JP5961886B2 - ペントースおよびグルコース発酵酵母細胞 - Google Patents
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Description
本発明は、C5およびC6糖を含む糖組成物(そのような組成物は、本明細書において混合糖組成物と命名される)の発酵に好適なペントースおよびグルコース発酵酵母細胞に関する。混合糖組成物は、リグノセルロース材料に由来し得る。本発明はまた、ペントースおよびグルコース発酵酵母細胞を使用して混合糖組成物から発酵生成物を生成する方法に関する。
化石燃料の代替物として生成されるエタノールのほとんどが、現在、トウモロコシデンプンおよびサトウキビベースのスクロースの発酵からのものである。再生燃料を生成する意欲的目的に到達するため、非食材バイオマスを発酵組成物、例えばエタノールに変換する新規技術が開発されている。サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は、エタノール工業において厳選された生物であるが、それはバイオマス原料のヘミセルロース構成成分中に含有される五炭糖を利用し得ない。ヘミセルロースは、バイオマスの20〜30%を構成し得、キシロースおよびアラビノースが最も豊富なC5糖である。キシロースイソメラーゼ(XI)の異種性発現は、酵母細胞のキシロースの代謝および発酵を可能とする任意選択である。同様に、S.セレビシエ(S.cerevisiae)株における細菌性遺伝子araA、araB、およびaraDの発現は、アラビノースの利用および効率的なアルコール発酵をもたらす。
本発明の目的は、ペントースおよびグルコースを嫌気的に同時発酵し得る酵母株を提供することである。
遺伝子破壊カセットの構築に使用されるオリゴヌクレオチド:
配列番号1は、オリゴヌクレオチドHXK2−disAの配列を説明する
配列番号2は、オリゴヌクレオチドHXK2−disBの配列を説明する
配列番号3は、オリゴヌクレオチドHXK1−disAの配列を説明する
配列番号4は、オリゴヌクレオチドHXK1−disBの配列を説明する
配列番号5は、オリゴヌクレオチドGLK1−disAの配列を説明する
配列番号6は、オリゴヌクレオチドGLK1−disBの配列を説明する
診断目的に使用されるオリゴヌクレオチド:
配列番号7は、オリゴヌクレオチドKanAの配列を説明する
配列番号8は、オリゴヌクレオチドKanBの配列を説明する
配列番号9は、オリゴヌクレオチドHXK2−FWの配列を説明する
配列番号10は、オリゴヌクレオチドHXK2−RVの配列を説明する
配列番号11は、オリゴヌクレオチドHXK1−FWの配列を説明する
配列番号12は、オリゴヌクレオチドHXK1−RVの配列を説明する
配列番号13は、オリゴヌクレオチドGLK1−FWの配列を説明する
配列番号14は、オリゴヌクレオチドGLK1−RVの配列を説明する
配列番号15は、HXK1のDNA配列を説明する
配列番号16は、HXK2のDNA配列を説明する
配列番号17は、GLK1のDNA配列を説明する
配列番号18は、GAL1のDNA配列を説明する
配列番号19は、YDR516CのDNA配列を説明する
配列番号20は、YLR446WのDNA配列を説明する
配列番号21は、HXK1のアミノ酸配列を説明する
配列番号22は、HXK2のアミノ酸配列を説明する
配列番号23は、GLK1のアミノ酸配列を説明する
配列番号24は、GAL1のアミノ酸配列を説明する
配列番号25は、YDR516Cのアミノ酸配列を説明する
配列番号26は、YLR446Wのアミノ酸配列を説明する
配列番号27は、オリゴヌクレオチドGAL1−DisAの配列を説明する
配列番号28は、オリゴヌクレオチドGAL1−DisBの配列を説明する
配列番号29は、オリゴヌクレオチドGAL1−FW2の配列を説明する
配列番号30は、オリゴヌクレオチドGAL1−RV2の配列を説明する
配列番号31は、オリゴヌクレオチドHXK2−FW2の配列を説明する
配列番号32は、オリゴヌクレオチドHXK2−RV2の配列を説明する
配列番号33は、オリゴヌクレオチドHXK2−FW3の配列を説明する
配列番号34は、オリゴヌクレオチドHXK2−RV3の配列を説明する
配列番号35は、オリゴヌクレオチドHXK1−FW2の配列を説明する
配列番号36は、オリゴヌクレオチドHXK1−RV2の配列を説明する
配列番号37は、オリゴヌクレオチドHXK1−FW3の配列を説明する
配列番号38は、オリゴヌクレオチドHXK1−RV3の配列を説明する
配列番号39は、オリゴヌクレオチドGLK1−FW4の配列を説明する
配列番号40は、オリゴヌクレオチドGLK1−RV4の配列を説明する
配列番号41は、オリゴヌクレオチドGLK1−FW5の配列を説明する
配列番号42は、オリゴヌクレオチドGLK1−RV5の配列を説明する
配列番号43は、GAL1(CEN.PK113−7D)のDNA配列を説明する
配列番号44は、GAL1(IMK318)のDNA配列を説明する
配列番号45は、GAL1(IMW017)のDNA配列を説明する
配列番号46は、GAL1(IMW018)のDNA配列を説明する
配列番号47は、GAL2(CEN.PK113−7D)のDNA配列を説明する
配列番号48は、GAL2(IMK318)のDNA配列を説明する
配列番号49は、GAL2(IMW017)のDNA配列を説明する
配列番号50は、GAL2(IMW018)のDNA配列を説明する
配列番号51は、GAL1(CEN.PK113−7D)のアミノ酸配列を説明する
配列番号52は、GAL1(IMK318)のアミノ酸配列を説明する
配列番号53は、GAL1(IMW017)のアミノ酸配列を説明する
配列番号54は、GAL1(IMW018)のアミノ酸配列を説明する
