、0.8-1.3mg/L的KT、0.9-1.2mg/L的6-BA和0.3-0.6mg/L NAA；
(4)增殖培养：将上述得到的愈伤组织接种于增殖培养基中进行培养；所述增殖培养基组成为：在MS培养基中添加0.25-1.0mg/L的6-BA和0.1-0.5mg/L的NAA；
(5)分化培养：将上述经过增殖培养获得的愈伤组织接种于分化培养基中进行培养，即可得到分化的组培苗；所述分化培养基组成为：在B5培养基中添加0.6-1.1mg/L的6-BA和0.08-0.2mg/L的NAA。
进一步的，步骤(1)中，所述外植体还可以是三七植株的叶柄或茎段。
进一步的，步骤(2)中，所述氯化汞溶液中添加有2-3滴的吐温-80。
进一步的，步骤(3)中，所述初代培养基组成为：在MS培养基中添加2.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的KT、1.0mg/L的6-BA和0.5mg/L NAA。
进一步的，步骤(3)中，所述初代培养基的pH为5.8。
进一步的，步骤(4)中，所述增殖培养基组成为：在MS培养基中添加0.7mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA。
进一步的，步骤(5)中，所述分化培养基组成为：在B5培养基中添加1.0mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA。
其中，2,4-D是2,4-二氯苯氧乙酸类除草剂、KT是一种人工合成的细胞分裂素、6-BA是6-苄氨基腺嘌呤、NAA是1-萘乙酸。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明依次对外植体进行预处理和灭菌处理，本发明所采用的预处理和灭菌处理结合，可有效对外植体进行消毒，从而有效降低了外植体的污染率，且具有较好的愈伤组织诱导率。
(2)采用本发明的初代培养基进行外植体的培养，可有效促进愈伤组织的形成，诱导愈伤组织的成功率高；进一步，采用本发明的增殖培养基来对愈伤组织进行增殖培养，可得到大量的愈伤组织，且得到的愈伤组织生长状态好；最后，采用本发明的分化培养基来对愈伤组织进行分化培养，分化效果好，且能实现生根。
综上，采用本发明的组织培养方法来对三七植株的外植体进行培养，愈伤组织的诱导率高、愈伤组织生长状态好，同时，愈伤组织的分化效果好并能实现生根，因此，本发明的组织培养方法操作简便、成本低，可有效为进一步繁殖三七种苗提供技术支持，促进三七产业的发展。
【具体实施方式】
下面将结合具体实施例来对本发明作进一步的说明。
实施例1
(1)三七外植体的选取与预处理：选取新鲜嫩绿、健康的三七植株，剪取三七植株的叶片作为外植体，并置于烧杯中；使用干净的软毛刷在水中轻刷上述剪取的叶片的表面后，采用质量分数为0.1％的多菌灵溶液浸泡10min；倒出多菌灵溶液并用纱布包住烧杯口后，用流水冲洗10min；
(2)灭菌：采用体积分数为75％的酒精浸泡上述经过预处理的外植体20s后，用无菌水冲洗3次，再用质量分数为0.1％、且添加有2滴的吐温-80的氯化汞溶液浸泡7min，最后再用无菌水冲洗5次；
(3)外植体诱导培养：将上述灭菌后的外植体接种于初代培养基中，在26℃下进行暗培养11-13d，外植体周围出现了很多绿色的组织，即得愈伤组织；所述初代培养基组成为：在MS培养基中添加1.8mg/L的2,4-D、0.8mg/L的KT、0.9mg/L的6-BA和0.3mg/L NAA，且其pH为5.8；
(4)增殖培养：将上述得到的愈伤组织接种于增殖培养基中进行培养23-27d，即得大量的愈伤组织；所述增殖培养基组成为：在MS培养基中添加0.25mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA；
(5)分化培养：将上述经过增殖培养获得的愈伤组织接种于分化培养基中进行培养至分化成芽后，继续培养5-6d，芽形成茎和叶，再继续培养3-4d后，可长出根须，此时，即可得到分化的组培苗；所述分化培养基组成为：在B5培养基中添加0.6mg/L的6-BA和0.08mg/L的NAA。
实施例2
(1)三七外植体的选取与预处理：选取新鲜嫩绿、健康的三七植株，剪取三七植株的茎段作为外植体，并置于烧杯中；使用干净的软毛刷在水中轻刷上述剪取的叶片的表面后，采用质量分数为0.1％的多菌灵溶液浸泡17min；倒出多菌灵溶液并用纱布包住烧杯口后，用流水冲洗19min；
(2)灭菌：采用体积分数为75％的酒精浸泡上述经过预处理的外植体32s后，用无菌水冲洗3次，再用质量分数为0.1％、且添加有3滴的吐温-80的氯化汞溶液浸泡9min，最后再用无菌水冲洗5次；
(3)外植体诱导培养：将上述灭菌后的外植体接种于初代培养基中，在26℃下进行暗培养11-13d，外植体周围出现了很多绿色的组织，即得愈伤组织；所述初代培养基组成为：在MS培养基中添加2.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的KT、1.0mg/L的6-BA和0.5mg/L NAA；
(4)增殖培养：将上述得到的愈伤组织接种于增殖培养基中进行培养23-27d，即得大量的愈伤组织；所述增殖培养基组成为：在MS培养基中添加0.7mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA；
(5)分化培养：将上述经过增殖培养获得的愈伤组织接种于分化培养基中进行培养至分化成芽后，继续培养5-6d，芽形成茎和叶，再继续培养3-4d后，可长出根须，此时，即可得到分化的组培苗；所述分化培养基组成为：在B5培养基中添加1.0mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA。
实施例3
(1)三七外植体的选取与预处理：选取新鲜嫩绿、健康的三七植株，剪取三七植株的叶柄作为外植体，并置于烧杯中；使用干净的软毛刷在水中轻刷上述剪取的叶片的表面后，采用质量分数为0.1％的多菌灵溶液浸泡20min；倒出多菌灵溶液并用纱布包住烧杯口后，用流水冲洗30min；
(2)灭菌：采用体积分数为75％的酒精浸泡上述经过预处理的外植体40s后，用无菌水冲洗3次，再用质量分数为0.1％、且添加有2-3滴的吐温-80的氯化汞溶液浸泡10min，最后再用无菌水冲洗5次；
