CN109486823B - 一种高表达的籼稻型启动子在粳稻中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高表达的籼稻型启动子在粳稻中的应用，属于植物基因工程领域。本发明涉及的启动子为OsAAP4基因籼稻型启动子，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过分别构建OsAAP4基因籼稻型、和粳稻型启动子‑GUS转基因植株，及GUS表达活性互相检测与比较，发现该基因籼稻型启动子在粳稻各个组织部位都比粳稻型启动子活性高，能够强烈启动下游基因在粳稻多个部位的强烈表达。将OsAAP4基因籼稻型的启动子应用于粳稻型水稻转基因工程中，可在粳稻各个生长阶段促进下游基因的表达，也可以使其他目的基因的表达产物特异的积累或富集，提高水稻中基因的整体表达量，因此该启动子在转基因工程中有良好的应用前景。

Description

一种高表达的籼稻型启动子在粳稻中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种高表达的籼稻型启动子在粳稻中的应用。

背景技术

植物通过吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等来获得氮素；氮的吸收和转运主要依靠铵根运输蛋白(AMT)、硝酸根运输蛋白(NRT)、氨基酸运输蛋白(AAT)、肽运输蛋白(PTR)等运输蛋白来完成(Williams L,Miller A.Transporters responsible forthe uptake and partitioning of nitrogenous solutes.Annu Rev Plant Biol andPlant Mol Biol,2001,52:659-688.)。铵通过植物AMT吸收后再通过谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再进一步形成其它氨基酸(Sonoda Y,Ikeda A,Saiki S,et al.Feedback regulation of the ammonium transporter genefamily AMT1by glutamine in rice.Plant Cell Physiol,2003,44:1396-1402.)。植物可通过高亲和转运系统(HATS)的NRT2和低亲和转运系统(LATS)的NRT1吸收环境中的硝酸盐，由硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NiR)还原形成铵，再进一步形成氨基酸(Paungfoo-Lonhienne C,Lonhienne T G,Rentsch D,et al.Plants can use protein as anitrogen source without assistance from other organisms.PNAS,2008,105:4524-4529.)。

在高等植物中，AAT是一类跨膜蛋白，将氨基酸从胞外运至胞内，同时还在氨基酸远距离运输、病原反应和非生物胁迫等方面发挥着重要作用(Tegeder M.Transportersfor amino acids in plant cells:some functions and many unknowns.Curr OpinPlant Biol,2012,15:1-7.)。AAT基因被分为两个超家族：APC(氨基酸、多胺和胆碱转运)超家族和AAAP(氨基酸/生长素透性酶)超家族。APC超家族分为三个亚家族：CATs(阳离子氨基酸转运蛋白)家族、ACTs(氨基酸/胆碱转运蛋白)家族和PHSs(多胺、H+协同转运蛋白)家族。AAAP超家族分为六个亚家族：AAPs(氨基酸透性酶)家族、LHTs(赖氨酸和组氨酸转运蛋白)家族、ProTs(脯氨酸转运蛋白)家族、GATs(γ-氨基酸丁酸，GABA)家族、AUXs(生长素转运蛋白)家族和ANTs(芳香族和中性氨基酸转运蛋白)家族(Fischer WN,Andre B,Rentsch D,etal.Amino acid transport in plants.Trends Plant Sci,1998,3:188-195.)。