配列番号55は、GAL2(CEN.PK113−7D)のアミノ酸配列を説明する
配列番号56は、GAL2(IMK318)のアミノ酸配列を説明する
配列番号57は、GAL2(IMW017)のアミノ酸配列を説明する
配列番号58は、GAL2(IMW018)のアミノ酸配列を説明する
ヘキソキナーゼにより介在される細胞内反応は、以下のとおり類型化することができる:
ヘキソース+ATP→ヘキソース−P+ADP
本発明によれば、天然ヘキソキナーゼ活性の破壊は、C5/C6発酵におけるより短い発酵時間および/またはペントースおよびグルコースの酵母細胞による同時消費をもたらす。
一実施形態によれば、
a)場合により強力な構成性プロモーターの制御下のPPP遺伝子TAL1、TKL1、RPE1およびRKI1からなるクラスター;
b)強力な構成性プロモーターの制御下下のxylA遺伝子からなるクラスター;
c)強力な構成性プロモーターの制御下のXKS1遺伝子を含むクラスター;
d)強力な構成性プロモーターの制御下の遺伝子araA、araBおよびaraDからなるクラスター
e)アルドースレダクターゼ遺伝子の欠失;
f)酵母由来の1つ以上のヘキソキナーゼ遺伝子の破壊;
g)a)からe)から得られた株の進化工学;
ならびに場合により
h)1つ以上の外因性ヘキソキナーゼ遺伝子の、進化工学から得られた細胞中への導入
を宿主細胞中に導入することにより遺伝子を酵母細胞に導入して酵母細胞を生成することができる。
酵母細胞は、組換え細胞である。すなわち、酵母細胞は、当該細胞中で天然に生じないヌクレオチド配列を含み、またはその配列により形質転換もしくは遺伝子改変されている。
アミノ酸またはヌクレオチド配列は、あるレベルの類似性を示す場合に相同性であると考えられる。相同性である2つの配列は、共通の進化的起源を示す。2つの相同配列が近縁であるかより遠縁であるかは、それぞれ高いかまたは低い「同一性パーセント」または「類似性パーセント」により示される。議論されているが、「同一性パーセント」または「類似性パーセント」を示すため、「相同性のレベル」または「相同性パーセント」が互換的に使用されることが多い。
相同性または同一性は、任意のギャップまたはエクステンションを含むアラインされた全領域にわたる2つの完全配列間の同一合致の百分率である。2つのアラインされた配列間の相同性または同一性は、以下のとおり算出される:両配列中の同一アミノ酸を示すアラインメント中の対応位置の数を、ギャップを含むアラインメントの全長により割る。本明細書に定義の同一性は、NEEDLEから得ることができ、プログラムの出力において「IDENTITY」とラベルすることができる。
2つのアラインされた配列間の相同性または同一性は、以下のとおり算出される:両配列中の同一アミノ酸を示すアラインメント中の対応位置の数を、アラインメント中のギャップの総数を引いた後のアラインメントの全長により割る。本明細書に定義の同一性は、NOBRIEFオプションを使用することによりNEEDLEから得ることができ、プログラムの出力において「longest−identity」とラベルすることができる。本発明の目的のため、2つの配列(アミノ酸またはヌクレオチド)間の同一性(相同性)のレベルは、プログラムNEEDLEを使用することにより実施することができる「最長同一性」の定義に従って算出される。
−オープンギャップに対するコスト:デフォルト=ヌクレオチドについて5/タンパク質について11
−エクステンドギャップに対するコスト:デフォルト=ヌクレオチドについて2/タンパク質について1
−ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティ:デフォルト=−3
−ヌクレオチドマッチについてのリワード:デフォルト=1
−期待値:デフォルト=10
−ワードサイズ:デフォルト=ヌクレオチドについて11/megablastについて28/タンパク質について3
長年にわたり、作物糖からバイオエタノールを生成するために、種々な生物の導入が提案されてきた。しかしながら、実際、全ての主要なバイオエタノール生成プロセスは、エタノール生成菌としてサッカロマイセス(Saccharomyces)属の酵母を使用し続けている。これは工業的プロセスのための、サッカロマイセス(Saccharomyces)種の多くの魅力的な特徴、すなわち高い酸、エタノールおよび浸透圧耐性、嫌気的生育能、ならびにもちろんその高いアルコール発酵能に起因する。宿主細胞として好ましい酵母種には、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、S.ブルデリ(S.bulderi)、S.バルネッチ(S.barnetti)、S.エクシグウス(S.exiguus)、S.ウバラム(S.uvarum)、S.ディアスタティカス(S.diastaticus)、K.ラクチス(K.lactis)、K.マルキシアヌス(K.marxianus)またはK.フラギリス(K.fragilis)が含まれる。
潜在的な再生可能原料とみなすことができるリグノセルロースは、一般に、多糖セルロース(グルカン)およびヘミセルロース(キシラン、ヘテロキシランおよびキシログルカン)を含む。さらに、例えば木材由来原料中に、一部のヘミセルロースがグルコマンナンとして存在し得る。例えばこれらの多糖の、可溶性糖、例としてモノマーおよびマルチマーの両方、例えばグルコース、セロビオース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、ラムノース、リボース、ガラクツロン酸、グルクロン酸ならびに他のヘキソースおよびペントースへの酵素加水分解は、協調して作用する異なる酵素の作用下で生じる。
