CN106434693A - 氨基酸转运基因OsAAP4在水稻选育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氨基酸转运基因OsAAP4在水稻选育中的应用，属于植物基因工程领域。OsAAP4基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过构建水稻OsAAP4基因超表达植株、OsAAP4基因干扰植株，发现通过提高OsAAP4基因表达，可以使正常的水稻分蘖数和每株穗数增加，因此OsAAP4基因可用于水稻选育中以提高水稻产量。OsAAP4基因在阐述氨基酸运输影响植物生长及发育过程方面具有重要的应用价值。

Description

氨基酸转运基因OsAAP4在水稻选育中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及氨基酸转运基因OsAAP4在水稻选育中的应用。

背景技术

植物通过吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等来获得氮素；氮的吸收和转运主要依靠铵根运输蛋白（AMT）、硝酸根运输蛋白（NRT）、氨基酸运输蛋白（AAT）、肽运输蛋白（PTR）等运输蛋白来完成（Williams L, Miller A. Transporters responsible forthe uptake and partitioning of nitrogenous solutes. Annu Rev Plant Biol andPlant Mol Biol, 2001, 52: 659-688.）。铵通过植物AMT吸收后再通过谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再进一步形成其它氨基酸（SonodaY, Ikeda A, Saiki S, et al. Feedback regulation of the ammonium transportergene family AMT1 by glutamine in rice. Plant Cell Physiol, 2003, 44: 1396-1402.）。植物可通过高亲和转运系统（HATS）的NRT2和低亲和转运系统（LATS）的NRT1吸收环境中的硝酸盐，由硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NiR）还原形成铵，再进一步形成氨基酸（Paungfoo-Lonhienne C, Lonhienne T G, Rentsch D, et al. Plants can useprotein as a nitrogen source without assistance from other organisms. PNAS,2008, 105: 4524-4529.）。

在高等植物中，AAT是一类跨膜蛋白，将氨基酸从胞外运至胞内，同时还在氨基酸远距离运输、病原反应和非生物胁迫等方面发挥着重要作用（Tegeder M. Transportersfor amino acids in plant cells: some functions and many unknowns. Curr OpinPlant Biol, 2012, 15: 1-7.）。AAT基因被分为两个超家族：APC（氨基酸、多胺和胆碱转运）超家族和AAAP（氨基酸/生长素透性酶）超家族。APC超家族分为三个亚家族：CATs（阳离子氨基酸转运蛋白）家族、ACTs（氨基酸/胆碱转运蛋白）家族和PHSs（多胺、H+协同转运蛋白）家族。AAAP超家族分为六个亚家族：AAPs（氨基酸透性酶）家族、LHTs（赖氨酸和组氨酸转运蛋白）家族、ProTs（脯氨酸转运蛋白）家族、GATs（γ-氨基酸丁酸，GABA）家族、AUXs（生长素转运蛋白）家族和ANTs（芳香族和中性氨基酸转运蛋白）家族（Fischer WN, Andre B,Rentsch D, et al. Amino acid transport in plants. Trends Plant Sci, 1998, 3:188-195.）。

水稻基因组中共找到85个AAT家族成员（Zhao H, Ma H, Yu L, et al. Genome-wide survey and expression analysis of amino acid transporter gene family inrice (Oryza sativa L.). PLoS ONE, 2012, 7: e49210.）。研究发现OsAAT5、OsAAT7、OsAAT24、OsAAT49和OsAAT60的T-DNA插入突变体的稻米产量及植物体干重均下降，证明AAT对水稻的氮素积累及碳氮分配有着重要作用（Lu Y, Song Z, Lu K, et al. Molecularcharacterization, expression and functional analysis of the amino acidtransporter gene family (OsAATs) in rice. Acta physiol Plant, 2012, 34: 1943-1962.）。研究发现超量表达OsAAP6会增加水稻籽粒中储藏性蛋白和氨基酸含量，从而改善稻米营养和风味（Peng B, Kong H, Li Y, et al. OsAAP6 functions as an importantregulator of grain protein content and nutritional quality in rice. NatCommun, 2014, 5: doi:10.1038.）。氨基酸转运蛋白对水稻等各种植物体的氨基酸吸收、转运和储藏具有重要的作用。目前对水稻AAP家族成员研究的报道很少，水稻氨基酸转运家族OsAAP4基因对水稻的生长发育目前未有任何研究。本发明发现OsAAP4基因对水稻分蘖有极其重要的作用，可应用于植物株型改良从而使水稻增产。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供氨基酸转运基因OsAAP4在水稻选育中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的氨基酸转运基因OsAAP4为对象，从水稻中花11中克隆了OsAAP4的cDNA序列。通过构建OsAAP4基因超表达载体，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到OsAAP4基因超表达植株，其分蘖数与对照野生型中花11相比显著提高。通过RNAi技术构建OsAAP4基因干扰表达载体，将干扰表达载体导入中花11中，得到OsAAP4基因表达量下降的干扰植株，干扰植株的分蘖数与中花11相比显著降低。这些结果表明，通过提高OsAAP4基因的表达，可以使正常的水稻分蘖数增加，从而提高穗数和水稻产量。OsAAP4基因在阐述氨基酸运输影响植物生长及发育过程方面具有重要的应用价值。

