CN101831430A - 水稻干旱诱导型启动子Oshox24P的鉴定和利用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。涉及一种植物逆境特异诱导型启动子的分离鉴定和应用。通过分离和鉴定获得一种水稻干旱诱导型基因的启动子Oshox24P，它具有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明的启动子可以应用于植物的基因工程中，以达到植物遗传改良特别是提高植物抗旱性的目的。

Description

水稻干旱诱导型启动子Oshox24P的鉴定和利用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。涉及一种植物逆境特异诱导型启动子的分离鉴定和应用。通过分离和鉴定一个水稻干旱诱导型基因的启动子，可以将其应用于植物的基因工程中，以达到植物遗传改良特别是提高植物抗旱性的目的。

背景技术

干旱一直是造成作物减产的重要原因之一，并且随着全球环境恶化、气候异常将日益危害着粮食生产安全。对于中国这样一个淡水资源短缺的国家，这一点更为明显。提高植物抗旱性一直以来都是一个长期而艰巨的任务。一方面转基因已经成为研究功能基因组学的有效手段，另一方面，通过转基因途径改良植物抗逆性近年来正逐步得到可行性论证和普遍接受。已经有大量文献报道通过在植物中超量表达逆境应答相关基因能够在一定程度上提高植物的抗逆性(Saijo等，Over-expression ofa single Ca²⁺-dependent proteinkinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants.Plant J 23：319-327，2000；Zhang等，Twocysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana，AtCYSa and AtCYSb，increasing the salt，drought，oxidation and cold tolerance.Plant Mol Biol 68：131-143，2008；Hou等，A homolog of human ski-interactingprotein in rice positively regulates cell viability and stress tolerance.Proc Natl Acad Sci 106：6410-6415，2009；Ma等，Enhanced tolerance to chilling stress in OsMYB3R-2transgenic rice is mediated by alteration in cell cycleand ectopic expression of stress genes.PlantPhysiol 150：244-56，2009)。但是报道中的这些超量表达通常用的都是组成型启动子，尽管组成型启动子超量表达效应高，但是通常会伴随着负面效应，如对植物产生毒害或负担或者使转基因植株致死等(Shavindra等，Transgenic approaches to increase dehydration-stresstolerance in plants.Mol Breed 5：493-503，1999)。尽管已经有文献报道从植物中分离出受逆境应答的启动子(Yamaguchi-Shinozaki等，Characterization ofthe expression of a desiccation-responsive rd29gene ofArabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants.Mol Gen Genet 23：331-340，1993；Kasuga等，A combination ofthe Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer.Plant Cell Physiol 45：346-350，2004；Xiao等，Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions.Theor Appl Genet115：35-46，2007)，但是在重要粮食作物水稻中尚且少有很强的逆境诱导型启动子应用于植物基因工程。HD-Zip(homeodomain-leucine zipper)基因是一类植物中特有的转录因子基因家族，在植株的生长发育和逆境应答中发挥着多种功能(Scarpella等，A role for the rice homeobox gene Oshoxl in provascular cell fatecommitment.Development 127：3655-3669，2000；Agalou等，A genome-wide survey ofHD-Zip genes in rice andanalysis of drought-responsive family members.Plant Mol Biol 66：87-103，2007；Dai等，Functional analysis ofrice HOMEOBOX4(Oshox4)gene reveals a negative function in gibberellin responses.Plant Mol Biol66：289-301，2007；Itoh等，Developmental role and auxin responsiveness of Class III homeodomain leucine zippergene family members in rice.Plant Physiol，147(4)：1960-1975，2008)。

本发明是鉴定一个受干旱强烈诱导的水稻HD-Zip转录因子基因的启动子，通过启动子活性定量分析表明，可以将该启动子用于抗逆性相关基因在水稻等作物中的表达，从而有效地提高植株的抗逆境性能。

