KR20110106468A - 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 배아체 및/또는 신경 줄기세포의 배양방법 - Google Patents

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Abstract

인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화시키는 방법이 제공되는 바, 해당 방법은 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 배아체를 제조하는 단계; 및 LIF를 포함하는 배지에서 상기 배아체를 배양하여 신경 줄기세포로 분화시키는 단계를 포함하므로, 상기 신경 줄기세포를 해당 신경 줄기세포의 다수의 2차 배양 후 체외에서 분화시키는 것이 가능하게 되면, 이는 신경원으로 주로 분화되지만 아교세포로는 실질적으로 분화되지 않는다.

Description

인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 배아체 및/또는 신경 줄기세포의 배양방법{CULTURE METHOD OF EMBRYOID BODIES AND/OR NEURAL STEM CELLS DERIVED FROM HUMAN DIFFERENTIATED CELL-DERIVED PLURIPOTENT STEM CELLS}
본 발명은 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 배아체(embryoid bodies) 및/또는 신경 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.
근년, Oct3/4 유전자, Sox2 유전자, Klf4 유전자 및 c-myc 유전자가 도입되어 발현되는 섬유아세포(fibroblast) 등과 같은 체세포로부터 Fbxo15 유전자를 발현하는 세포를 선택함으로써 배아 줄기세포(이하 "ES 세포"라 칭함)와 유사한 다능성을 지니는 세포를 얻는 것이 가능해졌다(국제 특허 출원 공보 WO2007/069666; Takahashi K, and Yamanaka S. (2006) Cell 126:663-676). 이와 같이 해서 얻어진 체세포로부터 유래된 다능성 줄기세포가 재생 의학에 이용될 경우, 환자의 세포는 환자 자신에게 이식될 수 있으므로, 거부 문제가 ES 세포를 사용할 때보다 작아지게 되는 것으로 여겨진다.
마커로서 Fbxo15 유전자를 이용해서 확립된 체세포-유래 다능성 줄기세포(이하, "유도 다능성 줄기세포" 또는 "iPS 세포"라 칭함)는 세포 형태학, 증식 능력, 분화 능력 등의 관점에서 배아 줄기세포와 밀접하게 유사하였지만, 상기 다능성 줄기세포는 유전자 발현 및 DNA 메틸화 패턴 등과 같은 몇몇 특성에 있어서 ES 세포와 달랐다. 따라서, 상기 세포는 나노그 유전자(Nanog gene)의 발현을 마커로서 이용함으로써 선택되고, ES 세포와 더욱 유사한 다능성을 지니는 iPS 세포가 확립되었다(Okita K, Ichisaka T, and Yamanaka S. (2007) Nature 448:313-317).
그 후, iPS 세포는 Fbxo15 유전자 혹은 나노그 유전자의 발현 대신에 마커로서 세포 형태의 변화를 이용해서 단리되었다(Meissner A, Wernig M, and Jaenisch R. (2007). Nat Biotechnol 25:1177-1181). iPS 세포는 또한 c-myc 대신에 N-myc를 이용해서 확립되었다(Blelloch R, Venere M, Yen J, Ramalho-Santos M. (2007) Cell Stem Cell 1:245-247). 또, 인간뿐만 아니라 마우스에서도, iPS 세포는, c-myc 유전자를 이용하는 일없이, Oct3/4, Sox2 및 Klf4의 세 유전자를 도입함으로써 확립되었다(Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, and Yamanaka S. (2008). Nat Biotechnol 26:101-106; Wernig M, Meissner A, Cassady JP, and Jaenisch R. (2008) Cell Stem Cell 2:10-12). 또한, iPS 세포는, 섬유아세포 이외에, 간세포 및 위 상피세포로부터 확립되었다(Aoi T, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, and Yamanaka S. (2008) Science (February 14, 2008)(온라인 공개)).