基于本发明发现的OsAAP4基因的功能，其可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻分蘖数，从而提高穗数和水稻产量。具体可通过提高OsAAP4基因的表达使水稻分蘖数和每株穗数增加，达到提高水稻产量的目的。

OsAAP4基因也可用于提高其他植物的产量，如通过转基因使OsAAP4基因在植物中（超量）表达，来提高植物的分枝数量，进而使植物的产量得到提高。所述的植物是指单子叶植物或双子叶植物；如：小麦、番茄、草坪草或苜蓿等。

所述的OsAAP4基因编码的OsAAP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的OsAAP4基因的cDNA序列优选如SEQ ID NO.2所示。

应该理解为，在不影响OsAAP4蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsAAP4蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

（1）本发明克隆的OsAAP4基因超表达后使水稻分蘖能力增强，说明OsAAP4基因对提高水稻分蘖数较明显，因此，通过基因工程技术提高OsAAP4基因的表达能够提高植物产量。这有助于通过正常施氮条件下培育高产水稻，使得分子育种进行植物的品种改良。

（2）OsAAP4基因的成功克隆，进一步证实了氨基酸转运家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明氨基酸转运家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。

（3）尽管目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本发明克隆的OsAAP4基因能够提高水稻的分蘖数，对确定植物增产的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是对照中花11、OsAAP4基因超表达植株2个株系和OsAAP4基因干扰植株2个株系的整株表型图。

图2是对照中花11、OsAAP4基因超表达植株2个株系和OsAAP4基因干扰植株2个株系分蘖数的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比有差异显著。

图3是对照中花11、OsAAP4基因超表达植株2个株系和OsAAP4基因干扰植株2个株系OsAAP4基因相对表达量的统计柱状图，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1 OsAAP4基因超表达植株的构建

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F1：5'-GGTACCATGGACAGGAGAGCAGTAGTGTAT-3'（KpnI），

R1：5'-TCTAGATCGTCGATCGCCGCCCGCCAT-3'（XbaI）；

通过PCR扩增OsAAP4基因的cDNA后，通过KpnI、XbaI酶切后连入pCAMBIA-1306载体（pCAMBIA-1306载体购自Cambia公司），构建出OsAAP4基因的超表达载体OsAAP4-p1306。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组DNA通过PCR对转基因植株进行检测，检测引物对为：

F2：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R2：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'；

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsAAP4基因超表达植株。OsAAP4基因超表达植株的分蘖数远多于对照中花11植株，差异显著，如图1、2所示。

取OsAAP4基因超表达植株叶片，提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测OsAAP4基因的表达量，结果显示（图3）超表达植株OsAAP4基因的表达量与对照中花11相比显著升高。实时荧光定量PCR所用引物对为：

F3：5'-ACTTCCCGGTGAGCATGCACGTCG-3'，

R3：5'-GCCTTGAGGTTGTGGACGATGTCC-3'。

实施例2 OsAAP4基因干扰植株的构建

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F4：5'-AGGATCCGAGACAAGGGACGGTGTGGA-3'（BamHI），

R4：5'-AAGGTACCACCCACACAACATCACGTTCTTCG-3'（KpnI）；

F5：5'-AGAGCTCGAGACAAGGGACGGTGTGGA-3'（Sac I），

R5：5'-AAACTAGTACCCACACAACATCACGTTCTTCG-3'（Spe I）；

各自PCR扩增出OsAAP4基因的cDNA片段后，通过上述相应的限制性内切酶酶切后连入pTCK303载体，构建出OsAAP4基因的干扰表达载体OsAAP4-pTCK303。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组DNA通过PCR对转基因植株进行检测，检测引物对为：

