CN104560998B - 一种植物胚乳特异启动子及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种植物胚乳特异启动子及其应用，涉及一种植物启动子及其应用。本发明的目的是提供一种在水稻胚乳组织中特异性表达的启动子及其表达载体，以及启动子和表达载体的用途。该启动子的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过农杆菌介导法转化水稻，成功获得转基因植株。经过PCR验证和潮霉素筛选，表明水稻胚乳特异性启动子已经整合到水稻基因组中；GUS组织化学染色以及GFP激发光鉴定证实ZOU基因的启动子为胚乳特异性表达启动子。该启动子在启动目的基因在植物表达中的应用。

Description

一种植物胚乳特异启动子及其应用
技术领域
本发明涉及一种植物启动子及其应用。
背景技术
启动子是位于结构基因上游的一段特定的核酸序列，能够调控下游结构基因转录的起始时间和强度。根据植物中启动子启动转录的模式和功能，可将其分为三类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子在所有组织中都能启动基因的表达，具有持续性，不表现时空特异性，RNA和蛋白质表达量也相对恒定；组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在特定的器官或组织中；诱导型启动子需要在某些物理或化学信号的诱导下，才能启动目的基因的表达。
目前在植物表达载体中广泛应用的是组成型启动子，如花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因Ocs启动子等。虽然利用组成型启动子启动目的基因的表达对于基因的功能研究起到了一定的推动作用，但是由于目的基因会在所有组织中持续表达，不仅消耗细胞内大量的物质和能量，过量产物的积累有时还会导致原有代谢的失衡，阻碍植物的正常生长发育，甚至导致死亡。另外，重复使用组成型启动子驱动多个外源基因的表达可能引起基因沉默。因此，寻找组织特异性启动子代替组成性启动子对于基因功能研究以及通过基因工程的手段改造农作物、观赏性植物的品质具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种在水稻胚乳组织中特异性表达的启动子及其表达载体，以及启动子和表达载体的用途。
本发明植物胚乳特异启动子为ZOU基因启动子，来源于粳亚种水稻日本晴，该启动子大小为2648bp，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
将前述的植物胚乳特异性启动子插入pCXGUS-P和pCXGFP-P中，构建了新的植物表达载体，分别命名为pCXGUS-Pzou和pCXGFP-Pzou。
本发明植物胚乳特异启动子在启动目的基因在植物表达中的应用。所述植物为水稻。所述表达为在水稻胚乳中表达。
本发明通过农杆菌介导法转化水稻，成功获得转基因植株。经过PCR验证和潮霉素筛选，表明水稻胚乳特异性启动子已经整合到水稻基因组中；GUS组织化学染色以及GFP激发光鉴定证实ZOU基因的启动子为胚乳特异性表达启动子，pCXGUS-Pzou和pCXGFP-Pzou为胚乳特异性表达的载体。
附图说明
图1为构建的pCXGUS-Pzou表达载体的质粒图谱；图2为构建的pCXGFP-Pzou表达载体的质粒图谱；图3为转基因植株和未转化水稻日本晴各组织的GUS染色结果；图4为转基因植株和未转化水稻日本晴胚乳部分的GUS信号对比；图5为转基因植株和未转化水稻日本晴胚乳部分的GFP信号对比。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式植物胚乳特异启动子为ZOU基因启动子，来源于粳亚种水稻日本晴，该启动子大小为2648bp，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
具体实施方式二：本实施方式植物胚乳特异启动子在启动目的基因在植物表达中的应用；所述植物为水稻。
实施例1、植物胚乳特异启动子的获得方法及pCXGUS-Pzou表达载体的构建：
以水稻品种日本晴叶片为材料，提取其基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用引物AW32101(加了BamHⅠ酶切位点)和AW32102(加了PstⅠ酶切位点)进行PCR扩增，反应体系为50μL，由下列成分组成：
CR扩增条件为：94℃变性5min；接着94℃，2min，55℃，30sec，72℃，2min进行30个循环；72℃延伸反应10min。
水稻品种日本晴购买自中国水稻研究所。
将PCR扩增所得产物进行测序，测序结果表明植物胚乳特异启动子具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，即为ZOU基因启动子。
纯化PCR产物，用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ对PCR产物和载体pCXGUS-P(购自优宝生物公司)进行双酶切，回收11007bp的载体目的条带与酶切后的PCR产物相连，转化大肠杆菌DH10B，提取质粒，酶切验证后测序。该载体全长为13655bp(如图1)，在大肠杆菌中的抗性为卡那霉素抗性，在植物体中的抗性为潮霉素抗性。
