CN106282393A - 特异引物对及其在检测水稻耐盐性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异引物对及其在检测水稻耐盐性中的应用。本发明提供的特异引物对，由引物F1和引物R1组成；引物F1如序列表的序列1所示，引物R1如序列表的序列2所示。本发明还保护所述特异引物对在检测水稻耐盐性中的应用。本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的方法。本发明建立的检测方法可用于预测水稻耐盐性，对于水稻育种有重要意义。

Description

特异引物对及其在检测水稻耐盐性中的应用
技术领域
本发明涉及一种特异引物对及其在检测水稻耐盐性中的应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，目前我国65％以上的人口以此作为主食。但随着人口与经济的快速增长，粮食生产面临着巨大的挑战，其中水稻安全生产对于中国的可持续发展至关重要。水稻对盐碱表现为中度敏感，其生长和结实会受到盐碱的抑制。当前，土地盐碱化已成为威胁水稻生产的重要因素之一，盐碱可以使粮食作物严重减产，甚至高达40％以上。目前，全球大约20％的耕地存在盐碱化现象，其中中国约为2000万公顷，加之灌溉技术不当，造成的耕地次生盐碱化面积也在日益扩大。为了克服盐碱对水稻生产的不利影响，除了采用传统的农业栽培保护措施外，种植耐盐品种成为降低盐害损失最经济、最环保、最有效的重要方式之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异引物对及其在检测水稻耐盐性中的应用。
本发明提供了一种特异引物对，由引物F1和引物R1组成；
所述引物F1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子。
所述特异引物对的用途为鉴定水稻耐盐性。
本发明还保护所述特异引物对在鉴定水稻耐盐性中的应用。
本发明还保护含有所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为鉴定水稻耐盐性。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的方法，包括如下步骤：提取待测水稻的基因组DNA，以待测水稻的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，将扩增产物用BstUI限制性内切酶进行酶切，如果酶切产物中具有片段甲、待测水稻为耐盐水稻，如果酶切产物中具有片段乙和片段丙、待测水稻为感盐水稻。
所述片段甲为743-763bp的DNA片段。
所述片段乙为450-470bp的DNA片段。
所述片段丙为283-303bp的DNA片段。
所述片段甲具体可为753bp的DNA片段。
所述片段乙具体可为460bp的DNA片段。
所述片段丙具体可为293bp的DNA片段。
耐盐水稻具体可为VI_R≥0.3的水稻。感盐水稻具体可为VI_R<0.3的水稻。
VI_R的计算方法如下：将待测水稻的种子分为两组，一组进行盐溶液处理，一组进行水处理，在平行试验的情况下，计算VI，进一步计算VI_R；VI_R＝盐溶液处理组的VI/水处理组的VI。
VI为种子活力指数。
VI＝GL×SL，GL表示发芽指数；SL表示第10天的平均芽长。
GL＝∑(Ni/n)/i，Ni为第i天种子总发芽数，n为种子总数，i为实验进行到第i天。
所述盐处理具体可为采用60mM NaCl水溶液处理。
所述水处理具体可为采用蒸馏水处理。
所述盐处理和所述水处理的条件具体可为：放置在30℃，相对湿度为80％的恒温箱中处理10天(12h光照/12h黑暗)。
计算发芽指数时，具体可从第3天开始，每天记录种子发芽数目并统计芽长，当芽长为种子长度一半，同时根长大于种子本身长度时作为种子发芽的标准。
所述待测水稻具体可为栽培稻。
所述待测水稻具体可为如下水稻材料中的任意一种：ESCARLATE：：GERVEX 887-C1、SAMBA：：GERVEX 186-C1、78XUAN WU：：IRGC 70475-1、ARC 7336：：IRGC 20606-1、E4197：：IRGC 68004-1、GENG 77-4：：IRGC 59321-1、GORIA：：IRGC 58736-1、HONG YANGZAO3：：IRGC 67177-1、LUO AI ZAO 3：：IRGC 63730-1、M 142：：IRGC 35054-1、MIAOZHAN：：IRGC76691-1、PERUNEL 0-69-18：：IRGC 19581-1、PINIDWA QAN QIPUGOPINGKITAN：：IRGC23359-1、SAFARI、ARC 11822：：IRGC 21677-1、AUS 233：：IRGC29036-1、AUS 344：：IRGC29131-1、BIR BAHADUR：：IRGC 53889-1、KARIA：：IRGC 6702-1、LAL TAURA：：IRGC 35017-1、NARIKEL BADI：：IRGC 37550-1、RANRUWAN：：IRGC 36360-1、AE NOUA：：IRGC 89308-1、B3913B 16-20ST 28：：IRGC 63099-1、BALIBUD：：IRGC26871-1、BHU BHUSI：：IRGC 70803-1、DA HEI GU：：IRGC 72009-1、DAWK PUD KHAO：：IRGC 65808-1、DO KHAW：：IRGC 106977-1、HALSUDU HEENATI：：IRGC 15599-1、HONG MI JIU GONG JI：：IRGC 74031-1、JAERAERYUKDO：：IRGC 73053-1、RIKUTO KEMOCHI、GITANO：：IRGC82424-1、AI DA：：IRGC72567-1、BAK TULSI：：IRGC 34831-1、IH PEN SHIM MING：：IRGC 26067-1、B 6311 A 5553-16-2：：IRGC 14541-1、ARC 11751：：IRGC 21614-1、ARC 12101：：IRGC 21907-1、BARISUTAR：：IRGC 52410-1、BEGMI 135：：IRGC 27845-1。