F2：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R2：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsAAP4基因干扰植株。OsAAP4基因干扰植株的分蘖数远少于中花11植株，差异显著，如图1、2所示。

通过实时荧光定量PCR检测OsAAP4基因干扰植株OsAAP4基因的表达量，操作同实施例1，结果显示（图3）干扰植株OsAAP4基因的表达量与中花11相比显著降低。

上述结果表明，通过提高OsAAP4基因的表达，可以增加水稻的分蘖数和每株穗数，最终提高水稻产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉生物工程学院

<120> 氨基酸转运基因OsAAP4在水稻选育中的应用

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Asp Arg Arg Ala Val Val Tyr Asp Ala Glu Ala Val Asp Asp His

1 5 10 15

Glu Arg Gln Gly Thr Val Trp Thr Ala Thr Ser His Ile Val Ala Ala

20 25 30

Val Val Gly Ser Gly Val Leu Ala Leu Ala Trp Thr Val Ala Gln Leu

35 40 45

Gly Trp Val Val Gly Pro Leu Val Leu Val Gly Phe Ser Cys Val Thr

50 55 60

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Ala Asn Cys Tyr Arg Tyr Pro Asp Pro

65 70 75 80

Val Thr Gly Thr Ala Asn Arg Glu Tyr Ile Asp Ala Val Arg Cys Tyr

85 90 95

Leu Gly Pro Lys Asn Val Met Leu Cys Gly Cys Ala Gln Tyr Val Asn

100 105 110

Leu Trp Gly Thr Leu Val Gly Tyr Thr Ile Thr Ala Ser Ala Ser Met

115 120 125

Ile Ala Val Lys Arg Val Asn Cys Phe His Arg Glu Gly Tyr Gly Ala

130 135 140

Gly Asp Cys Gly Ala Ser Gly Ser Thr Tyr Met Val Val Phe Gly Val

145 150 155 160

Phe Gln Leu Leu Leu Ser Gln Leu Pro Ser Leu His Asn Ile Ala Trp

165 170 175

Leu Ser Val Val Ala Val Ala Thr Ser Phe Gly Tyr Ser Phe Ile Ser

180 185 190

Leu Gly Leu Cys Ala Ala Lys Trp Ala Ser His Gly Gly Ala Val Arg

195 200 205

Gly Thr Leu Ala Gly Ala Asp Leu Asp Phe Pro Arg Asp Lys Ala Phe

210 215 220

Asn Val Leu Leu Ala Leu Gly Asn Ile Ala Phe Ser Tyr Thr Phe Ala

225 230 235 240

Asp Val Leu Ile Glu Ile Gln Asp Thr Leu Arg Ser Pro Pro Ala Glu

245 250 255

Asn Lys Thr Met Lys Arg Ala Ser Phe Tyr Gly Leu Ser Met Thr Thr

260 265 270

Val Phe Tyr Leu Leu Leu Gly Cys Thr Gly Tyr Ala Ala Phe Gly Asn

275 280 285

Asp Ala Pro Gly Asn Ile Leu Thr Gly Phe Ala Phe Tyr Glu Pro Phe

290 295 300

Trp Leu Val Asp Ile Ala Asn Ile Cys Val Ile Val His Leu Ile Gly

305 310 315 320

Ala Tyr Gln Val Phe Ala Gln Pro Ile Phe Ala Arg Leu Glu Ser Tyr

325 330 335

Val Ala Cys Gln Trp Pro Asp Ala Lys Phe Ile Asn Ala Thr Tyr Tyr

340 345 350

Val Arg Val Pro Gly Arg Trp Trp Pro Ala Ala Thr Val Ala Val Ala

355 360 365

Pro Leu Lys Leu Val Leu Arg Thr Ile Ile Ile Met Phe Thr Thr Leu

370 375 380

Val Ala Met Leu Leu Pro Phe Phe Asn Ala Val Leu Gly Leu Ile Gly

385 390 395 400

Ala Leu Gly Phe Trp Pro Leu Ser Val Tyr Phe Pro Val Ser Met His

405 410 415

Val Ala Arg Leu Gly Ile Arg Arg Gly Glu Pro Arg Trp Trp Ser Leu

420 425 430

Gln Ala Met Ser Phe Val Cys Leu Leu Ile Ser Ile Ala Ala Ser Ile

435 440 445

Gly Ser Val Gln Asp Ile Val His Asn Leu Lys Ala Ala Ala Pro Phe

450 455 460

Lys Thr Val Asn

465

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggacagga gagcagtagt gtatgatgct gaagcagttg atgatcatga gagacaaggg 60