한편, 인간 세포를 이용한 신체 성장 연구도 있었다. 인간 iPS 세포는 Oct3/4, Sox2, Nanog 및 lin28의 네 유전자를 섬유아세포에 도입함으로써 확립되었다(Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, and Thomson JA. (2007) Science 318:1917-1920). 유전자들(예컨대, Oct3/4 유전자, Sox2 유전자, Klf4 유전자 및 c-myc 유전자)의 동일한 조합은 마우스 iPS 세포의 확립에 이용되었다(Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, and Yamanaka S.(2007) Cell 131:861-872).
iPS 세포는 치료 대상 환자로부터 유래된 세포를 이용해서 생산될 수 있으므로, 거부로부터 자유롭게 된 인공 기관 등이 재생 의학 분야에서 iPS 세포를 이용함으로써 생산될 것으로 기대되고 있다.
본 발명의 목적은 신경 줄기세포의 신경원 분화에 적절한, iPS 세포로부터 유래된 배아체 및/또는 신경 줄기세포의 배양 조건을 개발하는 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 배아체 및/또는 상기 배아체로부터 유래된 신경 줄기세포를 배양하기 위한 배양제는 LIF를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 배아체를 신경 줄기세포로 분화시키는 방법은, LIF를 포함하는 배지에서 상기 배아체를 배양하여 신경 줄기세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 LIF를 포함하는 배지에서 상기 신경 줄기세포를 2차 배양하는(subculturing) 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 신경 줄기세포를 배양하는 방법은, LIF를 포함하는 배지에서 상기 신경 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 신경 손상을 치료하기 위한 의약을 제조하는 방법으로서, 상기 의약은 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 신경 줄기세포를 포함하며, 상기 방법은 LIF를 포함하는 배지에서 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 배아체를 배양하여 신경 줄기세포로 분화시키는 단계; 및 상기 신경 줄기세포를 이용해서 상기 의약을 제조하는 단계를 포함한다. 이 방법은 LIF를 포함하는 배지에서 상기 신경 줄기세포를 2차 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 신경 손상을 치료하기 위한 의약을 제조하는 방법으로서, 상기 의약은 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 신경 줄기세포를 포함하며, 상기 방법은 LIF를 포함하는 배지에서 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 신경 줄기세포를 배양하는 단계; 및 상기 신경 줄기세포를 이용해서 상기 의약을 제조하는 단계를 포함한다.
상기 실시형태의 어느 하나에 있어서, 상기 LIF의 농도는 바람직하게는 10 내지 100 ng/㎖이다.
== 관련 출원에 관한 교차 참조 ==
본 출원은 미국 특허 가출원 제61/206711호(출원일: 2009년 2월 3일)에 대한 우선권의 이득을 주장하며, 이 기초 출원은 참조로 본원에 포함된다.
도 1a는 본 발명의 일례에 있어서 인간 iPS 세포로부터 유래된 신경구(neurosphere)의 형태를 나타낸 현미경 사진;
도 1b는 본 발명의 일례에 있어서 인간 iPS 세포로부터 유래된 신경구의 분화 능력을 나타낸 현미경 사진;
도 2는 본 발명의 일례에 있어서 인간 iPS 세포로부터 유래된 신경구에서의 미분화 세포의 존재를 조사하기 위한 FACS 분석 결과를 나타낸 도면(적색 선은 음성 대조군을 나타냄);
도 3은 이식된 마우스의 BBB 스코어에 의해 평가된 운동 기능 분석 결과를 나타낸 그래프;
도 4는 본 발명의 일례에 있어서 LIF가 첨가되거나 첨가되지 않은 채 배양된, 인간 iPS 세포로부터 유래된 1차, 2차 및 3차 신경구의 분화 능력을 나타낸 현미경 사진;
도 5는 본 발명의 일례에 있어서 LIF가 첨가되거나 첨가되지 않은 채 배양된, 인간 iPS 세포로부터 유래된 1차, 2차 및 3차 신경구의 형태를 나타낸 현미경 사진;
도 6은 본 발명의 일례에 있어서 LIF가 첨가된 채 배양된, 인간 iPS 201B7 세포로부터 유래된 3차 신경구로부터 분화된 신경원의 아형(subtype)을 나타낸 현미경 사진.