所述待测水稻为以如下水稻材料中的任意一种或两种为亲本得到的后代：ESCARLATE：：GERVEX 887-C1、SAMBA：：GERVEX 186-C1、78XUAN WU：：IRGC 70475-1、ARC7336：：IRGC 20606-1、E 4197：：IRGC 68004-1、GENG 77-4：：IRGC 59321-1、GORIA：：IRGC58736-1、HONG YANG ZAO 3：：IRGC 67177-1、LUO AI ZAO 3：：IRGC 63730-1、M 142：：IRGC35054-1、MIAO ZHAN：：IRGC 76691-1、PERUNEL 0-69-18：：IRGC 19581-1、PINIDWA QANQIPUGO PINGKITAN：：IRGC 23359-1、SAFARI、ARC 11822：：IRGC 21677-1、AUS 233：：IRGC29036-1、AUS 344：：IRGC 29131-1、BIR BAHADUR：：IRGC 53889-1、KARIA：：IRGC 6702-1、LAL TAURA：：IRGC 35017-1、NARIKEL BADI：：IRGC 37550-1、RANRUWAN：：IRGC 36360-1、AENOUA：：IRGC 89308-1、B 3913B 16-20ST 28：：IRGC 63099-1、BALIBUD：：IRGC 26871-1、BHUBHUSI：：IRGC 70803-1、DA HEI GU：：IRGC 72009-1、DAWK PUD KHAO：：IRGC 65808-1、DOKHAW：：IRGC 106977-1、HALSUDU HEENATI：：IRGC 15599-1、HONG MI JIU GONG JI：：IRGC74031-1、JAERAERYUKDO：：IRGC 73053-1、RIKUTO KEMOCHI、GITANO：：IRGC 82424-1、AIDA：：IRGC 72567-1、BAK TULSI：：IRGC 34831-1、IH PEN SHIM MING：：IRGC 26067-1、B6311 A 5553-16-2：：IRGC 14541-1、ARC 11751：：IRGC 21614-1、ARC 12101：：IRGC 21907-1、BARI SUTAR：：IRGC 52410-1、BEGMI 135：：IRGC 27845-1。
所述引物F1和引物R1均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为10μM。
所述PCR扩增的反应体系具体可为：模板DNA 1.5μL(50-300ng)，引物F1 1μL，引物R1 1μL，2×TSINGKE Master Mix7.5μL和ddH204μL。
所述PCR扩增的反应程序具体可为：94℃预变性5min；94℃1min，65℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
本发明还保护所述特异引物对或所述试剂盒或所述方法在水稻育种中的应用。
所述育种的目的是选育耐盐性水稻。
本发明提供了一种特异引物对，还提供了利用特异引物对检测水稻耐盐性的方法。本发明建立的检测方法可用于预测水稻耐盐性，对于水稻育种有重要意义。
附图说明
图1为42份水稻材料基因组DNA的PCR扩增产物酶切电泳检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，各条引物均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为10μM。
以下实施例中的水稻材料均已经在参考文献：3K RGP.The 3,000 rice genomesproject[J].Gigascience，2014，3：7.中公开记载。
实施例1、引物设计
对水稻基因组进行大量序列分析，设计了用于检测水稻耐盐性的一对引物(5’→3’)：
F1(序列表的序列1)：ACGAAGTGGAGGCAGGTATGTC；
R1(序列表的序列2)：TGCCGAGTTTTGGGTCTATTTTC。
实施例2、水稻耐盐性检测方法建立
提取待测水稻的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用实施例1设计的引物对进行PCR扩增。经PCR扩增的产物用BstUI限制性内切酶37℃酶切3h。如果酶切产物中具有753bp的DNA片段、待测水稻为耐盐水稻，如果酶切产物中具有460bp的DNA片段和293bp的DNA片段、待测水稻为感盐水稻。
PCR扩增体系(15μL)：模板DNA 1.5μL，引物F1 1μL，引物R1 1μL，2×TSINGKEMaster Mix 7.5μL和ddH2O 4μL。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃ 1min，65℃ 1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
酶切反应体系(20μL)：PCR扩增产物10μL，酶切buffer 2μL，BstUI限制性内切酶0.5μL，ddH2O 8μL。
实施例3、水稻耐盐性检测
1、采用42份水稻材料作为实验材料，每份材料选出120粒饱满的种子，在温度为50℃的烘箱中烘3天。将每份种子分成4份(盐处理组和对照组，每组设置两个重复，每个重复30粒种子)。
