CN103725689A - 一种来源于中华按蚊水通道蛋白2的编码基因与应用 - Google Patents

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唐建霞
曹俊
张超
李菊林
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Abstract

一种来源于中华按蚊水通道蛋白2的编码基因与应用，属于生物工程技术领域。本发明提供中华按蚊水通道蛋白2的编码基因，以其为基础合成的多肽、构建的重组蛋白及其在昆虫杀虫剂中的应用技术。该中华按蚊水通道蛋白2基因的cDNA具有753个碱基，具有SEQIDNo.1的核苷酸序列，命名为AsAQP2；该蛋白编码250个氨基酸，具有SEQIDNo.2的氨基酸序列，与冈比亚按蚊对应的氨基酸序列(AGAP008842)具有90%的同源性。该中华按蚊水通道蛋白2分子量为26.0kDa，等电点为6.40，是一类稳定蛋白。体外实验证实具有高效的水分转运功能。位于N端14个氨基酸具有良好的抗原性，可诱导免疫性抗体产生。该重组蛋白在昆虫杀虫剂中具有良好的应用前景。

Description

一种来源于中华按蚊水通道蛋白2的编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种水通道蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及来源于中华按蚊水通道蛋白2（AsAQP2）的编码基因与应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
中华按蚊(Anopheles sinensis)是疟疾和马来丝虫病的重要传播媒介，不仅分布于我国除新疆和青海以外的全国各省区，还在东南亚和西太平洋地区广泛分布，是水稻种植地区的优势蚊种，是我国中部间日疟流行区的主要传疟媒介，在我国的种群数量大。中华按蚊是我国重要的媒介生物，有效控制中华按蚊对控制相关疾病的传播具有重要的意义。
杀虫剂是目前主要使用的控制按蚊的方式，但是由于近几十年来杀虫剂的广泛应用和剂量增加，导致蚊虫对杀虫剂抗体的抗性问题日益严重，增加对环境的破坏和人类健康的威胁，成为控制医学和农业重要节肢动物的主要障碍之一。面对这样巨大的挑战，寻找新型、有效、对环境低毒甚至无害的杀虫剂，或者改变现有杀虫剂的配方，提高杀虫效果和/或减少杀虫剂用量成为近年来研究的热点。
杀虫剂在昆虫体内产生抗性的原因之一是生理抗性，主要包括靶部位敏感性降低和表皮穿透性降低。其中，表皮穿透性降低是蚊虫增强抗性的一个机制。蚊虫表皮穿透性降低会延缓杀虫剂到达靶部位的时间，这样就使蚊虫有充分的时间以更快的速度将进入体内的杀虫剂进行代谢，很明显的降低了杀虫剂达到靶部位的有效浓度，避免了杀虫剂对蚊虫的毒害作用，从而增强抗性。而水通道蛋白是位于质膜或液泡膜上转移、高效的水分跨膜双向通道，是生物体中一种重要的跨膜蛋白，它通过一些中性小分子化合物的运输，从而参与昆虫对食物中水分再吸收、抗寒和抗干燥等重要生理机制。
有关蚊虫抗药性的研究中发现，具有抗药性的按蚊与不具抗药性的按蚊存在多种表达差异的基因，而其中一种基因与水通道蛋白具有较高的同源性。并且已经有报道，水通道蛋白可以提高药物对锥虫的杀灭效果。虽然有这些基础，但还未有人对水通道蛋白在杀虫剂中的应用进行相关研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的中华按蚊水通道蛋白2的编码基因与应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案：一种中华按蚊的水通道蛋白2的编码基因，记作AsAQP2，所述基因为SEQ ID No.1的核苷酸序列；基因编码区序列与SEQ ID No.1的核苷酸序列经过一个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺失而获得的相似性在90%以上，且其编码蛋白具有水通道蛋白活性的基因。提供中华按蚊水通道蛋白2编码基因，来源于中华按蚊，名称为中华按蚊水通道蛋白2编码基因，是如下的所示的核苷酸序列SEQ ID No.1。SEQ ID No.1由753个核苷酸组成。
含有所述的中华按蚊水通道蛋白2编码基因所表达的蛋白，其有SEQ ID No.2氨基酸序列所组成的蛋白质，其分子量为26.0kDa，等电点为6.40，稳定蛋白；及由SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失，且具有水通道蛋白活性的衍生蛋白质。
上述SEQ ID No.2编码250个氨基酸组成的蛋白质，即中华按蚊水通道蛋白2。上述中华按蚊水通道蛋白可以从中华按蚊的幼虫或成蚊中分离纯化。
含有所述水通道蛋白2编码基因的表达载体或转基因重组菌属于本发明的保护范围。
所述中华按蚊水通道蛋白2的编码基因的应用，其编码基因部分或全部序列在不抗寒转基因中华按蚊和增加杀虫剂杀虫效果中的应用。
对本发明中华按蚊水通道蛋白2编码基因的进一步研究表明，该基因编码的蛋白具有水通道蛋白的功能，能在体外情况下转运水分，其活性可被蚊虫不同发育期、低温及杀虫剂的水分胁迫等条件所调节。该蛋白存在于中华按蚊的幼虫、蛹或成虫的各个发育阶段。该蛋白本身或经过一个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失其具有水通道蛋白活性的衍生蛋白至少可用于昆虫生物工程领域；利用该基因的部分或全部序列反义表达或者对其活性进行调节至少可调节按蚊体内水分的运输，因此能够改变按蚊在干燥及低温条件下的生存状态；利用该基因或者经过一个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺失而获得的功能性衍生的表达可能改变蚊种对杀虫剂的敏感性。