== 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포 ==
인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포는 난세포(egg cell), 정자 세포 및 그들의 전구체 세포, 예컨대, 난조세포 혹은 정조세포 등의 생식 세포 이외의 분화 세포, 또는 배아 줄기세포 등과 같은 발달의 초기 단계에서 배아로부터 유래된 미분화 세포를 리프로그래밍(reprogramming)함으로써 인공적으로 유도된, 다능성 및 자체-재생 능력을 지니는 인간 세포에 관한 것이다. 분화 세포는 배아, 태아 혹은 성체로부터 유래될 수 있다. 분화 세포의 특징은 세포가 수정란 혹은 ES 세포가 지니고 있는 고유한 전능성(totipotency)을 세포가 적어도 부분적으로 손실하는 한 특히 제한되지 않는다. 이러한 분화 세포의 예로는 섬유아세포, 상피세포, 간세포 등을 들 수 있다.
분화 세포를 리프로그래밍하는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 핵 리프로그래밍 인자의 세포에의 도입은 다능성 및 자체-재생 능력을 지니도록 리프로그래밍을 유도하는 것이 바람직하다. 예를 들어, Takahashi 등(NPL 8)에 기재된 바와 같은 리프로그래밍 방법은 리프로그래밍을 위해 이용될 수 있다. 이 공보는 참조로 본 명세서에 포함된다.
핵 리프로그래밍 인자는 특별히 제한되지 않지만, Oct 유전자군, Klf 유전자군 및 Sox 유전자군의 각각의 하나의 일원으로부터 선택된 유전자의 산물의 배합이 바람직하다. iPS 세포의 확립의 효능의 관점에서, myc 유전자군의 하나의 일원의 유전자 산물을 더 함유하는 조합이 더욱 바람직하다. Oct 유전자군에 속하는 유전자로는 Oct3/4, Oct1A, Oct6 등을 포함하고; Klf 유전자군에 속하는 유전자로는 Klf1, Klf2, Klf4, Klf5 등을 들 수 있으며; Sox 유전자군에 속하는 유전자로는 Sox1, Sox2, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17, Sox18 등을 들 수 있고; myc 유전자군에 속하는 유전자로는 c-myc, N-myc, L-myc 등을 들 수 있다. 몇몇 경우에, myc 유전자군의 유전자 산물은 SCF, bFGF 등과 같은 사이토카인, 또는 아자시티딘, 발프로산 나트륨(sodium valproate; VPA) 등과 같은 화학적 화합물로 치환되어 있을 수 있다.
상기 조합 이외의 핵 리프로그래밍 인자의 예로는 Oct 유전자군로부터의 유전자 및 Sox 유전자군으로부터의 유전자에 부가해서 나노그 유전자 및 lin-28 유전자를 함유하는 조합을 들 수 있다. 단, 이러한 인자를 세포 내로 도입할 경우, 다른 유형의 유전자 산물이 전술한 조합에 있어서의 유전자들에 부가해서 도입될 수 있다. 이러한 유전자 산물의 예로는 TERT 등과 같은 불사화-유도 인자(immortalization-inducing factor)를 들 수 있다.
전술한 유전자의 모두가 척추동물 중에서 고도로 보존되므로, 여기에서 지칭하는 유전자는 특정 동물명이 지칭되는 경우를 제외하고 그의 동종 유전자(homologue) 및 상동 유전자(orthologue)를 포함한다. 또한, 다형성 유전자를 포함하는 변이 유전자는 야생형 유전자 산물의 것에 견줄만한 기능을 지니는 한 역시 포함된다.