酵素処理前に、リグノセルロース材料を前処理することができる。前処理は、リグノセルロース材料を酸、塩基、溶媒、熱、過酸化物、オゾン、機械的破砕、研削、粉砕もしくは急速減圧、またはそれらの任意の2つ以上の組合せに曝露することを含み得る。この化学的前処理は、熱前処理、例えば1〜30分間の150〜220℃の処理と組み合わされることが多い。
前処理された材料は、一般に、酵素加水分解に供して本発明により発酵することができる糖を放出させる。これは、慣用の方法を用いて、例えばセルラーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼおよび場合により他の酵素と接触させることにより行うことができる。セルラーゼによる変換は、周囲温度においてまたはより高温において、十分量の糖を放出させるための反応時間において行うことができる。酵素加水分解の結果は、本明細書において糖組成物として命名されるC5/C6糖を含む加水分解生成物である。
本発明により使用される糖組成物は、グルコース、および例えばアラビノースおよび/またはキシロースなどの1つ以上のペントースを含む。それらの基準を満たす任意の糖組成物を本発明において使用することができる。糖組成物中の任意選択の糖は、ガラクトースおよびマンノースである。好ましい実施形態において、糖組成物は、1つ以上のリグノセルロース材料の加水分解物である。本明細書におけるリグノセルロースには、ヘミセルロースおよびバイオマスのヘミセルロース部分が含まれる。リグノセルロースには、バイオマスのリグノセルロース画分も含まれる。好適なリグノセルロース材料は、以下の列記に見出すことができる:果樹園のプライミング処理物、シャパラル、ミル廃棄物、都市木材廃棄物、一般廃棄物、伐採廃棄物、森林間伐材、短期輪作木質作物、工業廃棄物、コムギ藁、オートムギ藁、イネ藁、オオムギ藁、ライムギ藁、アマ藁、ダイズ殻、籾殻、イネ藁、トウモロコシグルテン飼料、オートムギ殻、サトウキビ、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ茎、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ外皮、スイッチグラス、ススキ、サトウモロコシ、キャノーラ茎、ダイズ茎、プレリーグラス、ガマグラス、エノコログサ;サトウダイコンパルプ、柑橘果実パルプ、種子殻、セルロース性家畜排泄物、刈り取った芝草、ワタ、海藻、樹木、針葉樹、広葉樹、ポプラ、マツ、灌木、草、コムギ、コムギ藁、サトウキビバガス、トウモロコシ、トウモロコシ外皮、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ穀粒、穀粒からの繊維、穀物の湿式または乾式粉砕からの製品および副産物、一般固形廃棄物、古紙、庭ごみ、草質材料、農業残渣、林業残渣、一般固形廃棄物、古紙、パルプ、製紙工場残渣、枝、低木、トウ、トウモロコシ、トウモロコシ外皮、エネルギー作物、森林、果実、花、穀物、草、草本作物、葉、樹皮、針葉、原木、根、苗木、灌木、スイッチグラス、木、野菜、果皮、蔓植物、サトウダイコンパルプ、コムギ製粉物、オートムギ殻、広葉樹もしくは針葉樹、農業プロセスから生じる有機廃材、林業木材廃棄物、またはそれらの任意の2つ以上の組合せ。
発酵プロセスは、好気的または嫌気的発酵プロセスであり得る。嫌気的発酵プロセスは、本明細書において、酸素不存在下で実行される発酵プロセス、または実質的に酸素が消費されず、好ましくは約5、約2.5または約1mmol/L/h未満、より好ましくは0mmol/L/h未満が消費され(すなわち酸素消費が検出可能でない)、有機分子が電子供与体および電子受容体の両方として機能する発酵プロセスと定義される。酸素の不存在下で、解糖およびバイオマス形成中に生成されたNADHは、酸化的リン酸化により酸化され得ない。この問題を解決するため、多くの微生物は、電子および水素受容体としてピルビン酸またはその誘導体の1つを使用し、それによりNAD+を再生する。
並行復発酵(SSF)様式について、液化/加水分解または前糖化工程のための反応時間は、所望の収率、すなわちセルロースからグルコースへの変換収率を実現する時間に依存する。そのような収率は、好ましくは可能な限り高く、好ましくは60%以上、65%以上、70%以上、75%以上80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、さらには99.5%以上または99.9%以上である。
SSF操作において、生成物濃度(g/L)は生成されるグルコースの量に依存するが、糖はSSFにおいて生成物に変換され、生成物濃度は、基礎グルコース濃度に理論的最大収率(Yps maxは、1グラムのグルコース当たりの生成物のグラムである)を掛けたものに関連し得るため、これは可視的でない。
SSF操作において、生成物濃度は、25g*Yps g/L/L以上、30*Yps g/L以上、35g*Yps/L以上、40*Yps g/L以上、45*Yps g/L以上、50*Yps g/L以上、55*Yps g/L以上、60*Yps g/L以上、65*Yps g/L以上、70*Yps g/L以上、75*Yps g/L以上、80*Yps g/L以上、85*Yps g/L以上、90*Yps g/L以上、95*Yps g/L以上、100*Yps g/L以上、110*Yps g/L以上、120g/L*Yps以上であり、または例えば25*Yps g/L〜250*Yps g/L、30*Yps gl/L〜200*Yps g/L、40*Yps g/L〜200*Yps g/L、50*Yps g/L〜200*Yps g/L、60*Yps g/L〜200*Yps g/L、70*Yps g/L〜200*Yps g/L、80*Yps g/L〜200*Yps g/L、90*Yps g/L、80*Yps g/L〜200*Yps g/Lであり得る。