发明内容

本发明的目的是克隆、鉴定一个受干旱胁迫诱导表达的植物内源启动子，并利用该启动子构建抗旱相关基因表达载体，通过遗传转化方法达到控制目标基因特异地受逆境表达的目的。

本发明通过以下技术方案实施：

首先是分离受干旱强烈诱导表达的候选基因的启动子。所选择的候选基因是水稻内源基因HD-Zip转录因子家族的一员，命名为Oshox24(Adamantia等，A genome-wide survey ofHD-Zip genes in rice andanalysis of drought-responsive family members，Plant Mol Biol 66：87-103，2008)(KOME注释号AK063685)。该基因在水稻品种“中旱5号”、“中花11”和“珍汕97”的苗期干旱胁迫中均受到强烈的上升诱导表达(如图2)。所分离的该基因的启动子来源于水稻品种“中旱5号”，命名为Oshox24P。Oshox24P启动子是具有附图1中碱基第1-1918位的序列；在88-92、684-688、895-899、957-961、1480-1484、1550-1554、1681-1685、1820-1824碱基位点含有与逆境相关的ABA应答元件ABRELATERD1(Simpson等，Two different novelcis-acting elements of erd 1，a clpA homologous Arabidopsis gene function in induction by dehydration stress anddark-induced senescence.Plant J 33：259-270，2003；Nakashima等，Transcriptional regulation of ABI3-andABA-responsive genes including RD29B and RD29A in seeds，germinating embryos，and seedlings of rabidopsis.Plant Mol Biol.60：51-68，2006)，在448-455碱基位点含有逆境相关的ABA应答元件ABREOSRAB21(Marcotte等，Abscisic acid-responsive sequences from the Em gene of wheat.Plant Cell 1：969-976，1989；Busk等，Regulation ofabscisic acid-induced transcription，Plant Mol Biol 37：425-435，1998；Skriver等，Geneexpression in response to abscisic acid and osmotic stress，Plant Cell 2：503-512，1990)，在415-421、956-962、1233-1239、1680-1686、1789-1795、1819-1825碱基位点含有逆境相关的ABA应答元件ABRERATCAL(Kaplan等，Rapid Transcriptome Changes Induced by Cytosolic Ca2+Transients Reveal ABRE-RelatedSequences as Ca2+-Responsive cis Elements in Arabidopsis.Plant Cell 18：2733-2748，2006)。

本发明所提供的启动子Oshox24P区域含有多个与逆境相关的顺式作用元件(如附图1所示)，能特异性地对逆境和脱落酸(ABA)起应答反应。申请人利用Oshox24P启动子构建的GUS表达载体(如附图3所示)转化水稻受体品种中花11，可以在转基因植株受到逆境胁迫时强烈地诱导报告基因GUS的表达(如附图4所示)。本发明的效果详见具体实施方式。

详细的技术方案如下所述：

一种分离出的水稻DNA分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1和附图1所示，其中启动子Oshox24P包含附图1所示的序列中的1-1918位碱基的核酸序列。

所述的一种分离的DNA分子，其特征在于区域内除基本启动子元件外(TATA-box)，还包含多个逆境应答顺式作用元件(ABRELATERD1、ABREOSRAB21、ABRERATCAL)的组合。

所述的Oshox24P启动子全部或部分序列构建的水稻表达载体。

所述的Oshox24P启动子全部或部分序列构建水稻表达载体，通过遗传转化培育改良植物的方法。

所述的Oshox24P启动子全部或部分序列构建水稻表达载体，通过遗传转化培育的抗逆植物材料。所述的抗逆植物的材料是指植株、种子或细胞无性系。

按照以上的技术方案，很显然，申请人或申请人以外的其他人可以利用本发明所提供的Oshox24P启动子构建抗逆相关基因的表达载体转化植物以提高植物的抗逆性。受体植物可以是包括水稻、小麦、玉米等在内的禾谷类作物，当然也可以是包括其他一些重要的经济作物，例如玉米、棉花、油菜或番茄。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的水稻启动子Oshox24P的核苷酸序列。

图1：是本发明克隆的Oshox24P启动子序列。下划线序列为扩增Oshox24P启动子所用的引物序列。阴影显示的是基本启动子元件序列。逆境应答ABRE元件核心序列用红色并加波浪线表示。

图2：显示的是Oshox24基因在苗期水稻品种“中旱5号”、“中花11”、“珍汕97”中，当植株受到干旱胁迫时能够被强烈地诱导表达。

图3：显示的是本发明构建的表达载体pCAMBIA1391Z-Oshox24P表达载体。该载体含潮霉素抗性筛选基因(HRG)，启动子Oshox24P被融合到GUS基因5’端非翻译区。