== 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포를 제조하는 방법 ==
핵 리프로그래밍 인자를 이용해서 인간 분화 세포-유래 다능성 세포를 제조하기 위하여, 핵 리프로그래밍 인자가 세포 내에서 기능하는 단백질인 경우에, 단백질을 코드화하는(encoding) 유전자는 발현 벡터 내에 편입되는 것이 바람직하며, 이는 체세포 등과 같은 표적 분화 세포 내에 도입되므로, 해당 단백질은 세포내 발현된다(유전자 전달 방법). 이용되는 발현 벡터는 특별히 제한되지 않지만, 바이러스 벡터가 바람직하고, 레트로바이러스 벡터 혹은 렌티바이러스 벡터가 특히 바람직하며, 센다이 바이러스 벡터(Sendai virus vector)가 가장 바람직하다. 핵 리프로그래밍 인자는 단백질 전달 영역(protein transduction domain: PTD)이라 불리는 펩타이드를 배지에 첨가되는 단백질에 결합함으로써 세포 내로 도입될 수 있다(단백질 전달 방법). 단백질이 세포외로 분비될 경우에, 상기 인자는 분화 세포-유래 다능성 줄기세포의 제조 동안 분화 세포의 배지에 부가될 수 있다. 상기 인자가 리프로그래밍될 분화 세포에서 발현된다면, 외부로부터 도입될 필요는 없다. 또한, 특정 핵 리프로그래밍 인자의 기능을 위해 치환될 수 있는 화학적 화합물이 존재한다면, 핵 리프로그래밍 인자 대신에 이용될 수 있다. 해당 화학적 화합물로는 트라닐사이프로민, CHIR99021, SB431542, PD0325901, 티아조비빈 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
다음에, 핵 리프로그래밍 인자가 도입되는 분화 세포에서, 그들의 미분화 상태를 유지하는 세포의 콜로니 또는 Fbxo15 유전자 혹은 나노그 유전자 등과 같은 미분화 마커 유전자를 발현하는 세포의 콜로니는 세포가 살아서 유지되는 동안 선택되어 단리될 수 있다. 대안적으로, 분화 세포는 레트로바이러스 벡터와 코-트랜스펙션(co-transfection)되어 GFP(green fluorescent protein) 혹은 dsRed(red fluorescent protein)를 마커로서 발현하고 나서, 해당 마커의 발현이 없는 세포의 콜로니가 선택될 수 있다.
상기 마커의 어느 하나를 이용함으로써, 미분화 상태를 리프로그래밍하여 유지하는 세포가, 핵 리프로그래밍 인자가 도입된 인간 분화 세포로부터 선택되어 단리될 수 있고, 확립된 세포 모집단은 인간 분화 세포-유래 다능성 세포로서 이용될 수 있다.
== 신경 손상을 치료하기 위한 의약 ==
분화 세포-유래 다능성 세포는 신경 손상을 치료하기 위한 의약을 제조하는 데 이용될 수 있다. 신경 손상을 치료하기 위한 의약 제제(약제)를 제조하는 방법은 Okada 등(Okada Y, Matsumoto A, Shimazaki T, Enoki R, Koizumi A, Ishii S, Itoyama Y, Sobue G, Okano H. (2008) Stem Cells. vol. 26, pp.3086-98)(이 문헌은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 바와 같이, 신경 손상을 치료하기 위한 제제로서 배아 줄기세포를 이용하는 것을 개발한 방법에 기초할 수 있다.
신경 손상을 치료하기 위한 약제는 인간 분화 세포-유래 다능성 세포에 부가해서, 염을 함유하는 완충 용액 및/또는 항생제 등과 같은 다른 성분을 함유할 수 있다. 치료의 표적으로서의 신경 조직은 특별히 제한되지 않지만, 이것은 뇌 혹은 척수 등과 같은 중추신경계 또는 말초신경계이다. 또한, 치료 대상 질환은 임의의 특별한 증상으로 제한되지 않고, 척수 손상 등과 같은 외상성 질환; 근위축 측삭 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상 마미, 헌팅톤병, 다계통 위축(multiple system atrophy) 및 척수소뇌 변성 등과 같은 신경변성 질환; 뇌경색증, 뇌내 출혈 등으로부터 기인하는 신경 세포의 괴사를 포함하며, 또한, 임의의 특별한 원인으로 제한되지 않고, 신경 세포가 손상되는 질환 혹은 병리 상태인 한, 손상, 뇌경색증 등과 관련된 주된 원인 및 감염, 종양 등과 관련된 이차적인 원인을 포함한다.
인간 분화 세포-유래 다능성 세포는 그대로 인간에게 투여될 수 있지만, 신경 세포로 분화하는 능력을 증강시키기 위하여, 배아체(EB)가 형성되고 나서 투여될 수도 있다. EB는 바람직하게는 신경 줄기세포를 포함한다. EB 내의 신경 줄기세포는 투여 전에 해당 신경 줄기세포를 증식시키는 배양 조건에서 증폭되는 것이 더욱 바람직하다.