a.本明細書に記載の方法を使用してリグノセルロースを分解すること;および
b.得られた材料を発酵すること
を含み、それにより発酵生成物を調製する方法を提供する。
本発明の発酵生成物は、任意の有用な生成物であり得る。一実施形態において、これは、エタノール、n−ブタノール、イソブタノール、乳酸、3−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、アミノ酸、例えばリジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびアスパラギン酸、1,3−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン、ビタミン、医薬品、動物飼料補助剤、特殊化学薬品、化学原料、プラスチック、溶媒、燃料、例としてバイオ燃料およびバイオガスまたは有機ポリマー、ならびに工業酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼからなる群から選択される生成物である。
発酵生成物の回収のため、既存の技術が使用される。異なる発酵生成物について、異なる回収プロセスが適切である。水性混合物からエタノールを回収する既存の方法は、一般に分留および吸着技術を使用する。例えばビール蒸留器を使用して、エタノールを水性混合物中に含有する発酵生成物を処理して濃縮エタノール含有混合物を生成し、次いで分留(例えば分別蒸留または他の同様の技術)に供することができる。次に最高濃度のエタノールを含有する留分を吸収材に導通させ、エタノールから残りの水の全部ではないが大部分を除去することができる。
[株および維持]
本試験において使用される株(表1)の貯蔵のため、振とうフラスコ培養を10g l−1の酵母抽出物(BD Difco)および20g l−1のペプトン(BD Difco)からなり、2%のグルコース(YPD)、2%のエタノール+1.5%のグリセロール(YP−EtOH/Glyc)または2%のアラビノース(YP−Ara)のいずれかを補給した複合培地(YP)中で実施した。培養物を、静止生育期までオービタルシェーカー(200rpm)中で30℃においてインキュベートした。30%(v/v)のグリセロールの添加後、振とうフラスコ培養物からの試料を2mlのアリコートで−80℃において貯蔵した。
振とうフラスコ中での培養を、2.3g l−1の尿素、6.6g l−1のK2SO4、3g l−1のKH2PO4、0.5g l−1のMgSO4.7H2O、および微量元素を含有する合成培地(MY尿素)[7]中で30℃において実施した。振とうフラスコ培養のため、培地pHを滅菌前に2MのKOHにより4.7に調整した。加熱滅菌(121℃、20分)後、フィルター滅菌ビタミン溶液[7]および糖を添加した。振とうフラスコ培養物は、500mlの振とうフラスコ中の適切な糖を含有する100mlの培地に凍結ストック培養物を植菌することにより調製し、オービタルシェーカー(200rpm)中で30℃においてインキュベートした。
嫌気的バッチ培養は、1lの作業容積を有する2リットルの発酵槽(Applikon,Schiedam,the Netherlands)中で30℃において実施した。培養は、5g l−1の(NH4)2SO4、3g l−1のKH2PO4、0.5g l−1のMgSO4.7H2Oおよび微量元素を含有する合成培地[7]中で実施した。加熱滅菌(121℃、20分)後、培地にエタノール中に溶解した0.01g−1のエルゴステロールおよび0.42g−1のTween80[1,2]、ケイ素消泡剤、微量元素、フィルター滅菌ビタミン溶液[7]、ならびに適切な炭素源を補給した。培養物を800rpmにおいて撹拌し、0.5l min−1の窒素ガス(<10ppmの酸素)によりスパージし、2MのKOHの自動添加によりpH5.0において維持した。酸素拡散を最小化するため、発酵槽にNorpreneチューブ(Cole Palmer Instrument Company,Vernon Hills,USA)を備えた。酸素の不存在は、酸素電極(Applisens,Schiedam,the Netherlands)により確認した。バッチ培養は、100mlのグルコースにより生育させた振とうフラスコ培養物の植菌により開始した。
振とうフラスコ培養物について、660nmにおける光学密度(OD660)を経時的に計測することにより生育プロファイルを作製した。発酵槽中の嫌気的培養について、比生育速度を排ガス中のCO2濃度に基づき決定した。比生育速度は、データ点を指数曲線にフィットすることにより決定した。
嫌気的発酵槽からの排ガスを、凝縮器(2℃)中で冷却し、Permapure乾燥器型MD−110−48P−4(Permapure,Toms River,USA)により乾燥させた。二酸化炭素濃度は、NGA2000分析器(Rosemount Analytical,Orrville,USA)により測定した。排ガス流速および比二酸化炭素生成速度は、上記のとおり測定した[6,8]。
本試験において使用された株の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性は、グルコースのグルコース−6−リン酸(反応1)への変換率を、形成されたグルコース−6−リン酸を酵素グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼにより6−ホスホグルコン酸に変換する連結酵素反応(反応2)を使用して計測することにより測定した。この連結反応において形成されるNADPHの速度は、ヘキソキナーゼ活性と等しく、340nmにおける吸光度を計測することにより測定する。
[遺伝子欠失]
