CN105483116B - 花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法 - Google Patents
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Abstract
一种花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)材料的准备与处理、(2)RNA的提取和cDNA的合成(3)基因克隆，通过荧光定量PCR验证了AhbHLH1L基因在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，说明AhbHLH1L基因能显著提高植物的抗逆性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法。
背景技术
花生富含油脂和蛋白，是我国重要的油料作物和经济作物。花生的产量和品质受干旱、盐碱等胁迫影响非常严重，全国每年因干旱引起的花生减产率达20％以上。但由于花生品种资源遗传基础狭窄，缺少高度抗旱、耐寒、耐盐的基因源，利用常规育种方法难以培育出高抗品种。随着分子生物学的快速发展，近年来利用转基因技术提高植物胁迫耐受能力的研究取得了显著成果，对胁迫相关基因和信号转导途径也有了更深入的了解。
bHLH类转录因子是一类较大的转录因子家族。近年来，一些bHLH类转录因子在植物逆境胁迫调控中可能发挥着重要功能。拟南芥的ICE1和ICE2均编码bHLH类转录因子，二者均作用于CBF/DREB转录因子的上游，在低温胁迫下可以促进该类基因的表达，从而在拟南芥对低温的适应性中起到了关键作用。拟南芥中bHLH192基因的表达对干旱、高盐及低温胁迫都有响应，在拟南芥中超表达该基因能够提高转基因植株对盐胁迫的抗性。近年也发现水稻中多个bHLH类转录因子在转基因拟南芥或水稻中对转基因植株对低温、盐或干旱胁迫的抵抗能力方面具有积极的调控作用。目前花生中还没有bHLH类转录因子克隆及功能研究的报导，本研究通过芯片杂交发现该基因在花生盐处理芯片中表达上调明显，随后对该基因进行了基因克隆及功能研究。
发明内容
为了提高花生生长的抗逆能力，增强其对高盐、干旱和低温胁迫的抗性，发明了一种花生逆境胁迫相关基因AhbHLH1L的克隆及功能表达方法。
一种花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法，主要包括以下步骤：
(1)材料的准备与处理
材料为花生花育33(Arachis hypogaea L.cultivar Huayu33)。花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗(28℃/22℃)。生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理；
低温处理，将三叶期花生幼苗置于4℃光照培养箱中进行处理，分别于处理的0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生叶片和根作为材料；对于耐盐用NaCl处理；对于抗旱，用PEG6000处理。将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mM NaCl或重量浓度20％PEG6000溶液中，在处理时间为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为材料。所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。
(2)RNA的提取和cDNA的合成
本实验用天根的RNeasy Mini Kit(Qiagen)分离提取花生幼苗RNA。RQ1RNase-free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用Takara的M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2μg RNA。在42℃条件下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用。
(3)基因克隆
通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA TaqTM DNA polymerase(TaKaRa)，在25-μL体系中加入以下成分：2.5μL 10×PCR buffer(含MgCl2)；2.5μL 10mMdNTPs；1μL cDNA模板；0.5μL LA polymerase和17.5μL ddH2O。PCR反应条件为：(a)94℃，5min；(b)94℃，45s；54℃，60s；72℃，90s；共35cycles；(c)72℃，10min。扩增基因全长所用引物为AhbHLH1L-S:5’-ACTGAATGCTCCTGTGCCC-3’和AhbHLH1L-A:5’-GCTCCTGCCCTTTGCTATCT-3’。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Omega)进行纯化，纯化产物连接pMD18-T Easy vector(Takara)并测序(Sangon,Shanghai)。
本发明的AhbHLH1L基因开放阅读框为1260bp，共编码420个氨基酸。
本发明的AhbHLH1L基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列上有DNA结合位点，蛋白二聚体互作区及HLH保守结构域，同时该基因编码的氨基酸序列与大豆bHLH130-like同源性近60％。
本发明的AhbHLH1L基因的核苷酸序列是序列表中序列1。
本发明的AhbHLH1L基因的氨基酸序列是序列表中序列2。
(4)表达分析
用荧光定量Real-time RT-PCR对AhbHLH1L基因进行表达分析。荧光定量PCR所用cDNA模板稀释到8ngμL-1，用的聚合酶是SYBR Premix Ex Taq polymerase(Takara)，用的仪器是LightCycler 2.0instrument system(Roche,Germany)，每反应体系加2μL稀释的cDNA。PCR反应程序如下：(1)95℃，10s；(2)95℃，5s，40cycles；(3)60℃，30s；(4)72℃，10s。PCR反应结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加0.5℃。actin11为实验的内参基因。