EB가 인간 분화 세포-유래 다능성 세포로부터 형성되는 배양용의 배지는 제한되지 않고, KSR(Knockout Serum Replacement), NEAA(non-essential amino acid) 및 2-ME(2-mercaptoethanol)를 함유하는 DMEM/F12 배지일 수 있다. KSR, NEAA 및 2-ME의 농도는 제한되지 않지만, 각각 5% 이하, 0.1mM 및 0.1mM인 것이 바람직하다. 형성된 EB는 신경구의 형태로 신경 줄기세포로 분화시키기 위하여 FGF-2(10 내지 100 ng/㎖)가 보충된 혈청 무첨가 배지 등과 같은 분화 배지에서 배양될 수 있다. 신경구의 배지는 제한되지 않지만, FGF-2(10 내지 100 ng/㎖)가 보충된 동일한 혈청-무첨가 배지가 신경구를 배양하는데 이용될 수 있다. 1차 신경 줄기세포를 포함하는 1차 신경구는 배양 접시 상에 이들을 분산시켜 재배치함으로써 2차 배양될 수 있으므로, 이들은 증식되어 2차 신경 줄기세포를 포함하는 신경구를 형성할 수 있고; 이 2차 배양 공정은 고차(higher-order) 신경 줄기세포를 포함하는 고차 신경구를 만들기 위하여 반복될 수 있다. 이와 같이 해서 형성된 신경 줄기세포는 바람직하게는 신경구의 분산 후 인간에게 투여될 수 있다. 투여될 신경 줄기세포는 체외(시험관내)에서 아교 세포(glial cell)로 분화되는 능력을 지닐 수 있거나 지니지 않을 수 있다. LIF는 EB 및 신경 줄기세포 중 어느 한쪽 혹은 양쪽 모두를 위한 배지에 첨가될 수 있고, 그의 적절한 농도는 당업자에 의해 결정될 수 있지만, 1 ng/㎖ 이상이 바람직하고, 5 ng/㎖ 이상이 더욱 바람직하며, 10 ng/㎖ 이상이 가장 바람직하고; 1000 ng/㎖ 이하가 바람직하며, 500 ng/㎖ 이하가 더욱 바람직하고, 100 ng/㎖ 이상이 가장 바람직하며; 1 내지 1000 ng/㎖가 바람직하고, 5 내지 500 ng/㎖가 더욱 바람직하며, 10 내지 100 ng/㎖가 가장 바람직하다.
EB 또는 신경 줄기세포는 LIF가 없는 배지에서 배양될 경우, 신경 줄기세포는 신경원 세포(neuronal cell) 및 아교 세포로의 분화 잠재성(differentiation potential)이 얻어진다. 그러나, EB 및 신경 줄기세포가 LIF를 지닌 배지에서 배양될 경우, 신경 줄기세포는 주로 신경원 세포로의 분화 잠재성을 지니지만 아교 세포로의 분화 잠재성은 실질적으로 없다. LIF를 지닌 배양 조건에서, 신경 줄기세포를 수회 2차 배양한 후에도, 신경 줄기세포는 체외에서 주로 신경원 세포로 분화되지만 실질적으로 아교 세포로 분화되지 않는 분화 잠재성을 여전히 유지한다. 신경 줄기세포는 CNS에서 그들의 발달 동안 팽창 상, 신경발생 상 및 아교발생 상을 이 순서로 경험하는 것이 공지되어 있다(Temple, S., Nature vol.414. p.112-117, 2001). 따라서, 신경 줄기세포는 LIF의 존재 하에 배양됨으로써 체외에서 그들의 유년기(young stage)의 그들의 분화 잠재성을 유지할 수 있다. 또, 이와 같이 해서 얻어진 신경 줄기세포로부터 유래된 신경원 세포는 TH-양성 신경원 혹은 Isl-양성 신경원 등과 같은 조기에 생긴(early-born) 신경원들을 포함하며, 이들은 LIF 없이 배양된 신경 줄기세포로부터 유래된 것 혹은 임신 중기 후의 태아로부터 얻어진 것에 일반적으로 포함되어 있지 않다(Nature neurosci. vol.11, p.1014-1023, 2008). 이것은 LIF의 존재 하에 그들의 유년기의 그들의 잠재성을 유지할 수 있다는 사실과 일치한다. 또한, LIF를 첨가해서 배양된 신경 줄기세포는 LIF 없이 배양된 것보다 평균적으로 보다 큰 신경구를 형성하는데, 이는 전자가 후자보다 양호하게 성장하기 때문인 것으로 여겨진다.