水稻基因组中共找到85个AAT家族成员(Zhao H,Ma H,Yu L,et al.Genome-widesurvey and expression analysis of amino acid transporter gene family in rice(Oryza sativa L.).PLoS ONE,2012,7:e49210.)。研究发现OsAAT5、OsAAT7、OsAAT24、OsAAT49和OsAAT60的T-DNA插入突变体的稻米产量及植物体干重均下降，证明AAT对水稻的氮素积累及碳氮分配有着重要作用(Lu Y,Song Z,Lu K,et al.Molecularcharacterization,expression and functional analysis of the amino acidtransporter gene family(OsAATs)in rice.Acta physiol Plant,2012,34:1943-1962.)。研究发现超量表达OsAAP6会增加水稻籽粒中储藏性蛋白和氨基酸含量，从而改善稻米营养和风味(Peng B,Kong H,Li Y,et al.OsAAP6functions as an importantregulator of grain protein content and nutritional quality in rice.NatCommun,2014,5:doi:10.1038.)。氨基酸转运蛋白对水稻等各种植物体的氨基酸吸收、转运和储藏具有重要的作用。目前关于水稻AAP家族成员研究的报道很少，水稻氨基酸转运家族OsAAP3基因的蛋白可以运输赖氨酸和精氨酸等多种氨基酸(Taylor M R,Reinders A,WardJ M.Transport function of rice amino acid permeases(AAPs)[J].Plant and CellPhysiology,2015,56(7):1355-1363.)。

籼稻和粳稻是我国自古以来栽培稻的两大类型。籼稻比较适宜生长在高温、强光和多湿的热带及亚热带地区，在我国主要分布于华南热带和淮河以南的亚热带低地，籼稻分蘖性较强，叶子黄绿色，茎秆较高较软，稻穗上的子粒较稀，米粒长而细。早熟而黏性较弱，胀性大，比较耐热和耐强光，但不耐寒。米粒直链淀粉含量较高，胶稠度硬，故蒸煮的米饭不粘。

而粳稻比较适宜生长在气候暖和的温带热带高地，在我国主要分布于南部热带、亚热带的高地、华东太湖流域以及华北、西北、东北等温度较低的地区。粳稻主产我国黄河流域、北部和东北部；在南方则分布于海拔1800米以上，较耐冷寒，是为中纬度和较高海拔地区发展形成的亚种。粳稻茎杆较矮，叶子较窄，深绿色，米粒短而粗，其米粒不粘。粳稻籽粒阔而短，较厚，呈椭圆形或卵圆形。籽粒强度大，耐压性能好，加工时不易产生碎米，出米率较高，米饭胀性较小，蛋白质含量较高，口味好。

本发明发现OsAAP4基因在籼稻和粳稻中存在不同类型的启动子序列，籼稻型的启动子序列比粳稻型的启动子序列能够启动基因在水稻各个部位高表达，在基因工程应用中可以整体提高目的基因在粳稻中的表达量，改善粳稻的株型和产量。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种高表达的籼稻型启动子在粳稻中的应用，启动子来源为水稻AAT基因家族成员OsAAP4基因的籼稻型启动子。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的AAT基因家族成员OsAAP4基因的籼稻型和粳稻型的启动子为对象，首先分别将构建好的启动子-GUS表达载体通过农杆菌介导转化到粳稻中花11成熟胚诱导的愈伤组织中，得到转基因植株后鉴定阳性植株，继而得到T1代转基因植株，得到T2代成熟种子。然后在T2代种子生长的不同时期分别进行GUS组织化学染色，分别对其植株的根尖、刚长侧根的根、有较多侧根的根、幼嫩的分蘖芽、较大的分蘖芽、叶片、叶鞘、茎和穗等不同组织进行染色，检测GUS表达活性，比较与分析其组织表达特异性。结果发现该基因籼稻型启动子是一个在各个组织部位都高表达的启动子，能够启动下游基因在粳稻中高表达。将该启动子应用于转基因工程中，可以使其他目的基因的表达产物整体上提高表达量，改善水稻株型和产量性状。因此，OsAAP4基因的籼稻型启动子在转基因工程中有良好的应用前景。

