CN108728447A

CN108728447A - 一种花生抗逆相关基因及其应用

Info

Publication number: CN108728447A
Application number: CN201810563896.2A
Authority: CN
Inventors: 隋炯明; 禹山林; 王晶珊; 乔利仙; 杨庆利; 衣艳君; 张芳; 汤松
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2038-06-04
Also published as: CN108728447B

Abstract

本发明公开了一种花生抗逆相关基因及其应用，属于生物技术领域。本发明的花生抗逆相关基因序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。构建本发明基因的植物表达载体和原核表达载体，分别转化拟南芥和大肠杆菌后发现，该基因的表达能够显著提高拟南芥和大肠杆菌的耐盐性。

Description

一种花生抗逆相关基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花生抗逆相关基因及其应用。

背景技术

生物在自然环境中经常要面对各种不利条件(如干旱、盐胁迫、低温等)胁迫；这些不利条件能够抑制生物的生长，甚至导致生物体死亡。随着环境的不断恶化，盐碱等逆境胁迫已经成为世界性的问题，培育具有多种抗逆性的生物新品种已成为广大育种家研究的主要目标之一。

目前，通常采用常规杂交方法选育生物新品种。当前发展迅速的基因工程技术为生物遗传改良提供了新的途径，利用在盐胁迫应答中起重要作用的基因进行遗传转化是获得耐盐新种质的重要手段。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种花生抗逆相关基因及其应用。

为了到达上述目的，本发明的技术方案为：

一种花生抗逆相关基因，其序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。

在上述方案的基础上，克隆该基因的引物序列为：

P1：5′-CTCAATCACAAGTCACAACAAAC-3′；

P2：5′-GAACATAAACCAAACAAGCACCC-3′。

扩增所述抗逆相关基因任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

在上述方案的基础上，所述花生抗逆相关基因序列具有6个内含子，分别对应的碱基为125-443，481-617，744-856，944-1082，1164-1281，1428-2332。

含有上述花生抗逆相关基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述花生抗逆相关基因编码的蛋白。

在上述方案的基础上，所述花生抗逆相关基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2或SEQ ID No.2经一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白。

上述花生抗逆相关基因或其编码的蛋白在提高生物抗逆性中的应用。

在上述方案的基础上，所述的生物为植物和微生物；

优选的，所述植物为拟南芥，所述微生物为大肠杆菌。

在上述方案的基础上，所述的抗逆性为耐盐性。

一种提高植物耐盐性的方法，将上述花生抗逆相关基因构建到植物表达载体，导入植物细胞中，使其在植物中表达，获得高耐盐性植株。

一种提高微生物耐盐性的方法，将上述花生抗逆相关基因构建到表达载体，导入微生物细胞中，使其在微生物细胞中表达，获得高耐盐性菌株。

本发明的有益效果

1、本发明从花生中克隆了一条抗逆性相关基因，将其命名为AhRabG；该基因有6个内含子，分别对应的碱基为125-443，481-617，744-856，944-1082，1164-1281，1428-2332。

2、构建AhRabG的植物表达载体，并转化拟南芥；结果表明：转入AhRabG基因的拟南芥植株形态发育正常，转基因拟南芥苗至少可以耐受100mM NaCl的胁迫；AhRabG基因在拟南芥中表达可显著提高其耐盐性。

3、构建AhRabG的原核表达载体，并转化大肠杆菌，重组大肠杆菌可以抗10％NaCl的胁迫。

附图说明

图1AhRabG在花生盐胁迫处理后的表达情况；

图2转基因拟南芥耐盐性分析(左边为对照组，右边为转基因组)；

图3转基因大肠杆菌耐盐性分析(A为转入空载pET22b，B为转入pET22b-AhRabG)。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

花生品种“鲁花11号”由青岛农业大学遗传研究室实验室提供；

大肠杆菌DH5α由青岛农业大学遗传研究室实验室保存；

1、花生抗逆性相关基因的克隆

以花生(品种“鲁花11号”由青岛农业大学遗传研究室实验室提供)的基因组DNA为模板，以引物对：

P1：5′-CTCAATCACAAGTCACAACAAAC-3′SEQ ID No.3；

P2：5′-GAACATAAACCAAACAAGCACCC-3′SEQ ID No.4；

扩增花生抗逆性相关基因，其基因序列如SEQ ID No.1所示；其基因序列中含有6个内含子，分别对应的碱基为125-443，481-617，744-856，944-1082，1164-1281，1428-2332，将其命名为AhRabG。