本发明的有益效果：体外实验证实中华按蚊水通道蛋白2具有高效的水分转运功能。位于N端14个氨基酸具有良好的抗原性，可诱导免疫性抗体产生。该重组蛋白在昆虫杀虫剂中具有良好的应用前景。
附图说明
图1：为本发明的中华按蚊AsAQP2的基因扩增图
图2：为本发明的中华按蚊AsAQP2的基因的跨膜结构分析
a、跨膜区；b、膜内区；c、膜外区；
图3：显示了本发明的中华按蚊水通道蛋白2在爪蟾卵母细胞中表达的检测图
图4：中华按蚊水通道蛋白2在爪蟾卵母细胞中转运水分的能力
 图5：为本发明的中华按蚊水通道蛋白2在中华按蚊不同发育阶段及成蚊不同组织中的表达量变化
图6：显示本发明中华按蚊水通道蛋白2具有免疫原性的多肽
图7：中华按蚊水通道蛋白2制备的抗体对不同组织中中华按蚊水通道蛋白2表达量的检测。
具体实施方式
实施例1  中华按蚊水通道蛋白2 cDNA序列的克隆
根据冈比亚按蚊中水通道蛋白的保守氨基酸序列设计兼并引物，利用RT-PCR结合RACE技术，从中华按蚊中克隆到本基因的全长cDNA。经过序列比对，该基因与冈比亚按蚊水通道蛋白中的一种具有较高的同源性，冈比亚按蚊中该蛋白的表达丰度较高，具有非常高效的水分转运功能。根据序列信息设计特异性引物：
3F： 5’ -ATGACTGAAA GCGCAGGAGT G-3’，
3R： 5’ -TTAAAAATCG TATGAATTTG ATTCTTCG-3’，
利用中华按蚊成蚊mRNA，利用Invitrogen的SuperScriptⅢ反转录试剂盒获得cDNA模板，按照如下反应体系配制PCR反应物：
cDNA模板 2 μL
上游引物3F（20μM） 0.4 μL
下游引物3R（20μM） 0.4 μL
10XBuffer(-Mg2+) 2 μL
25mM MgCl2 2 μL
2mM dNTPs 2 μL
Taq 0.1μL
ddH2O 11.1μL
Total 20 μL
混匀后在PCR仪上用如下反应条件进行扩增：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，40个循环；最后72℃延伸5min。
反应结束后在反应体系中加入0.5μL dATP 及普通TaqDNA聚合酶(TAKARA)，混匀后置于72℃孵育60 min进行加尾反应。
将得到的PCR产物进行电泳检测和回收，得到一个约750bp大小的片段，将其连接进入pGEM-T easy载体（TAKARA）中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经克隆PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定，将测序结果在NCBI上进行同源性搜索，结果显示与冈比亚按蚊及埃及伊蚊的水通道蛋白具有80%以上的相似性。初步确定该基因为水通道家族成员，并命名为中华按蚊水通道蛋白2基因(AsAQP2)。并对该基因序列的结构进行分析，结果表明具有6个跨膜区及2个NPA结构，均为水通道蛋白的典型特征。
实施例2   中华按蚊水通道蛋白2体外功能的鉴定(爪蟾卵母细胞系统)
根据该基因序列的编码区设计引物，并在两端加上BglⅡ酶切位点。具体引物序列如下：
AQP2BglⅡF0' ： 5’ -AGA agatct ATGACTGAAA GCGCAGGAGT G-3’ ，
AQP2BglⅡR0' ： 5’ -AGA agatct TTAAAATCGT ATGAATTTGA TTC-3’ ，
内切酶BglⅡ分别酶切和回收PCR产物和卵母细胞表达载体pXβG-myc，经T4连接酶16℃过夜连接。对构建好的质粒分别经PCR、酶切和测序鉴定，确认方向和序列无误后，提取质粒线性化。利用Ambion公司的mMESSEGEmMACHINE T3体外转录试剂盒进行体外转录，具体操作详见公司使用说明书。所得产物进行稀释到0.5μg/μL用于显微注射。
成年雌性非洲爪蟾，购自中国科学院上海细胞研究所。取成熟爪蟾，置于冰上麻醉，下腹部用酒精消毒后作1cm左右切口，取出卵母细胞，置于含有改良Barth’s缓冲液(MBS)的培养皿中。MBS为：A液：NaCl 1.76 M，KCl 20mM， NaHCO3 47mM，MgSO4·7H2O 16.4 mM，MOPS 100mM；B液：Ca(NO3)2·4H2O 6.6mM，CaCl2·7H2O 0.5 mM；A、B液各稀释10倍后1:1混合，用Tris调节pH至7.4，每1000mL加庆大霉素70mg。卵母细胞用MBS清洗5次，加入1g/L 胶原酶，置20℃生化培养箱中轻微振荡，消化过夜。消化后用无钙MBS培养液清洗3次去除细胞间粘连，再用MBS清洗5次后，加入MBS培养液置20℃生化培养箱培养1h。选取Ⅴ,Ⅵ期正常发育的卵母细胞。每12h更换一次MBS培养液，连续培养3天。通过孕酮成熟实验以产生核成熟发生泡破裂来判别细胞是否存活。
爪蟾卵母细胞置于有凹槽培养皿中，显微镜下注射50.6nL 500ng/μL 的RNA或者同样剂量的RNase-free的水。经显微注射后的爪蟾卵母细胞在含有10 mg/L庆大霉素的MBS中培养3天后进行中华按蚊水通道蛋白2表达鉴定及功能研究。
取10个爪蟾卵母细胞，置于含有蛋白酶抑制剂(Promega)的低渗裂解缓冲液(7.5 mM 磷酸钠，1 mM EDTA，pH7.5)中，经反复吹吸使其充分混合。在4℃，经735g离心10 min，收集上清(含爪蟾卵母细胞卵黄)。收集的上清液再经200,000g、4℃离心1h，收集沉淀，即为爪蟾卵母细胞的细胞膜。细胞膜经2% SDS裂解，用BCA的方法测定浓度后，进行12% SDS-PAGE电泳，用Wester-blot方法，采用制备的抗体验证中华按蚊水通道蛋白2是否有表达。
