CN102533802A - 烟草干旱响应基因NtRHF1及其编码蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了烟草干旱响应基因NtRHF1及其编码蛋白的应用；烟草干旱响应基因NtRHF1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；过量表达该基因能提高植物对干旱胁迫的适应性，NtRHF1在烟草抗旱领域具有广阔的应用前景。

Description

烟草干旱响应基因NtRHF1及其编码蛋白的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种烟草干旱响应基因NtRHF1及其编码蛋白的应用。

背景技术

近年来，随着全球气候变暖，干旱已成为我国作物生产中频繁发生的自然灾害。烟草作为中国重要的经济作物，在整个生育期对水分的要求很高。中国大部分烟区处于干旱、半干旱环境中，而且优质烟区多位于丘陵山区，常因土壤干旱而影响烟株的生长发育，导致烟叶的产量和品质降低，干旱已成为制约我国烟叶产量与品质提高的主要限制因子之一。因此，加强烟草抗旱基因资源的挖掘和利用，对于烟草抗旱新品种培育，实现烟草农业可持续发展具有重大意义。

自20世纪80年代以来，国内外学者在干旱对烟草生长、发育、代谢的影响等方面做了大量研究，取得了一些重要进展。归纳起来主要有以下几个方面：第一，干旱对烟草生理的影响，主要表现在：(1)干旱胁迫影响了叶绿素的合成，促进了叶绿素的分解，从而影响了叶片的光合效率(Plant Molecular Biology，1979，20：37-44)；(2)干旱胁迫导致植株氮素代谢关键酶-硝酸还原酶(NR)的活性降低，而蛋白水解酶活性增强引起脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和缬氨酸等大量积累；(3)干旱胁迫导致叶片膜脂过氧化作用增强，膜透性增加，丙二醛(MDA)含量升高，出现电解质外渗。抗氧化保护酶SOD、POD、CAT等酶活性显著下降。第二，干旱对烟草生长发育的影响，主要表现在：(1)干旱胁迫降低了种子的萌发和幼苗的成活；(2)抑制了根系的生长，从而影响了矿质营养的吸收；(3)干旱胁迫导致植株矮小，节间短，叶片小，易早衰。这些研究较好地阐明了干旱对烟草生长、发育及代谢影响的生理生化基础，但缺乏对烟草抗旱分子遗传机理的研究。

近年来，随着分子生物学和基因组学研究的深入，抗旱基因的发掘成为目前作物抗逆遗传资源与品种改良研究的热点，越来越多的抗旱相关基因相继被克隆和鉴定。按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类：第一类基因为功能基因，主要在植物抗性中起保护作用。这一类基因主要包括渗透调节基因如：海藻糖合成酶基因TPS1、脯氨酸合成酶基因P5CS、甘露醇合成基因mt1D、甜菜碱合成酶级以内BADH、及多按合成基因Odc等；保护生物大分子的活性基因如：脱水蛋白基因BDN1、水通道蛋白基因AQP和晚期胚胎发生丰富蛋白LEA等。第二类基因为调节基因，主要在信号传导和逆境基因表达过程中起调节作用，主要包括一些转录因子基因如：DREB、MYB、bZIP、WRKY、NAC等。这些基因已在植物基因工程中得到应用。

泛素化是生物体内蛋白质翻译后的重要修饰之一，是蛋白质降解的信号。泛素连接酶E3是泛素化过程中的关键酶类，决定了泛素化修饰的特异性，在植物激素调控、花发育和病原菌防卫反应中起着重要的作用(Plant J，2010，61：1029-1040；J Exp Bot，2007，58：221-227)。目前烟草中E3连接酶编码基因的克隆与功能鉴定的报道较少。

发明内容

本发明提供一种受干旱胁迫诱导表达的烟草基因RHF1(RING-H2 Finger 1)及其编码蛋白的应用；

烟草干旱响应基因NtRHF1，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；该基因编码一种具有锌指结构的泛素E3连接酶，过量表达能提高植物对干旱胁迫的抗性，尤其是能够提高植物的抗旱能力。

本发明的有益效果为：

本发明中，干旱处理的烟草幼苗叶片中，所述的泛素E3连接酶编码基因RHF1被诱导表达。本发明所述的蛋白NtRHF1是植物泛素化蛋白降解途径中的关键酶类，所以调控NtRHF1的表达能够调节植物对干旱的抗性。因此所述的干旱响应的基因NtRHF1在植物抗旱领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。。

附图说明

图1：NtRHF1的PCR产物电泳图；

图2：烟草幼苗叶片中NtRHF1基因响应干旱胁迫的表达模式柱状图；

图3：NtRHF1基因植物表达载体构建示意图；

图4：转NtRHF1基因的烟草株系表达水平柱状图；

图5：NtRHF1基因过量表达的烟草植株对干旱胁迫处理的生长表型照片；

图6：NtRHF1基因过量表达烟草植株对干旱胁迫处理的生理指标变化的柱状图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：材料干旱胁迫处理