acggtgtgga cggcgacgtc gcacatcgtg gcggcggtgg tcggctccgg cgtgctggcg 120

ctggcgtgga cggtggcgca gctggggtgg gtggtggggc ccctcgtcct cgttggcttc 180

tcatgtgtca cttactacac atctaccctc ctcgccaatt gctaccgcta ccccgacccc 240

gtcaccggca ccgccaaccg cgagtacatc gacgccgttc gctgctacct cgggccgaag 300

aacgtgatgt tgtgtgggtg tgcgcagtat gtcaacctgt ggggtacact tgtcgggtac 360

accatcacag cgagtgcaag catgatagcg gtgaagcggg tgaactgctt ccaccgggaa 420

gggtacggcg ccggcgactg cggcgcgtcg gggagcacgt acatggtggt gttcggcgtc 480

ttccagctcc tcctctccca gctcccctcc ctccacaaca tcgcctggct ctccgtcgtc 540

gccgtcgcca cctccttcgg ctactccttc atcagcctcg gcctctgcgc cgccaagtgg 600

gcctcccacg gcggcgccgt ccgcggcacc ctcgccggcg ccgacctcga cttcccccgc 660

gacaaggcct tcaacgtcct cctcgccctc ggcaacatcg ccttctccta caccttcgcc 720

gacgtcctca tcgagatcca ggacacgctc cgctcgccgc cggcggagaa caagaccatg 780

aagagggcct ccttctacgg cctctccatg accaccgtct tctacctcct cctcggctgc 840

accggctacg ccgccttcgg caacgacgcc cccggcaaca tcctcaccgg cttcgccttc 900

tacgagccct tctggctcgt cgacatcgcc aacatctgcg tcatcgtcca cctcatcggc 960

gcctaccaag tgttcgcgca gccgatcttc gcgaggctgg agagctacgt ggcgtgccag 1020

tggccggacg ccaagttcat caacgcgacc tactacgtga gggtgccggg gaggtggtgg 1080

ccggcggcga cggtggcggt ggcgccgctg aagctggtgc tgcggacgat catcatcatg 1140

ttcaccacgc tggtggcgat gctcctcccc ttcttcaacg ccgtgctggg cctcatcggg 1200

gcgctcggct tctggccgct ctccgtctac ttcccggtga gcatgcacgt cgcccgcctc 1260

ggcatccgcc gcggcgagcc gcggtggtgg tcgctgcagg ccatgagctt cgtctgcctc 1320

ctcatctcca tcgccgccag catcggctcc gtccaggaca tcgtccacaa cctcaaggct 1380

gctgcaccct tcaagactgt caactga 1407

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F1

<400> 3

ggtaccatgg acaggagagc agtagtgtat 30

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R1

<400> 4

tctagatcgt cgatcgccgc ccgccat 27

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F2

<400> 5

gatgttggcg acctcgtatt 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R2

<400> 6

tcgttatgtt tatcggcact tt 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F3

<400> 7

acttcccggt gagcatgcac gtcg 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R3

<400> 8

gccttgaggt tgtggacgat gtcc 24

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F4

<400> 9

aggatccgag acaagggacg gtgtgga 27

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R4

<400> 10

aaggtaccac ccacacaaca tcacgttctt cg 32

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F5

<400> 11

agagctcgag acaagggacg gtgtgga 27

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R5

<400> 12

aaactagtac ccacacaaca tcacgttctt cg 32

Claims (7)

1.OsAAP4基因在水稻选育中的应用，其特征在于：所述的水稻选育为提高水稻分蘖数。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过提高OsAAP4基因的表达使水稻分蘖数增加。

3.OsAAP4基因在提高植物产量中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的植物指单子叶植物或双子叶植物。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述的植物包括小麦、番茄、草坪草或苜蓿。

6.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述的OsAAP4基因编码的OsAAP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或OsAAP4蛋白为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的OsAAP4基因的cDNA序列如SEQ IDNO.2所示。