2、AhRabG在花生盐胁迫处理后的表达情况

取生长1个月的花生幼苗，经200mM NaCl胁迫处理后，在0、6、12、24、48h时取叶片，提取RNA，反转录后在ABI 7500 FAST型荧光定量PCR仪上进行反应。荧光定量PCR 25μL反应体系包括：12.5μL 2×SybrGreen qPCR Master Mix，10μmol/L正反向引物各0.5μL，25ng反转录产物。扩增程序为：先95℃预变性2min；接着进入40个循环反应，每个循环中95℃变性10s，60℃延伸40s；循环结束后，缓慢升至95℃，制备熔解曲线。每个反应设3个复孔。

试验结果如图1所示：分析结果发现，AhRabG基因在花生盐胁迫处理前后，表达量出现明显变化，表明AhRabG基因表达受盐胁迫影响。

实施例2

根癌农杆菌菌株EHA105购自北京天恩泽基因科技有限公司；

1、AhRabG基因植物表达载体的构建

以花生(品种“鲁花11号”由青岛农业大学遗传研究室实验室提供)的基因组DNA为模板，在扩增时分别在上下游引物中加入KpnI和SacI酶切位点。

其中上下游引物序列为：

P3：5′-GGTACCCTCAATCACAAGTCACAACAAAC-3′(KpnI)(SEQ ID No.5)；

P4：5′-GAGCTCGAACATAAACCAAACAAGCACCC-3′(SacI)(SEQ ID No.6)；

回收PCR产物，并在T₄DNA连接酶作用下与克隆载体pUC18(购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用KpnI和SacI进行双酶切，回收含AhRabG基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体pBI121-AhRabG。

2、表达载体转化拟南芥

(1)农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将pBI121-AhRabG重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD600＝0.5～0.8时，取2mL菌液转移到50mLYEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)培养基中，培养到OD₆₀₀＝0.6～0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体MS B₅悬浮备用。

(2)拟南芥的种植：选取合适的的拟南芥种子，在1％NaClO中浸泡5min，无菌水冲洗4-6次。点种到基质土上。

(3)农杆菌介导的遗传转化：选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的湿度。24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下使其正常生长。大约3w后收取成熟种子。

将转基因拟南芥种子接种到20mLMS(含抗生素)培养基中，22℃培养1w左右，选取鲜绿健壮的拟南芥幼苗，移植于基质土。

3、转基因植株的PCR检测

转基因拟南芥种子在含有抗生素的平板上经过筛选后，提取再生植株的基因组DNA，利用上述载体序列和AhRabG基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，56℃、30s，72℃、1min，32个循环；72℃、10min。。

4、转基因拟南芥耐盐性分析

将自交纯合后的转基因和未转基因(对照)拟南芥种子点播在含有100mM NaCl的MS培养基上，2w后比较二者的生长情况。结果发现转基因幼苗生长正常，而未转基因幼苗生长受到抑制(如图2所示)，所以转基因拟南芥幼苗的抗盐浓度为100mM或以上。

实施例3

大肠杆菌BL21、大肠杆菌菌株pET-22b由青岛农业大学遗传研究室实验室保存。

1、AhRabG基因原核表达载体的构建

花生品种“鲁花11号”由青岛农业大学遗传研究室实验室提供，提取花生总RNA，通过RT-PCR扩增了AhRabG基因的编码区(其序列表如SEQ ID No:7所示)，该编码区所编码的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示；所用引物为：

P5(5′-CATATGCCTTCCCGAAGAAGAAC-3′)(NdeⅠ)(SEQ ID No:8)；

P6(5′-AAGCTTACACTCGCATCCTGGTTGAT-3′)(HindⅢ)(SEQ ID No:9)；

回收PCR产物，并在T₄DNA连接酶作用下与克隆载体pUC18进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收含AhRabG基因的酶切片段，并克隆到原核表达载体pET-22b的对应位点中，获得该基因的原核表达载体pET-22b-AhRabG。

2、AhRabG基因在大肠杆菌中的诱导表达

将pET-22b-AhRabG转化大肠杆菌BL21，筛选阳性单克隆。挑取携带pET-22b-AhRabG的单菌落接种于含100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃摇床250rpm培养16h，按1：30的比例转接过夜菌液(约340μL)转到10mL含100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃摇床250rpm活化2-3h。当菌液OD600达到0.6-0.8时，加入100mM IPTG使终浓度达1mM，于37℃摇床250rpm诱导培养8h。含pET-22b的大肠杆菌BL21在IPTG诱导8h后的产物作为对照。。

3、pET-22b-AhRabG重组菌的耐盐性测定

按1：100取经IPTG诱导的重组菌和对照菌株，将其分别置于10mL含0、3.5％、5.5％、7.5％、10.0％和15.0％NaCl的液体LB中(含100μg/mL卡那霉素)，分别取培养0h、1h、2h、3h、4h、5h的培养物于600nm测其吸光度，重复3次，根据实验结果绘制其生长曲线，实验结果进行统计分析。pET-22b-AhRabG重组菌在10％NaCl溶液中还能生长，而对照菌的生长受到严重抑制(如图3所示)。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种花生抗逆相关基因及其应用