신경 줄기세포의 체외 분화 방법은 특별히 제한되지 않고, 신경구는 임의의 공지된 분화-유도 배지에서 배양될 수 있고, 그 바람직한 예는 글루코스, 글루타민, 인슐린, 트랜스페린, 프로게스테론, 푸트레신 및 염화셀렌이 보충된 DMEM:F-12 배지(즉, FGF 및 헤파린 없이 신경 줄기세포를 증식하기 위한 배지)이다. 이러한 헤지호그 단백질(hedgehog protein)은 그 안에 존재하거나 혹은 부재할 수도 있다. 세포들은 5 내지 7일 동안 35 내지 40℃에서 5% CO2의 조건 하에 배양되는 것이 바람직하다.
분화 세포-유래 다능성 세포, EB 세포 혹은 신경 줄기세포는 직접 혹은 간접적으로 투여될 수 있다. 직접 투여를 위하여, 세포들은 예를 들어 신경 손상 부위로 이식될 수 있다. 간접 투여를 위하여, 세포들은 정맥내 혹은 척수내로 주입되어 혈액 혹은 뇌척수액의 순환을 통해서 해당 병에 걸린 부위로 전달될 수 있다.
실시예
== 세포 ==
이 예에서, 분화 세포-유래 다능성 세포는 핵 리프로그래밍 인자로서 Oct3/4, Sox2 및 Klf4의 조합을 인간 배아 섬유아세포로 도입함으로써 얻어진 세포(253G4, 253G1) 또는 핵 리프로그래밍 인자로서 Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4의 조합을 인간 배아 섬유아세포로 도입함으로써 얻어진 세포(201B7, 201B6)였고(Yu J et al. (2007). Science 318:1917-1920; Nakagawa M et al., (2008). Nat Biotechnol vol.26, p.101-106.), 이들은 모두 교토 대학에서 제공되었다. 대조군에 대해서는, 인간 ES 세포(KhES1)(Suemori H et al., (2006), Biochem. and Biophys. Res. Commun. vol.345, p.926-932.)가 이용되었다.
<실험 1> 신경 줄기세포의 제조
신경 세포로 분화시키기 위한 이들 세포의 능력을 증강시키기 위하여, 배아체(EB)들은 30일간 박테리아-배양 접시에서 5% KSR가 보충된 배아-배지를 지닌 현탁액에 분화 세포-유래 다능성 세포를 배양함으로써 만들었다. 이어서, 형성된 이들 EB는 FGF-2(20 ng/㎖) 및 LIF(10 ng/㎖)가 보충된 혈청-무첨가 배지에 분산되어 배양되었다. 12일째에, EB들로부터 유래된 세포가 신경구를 형성하였고, 이것은 1차 신경구 혹은 iPS-PNS라 불린다. 이들 iPS-PNS를 해리시켜 동일 조건 하에서 반복해서 재차 신경구를 만드는 것이 가능하였다. 본 명세서에서, 적어도 1회 2차 배양된 신경구는 일괄해서 고차 신경구라 칭하고; 구체적으로는, (N-1)회 2차 배양된 신경구는 N차 신경구라 칭한다.
광학 현미경 하에 관찰된 신경구의 형태 화상을 나타내는 도 1a에 도시된 바와 같이, 신경구는 1차 신경구로서 형성되었고, 2회 2차 배양된 후는 3차 신경구, 5회 2차 배양된 후에는 6차 신경구로서 형성되었다.