另外，经注射中华按蚊水通道蛋白2的爪蟾卵母细胞置于经稀释的MBS(低渗，70 mOSM)中。在室温条件下，通过显微镜记录细胞膨胀的时间和计量细胞的面积。通过起始时间细胞面积(A 0 )与相应时间后细胞面积(A t )来计算相对体积(V/V 0 )，V/V 0 =( A t  / A 0 )3∕2。通过8-10个爪蟾卵母细胞计算水渗透性(P f )。
计算公式为：P f  =(V 0×d(V/V 0)/dt)/(S×Vw×(osmin- osmout))。其中d(V/V 0)/dt为时间过程中的起始斜率，V 0为平均起始爪蟾卵母细胞体积，S为平均起始爪蟾卵母细胞面积，Vw为水的摩尔体积，osmin - osmout为溶液的渗透梯度。结果与对照组比较，进行统计分析。结果表明该中华按蚊水通道蛋白2能在爪蟾卵母细胞膜上有效表达，并且具有活性，能有效转运水分。
实施例3  中华按蚊水通道蛋白2在不同发育阶段及成蚊不同组织中的表达
收集同一批中华按蚊不同发育阶段的蚊虫样本，分别为：蚊卵、4龄幼虫、蛹、成虫(雄蚊、雌蚊)；以及中华按蚊不同组织的收集，从同一批中华按蚊中取雌蚊50-60只，在解剖镜下分离头部、中肠、卵巢、脂肪体，用于提取总RNA，用于荧光定量PCR检测。
取收集的冷冻标本，在冰上研磨匀浆。总RNA由Qiagen RNeasy试剂盒抽取， 并用 RNase-free DNAse处理, 以去除基因组DNA 的污染。取2μg总RNA按照Toyobo反转录试剂盒说明书，用随机引物反转录合成cDNA。cDNA样本用于荧光定量PCR检测，观察中华按蚊水通道蛋白2的表达水平。
根据目的基因AsAQP2序列，设计特异性引物，利用核糖体蛋白S7作为内参。所用引物分别为：
AQP2rtF：  5’ -TCGCAACATA TGGCGAATGC TGAT-3’ ，
AQP2rtR：  5’ -GGATTGATGT GGCATCCGCT CACGTG-3’ ，
S7F：      5’ -CGTCATCTAC GTTCCAGTAC C-3’ ，
S7R：      5’ -GGCGGGTCTG GACCTTCTGG-3’ ，
以不同虫期以及成蚊不同组织的cDNA为模板，每个样本做 3个复孔，用SYBR green的方法在LC480荧光定量PCR仪上进行检测。结果表明中华按蚊水通道蛋白2在中华按蚊各个发育阶段均有不同程度的表达，除了卵的阶段。且该基因在成蚊的马斯管中高表达，也与其功能相符，与昆虫体内的水分代谢有关。
实施例 4  中华按蚊水通道蛋白2免疫原性多肽的预测、合成和抗体制备
将所得氨基酸序列，通过软件预测具有免疫原性的多肽片段，并合成。合成后的多肽进行偶联，并免疫采用肌肉注射方法免疫新西兰大白兔2只，免疫2周后用同样剂量蛋白加佛氏不完全佐剂(FIA)进行加强免疫，3次加强免疫后收集血清，用于免疫印迹（Western blot）检测及免疫荧光抗体试验(Immunofluorescence assay IFA)。
将体外合成的重组蛋白25倍稀释后，用TEV 蛋白酶30℃酶切3h，取5μL 加入等体积2×SDS-PAGE Loading Buffer后 100℃加热3min，冷却离心后取上清在5%-20%的PAGE 胶上电泳分离，电转移到PVDF 膜上，封闭后用获得的血清作为一抗（室温1h 或4℃过夜），辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体作为二抗进行免疫标记，然后加显色剂显色，以确定获得的抗体对重组蛋白的特异性识别。结果表明，该多肽能诱导产生特异性抗体，并且抗体可以特异性识别相应的蛋白。
SEQ ID No.1：
atgactgaaa gcgcaggagt gaaacagatc gtcggcgtct ccgatatcac cgaaaatcgc   60
aacatatggc gaatgctgat cgccgagttc ctcggcacct tcttgctggt gtcgatcggc  120
atcggtagca cgacgggctg gaccgactac agtcccacgc tgacgcagat tgcgttcacc  180
ttcggcctgg tggtcgccac tttggcacag gcattcggac acgtgagcgg atgccacatc  240
aatcctgccg ttacgatcgg cctgatggtg acggccgacg tgagcattct gaagggtgca  300
ttctacatcg tttcgcagtg catcggtgca attgcaggag ccgccgtcat caaggctgcc  360
acgccgacgg aagtggtcgg ttcactcggt gtaaccggca tcgccccggg actgtccgcg  420
gcccagggtg tcctggttga ggcgctcatc accttcatac tggtgttcgt cgtccatggc  480
gtgtgtgaca atcgtcgctc ggacatcaag ggttcggcac cgctcgccat cgggctttcc  540
atcaccgctg gacacttggc tgcgattaag tacaccggcg ccagcatgaa cccagctcgc  600
tcgttcggac cagcggtcgt tatgggcaac tacaccgacc tttgggttta ctgggttggt  660
ccgatcgtcg gaggtatcat cgccggggcc ctttaccgtc tgttcttcaa agtaagaaaa  720
ggtgacgagg aatcaaattc atacgatttt taa                               753
 