<130> 2018

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2556

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea Linn.(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 1

ctcaatcaca agtcacaaca aacgcaattt ctcgccgcca aacacctttg tttccgatct 60

attctgttaa catgccttcc cgaagaagaa ctctcttgaa ggtcatcatt ctcggcgaca 120

gcgggttcgt ctcttctttc cgcctctcaa ttctagggca cgcactttgc tttaatcgtt 180

tccctgattc ctatcatttt ttttatctta aattattcct ctgcttctgc tgaacttttc 240

tttcttattt gtgtccaaag agcttactta tcatttggaa ttaagatcta cattttcaga 300

ttttctacct gctagtattt ataactattg ctctatgtga ctgtttatgt tgcatttgtt 360

tgagttctta gaagcagtca aacaccggtc ttcggtgatt caaaatcagt gtatttgacg 420

cagtactgtt gctaactttg cagggtgggt aagacatctt tgatgaacca gtatcctgtg 480

gtactctttt ttttttttcc tcatacctta aatgttttca catttcaaca ctgtatatta 540

attacagtat tacattattt acacagacac ccaaaaaaaa aatatttaca ctgtagtaag 600

ctgcgggttt ggagtaggta tttcctttac atatgtattt tagatatgtt aataagaagt 660

tcagtaatca gtacaaggct accattggag cagacttttt aaccaaagaa gtgcaatttg 720

aagacaggct tttcacctta caggttcgtg cattggatac tgctcgatca tgcttagctt 780

cttttagttt ctgtaacacg atttgttgca acaatggaaa ctttattctg tctaaaatat 840

attcttaacc ttgcagattt gggatacagc tggccaggaa agattccaaa gtctgggagt 900

tgctttctat cgtggtgctg actgctgtgt tcttgtgtat gatgttaatt caatgaaatc 960

ttttgaaaac cttaacaact ggagagatga atttctgatt caggcatgcc tgtgttcatt 1020

tttgtgtata atttttgcgg tttaacaatt atgtgttagt aaatctgcgg ttgtgttggc 1080

aggcaagtcc ttcagatccg gagaattttc cttttgttgt tataggaaac aagattgata 1140

ttgatggtgg gaacagtaga gtggtatgct ttgctactat tattatatat attatttaac 1200

ttttttttct ctcttgttcg ttctttccaa aactcattga tatcagacac catatgaaca 1260

caaataaatt cttgtttgca ggtttcagaa aagaaggctc gagcttggtg tgcatctaaa 1320

ggaaatattc catattttga gacatccgcc aaggaaggcg ttaatgttga agaagcattc 1380

caatgcatag caaaggatgc cctgaaaagc ggtgaagagg aagaactgta agttcctaaa 1440

catgtgcttc tcttctatca tgtatgtaag caagttcaca cagagtttgt tgctatttga 1500

ttgtggacga tattggtgat tgctggagtc ctaaaagttc caaactatat gtatagtaat 1560

atcttggaat aaaaggattc tgtgtgtgat taaattttgg tttgggtcaa aacttagcat 1620

taatggtagg caacgggaac acccttatca atcaaaagtc gttaatcata caataaggat 1680

catgcttctg tttattattt ttggcagggg cagagctaga tgaaatatta gagggaggcc 1740

aaaaatattt acacaataaa ataagactaa aataaaattt taaggggggc taaactgaaa 1800

tttatgtata atttacatat aaaaattaaa attagggggg ccgttgcccc cctttctctc 1860

cattagctcc gcccctgatt ttttggaatt attaatttag gttttcaatg ggaagaaggc 1920

tagttacata tacataatcc attactgtac ttaagtatct ctaaataggt aaatatgaag 1980

agtaataatt gggataagat ttggataata tattcaatgg ggtaactact cattaatggc 2040

atgttctacc tcctttgtcc ttattttgtt actgctggtg ctggaattag ttggtgttac 2100

acaactgatg cctgatttta gaatgagtgt tgaaatcatc tgcctctata tcccggaata 2160

ttgctgtatg gctaaagttt ctttcaagta aaacatcttc aaagcgttat ttgatcttta 2220

ctccagccgt gatagaactt ttaatatttg taaattctat tctttgaata tgacactgat 2280

aataacgttt tggggttttg ttctccttgt ggataatctg tgcttattaa agatacctgc 2340

cagacacgat tgatgttgga aacagcagtc aacagcgatc aacaggatgc gagtgttaaa 2400

tatgtcactt tcccgtttac atacaaataa actcacttaa aaatggcttc ttcctgttta 2460

ggctttgctg tctttgaaac tttgctgtag attagtgttt gctcaagaaa caaattgccc 2520

caaaccattt gtagggtgct tgtttggttt atgttc 2556

<210> 2

<211> 198

<212> PRT

<213> Arachis hypogaea Linn.(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 2