云烟87种子经15％次氯酸钠消毒后，放于含蒸馏水的培养皿中，在温度为24-26℃、湿度为60％、光暗交替周期为12h/12h的光照培养室中培养。待幼苗长至二叶一心(约14天)时，倒掉蒸馏水，进行20％PEG 6000溶液胁迫处理实验。处理的时间分别为1、3、6、12、24小时；胁迫处理后的烟草作为实验者，未做胁迫处理的烟草幼苗作为对照组，用于RHF1的表达分析。转基因烟草植株的干旱处理，采用人工控制浇水法。待植株长至5片叶(约30天)时，停止浇水14天，观察各株系生长情况。

实施例2：RHF1(RING-H2 Finger 1)基因的克隆

1.烟草叶片第一链cDNA合成

烟草叶片总RNA的分离和纯化参照TRIZOL试剂盒(Invitrogen，USA)说明书进行。将所述的烟草叶片总RNA吸取1-2μg于1.5ml离心管中，按照Fermentas公司的RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit产品说明进行反转录，得到烟草叶片第一链cDNA。

2.NtRHF1基因的PCR扩增

以所述的第一链cDNA为模板，进行NtRHF1基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。

根据网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中烟草表达序列标签(ExpressedSequence Tag，EST)信息设计烟草的NtRHF1基因的全长cDNA引物：

上游引物：5′-ATGAGTTTTGTTTTCCGAG-3′；

下游引物：5′-CTACACCATATCATA AGCATC-3′。

将所述的PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶照相系统检测扩增产物(如图1所示)，获得822bp长的片段。

3.电泳结束后，用生工生物工程上海公司的胶回收试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR扩增产物，并送至北京华大基因公司测序，验证其正确性。

实施例3：NtRHF1基因的表达分析

1.本实例中利用荧光定量RT-PCR方法来分析NtRHF1基因在20％PEG 6000胁迫下的表达情况。实验样品为实施例1中所述的实验者和对照组中的烟草叶片。每个样品中，按照实施例2中所述的方法，取5μg的总RNA反转录成第一链cDNA作为模板。

根据NtRHF1基因全长cDNA序列设计荧光定量PCR特异引物为：

上游引物：5’-TTGGTGCTCGGTGTCTTCTTTAT-3’；

下游引物：5’-GTGCCCTCAGTGTTTCGTAATCT-3’。

应用BioRad iQ5实时定量PCR仪进行PCR扩增，扩增产物为244bp。

2.每个样品分别以上游引物：5’-TGGCATCACACTTTCTAAAC-3’和下游引物：5’-CAACGGAATCTCTCAGCCCT-3’来扩增烟草Actin基因片段作为内参基因。

3.反应结束后分析荧光值变化曲线和融解曲线。将C_T值导入Microsoft Excel 2003中，按照公式2^-ΔΔc _T计算目的基因的相对表达量，并绘制基因表达差异柱状图。计算公式为：ΔC_T目标基因＝C_{T目标基因}-C_TUbiquitin

ΔΔC_T目标基因＝处理组ΔC_{T目标基因}-对照组C_TUbiquitin

4.NtRHF1在干旱胁迫下的表达分析

将生长14天的烟草幼苗移至20％PEG 6000溶液中进行1、3、6、12、24小时的胁迫处理。NtRHF1在干旱胁迫下的表达模式如图2所示，在胁迫处理的24小时内，NtRHF1基因在干旱处理后的3小时表现出明显的升高，一直持续到24小时，仍保持较高的表达量。这表明NtRHF1受干旱胁迫表现出较强的诱导表达。

实施例4：NtRHF1基因转化烟草及转基因植株检测

1.植物表达载体的构建

以实施例2中构建的NtRHF1全长cDNA片段为模板，用含有EcoRI和BamHI接头序列的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经EcoRI和BamHI双酶切、回收后，正向插入植物双元表达载体pART27的CaMV 35S启动子之后的EcoRI和BamHI位点之间，得到重组载体pART27-NtRHF1(图3)。

引物序列如下：

上游引物：5’-AGTGAATTCATGAGTTTTGTTT TCCGAG-3’；

下游引物：5’-ACAGGATCCCTACACCATATCATAAGCATC-3’。

2.农杆菌介导的基因转化烟草及转基因植株的鉴定

经PCR、质粒酶切鉴定正确的重组质粒利用冻融法转化农杆菌LBA4404，经菌落PCR检测正确后，利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草品种云烟87。具体方法如下：

(1)农杆菌的活化：从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到5mL LB液体培养基中(Rif 100μg/mL、Spec100μg/mL)28℃，180rpm摇床震荡培养20-24h至OD600达到0.6-0.8。