SEQ ID No.2：:
Met Thr Glu Ser Ala  Gly Val Lys Gln Ile  Val Gly Val Ser Asp
                  5                   10                   15
Ile Thr Glu Asn Arg  Asn Ile Trp Arg Met  Leu Ile Ala Glu Phe
                 20                   25                   30
Leu Gly Thr Phe Leu  Leu Val Ser Ile Gly  Ile Gly Ser Thr Thr
                 35                   40                   45
Gly Trp Thr Asp Tyr  Ser Pro Thr Leu Thr  Gln Ile Ala Phe Thr
                 50                   55                   60
Phe Gly Leu Val Val  Ala Thr Leu Ala Gln  Ala Phe Gly His Val
                 65                   70                   75
Ser Gly Cys His Ile  Asn Pro Asn Val Thr  Ile Gly Leu Met Val
                 80                   85                   90
The Ala Asp Val Ser  Ile Leu Lys Gly Ala  Phe Tyr Ile Val Ser
                 95                  100                  105
Gln Cys Ile Gly Ala  Ile Ala Gly Ala Ala  Val Ile Lys Ala Ala
                110                  115                  120
Thr Pro Thr Glu Val  Val Gly Gly Leu Gly  Val Thr Gly Ile Ala
                125                  130                  135
Pro Gly leu Ser Ala  Gly Gln Gly Val Leu  Val Glu Ala Leu Ile
                140                  145                  150
Thr Phe Ile Leu Val  Phe Val Val His Gly  Val Cys Asp Asn Arg
                155                  160                  165
Arg Ser Asp Ile Lys  Gly Ser Ala Pro Leu  Ala Ile Gly Leu Ser
                170                  175                  180
Ile Thr Ala Gly His  Leu Ala Ala Ile Lys  Tyr Thr Gly Ala Ser
                185                  190                  195
Met Asn Pro Ala Arg  Ser Phe Gly Pro Ala  Val Val Met Gly Asn
                200                  205                  210
Tyr Thr Asp Leu Trp  Val Tyr Trp Val Gly  Pro Ile Val Gly Gly
                215                  220                  225
Ile Ile Ala Gly Ala  Leu Tyr Arg Leu Phe  Phe Lys Val Arg Lys
                230                  235                  240
Gly Asp Glu Glu Ser  Asn Ser Tyr Asp Phe
245                              250
 