本実施例において、遺伝子欠失は、標的遺伝子を置き換えるG418耐性カセットの統合により達成した。HXK2、HXK1およびGLK1の欠失のため、pUG6からのKanMXカセットを、表2に示されるオリゴヌクレオチドを使用してPCRにより増幅した[4]。
[グルコースの存在下でアラビノース上で生育するIMK318の選択]
グルコース上での振とうフラスコ中の450時間の培養により、ヘキソキナーゼ/グルコキナーゼ欠失株IMK318(hxk1Δ hxk2Δ glk1Δ)がグルコース単独上で生育し得ないことを確認した。したがって、この株をYP−EtOH/Glyc中で培養し、続いてグリセロールの添加後に−80℃において貯蔵した。続いてIMK318を、2%のアラビノースを含有する100mlのMY中で培養した。3日後、約1のOD660において、2mlの培養物を、2%のアラビノースを含有する100mlの新たなMYに植継ぎした。約12日後、培養物のOD660は>5であり、試料を−80℃においてグリセロールストックとして貯蔵した。株IMK318は、30℃においてMY−ara中で数日間培養した。約5のOD660において、2mlの培養物を、2%のアラビノースを補給し、グルコース濃度が0、0.11、0.23、0.65、1.3および2.5(w/v)%で変動する100mlのMY尿素を含有する6つの別個の振とうフラスコに植継ぎした。これら6つの並行培養物の生育を、OD660計測により記録した(図3)。グルコースの存在下、生育が遅延することが観察された。グルコースの量の増加は、アラビノース上での次第に遅延する生育をもたらした。これらの並行培養物の2つ(系統A、0.65w/v%のグルコースにおいて開始;系統B、2.5w/v%のグルコースにおいて開始)を、表4に示される植継ぎスキームに従ってアラビノースおよびグルコースを補給した100mlのMYに継代した。
[アラビノースおよびグルコースの嫌気的同時発酵]
株IMW017を、連続バッチ発酵槽設定を使用してグルコースおよびアラビノースの混合物中で嫌気的に培養した。グルコース/アラビノース混合物中の3つの連続バッチを実施した(図6)。それぞれのバッチにおいて、グルコースおよびアラビノースは同時に消費され、エタノールに発酵された。CO2生成プロファイルから推定すると、グルコース/アラビノース混合物上での比生育速度が、第1のバッチにおける0.05h−1から第3のバッチにおける0.07h−1に増加することが観察された。
[ヘキソキナーゼ活性]
株DS62504、IMK307、IMK312、IMK318、IMW017およびIMW018の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性を測定する。IMK307(hxk2Δ)の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性は、株DS62504のそれよりも低い。IMK312(hxk2Δ hxk1Δ)のヘキソキナーゼ活性はIMK307のそれよりも低い一方、IMK318(hxk2Δ hxk1Δ glk1Δ)は、ヘキソキナーゼ活性を示さず/最低のヘキソキナーゼ活性を示す。株IMW018中のヘキソキナーゼ活性はIMK318について観察されるヘキソキナーゼ活性と類似する一方、IMW017はIMK318よりも高いヘキソキナーゼ活性を有する。
[IMW017における未知ヘキソキナーゼの同定]
進化させたhxkl hxk2 glkl株における計測されたヘキソキナーゼ活性に基づくと、ゲノム中に存在する糖キナーゼをコードする潜在性を有する別の遺伝子が活性になり、またはグルコースに対するその基質特異性を変えたことが予期される。この活性をコードする遺伝子をゲノム分析により同定する。この遺伝子の付加的欠失は、ヘキソキナーゼ活性の減少をもたらす。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
[IMK318におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入]
グルコース上での生育を回復させるため、HXK1、HXK2またはGLK1のいずれかをIMK318中に再導入する。活性計測は、IMK318におけるこれらの遺伝子の1つの再導入がヘキソ/グルコキナーゼ活性の増加をもたらすことを示す。単独の炭素源としてのグルコース上での生育が回復される。
[IMW018におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入]
活性計測は、IMW018におけるHXK1、HXK2またはGLK1のいずれかの再導入が株IMW018と比較してヘキソ/グルコキナーゼ活性の増加をもたらすことを示す。単独の炭素源としてのグルコース上での生育が回復される。HXK1、HXK2またはGLK1のいずれかの再導入は、単独の炭素源としてのグルコースおよびアラビノースの両方の上での生育をもたらす。得られた株は、グルコースおよびアラビノースの混合物中で生育し、グルコースおよびアラビノースの同時消費を示す。
[IMW017およびIMW018のグルコース非感受性表現型の基礎をなす突然変異の同定]
株IMW017およびIMW018のグルコース非感受性表現型は、グルコースおよびアラビノースを含有する培地中の株IMK318の選択的生育の間に蓄積した突然変異により説明することができることが予測される。これらの突然変異を同定するため、株IMK318、IMW017およびIMW018のゲノムをシーケンシングする。IMW017とIMK318およびIMW018とIMK318のゲノム配列を比較することにより、例えば単一ヌクレオチド多型などのゲノム改変を同定する。DS62504におけるこれらの単一ヌクレオチド多型の導入は、アラビノース上での生育がグルコースに対して非感受性である表現型をもたらす。