2、将步骤1的种子用体积百分比为15％的次氯酸钠水溶液浸泡20min，用蒸馏水清洗3次。
3、在直径9cm的培养皿中放置双层滤纸，将30粒种子均匀分布于滤纸上，然后加入处理液(每天更换新配制的处理液，每次的加入量为10ml；盐处理组的处理液为60mM盐水，对照组的处理液为蒸馏水)，将培养皿放置在30℃，相对湿度为80％的恒温箱中处理10天(12h光照/12h黑暗)。从第3天起，每天记录种子发芽数目并统计芽长，当芽长为种子长度一半，同时根长大于种子本身长度时作为种子发芽的标准。根据统计的数据计算种子活力指数(VI)：VI＝GL×SL，其中GL表示发芽指数(GL＝∑(Ni/30)/i，Ni为第i天种子总发芽数，30为实验种子总数，i为实验进行到第i天)，SL表示第10天的平均芽长。VI_R＝盐处理组的VI/对照组的VI。VI_R≥0.3为耐盐品种，VI_R＜0.3为感盐品种。
结果见表1。42份水稻材料中，33份为耐盐材料，9份为感盐材料。
表1 水稻耐盐性统计
4、分别提取表1中编号1-42号水稻的基因组DNA，按照实施例2的方法进行检测，结果如图1所示，图1中，M为DNA maker，泳道1-42分别对应表1中编号1-42的水稻品种。泳道1-33均得到一个条带(条带甲)，泳道34-42均得到两个条带(条带乙、条带丙)。
回收各个条带并进行测序，条带甲为753bp，条带乙为460bp，条带丙为293bp。结果表明，33个耐盐材料的酶切产物中均含有753bp的DNA片段。9个感盐材料的酶切产物中均含有460bp的DNA片段和293bp的DNA片段。
实施例4、敏感性
待测水稻为：表1中编号1的ESCARLATE：：GERVEX 887-C1水稻和编号34的GITANO：：IRGC 82424-1水稻。
1、提取待测水稻的基因组DNA。
2、用ddH2O稀释步骤1得到的DNA溶液，得到各个稀释液。
3、将步骤2得到的稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物对进行PCR扩增。
PCR扩增体系(15μL)：模板DNA 1.5μL，引物F1 1μL，引物R1 1μL，2×TSINGKEMaster Mix7.5μL和ddH2O 4μL。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃ 1min，65℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
反应体系1中，水稻基因组DNA的初始含量为300ng；
反应体系2中，水稻基因组DNA的初始含量为200ng；
反应体系3中，水稻基因组DNA的初始含量为150ng；
反应体系4中，水稻基因组DNA的初始含量为100ng；
反应体系5中，水稻基因组DNA的初始含量为50ng。
4、将步骤2的扩增产物用BstUI限制性内切酶进行酶切，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳分析。
酶切反应体系(20μL)：PCR扩增产物10μL，酶切buffer 2μL，BstUI限制性内切酶0.5μL，ddH2O 8μL。
结果：采用反应体系1-5扩增编号1的ESCARLATE：：GERVEX 887-C1水稻基因组DNA，PCR产物经BstUI酶切后，均能形成753bp的特征条带；采用反应体系1-5扩增编号34的GITANO：：IRGC 82424-1水稻基因组DNA，PCR产物经BstUI酶切后，均能形成460bp和293bp的两条特征条带。结果表明，当待测水稻基因组DNA含量低至50ng时，采用实施例2建立的检测方法依然能够检测出水稻耐盐性。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
中国农业科学院深圳生物育种创新研究院
<120> 特异引物对及其在检测水稻耐盐性中的应用
<130> GNCYXMN161901
<160> 2
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
acgaagtgga ggcaggtatg tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
tgccgagttt tgggtctatt ttc 23

Claims (7)

1.特异引物对，由引物F1和引物R1组成；
所述引物F1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述特异引物对在鉴定水稻耐盐性中的应用。
3.含有权利要求1所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为鉴定水稻耐盐性。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的方法，包括如下步骤：提取待测水稻的基因组DNA，以待测水稻的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，将扩增产物用BstUI限制性内切酶进行酶切，如果酶切产物中具有片段甲、待测水稻为耐盐水稻，如果酶切产物中具有片段乙和片段丙、待测水稻为感盐水稻；
所述片段甲为743-763bp的DNA片段；
所述片段乙为450-470bp的DNA片段；
所述片段丙为283-303bp的DNA片段。
6.权利要求1所述特异引物对，或，权利要求3所述试剂盒，或，权利要求5所述的方法在水稻育种中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述育种的目的是选育耐盐性水稻。
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