 
3F： 5’ -ATGACTGAAA GCGCAGGAGT G-3’，
3R： 5’ -TTAAAAATCG TATGAATTTG ATTCTTCG-3’，
 
AQP2BglⅡF0' ： 5’ -AGA agatct ATGACTGAAA GCGCAGGAGT G-3’ ，
AQP2BglⅡR0' ： 5’ -AGA agatct TTAAAATCGT ATGAATTTGA TTC-3’ ，
 
AQP2rtF：  5’ -TCGCAACATA TGGCGAATGC TGAT-3’ ，
AQP2rtR：  5’ -GGATTGATGT GGCATCCGCT CACGTG-3’ ，
 
S7F：      5’ -CGTCATCTAC GTTCCAGTAC C-3’ ，
S7R：      5’ -GGCGGGTCTG GACCTTCTGG-3’ 。

Claims (4)

1.一种中华按蚊水通道蛋白2的编码基因，记作AsAQP2，其特征在于：所述基因为SEQ ID No.1的核苷酸序列；基因编码区序列与SEQ ID No.1的核苷酸序列经过一个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺失而获得的相似性在90%以上，且其编码蛋白具有水通道蛋白活性的基因。
2.权利要求1所述的中华按蚊水通道蛋白2编码基因所表达的蛋白，其特征在于：具有SEQ ID No.2氨基酸序列所组成的蛋白质，其分子量为26.0kDa，等电点为6.40，稳定蛋白；及由SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失，且具有水通道蛋白活性的衍生蛋白质。
3.含有权利要求1所述中华按蚊水通道蛋白2的编码基因的表达载体或转基因重组菌。
4.权利要求1所述中华按蚊水通道蛋白2的编码基因的应用，其特征在于编码基因部分或全部序列在不抗寒转基因中华按蚊和增加杀虫剂杀虫效果中的应用。
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