Met Pro Ser Arg Arg Arg Thr Leu Leu Lys Val Ile Ile Leu Gly Asp

1 5 10 15

Ser Gly Val Gly Lys Thr Ser Leu Met Asn Gln Tyr Pro Val Val Phe

20 25 30

Pro Leu His Met Tyr Phe Arg Tyr Val Asn Lys Lys Phe Ser Asn Gln

35 40 45

Tyr Lys Ala Thr Ile Gly Ala Asp Phe Leu Thr Lys Glu Val Gln Phe

50 55 60

Glu Asp Arg Leu Phe Thr Leu Gln Ile Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu

65 70 75 80

Arg Phe Gln Ser Leu Gly Val Ala Phe Tyr Arg Gly Ala Asp Cys Cys

85 90 95

Val Leu Val Tyr Asp Ala Ser Pro Ser Asp Pro Glu Asn Phe Pro Phe

100 105 110

Val Val Ile Gly Asn Lys Ile Asp Ile Asp Gly Gly Asn Ser Arg Val

115 120 125

Val Ser Glu Lys Lys Ala Arg Ala Trp Cys Ala Ser Lys Gly Asn Ile

130 135 140

Pro Tyr Phe Glu Thr Ser Ala Lys Glu Gly Val Asn Val Glu Glu Ala

145 150 155 160

Phe Gln Cys Ile Ala Lys Asp Ala Leu Lys Ser Gly Glu Glu Glu Glu

165 170 175

Leu Tyr Leu Pro Asp Thr Ile Asp Val Gly Asn Ser Ser Gln Gln Arg

180 185 190

Ser Thr Gly Cys Glu Cys

195

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 3

ctcaatcaca agtcacaaca aac 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 4

gaacataaac caaacaagca ccc 23

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 5

ggtaccctca atcacaagtc acaacaaac 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 6

gagctcgaac ataaaccaaa caagcaccc 29

<210> 7

<211> 597

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea Linn.(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 7

atgccttccc gaagaagaac tctcttgaag gtcatcattc tcggcgacag cggggtgggt 60

aagacatctt tgatgaacca gtatcctgtg gtatttcctt tacatatgta ttttagatat 120

gttaataaga agttcagtaa tcagtacaag gctaccattg gagcagactt tttaaccaaa 180

gaagtgcaat ttgaagacag gcttttcacc ttacagattt gggatacagc tggccaggaa 240

agattccaaa gtctgggagt tgctttctat cgtggtgctg actgctgtgt tcttgtgtat 300

gatgcaagtc cttcagatcc ggagaatttt ccttttgttg ttataggaaa caagattgat 360

attgatggtg ggaacagtag agtggtttca gaaaagaagg ctcgagcttg gtgtgcatct 420

aaaggaaata ttccatattt tgagacatcc gccaaggaag gcgttaatgt tgaagaagca 480

ttccaatgca tagcaaagga tgccctgaaa agcggtgaag aggaagaact atacctgcca 540

gacacgattg atgttggaaa cagcagtcaa cagcgatcaa caggatgcga gtgttaa 597

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 8

catatgcctt cccgaagaag aac 23

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 9

aagcttacac tcgcatcctg gttgat 26

Claims

1.一种花生抗逆相关基因，其特征在于：其序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。

2.根据权利要求1所述花生抗逆相关基因，其特征在于：克隆该基因的引物序列为：

P1：5′-CTCAATCACAAGTCACAACAAAC-3′；

P2：5′-GAACATAAACCAAACAAGCACCC-3′。

3.根据权利要求1或2所述花生抗逆相关基因，其特征在于：其序列具有6个内含子，分别对应的碱基为125-443，481-617，744-856，944-1082，1164-1281，1428-2332。

4.含有权利要求1～3任一项所述花生抗逆相关基因的重组载体。

5.权利要求1～3任一项所述花生抗逆相关基因编码的蛋白。

6.权利要求1～3任一项所述花生抗逆相关基因或其编码的蛋白在提高生物抗逆性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的生物为植物和微生物；优选的，所述植物为拟南芥，所述微生物为大肠杆菌。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述的抗逆性为耐盐性。

9.一种提高植物耐盐性的方法，其特征在于：将权利要求1～3任一项所述花生抗逆相关基因构建到植物表达载体，导入植物细胞中，使其在植物中表达，获得高耐盐性植株。

10.一种提高微生物耐盐性的方法，其特征在于：将权利要求1～3任一项所述花生抗逆相关基因构建到表达载体，导入微生物细胞中，使其在微生物细胞中表达，获得高耐盐性菌株。