(3)外植体诱导培养：将上述灭菌后的外植体接种于初代培养基中，在26℃下进行暗培养11-13d，外植体周围出现了很多绿色的组织，即得愈伤组织；所述初代培养基组成为：在MS培养基中添加2.3mg/L的2,4-D、1.3mg/L的KT、1.2mg/L的6-BA和0.6mg/L NAA，且其pH为5.8；
(4)增殖培养：将上述得到的愈伤组织接种于增殖培养基中进行培养23-27d，即得大量的愈伤组织；所述增殖培养基组成为：在MS培养基中添加1.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA；
(5)分化培养：将上述经过增殖培养获得的愈伤组织接种于分化培养基中进行培养至分化成芽后，继续培养5-6d，芽形成茎和叶，再继续培养3-4d后，可长出根须，此时，即可得到分化的组培苗；所述分化培养基组成为：在B5培养基中添加1.1mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA。
效果验证：
1.污染率测定
以依次经过本发明预处理和灭菌处理的外植体作为实验组，以仅经过本发明预处理的外植体作为对比例1，以仅经过本发明灭菌处理的外植体作为对比例2。将上述各组外植体分别接种于不含外源激素的基础培养基上(MS培养基+蔗糖25g/L+琼脂5g/L，pH＝5.8)进行暗培养30d后，观察各组外植体出现污染的情况(只要接种外植体的培养瓶中有一个外植体出现肉眼可观察到的真菌菌落或细菌菌落即将整瓶外植体认定为污染)，并计算各组外植体的污染率，结果见表1：
表1各组外植体的污染率
| 组别 | 实验组 | 对比例1 | 对比例2 |
| 污染率(％) | 5 | 25 | 12.5 |
由表1可知，实验组1外植体的污染率明显低于对比例1和2，说明本发明预处理和灭菌处理结合，对外植体的消毒效果好。同时，在以上各组未污染的外植体中，实验组愈伤组织的诱导率比对比例1和对比例2分别高了19.4％和22.8％，说明经过本发明预处理和灭菌处理的外植体，不仅未污染率高，且愈伤组织的诱导率高。
2.诱导分化结果统计
对上述3组实施例外植体的诱导分化情况进行观察统计，结果见表2：
表2各组外植体的分化诱导分化情况表
| 组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 愈伤组织诱导率(％) | 94.8 | 98.3 | 95.2 |
| 愈伤组织分化率(％) | 98.4 | 99.5 | 98.7 |
| 愈伤组织生根率(％) | 87.5 | 89.3 | 86.4 |
由表2可知，本发明的组织培养方法愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率都很高，并且还可有效促进愈伤组织生根，减少了后续生根培养的工作量，效率高。同时，诱导得到的愈伤组织细胞团紧密，生长良好。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (7)
1.一种三七的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)三七外植体的选取与预处理：选取新鲜嫩绿、健康的三七植株，剪取三七植株的叶片作为外植体，并置于烧杯中；使用干净的软毛刷在水中轻刷上述剪取的叶片的表面后，采用质量分数为0.1％的多菌灵溶液浸泡10-20min；倒出多菌灵溶液并用纱布包住烧杯口后，用流水冲洗10-30min；
(2)灭菌：采用体积分数为75％的酒精浸泡上述经过预处理的外植体20-40s后，用无菌水冲洗3次，再用质量分数为0.1％的氯化汞溶液浸泡7～10min，最后再用无菌水冲洗5次；
(3)外植体诱导培养：将上述灭菌后的外植体接种于初代培养基中进行暗培养，得愈伤组织；所述初代培养基组成为：在MS培养基中添加1.8-2.3mg/L的2,4-D、0.8-1.3mg/L的KT、0.9-1.2mg/L的6-BA和0.3-0.6mg/L NAA；
(4)增殖培养：将上述得到的愈伤组织接种于增殖培养基中进行培养；所述增殖培养基组成为：在MS培养基中添加0.25-1.0mg/L的6-BA和0.1-0.5mg/L的NAA；
(5)分化培养：将上述经过增殖培养获得的愈伤组织接种于分化培养基中进行培养，即可得到分化的组培苗；所述分化培养基组成为：在B5培养基中添加0.6-1.1mg/L的6-BA和0.08-0.2mg/L的NAA。
2.根据权利要求1所述一种三七的组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述外植体还可以是三七植株的叶柄或茎段。
3.根据权利要求1所述一种三七的组织培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述氯化汞溶液中添加有2-3滴的吐温-80。
4.根据权利要求1所述一种三七的组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述初代培养基组成为：在MS培养基中添加2.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的KT、1.0mg/L的6-BA和0.5mg/LNAA。
5.根据权利要求1或4所述一种三七的组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述初代培养基的pH为5.8。
6.根据权利要求1所述一种三七的组织培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述增殖培养基组成为：在MS培养基中添加0.7mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA。
7.根据权利要求1所述一种三七的组织培养方法，其特征在于，步骤(5)中，所述分化培养基组成为：在B5培养基中添加1.0mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA。
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