AhbHLH1L荧光定量验证用的引物序列为：QAhbHLH1L-S：5’-GAGTGTTATGTATAGTCCTGTTC-3’和QAhbHLH1L-A：5’-TGTTGTTGTTGATGATGATGA-3’。
内参基因actin11所用引物序列为：QACT11-S：5’-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3’和QACT11-A：5’-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。
本发明的显著效果
通过荧光定量PCR验证了AhbHLH1L在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高(图1)。从图1可以看出，AhbHLH1L在低温、盐和干旱处理的根中表达量均有明显提高，并且此后一直维持在高于对照的水平(图1A,C,E)，在盐处理的叶片中表达量也明显增高(图1D)。以上结果表明AhbHLH1L可能在花生对逆境胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。说明AhbHLH1L基因能显著提高植物的抗逆性。
附图说明
图1 AhbHLH1L基因在花生根(A,C,E)和叶片(B,D,F)中受NaCl(A,B)、低温(C,D)和PEG6000(E,F)胁迫处理不同时间表达变化分析。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例进一步说明本发明，但并不是对本发明的进一步限定。
本发明的具体实施过程为：
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
实验材料为花生花育33(Arachis hypogaea L.cultivar Huayu33)。花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗(28℃/22℃)。生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理实验。
对于低温处理，将三叶期花生幼苗至于4℃光照培养箱中进行处理，分别于处理的0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生叶片和根作为实验材料；对于耐盐用NaCL处理；对于抗旱，用PEG6000处理。将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mM NaCl或20％PEG6000溶液中，在处理的0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为实验材料。所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。
1.2 RNA的提取和cDNA的合成
本实验用天根的RNeasy Mini Kit(Qiagen)分离提取花生幼苗RNA。RQ1RNase-free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用M-MLV ReverseTranscriptase(Promega,Madison,WI,USA)进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2μgRNA。在42℃条件下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用。
1.3 基因克隆
通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA TaqTM DNA polymerase(TaKaRa)，在25-μL体系中加入以下成分：2.5μL 10×PCR buffer(含MgCl2)；2.5μL 10mMdNTPs；1μL cDNA模板；0.5μL LA polymerase和17.5μL ddH2O。PCR反应条件为：(a)94℃，5min；(b)94℃，45s；54℃，60s；72℃，90s；共35cycles；(c)72℃，10min。扩增基因全长所用引物为AhbHLH1L-S:5’-ACTGAATGCTCCTGTGCCC-3’和AhbHLH1L-A:5’-GCTCCTGCCCTTTGCTATCT-3’。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Omega)进行纯化，纯化产物连接pMD18-T Easy vector(Takara)并测序(Sangon,Shanghai)。
1.4 荧光定量Real-time RT-PCR
荧光定量PCR所用cDNA模板稀释到8ngμL-1，用的聚合酶是SYBR Premix Ex Taqpolymerase(Takara)，用的仪器是LightCycler 2.0instrument system(Roche,Germany)，每反应体系加2μL稀释的cDNA。PCR反应程序如下：(1)95℃，10s；(2)95℃，5s，40cycles；(3)60℃，30s；(4)72℃，10s。PCR反应结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加0.5℃。actin11为实验的内参基因。
AhbHLH1L荧光定量验证用的引物序列为：QAhbHLH1L-S：5’-GAGTGTTATGTATAGTCCTGTTC-3’和QAhbHLH1L-A：5’-TGTTGTTGTTGATGATGATGA-3’。
内参基因actin11所用引物序列为：QACT11-S：5’-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3’和QACT11-A：5’-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。
2 实验结果
2.1 AhbHLH1L核苷酸全长及其编码的氨基酸序列
通过PCR扩增及测序，得到了目的基因，该基因开放阅读框为1260bp，共编码420个氨基酸。将该基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与大豆bHLH130-like同源性近60％，故将该基因命名为AhbHLH1L(Arachis hypogaea bHLH1-like)。