图4：显示的是Oshox24P启动子控制下的GUS基因在干旱胁迫处理下的GUS活性。CK是p1391Z空载体转化的中花11，作为对照家系，TG1、TG2和TG3是p1391Z-Oshox24P转化中花11得到的3个独立的转基因阳性家系。4个时间点依次是：d0、干旱胁迫前；d1、叶片微卷；d2、叶片半卷；d3叶片全卷。

图5：显示的是Oshox24P启动子控制下的GUS基因在200mM NaCl胁迫处理下的GUS活性。CK是p1391Z空载体转化的中花11，作为对照家系，TG1、TG2和TG3是p1391Z-Oshox24P转化中花11得到的3个独立的转基因阳性家系。4个时间点分别是胁迫0h、3h、6h、24h。

图6：显示的是Oshox24P启动子控制下的GUS基因在100mM ABA胁迫处理下的GUS活性。CK是p1391Z空载体转化的中花11，作为对照家系，TG1、TG2和TG3是p1391Z-Oshox24P转化中花11得到的3个独立的转基因阳性家系。4个时间点分别是胁迫0h、0.5h、3h、24h。

图7：显示的是Oshox24P启动子控制下的GUS基因在4℃冷胁迫处理下的GUS活性。CK是p1391Z空载体转化的中花11，作为对照家系，TG1、TG2和TG3是p1391Z-Oshox24P转化中花11得到的3个独立的转基因阳性家系。4个时间点分别是胁迫0h、6h、12h、24h。

具体实施方式

实施例1、Oshox24P启动子分离和鉴定

通过水稻品种“中旱5号”(由中国上海农业科学院提供的商业品种)的干旱诱导基因表达谱分析，发现了一个受干旱强烈诱导(干旱胁迫后期表达量提高30倍以上)的基因，其TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)ID为LOC02g43330，被命名为Oshox24(Adamantia等，Agenome-widesurvey of HD-Zip genes in rice and analysis ofdrought-responsive family members，Plant Mol Biol 66：87-103，2008)，对应的BAC克隆号为AP004868，在KOME数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中对应的全长cDNA编号为AK063685。

下一步就是分离该基因的启动子。具体步骤如下：在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找到该基因对应的粳稻“日本晴”的基因组序列(AP004868)并选取该基因的转录起始位点上游2.5Kb的范围作为候选启动子区域进行PCR扩增。设计引物Oshox24P-F(5’-ATAGGATCCAGACGAGAAAGGAGTGCC-3’)和Oshox24P-R(5’-ACAGGATCCCGAATGTAAGACCAGAGCA-3’)，并在引物5’端添加限制性酶切位点BamHI(用斜体加下划线表示，酶切位点前的三个碱基为保护碱基)。首先利用引物Oshox24P-F和Oshox24P-R以“中旱5号”基因组DNA(CTAB法抽提，Zhang等，genetic diversity and differentiation of indicaan japonica rice detected by RFLP analysis，1992，Theor Appl Genet，83，495-499)为模板进行扩增，反应体系为20uL GC buffer I体系(购自宝生物工程(大连)有限公司，即TaKaRa公司)，反应条件是：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2mim，32个循环；72℃延伸7min。PCR产物连入pGEM-TEasy载体上，筛选阳性克隆并测序(ABI3730测序仪，Applied Biosystem，测序在国家植物基因中心[武汉]完成)，结果证实：所扩增序列为预期的Oshox24P启动子序列，其包含多个干旱、ABA逆境应答顺式作用元件(如图1)。

实施例2、检测水稻内源基因Oshox24的诱导表达

以水稻品种“中旱5号”、“中花11”、“珍汕97”为材料，种在大棚的沙土中，3叶期时进行断水干旱胁迫。胁迫前取d0时间点样品，干旱至叶片微微卷起时取d1时间点样品，叶片半卷时取d2时间点样品，叶片全卷时取d3时间点样品。总RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSⅢ(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(5’-ATCACCTAGACTACTTGGGCGG-3’和5’-TTGGCCATATCTCCCACAGATC-3’)对Oshox24基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长78bp)。同时用引物(5’-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和5’-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’)对水稻Actinl基因做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为：95℃10sec，95℃5sec，60℃34sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明该基因在水稻品种“中旱5号”、“中花11”、“珍汕97”的苗期干旱胁迫中均受到强烈的上升诱导表达，相应的上升倍数分别约为50倍、100倍、160倍(如图2)。