实施例2、pCXGFP-Pzou表达载体的构建：
用BamHⅠ和PstⅠ对上述PCR产物和载体pCXGFP-P(购自优宝生物公司)进行双酶切，回收9912bp的载体目的条带与酶切后的PCR产物相连，转化大肠杆菌DH10B，提取质粒，酶切验证后测序。该载体全长为12560bp(如图2)，在大肠杆菌中的抗性为卡那霉素抗性，在植物体中的抗性为潮霉素抗性。
实施例3、农杆菌介导法转化水稻愈伤组织
(A)水稻愈伤组织的诱导
a)取成熟水稻种子，剥去颖壳。先用100mL 70％的乙醇(V/V)灭菌5min，再用2.5％的NaClO处理30min，无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干种皮表面的水分，将其接种到诱导培养基NBD2.0上，在25～28℃避光培养15天。
b)将在诱导培养基上诱导出的水稻愈伤组织分离，并接种到继代培养基NBD0.5上，进行继代培养3次，每次时间为2周。
(B)农杆菌菌液的准备
a)挑取鉴定好的农杆菌单菌落放于5mL含有50mg/L利福平、40mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃、250rpm震荡培养至OD600为0.6。然后以1:100比例重新接种到新鲜的LB培养基中振荡培养，LB培养基中所含抗生素和培养条件同前。
b)当OD600＝0.6时，将菌液以相对离心力4000g、4℃离心10min，集菌体，并按1:1的比例重悬于侵染液中，28℃、250rpm震荡培养2h，使菌种充分活化。(当OD600值不是0.6时，要调至0.6。)
(C)转化水稻愈伤组织
a)在水稻愈伤转化前，将其切成0.4～0.5cm大小，并置于NBD2.0培养基上预培养4天。
b)将预培养好的愈伤组织浸入含有农杆菌的侵染液中20min后，用无菌滤纸上吸干多余的菌体，置于铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上，黑暗中培养3天。
(D)水稻愈伤组织的抗性筛选
a)从共培养培养基上收集愈伤组织，并用含有500mg/L的头孢曲松钠的无菌水冲洗6～7次，吸取多余水分。
b)将愈伤组织转入筛选培养基a上培养2周，再移到筛选培养基b上继续筛选2次,每次2周。最后得到鲜黄色的抗性愈伤组织。
(E)抗性愈伤的再生
a)将获得的抗性愈伤组织，转移到预分化培养基上培养12～15天。(其中前6～7天黑暗培养，后8～9天光照培养，光照强度为45～55mmol·m-2·s-1。)
b)将已分化出不定芽的愈伤组织转移到分化培养基上培养15天，可使不定芽长成3cm左右的小苗。
c)将分化的小苗转移到生根培养基中，两周后生根，经过一周左右的炼苗，即可移栽到温室中栽培，待生长一段时间可以移至大田种植。
实施例4、转基因水稻的检测：
一、转基因水稻的PCR检测
以提取的转基因水稻总DNA为模板，以上述AW32101、AW32102为上下游引物，扩增目的片段，初步鉴定转基因植株。PCR反应体系和反应条件如之前克隆目的片段的体系和条件一样。
二、转基因水稻的潮霉素检测
以提取的转基因水稻总DNA为模板，用表达载体上所含的潮霉素基因为检测对象，设计引物，扩增片段，用于检测潮霉素抗性基因的上游引物为OL561(5’-TTCTACACAGCCATCGGTCC-3’)、下游引物为OL562(5’-CCCATGTGTATCACTGGCAA-3’)。
PCR反应体系参照ZOU基因启动子的克隆，反应条件如下：94℃预变性3min；94℃30sec；55℃30sec；72℃30sec，30个循环；72℃延伸10min。
三、水稻各组织的GUS染色
对上述检测阳性的植株，进行GUS组织化学染色，以非转基因水稻日本晴作为阴性对照。具体操作如下：分别将水稻的不同组织置于装有GUS染色液的EP管中，使GUS染色液浸没组织，37℃下保存4～12小时后，用75％的乙醇对材料进行脱色处理，直至材料呈白色。肉眼或显微镜下观察，被染成蓝色的部位即为GUS表达部位。染色结果如图3和图4所示，只有水稻的胚乳部位被染成蓝色，从而证明了启动子Pzou只在水稻胚乳组织中特异性表达。转基因植株和未转化水稻日本晴胚乳部分的GFP信号对比如图5所示。
上述实验的培养基组分及配方如下：
MS培养基：参照Muraashige and Skoog,1962
NB培养基(1L)为：
N6-I母液成份：
B5-II母液成份：
N6-III母液成份：
B5-IV母液成份：
N6-V母液成份：
成份 称量(g) 浓缩倍数 配制体积
CaCl2·2H2O 8.3 100× 500ml
培养水稻愈伤组织培养基：

Claims (3)

1.植物胚乳特异启动子，其特征在于该启动子的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
2.包含权利要求1所述植物胚乳特异启动子的重组载体。
3.权利要求1所述植物胚乳特异启动子在启动目的基因在植物表达中的应用；所述植物为水稻。
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