2.2 AhbHLH1L在非生物胁迫下的表达模式分析
通过荧光定量PCR验证了AhbHLH1L在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高(图1)。从图1可以看出，AhbHLH1L在低温、盐和干旱处理的根中表达量均有明显提高，并且此后一直维持在高于对照的水平(图1A,C,E)，在盐处理的叶片中表达量也明显增高(图1D)。以上结果表明AhbHLH1L可能在花生对逆境胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。说明AhbHLH1L基因能显著提高植物的抗逆性。
Claims (8)
1.花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法，其特征在于，主要包括以下步骤：材料的准备与处理：材料选择花生花育33，花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为22-28℃，生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理；
(1)材料的低温处理：将三叶期花生幼苗置于4℃光照培养箱中进行处理，取处理时间分别为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生叶片和根作为材料；
材料的盐处理：用NaCl处理；材料的干旱处理，用PEG6000处理；将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mMNaCl或重量浓度20％PEG6000溶液中，在处理时间为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用；
(2)RNA的提取和cDNA的合成
按照试剂盒操作手册的方法用天根的RNeasyMiniKit分离提取花生幼苗RNA，RQ1RNase-freeDNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成，用Takara的M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2μgRNA，在42℃条件下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用；
(3)基因克隆
通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LATaqTM DNA polymerase，在25-μL体系中加入以下成分：含MgCl2的2.5μL 10×PCR buffer；2.5μL 10mM dNTPs；1μL cDNA模板；0.5μL LA polymerase和17.5μL ddH2O；PCR反应条件为：(a)94℃，5min；(b)94℃，45s；55℃，45s；72℃，90s；共35cycles；(c)72℃，10min；扩增基因全长所用引物为AhbHLH1L-S:5’-ACTGAATGCTCCTGTGCCC-3’和AhbHLH1L-A:5’-GCTCCTGCCCTTTGCTATCT-3’；PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接pMD18-T Easy vector并测序。
2.根据权利要求1所述的花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法，其特征在于，所述的AhbHLH1L基因开放阅读框为1260bp，共编码420个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法，其特征在于，所述的AhbHLH1L基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列上有DNA结合位点，蛋白二聚体互作区及HLH保守结构域，同时该基因编码的氨基酸序列与大豆bHLH130-like同源性近60％。
4.根据权利要求1所述的花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法，其特征在于，所述的AhbHLH1L基因的核苷酸序列是序列表中序列1。
5.根据权利要求1所述的花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法，其特征在于，所述的AhbHLH1L基因的氨基酸序列是序列表中序列2。
6.根据权利要求1至5任一项所述的花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法，用荧光定量Real-time RT-PCR对AhbHLH1L基因逆境下的功能表达进行分析，其方法如下：荧光定量PCR所用cDNA模板稀释到8ngμL-1，用的聚合酶是SYBR Premix Ex Taqpolymerase，用的仪器是LightCycler 2.0 instrument system，每反应体系加2μL稀释的cDNA；PCR反应程序如下：(1)95℃，10s；(2)95℃，5s，40cycles；(3)60℃，30s；(4)72℃，10s；PCR反应结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加0.5℃；actin11为实验的内参基因。
7.根据权利要求6所述的花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法，其特征在于，所述的AhbHLH1L荧光定量验证用的引物序列为：QAhbHLH1L-S：5’-GAGTGTTATGTATAGTCCTGTTC-3’和QAhbHLH1L-A：5’-TGTTGTTGTTGATGATGATGA-3’。
8.根据权利要求6所述的花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法，其特征在于，所述的内参基因actin11所用引物序列为：QACT11-S：5’-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3’和QACT11-A：5’-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。
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