实施例3、Oshox24P启动子逆境诱导活性鉴定

本发明的实施方案就是构建Oshox24P启动子的GUS基因表达载体并转化到水稻品种“中花11”(来自中国农业科学院作物研究所商业品种)中，定量地检测Oshox24P启动子的逆境包括干旱、高盐、ABA、冷胁迫的诱导表达活性。具体操作如下：

首先将实施例1中分离的Oshox24P启动子的PCR产物连入pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)，转化大肠杆菌DH5α(购自Promega公司)并获得阳性克隆。通过BamHI单酶切从pGEM-T Easy阳性克隆上回收Oshox24P再将其连接到GUS表达载体p1391Z(来自CAMBIA公开使用的载体，载体含有GUS报告基因)。酶切验证阳性克隆并检测插入方向正确后，通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种“中花11中”，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficienttransformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries oftheT-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)并在其基础上进行改良优化。同时将不连接外源片段的p1391Z空载体转化水稻品种“中花11中”作为对照。主要步骤和试剂如下：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

硝酸钾(KNO₃)                  28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)            4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)             4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)           1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)           1.66g

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

碘化钾(KI)                    0.08g

硼酸(H₃BO₃)                   0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)           0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)           0.15g

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

烟酸(Nicotinic acid)            0.1g

维生素B1(Thiamine HCl)          0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl)        0.1g

甘氨酸(Glycine)                 0.2g

肌醇(Inositol)                  10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

硝酸铵(NH₄NO₃)             16.5g

硝酸钾                     19.0g

磷酸二氢钾                 1.7g

硫酸镁                     3.7g

氯化钙                4.4g

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

碘化钾                    0.083g

硼酸                      0.62g

硫酸锰                    0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)     0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)       0.0025g

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取2，4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取NAA  100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取IAA  100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g。在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X)                    100ml

N6mix母液(100X)                   10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              10ml

维生素贮存液(100X)                10ml

2，4-D贮存液                      2.5ml

脯氨酸(Proline)                   0.3g

CH                         0.6g

蔗糖(Sucrose)              30g

Phytagel                   3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X)             100ml

N6mix母液(100X)            10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)       10ml

维生素贮存液(100X)         10ml

2，4-D贮存液               2.0ml

脯氨酸                     0.5g

CH                         0.6g

蔗糖                       30g

Phytagel                   3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

N6max母液(10X)             12.5ml

N6mix母液(100X)            1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)       2.5ml

维生素贮存液(100X)         2.5ml

2，4-D贮存液               0.75ml

CH                         0.15g

蔗糖                       5g

琼脂粉(Agarose)            1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X)              12.5ml

N6mix母液(100X)             1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)        2.5ml

维生素贮存液(100X)          2.5ml

2，4-D贮存液                0.75ml

CH                          0.2g

蔗糖              5g

琼脂粉            1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X)            5ml

N6mix母液(100X)           0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      0.5ml

维生素贮存液(100X)        1ml

2，4-D贮存液              0.2ml

CH                        0.08g

蔗糖                      2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X)           25ml

N6mix母液(100X)          2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)     2.5ml

维生素贮存液(100X)       2.5ml

2，4-D贮存液             0.625ml

CH                       0.15g

蔗糖                     7.5g

琼脂粉                   1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X)        25ml

N6mix母液(100X)       2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)  2.5ml

维生素贮存液(100X)    2.5ml

6-BA贮存液            0.5ml

KT贮存液              0.5ml

NAA贮存液             50μl

IAA贮存液             50μl

CH                    0.15g

蔗糖            7.5g

琼脂粉          1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X)           100ml

N6mix母液(100X)          10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)     10ml