[GAL1の欠失]
ヘキソキナーゼ活性の維持を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、hxk1 hxk2 glk1株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、GAL1遺伝子をhxk1 hxk2 glk1株において欠失させる。得られた株は、親hxk1 hxk2 glk1株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親hxk1 hxk2 glk1株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
[YDR516cの欠失]
ヘキソキナーゼ活性の残留を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、hxk1 hxk2 glk1株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、YDR516c遺伝子をhxk1 hxk2 glk1株において欠失させる。得られた株は、親hxk1 hxk2 glk1株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親hxk1 hxk2 glk1株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
[YLR446wの欠失]
ヘキソキナーゼ活性の残留を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、hxk1 hxk2 glk1株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、YLR446w遺伝子をhxk1 hxk2 glk1株において欠失させる。得られた株は、親hxk1 hxk2 glk1株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親hxk1 hxk2 glk1株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
[アラビノースおよびグルコースの嫌気的同時発酵]
株IMW017のグルコースおよびアラビノースの同時消費を改善するため、株IMW017を、20g/リットルのグルコースおよび20g/リットルのアラビノースの混合物を補給したMY中で、連続バッチ発酵槽設定を使用して嫌気的に培養した。最初に、グルコース/アラビノース混合物中の4つの連続バッチを実施した。それぞれのバッチにおいて、グルコースおよびアラビノースは同時に消費され、エタノールに発酵された(図6、実施例3)。CO2生成プロファイルから推定すると、グルコース/アラビノース混合物上の比生育速度が、第1のバッチにおける0.05h−1から第4のバッチにおける0.06h−1に増加することが観察された。第4のバッチ後、連続バッチ培養をグルコースおよびアラビノースの混合物(バッチ番号6、7、9、11、13、15、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37および39)またはアラビノース単独(バッチ番号5、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38および40)の中で実施した。MY−アラビノースおよびMY−グルコース/アラビノースそれぞれにおける19および21のバッチ後、嫌気的生育速度は単独の炭素源としてのアラビノース上で0.09h−1に増加し、グルコース/アラビノース混合物上で0.10h−1に増加した(図7)。個々のバッチ培養のCO2生成プロファイルの比較は、反復バッチレジームがアラビノース単独またはグルコース/アラビノース混合物のいずれについても約120時間から約80時間に発酵時間の減少をもたらしたことを示し、それぞれのバッチについて等しい初期植菌材料サイズが想定される(図8)。グルコース/アラビノース混合物中のバッチ培養について観察されたCO2生成の単一ピークは、グルコースおよびアラビノースが連続的にではなく同時に消費されることを示す(図8および9)。
[ヘキソキナーゼ活性]
株DS62504、IMK307、IMK312、IMK318、IMW017およびIMW018のヘキソキナーゼ活性を、アラビノースを補給したYP中で生育させた振とうフラスコ培養物の細胞抽出物において測定した。ヘキソキナーゼ反応混合物は、50mMのイミダゾール−HCl、pH7.6、1mMのNADP+、10mMのMgCl2、2Uのグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、10mmのD−グルコースおよび細胞抽出物からなるものであった。反応は1mMのATPの添加により開始し、NADPHの形成は340nmにおける反応混合物の吸光度を計測することにより測定した。株DS62504およびIMK307(hxk2Δ)の細胞抽出物におけるヘキソキナーゼ活性は、それぞれ1.2および1.3μmol.min−1.mg−1タンパク質であった(図10)。IMK312(hxk2Δ hxk1Δ)の細胞抽出物における0.4μmol.min−1.mg−1タンパク質のヘキソキナーゼ活性は、IMK307のそれよりも低かった。株IMK318およびIMW018(hxk2Δ hxk1Δ glk1Δ)は、0.2μmol.min−1.mg−1タンパク質未満のヘキソキナーゼ活性を示した。三重のhxk2 hxk1およびglk1の欠失にかかわらずグルコースを消費し得る株IMW017は、両方ともグルコースを消費し得ない株IMK318およびIMW018と比較してより高いヘキソキナーゼ活性を有することが予期された。株IMW017についてのヘキソキナーゼ活性は、アッセイ条件下で0.02μmol.min−1.mg−1タンパク質未満でもあった。