一种OsAAP4基因的籼稻型启动子在粳稻中的应用，为该启动子能够启动下游基因在粳稻各个组织部位高表达。实现该应用的方法具体包括如下步骤：构建含OsAAP4基因的籼稻型启动子-目的基因的表达载体，再将表达载体导入粳稻中得到转基因水稻，目的基因能够在粳稻各个部位高表达，达到增加目的基因表达量的目的。所述的目的基因可以包括具有氨基酸运输功能、硝酸根运输功能、增加氮素吸收与同化功能的基因，如OsAAP4、OsNPF6.5、OsGRF4等

所述的OsAAP4基因的籼稻型启动子序列如SEQ ID NO.1所示，或为对SEQ ID NO.1所示的序列进行取代、添加和/或缺失一个或几个核苷酸获得的不影响下游基因表达、具有同等功能的DNA序列。

所述的表达载体的骨架载体优选为pCAMBIA-1391Z载体。

本发明发现了OsAAP4基因的籼稻型启动子能够启动下游基因在水稻各个组织部位高表达。将该启动子应用于粳稻的转基因工程中，可在粳稻各个生长阶段促进下游基因的表达，也可以使其他目的基因的表达产物特异的积累或富集，提高水稻中基因的整体表达量，有良好的应用前景。

附图说明

图1是pCAM1391Z载体图。

图2是OsAAP4基因的粳稻型启动子的转基因植株根尖(A-1)、刚长侧根的根(B-1)、有较多侧根的根(C-1)、幼嫩的分蘖芽(D-1)、较大的分蘖芽(E-1)、叶片(F-1)、叶鞘(G-1)、茎(H-1)和穗(I-1)，以及籼稻型启动子的转基因植株根尖(A-2)、刚长侧根的根(B-2)、有较多侧根的根(C-2)、幼嫩的分蘖芽(D-2)、较大的分蘖芽(E-2)、叶片(F-2)、叶鞘(G-2)、茎(H-2)和穗(I-2)的GUS表达活性情况，图中的蓝色深，表示GUS表达活性高，说明启动子能够启动下游基因的表达。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1OsAAP4基因的启动子-GUS转基因植株的构建

分别提取籼稻C172和粳稻W144(品种见文献Chen,W.,Gao,Y.,Xie,W.,Gong,L.,Lu,K.,Wang,W.,et al.(2014)Genome-wide association analyses provide geneticand biochemical insights into natural variation in ricemetabolism.Nat.Genet.46,20-20.)的DNA，利用扩增引物F(TTAAGCTTATGGTGCTATCCCATTTATTTGGAGGA，SEQ ID NO.3)和扩增引物R(TTGGATCCGCCGATGCACAAGCCACCCAA，SEQ ID NO.4)通过PCR分别扩增OsAAP4基因的籼稻型和粳稻型启动子序列后(OsAAP4基因的籼稻型、粳稻型启动子序列分别如SEQ ID NO.1、2所示)，利用HindIII和BamHI酶切连入pCAMBIA-1391Z载体，构建出两种类型的启动子-GUS表达载体。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，通过转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织将两种启动子-GUS表达载体分别导入粳稻品种中花11中。

将所有转基因小苗根部浸泡在50mg/L的潮霉素溶液72小时，叶子变卷的小苗为转基因阴性植株，可丢弃，叶子正常的小苗为阳性植株，进一步移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出株系基因不分离的纯合的转基因植株。

实施例2两种转基因植株不同部位启动子-GUS表达活性的检测

在分蘖期和生殖期对T2代纯合转基因植株的不同部位进行GUS染色，具体过程如下：收获鉴定成功的T2代种子后，将其浸泡在水中，并在37℃恒温培养箱中培养。待种子的芽长到2cm左右，将其播种到96孔板，在温室光照下用全营养液水培，待小苗时期，换用水稻营养液培养。待小苗长到在20cm左右，将其移栽到土壤里，温室光照培养。在分蘖期和生殖期对植株根尖、刚长侧根的根、有较多侧根的根、幼嫩的分蘖芽、较大的分蘖芽、叶片、叶鞘、茎和穗等进行GUS染色，比对两种启动子类型来源的染色情况进行比较。