维生素贮存液(100X)       10ml

6-BA贮存液               2ml

KT贮存液                 2ml

NAA贮存液                0.2ml

IAA贮存液                0.2ml

CH                       1g

蔗糖                     30g

Phytagel                 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X)            50ml

MSmix母液(100X)           5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      5ml

维生素贮存液(100X)        5ml

蔗糖                      30g

Phytagel                  3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

3.1愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

(2)用灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4农杆菌培养

(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

3.7分化

将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；

转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

3.8生根

(1)剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中，光照下培养2-3周，温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

申请人采用构建的p1391Z-Oshox24P载体(如图3)转化水稻“中花11中”，得到转基因阳性植株18株；不连接外源片段的p1391Z空载体转化水稻“中花11中”得到转基因阳性植株8株。选取3个转启动子阳性家系和1个转空载体阳性对照家系对T1代种子进行潮霉素(HN)抗性筛选发芽，将发芽的苗子一部分种于小红桶的沙土内长至4叶期做干旱胁迫，一部分种于小方盒内长至3、4叶期做高盐、ABA、4℃冷胁迫。其中干旱胁迫方法如实施例2中所述，取胁迫前d0、叶片微卷d1、叶片半卷d2、叶片全卷d3四个时间点的样品。小方盒内用的是实施例3中的生根培养基，高盐胁迫是在小方盒内加入100mL200mMNaCl，取0h、3h、6h、24h时间点样品；ABA胁迫是在每个小方盒内加入70mL100mMABA，取0h、0.5h、3h、24h时间点样品，冷胁迫是将小方盒放入4℃冷库中，取0h、6h、12h、24h样品。每份样品取的是该家系的混合样(不少于10株)。

样品用液氮磨样，通过GUS抽提液(50mM Na₂HPO4，pH7.0，10mM β-mercaptoethanol，10mMNa₂EDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％Triton-100)抽提总蛋白，从样品中取出一定量的蛋白着进行GUS活性定量分析。通过分析荧光结果获得原样品的GUS比酶活。具体步骤如下：通过Bradford法(参见：A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding.1976，Anal Biochem，72：248-254)测得样品的总蛋白浓度，再根据浓度用移液器量取一定体积的相同质量的总蛋白，用相同量的总蛋白质提取物+0.4mlGUS提取缓冲液+10μl 40mM底物MUG(4-methylumbelifferyl-β-D-glucuronide)在37℃水浴一定时间(1h以内)后，加入1.6ml反应终止液(0.2MNa₂CO₃)；每个反应设置三个技术重复。用Tecan光栅型酶标仪infinite M200测量各个样品在激发光365nm，发射光455nm处的荧光值，同时以50nM MU的荧光值作为参比。进而通过以上数据计算出各个样品中GUS蛋白的比酶活，即1ug总蛋白每分钟反应底物MU的量(单位pmol MU/min/ug protein)。

通过GUS蛋白活性定量测量发现，Oshox24P启动子控制下的GUS蛋白活性受到干旱胁迫的强烈诱导，在三个独立转基因家系中GUS蛋白在叶片全卷时的活性是胁迫前的约3至18倍(如图4)；同时在ABA胁迫时该启动子控制下的GUS蛋白活性也呈现出增强的趋势，变化幅度约2至3倍(如图6)；在高盐胁迫和冷胁迫时GUS蛋白的活性变化不大或者变化规律不明显(如图5和图7)。

序列表

<110>华中农业大学

<120>水稻干旱诱导型启动子Oshox24P的鉴定和利用

<130>

<141>2010-04-26

 

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1918

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1918)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(18)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1918)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1900)..(1918)

<223>

<400>1

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aaggtctgtg caccgcgacc gcgagatacg tgttgccgac atggtcctat cagtgaccag    120

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ggctccgatg cgggacacct ggcgcgggac aaaaggcgag gtggggccca cgcgtaccag    1800

ggcacgagac cgtggtgcca cgtgtcggca tcggctccgg tataaaaggt cgccgcgcgc    1860

gccgttgttc tggaacacac acactactgc gactgctagt gctctggtct tacattcg      1918

Claims (2)

1.一种被干旱、高盐或低温特异诱导表达的启动子Oshox24P，它的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.权利要求1所述的启动子Oshox24P在控制基因在植物中表达的应用。

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