[IMW017におけるヘキソキナーゼとしてのGAL1の同定]
グルコースおよびアラビノースの混合物上での進化させたhxk1Δ hxk2Δ glk1Δ株IMW017の生育実験に基づくと、ゲノム中に存在する糖キナーゼをコードする潜在性を有する別の遺伝子が活性になり、またはグルコースに対するその基質特異性を変えたことが予期された。未知のヘキソキナーゼ活性がGAL1によりコードされるか調査するため、GAL1遺伝子をIMW017において欠失させた。pSH65(実施例1参照)を使用してglk1遺伝子座からKanMXカセットを除去した後、GAL1欠失を、オリゴヌクレオチドGAL1−DisAおよびGAL1−DisB(表5)を使用するPCRにより増幅させたG418耐性カセットの統合により達成した。形質転換細胞は、100μg ml−のG418(InvivoGen,San Diego,USA)ならびに炭素源としての1.5%(w/v)のエタノールおよび1.5%(w/v)のグリセロールを含有するYP寒天上で選択した。KanMXカセットの正確な統合は、診断オリゴヌクレオチドGAL1−FW2/KanAおよびGAL1−RV2/KanB(表4)の組合せを使用する単一コロニーに対するPCRにより確認した。得られた株IMW023におけるGAL1の欠失は、単独の炭素源としてのガラクトース上での生育不能により確認した。
[グルコースの存在下でのアラビノースの嫌気的発酵について]
IMW017におけるGAL1pもヘキソキナーゼ活性を示すことが見出されたため、hxk1Δ hxk2Δ glk1Δ gal1Δ株IMW023は、進化工学によりグルコースを消費させずにグルコースの存在下でのアラビノース消費を改善するためのより堅実なプラットフォームを提供する。培地中のグルコースの存在下での改善されたアラビノース消費を選択するため、株IMW023を、振とうフラスコ培養物中で、2%のアラビノースおよび2%のグルコースを補給したMY培地中での継代により培養した。生育はOD660計測によりモニタリングし、比生育速度は培養物当たり2または3つのいずれかのOD660計測から推定した。グルコースおよびアラビノース濃度は、HPLC分析により測定した。63日間におけるアラビノース/グルコース混合物上での24代の継代後、株IMW023の植継ぎされた培養物は、依然としてグルコースを消費せずに2%のグルコースの存在下でアラビノース上で生育し得た(図12)。アラビノース上での比生育速度は、約0.06h−1から約0.11h−1に増加した(図13)。
[IMW018におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入]
株IMW018におけるHXK1、HXK2またはGLK1のいずれかの再導入を、グルコース上での生育を回復させるために実施した。このため、HXK2、HXK1およびGLK1を、オリゴヌクレオチド組合せHXK2FW/HXK2RV、HXK1FW/HXK1RVおよびGLK1FW/GLK1RVを使用し、S.セレビシエ(S.cerevisiae)CENPK113−7DのゲノムDNAをテンプレートとして使用するPCRにより増幅した。PCR生成物の精製後((GenElute PCR Clean−up Kit,Sigma,Steinheim,Germany)、IMW018の一晩培養物をこのPCR生成物により形質転換した(Gietz and Woods 2002)。形質転換細胞は、2%のグルコースを含有するMY寒天上のグルコース上での生育について選択した。相同性組換えによるHXK2、HXK1およびGLK1のそれらの元の遺伝子座における正確な統合は、診断プライマーペア(表6)を使用する単一コロニーに対するPCRにより確認した。
[IMW058におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入]
株IMW058におけるHXK1、HXK2またはGLK1のいずれかの再導入を、グルコース上での生育を回復させるために実施した。このため、HXK2、HXK1およびGLK1を、オリゴヌクレオチド組合せXK2FW/HXK2RV、HXK1FW/HXK1RVおよびGLK1FW/GLK1RVを使用し、S.セレビシエ(S.cerevisiae)のCENPK113−7DのゲノムDNAをテンプレートとして使用するPCRにより増幅させた。PCR生成物の精製後(GenElute PCR Clean−up Kit,Sigma,Steinheim,Germany)、IMW058の一晩培養物をこのPCR生成物により形質転換した(Gietz and Woods 2002)。形質転換細胞は、2%のグルコースを含有するMY寒天上のグルコース上での生育について選択した。相同性組換えによるHXK2、HXK1およびGLK1のそれらの元の遺伝子座における正確な統合は、診断オリゴヌクレオチド(表5)を使用する単一コロニーに対するPCRにより確認した。
[株IMK318、IMW017およびIMW018の比較全ゲノムシーケンシング]
株IMK318、IMW017およびIMW018についての全ゲノムDNAシーケンシングは、Illumina GAIIx技術(75bpのリード、ペアエンド)を使用して実施した。シーケンスリードは、CLC Genomics Workbenchバージョン4.5を使用してS.セレビシエ(S.cerevisiae)CEN.PK113−7Dの参照ゲノム配列にアラインした。SNP分析は、CLC Genomics Workbenchバージョン4.5を使用して実施した。
[IMW059によるグルコースおよびアラビノースの迅速な嫌気的発酵]