(2)转接：活化后的菌液按1∶50的比例，转入含有相应抗生素的LB液体培养基中28℃，180rpm摇床震荡培养4-6h左右，OD600达到0.3-0.5时可用于转化。

(3)侵染：于超净工作台中，取无菌珊西烟苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm²的小块，放入菌液中浸泡5-15min。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

(4)共培养：将侵染后的烟草叶片铺放于含有共培养基(MS基本固体培养基+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA)培养皿上，用封口膜封好培养皿，28℃黑培养1-2天。

(5)选择分化培养：将共培养后的烟草叶片转接到含有选择分化固体培养基(共培养基+600mg/LCef+100mg/LKm)的平皿上，用封口膜封好培养皿，在温度为25℃，光照强度为2000-10000lux，16h/8h光暗条件下选培养。

(6)生根培养：选择分化培养约2-3周后，待烟草不定芽长到1-2cm左右时，切下不定芽并移到含有生根培养基(MS基本固体培养基+0.3mg/L NAA+100mg/L Km+600mg/L Cef)的三角瓶里进行生根培养。

(7)移栽：待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。

3.利用生工生物工程上海公司的植物基因组提取试剂盒，按照产品说明提取转基因烟草幼苗的基因组DNA，利用本实例中所述的引物进行PCR扩增，进一步检测和筛选阳性植株，从15株再生植株中检测到10株阳性植株。

4.按照实例2中所述方法提取野生型植株和10株转NtRHF1基因T₀代植株的总RNA，按照实例3中所述的方法进行荧光定量RT-PCR分析，进一步分析不同株系的表达情况。

荧光定量PCR所用的烟草内参基因Actin如实施例3中所述。

结果表明，在10株转NtRHF1基因的T₀代植株中，有5株表达量较高，而在野生型对照中未检测到该基因的表达(图4)。将分子鉴定阳性的植株单株收种子，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T1代的分离情况，如此重复直至T₃代获得遗传稳定的转基因株系，共获得5个稳定遗传的转基因株系。选择稳定遗传的转基因株系中的表达量高的2个株系(OE-4和OE-5)进行下一步的干旱胁迫处理实验。

实施例5：转NtRHF1过量表达烟草植株对干旱胁迫的抗性表型鉴定

1.实验方法：将野生型(WT)和2个转基因系(OE-4-和OE-5)烟草种子先经4℃冰箱春化，然后于超净工作台里用15％的次氯酸钠溶液消毒并用灭蒸水洗净，均匀播于含营养土的小盆中，置于光照培养室中培养。待幼苗长至5片叶时(30天)，停止浇水2周，观察植株生长情况，并记录相关数据。实验共设三次重复，每次重复所测试的各株系植株均为10株。

2.实验结果：烟草植株经干旱处理14天后，与对照相比，NtRHF1转基因烟草生长基本正常，叶片表现部分萎焉，而野生型植株生长受到明显抑制，大部分叶片萎焉，受伤程度较重，植株明显比转基因的要小(图5)。表明NtRHF1过表达的转基因烟草对干旱胁迫表现出较好的抗性。

实施例6：转NtRHF1基因烟草植株对干旱胁迫处理后的生理指标变化

1.实验方法：将干旱处理14天后的转NtRHF1烟草株系(OE-4-和OE-5)和野生型(WT)幼苗，每个株系挑5株，分别称量鲜重，并计算平均值。对每个株系的5株剪取叶片，分别称重后，以未处理的株系叶片的含水量为对照，计算叶片相对含水量。

2.实验结果：图6A中显示经干旱处理14天后的转NtRHF1烟草株系(OE-4、OE-5)和野生型(WT)烟草植株的平均鲜重。从图中可以看出，处理14天后，转NtRHF1烟草株系(OE-4、OE-5)比野生型(WT)在生物量上分别提高96％，和125％，表明转NtRHF1基因植株对干旱胁迫有较高的抗性，生长影响较小。

图6B中显示经干旱处理14天后的转NtRHF1烟草株系(OE-4、OE-5)和野生型(WT)烟草植株叶片的相对含水量的变化。从图中可以看出转NtRHF1基因的烟草植株叶片含水量降低幅度较小，而野生型植株叶绿素含量降低的幅度较大。经处理后的野生型植株叶片含水量仅为46％，而2个转基因系叶片含水量在80％以上。这一结果也与实施例5中观察到的植株生长表型一致。

以上实验充分证明：烟草中过量表达所述的NtRHF1基因能够显著提高植物的抗旱能力。

Claims (2)

1.烟草干旱响应基因NtRHF1，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草干旱响应基因NtRHF1的编码蛋白的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，该蛋白过量表达能提高植物对干旱胁迫的抗性。

Images