以上材料浸泡于GUS染色液后并置于37℃保温至过夜。然后用75％酒精脱色3次后将其保存于4℃。将用酒精脱色后的材料置于显微镜下观察，蓝色部位为GUS活性表达位点。结果见图2，经过染色发现籼稻型的启动子序列所构建的材料GUS活性在各个组织部位均较高。

上述结果表明，OsAAP4基因籼稻型启动子是一个在水稻各个组织部位高表达的启动子，能够启动下游基因在水稻中高表达。将该启动子应用于粳稻的转基因工程中，可在粳稻各个生长阶段促进下游基因的表达，也可以使其他目的基因的表达产物特异的积累或富集，提高水稻中基因的整体表达量。因此OsAAP4基因的籼稻型启动子在转基因工程中有良好的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉生物工程学院

<120> 一种高表达的籼稻型启动子在粳稻中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1808

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atggtgctat cccatttatt tggaggaaca tggttgaaac taatgaattg atgtacaagt 60

tataagacaa actgaagtac caaaatcaat aaaaaaatgt gttcaaaaca aagataaaat 120

ttaatttgtt ggagatattt aaaattagaa tcctcaactt attaattaag tgtgtgttca 180

tattcataac catacatggc cgtacacact tctcaagtga tgtgcattgg agtgtgaatc 240

ggatcaattt ttacatacag aacacaccta gtgaaaagta tcatcactac caaaaaaaaa 300

aaaagccttg ttaaagatat aagcatatcc cacatataga cacttccaaa ttaaatcaat 360

tgttagtgct cttggaaccc ataggcttgc tataaaatta aacttgaact tgttttcttt 420

cttgaggtag atatatctga caactgatcg agtaccattc acatgcttaa tttgattaaa 480

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ttctttgcca tcagaagttt gttctagcta ggcaaggtgg acatatgttt ttcctttgat 720

attttctttt gaaccaactg caaagcctga caagtactcc atccgtccaa aaaagaccga 780

gtttttcgga tttcgtatcc aatgtttgac catccgtctt atatgaaact tttttatgat 840

tagtattttt attattgtta gatgataaaa catgaataat actttacgca tgacttatct 900

tttcaatttt ttttataatt ttttcaaata agacgaacgg tcaaatgtta gatacggaaa 960

cctaggaatt gagttttttt tggatggagg gagtacatat ctgtgagatg ccttttttaa 1020

aaaactttaa cagtgatagg tttcacctta tctcctgaaa aagaaaacag agagaaaggt 1080

aaaatatgga tgggatgtat gaaaacaatg tttattattt gcaatgcgcg taagggcatc 1140

aattcacttt ttttttacat caataaaacg acattatgga agttactttc tgaatcatag 1200

cctctcttag gatatagtag gcaacacgca acgaaatcag agtctctaca ctctctacaa 1260

aagagggaaa ctgtaaagat cttaatcatt ttcagttaca aattaaatgg tgtttcaata 1320

gcttgaaact caataaagtt tccttttgga gagaggatag aaactacccc agctagcaca 1380

tgcttgcatc gaacaataaa acaactttaa gaccatatat tcaagagcaa acggtccatc 1440

gatcatatat aacttctact cctatctata tatatcgcaa atacgacaaa tataccaatt 1500

gagctagcta gctataggat gatcaaccaa tcaaataagc aacctgcatt ctcttcactc 1560

actcactcac tcatactcat acatatatat atatgtgccc cctcaataat taaaagctag 1620

atctacgtac acatacgctg ataaaggtcg attgagacat caccccaaat cttcccctaa 1680

ctttgctaat tattcactgg ccttttcctt tctatttctg ctacagtttt aatgaggaga 1740

aaaatagatg agctaccagt tctttgcttt tcctgagcta tatatatttg ggtggcttgt 1800

gcatcggc 1808

<210> 2

<211> 1788

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggtgctat cccatttatt tggaggaaca tggttgaaac taatgaattg atgtacaagt 60