株IMW059を、20gl−1のグルコースおよび20gl−1のアラビノースを有するMY培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、HPLC計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびOD660のモニタリングにより測定した。CO2生成は、排ガス中のCO2濃度の計測により測定した。エタノール生成は、CO2生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、CO2の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたCO2生成(1グラムのバイオマス当たり5.85mmolのCO2)および酢酸形成に伴うCO2を差し引いたものに等しいと想定した。
[IMW060によるグルコースおよびアラビノースの嫌気的同時消費]
株IMW060を、20g l−1のグルコースおよび20g l−1のアラビノースを有するMY培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、HPLC計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびOD660のモニタリングにより測定した。CO2生成は、排ガス中のCO2濃度の計測により測定した。エタノール生成は、CO2生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、CO2の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたCO2生成(1グラムのバイオマス当たり5.85mmolのCO2)および酢酸形成に伴うCO2を差し引いたものに等しいと想定した。
[IMW061によるグルコースおよびアラビノースの嫌気的同時消費]
株IMW061を、20g l−1のグルコースおよび20g l−1のアラビノースを有するMY培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、HPLC計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびOD660のモニタリングにより測定した。CO2生成は、排ガス中のCO2濃度の計測により測定した。エタノール生成は、CO2生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、CO2の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたCO2生成(1グラムのバイオマス当たり5.85mmolのCO2)および酢酸形成に伴うCO2を差し引いたものに等しいと想定した。
[BAMにおける性能試験]
株IMW060およびIMW061の性能を試験するため、株を、2%のグルコースを補給したVerduyn培地において植菌した。対照として、株DS62504を含めた。
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Claims (12)
- 酵母細胞由来でない1つ以上のペントース代謝経路の1つ以上の外因性遺伝子を含む酵母細胞であって、前記酵母細胞由来のhxk1、hxk2、glk1およびgal1の破壊を有する酵母細胞。
- 前記酵母細胞は、グルコース消費能を回復するために、再導入されたhxk1、hxk2、glk1およびgal1遺伝子の1つ以上を含む、請求項1に記載の酵母細胞。
- ペントース発酵酵母細胞を調製する方法であって、ペントース代謝経路の1つ以上の外因性遺伝子を含む酵母細胞を、前記酵母細胞由来の遺伝子hxk2の破壊に供し、得られた破壊体株を、前記酵母細胞が単独の炭素源としてのペントース上で0.05h−1以上の生育速度を有するまで進化工学に供してペントース消費を改善し、得られたペントース発酵酵母細胞を単離し、得られた酵母細胞において、hxk1、hxk2、glk1およびgal1遺伝子の1つ以上を導入してそのグルコース消費能を回復する方法。
- 破壊体株は請求項1に記載の酵母細胞である、請求項3に記載の方法。
- 請求項3または4に記載の方法により得られる、嫌気的同時ペントースおよびグルコース消費をし得る、ペントースおよびグルコース発酵サッカロマイセス(Saccharomyces)細胞。
- 請求項5に記載のペントースおよびグルコース発酵酵母細胞をペントースおよびグルコース含有材料中で、好適な発酵条件下でペントースおよびグルコースの発酵生成物への発酵を可能とするために十分な期間培養する工程を含む、ペントースの発酵から発酵生成物を生成する方法であって、前記酵母細胞は、ペントースを発酵して発酵生成物を対応する野性型酵母と比べて高いレベルにおいて生成する方法。
- 発酵時間は、対応する野性型酵母の発酵と比べて低減される、請求項6に記載の方法。
- 発酵時間は、40%以上低減される、請求項7に記載の方法。
- ペントースおよびグルコースを同時に発酵する、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 全体エタノール生成速度は、対応する野生型酵母を用いる方法のそれよりも少なくとも20%高い、請求項9に記載の方法。
- 前記ペントース含有材料は、リグノセルロース材料の加水分解物を含む、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記加水分解物は、リグノセルロース材料の酵素加水分解物である、請求項11に記載の方法。
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