tataagacaa actaaagtac caaaatcaat aaaaaatgtg ttcaaaacaa agataaaatt 120

taatttgttg gagatatttg aaaattagaa tcctcaactt attaattaag tgtgtgttca 180

tattcataac catacatggc cgtacacact tctcaagtaa tgtgcactgg agtgtgaatc 240

ggatcaattt ttacatacag aacacaccta gtgaaaagta tcatcagtac tccctccgtc 300

ccaaaataag tacagtttta acattgttca tgctcaacgt ttgaccgttc gtcttatttg 360

aaaaacaatt atgattagta tttttattgt tattagatga taatacatga atagtacttt 420

atgtgtgatt aatattttta atttttttca taaaattttt aaataagacg gacggtcaaa 480

acgctggata cgaatatcta tggctgcact tattttggga tggaggtagt aaaaaaaagc 540

cttgttaaag atataagcat atcccacaaa aagacacttc caaattaaat caattgttag 600

tgctcttgga acccataggc ttgctataaa attaaacttc aacttgtttt ctttcttgag 660

gtagatatct gacaactgat cgagtaccat tcacatgctt aatttgatta aaaaaattgc 720

tttttttttt catattggtt ccgaaacgaa tatttagtat gcctacaagt tgtttcaatt 780

tataatggaa gccatatata catgcatgtt cttctgttgc tggaagaaga atcctttccg 840

aaagtggtgc taatcgagaa tatgttgatc ttcttggttt tattctttgc catcagaagt 900

ttgttctagc taggcaaggt ggacatatgt ttttcctttg gtattttctt ttgaaccaac 960

tgcaaagcct gacaagtaca tatctgtgag atgccttttt taaaaaactt taacagtgat 1020

aagtttcacc ttatctcctg aaaaagaaaa cagagagaaa ggtaaaatat ggatgggatg 1080

tatgaaaaca atgtttatta tttgcaatgc gcgtaagggc atcaattcac ttgttttttt 1140

acatcattaa aacgacatta tggaagttac tttctgaatc atagcctatc ttaggatata 1200

gtaggcaaca cgcaacgaaa tcagagtctc tacactctct acaaaagagg gaaactgtaa 1260

agatcttaat cattttcagt tacaaattaa atggtgtttc aatagcttga aactcaataa 1320

agtttccttt tggagagagg atagaaacta ccccagctag cacatgcttg catcgaacaa 1380

taaaacaact ttaagaccat atattcaaga gcaaacggtc catcgatcat atataacttc 1440

tactcctatc tatatatatc gcaaatacga caaatatacc aattgagcta gctagctata 1500

ggatgatcaa ccaatcaaat aagcaacctg cattctcttc attcactcac tcactcatac 1560

tcatacatat atatgtgccc cctcaataat taaaagctag atctacgtac acatacgctg 1620

ataaaggtcg attgagacat caccccaaat cttcccctaa ctttgctaat tattcactgg 1680

ccttttcctt tctatttctg ctacagtttt aatgaggaga aaaatagatg agctaccagt 1740

tctttgcttt tcctgagcta tatatatttg ggtggcttgt gcatcggc 1788

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaagcttat ggtgctatcc catttatttg gagga 35

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttggatccgc cgatgcacaa gccacccaa 29

Claims (3)

1.一种OsAAP4基因的籼稻型启动子在粳稻中的应用，其特征在于：所述的应用为OsAAP4基因的籼稻型启动子能够启动下游基因在粳稻中各个组织部位高表达；所述的OsAAP4基因的籼稻型启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：构建含OsAAP4基因的籼稻型启动子-目的基因的表达载体，再将表达载体导入粳稻中得到转基因水稻，目的基因能够在粳稻各个部位高表达。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的表达载体的骨架载体为pCAMBIA-1391Z载体。

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