이와 같이 해서 형성된 1차 내지 3차 신경구는 TrypLE Select(또는 트립신 용액)에 의한 처리 및 피펫팅에 의해 분산시키고, 폴리-L-오르니틴 및 피브로넥틴으로 이중 코팅되고 또한 분화-유발 배지가 충전된 배양 접시에 파종시켜, 7 내지 12일 동안 배양함으로써 분화시켰다. 분화-유발 배지에 대해서는, 글루코스, 글루타민, 인슐린, 트랜스페린, 프로게스테론, 푸트레신 및 염화셀렌이 보충되고 또한 B27 보충제가 2% 첨가된 DMEM:F-12 배지(즉, FGF 및 헤파린 없이 신경 줄기세포를 증식시키기 위한 배지)가 이용되었고, 상기 세포는 10일간 35 내지 40℃에서 5% CO2의 조건 하에 배양되었다. 이 검체는 이어서 신경원용 마커(녹색 형광으로 표시됨)인 베타 III-튜불린에 대한 항체(마우스 IgG, SIGMA T8660, 1000배 희석), 별아교세포(astrocyte)용 마커(적색 형광으로 표시됨)인 GFAP에 대한 항체(래비트 IgG, DAKO ZO334, 4000배 희석)를 이용해서 면역염색되었고, 그리고 세포 형태 및 염색은 형광 현미경 하에 관찰되었다. 훽스트(Hoechst) 33258을 이용해서 세포핵을 대비 염색하였다(청색 형광으로 표시됨).
도 1b에 나타낸 바와 같이, 1차 내지 3차 신경구로부터, 실질적으로 단지 신경원만이 분화되었고, 아교 세포는 분화되지 않았다. 인간 iPS 세포의 이러한 특징은 마우스 iPS 세포의 것과는 상당히 상이하다. 마우스 세포의 경우, 1차 신경구가 동일한 분화 조건 하에 배양되면, 신경원만이 인간 세포와 마찬가지로 분화된다. 그러나, 적어도 한번 2차 배양된 마우스로부터의 고차 신경구가 동일 배양 조건 하에 세팅될 경우에는, 신경원뿐만 아니라 아교 세포도 분화된다.
<실험 2> 신경구에서의 미분화 세포의 존재
인간 iPS 세포로부터 유래된 3차 신경구(이하, iPS-TNS라 칭함)에서는 어떠한 미분화 세포도 발견되지 않았음이 이하에 표시되어 있다.
상기 3차 신경구는 TrypLE Select(또는 트립신 용액)에 의한 처리 및 피펫팅에 의해 분산시키고, 미분화 세포 내에 발현된 세포 표면 항원에 대한 항체(TRA-1-60, TRA-1-81, CD56 또는 CD133)는 FACS 분석을 위하여 적용되었다. BD Inc.에서 구매한 항체 TRA-1-60-PE, TRA-1-81-PE 및 CD56-Alexa488는 50 ul 중 1×106 세포에 대해서 5 ul로 사용되었고, Milteny Biotech inc.에서 구입한 항체 CD133-APC는 50 ul 중 1×106 세포에 대해서 2 ul로 사용되었다. 도 2에 도시된 바와 같은 결과에서, TRA-1-60 및 TRA-1-81의 발현은 인간 ES 세포와 마찬가지로 인간 iPS 세포로부터 유래된 3차 신경구에서 관찰되었다. 또한, 거의 모든 세포가 신경 줄기세포용의 마커인 CD56을 발현하였다.
이제까지 설명한 바와 같이, 인간 iPS 세포로부터 제조된 고차 신경구는 오염이 존재하더라도 미분화 세포를 전혀 지니지 않거나 단지 약간만 지니므로, 종양발생의 위험을 낮춘 것으로 인해 세포 이식에 유용하다.
<실험 3> 척수-손상된 마우스의 준비, 해당 마우스에의 세포 이식 및 이식된 마우드들의 분석
이 예에서, 척수 손상된 모델 마우스들은 10번째 등뼈(흉추) 레벨에서 척수 신경의 외상성 척수 손상을 유발함으로써 만들어졌고, 이하에 기재된 바와 같이, 회복 증가를 입증하기 위하여 인간 iPS 세포로부터 유래된 3차 신경구의 이식을 위해 이용되었다.
우선, 8 내지 9주령의 NOD/SCID 암컷 마우스(체중 20 내지 22g)를 케타민(100 ㎎/㎏)과 자일라진(10 ㎎/㎏)으로 마취시켰다. 10번째 등뼈의 척추후궁절제 후, 경질막의 등쪽면을 노출시키고, 인피니트 호라이존 임펙터(Infinite Horizon Impactor)(60 kdyn; 미국의 일리노이주의 켄터키시에 소재한 Precision Systems)를 이용해서 외상 척수 손상을 발생시켰다.
손상된 척수에 세포를 이식하기 위하여, 손상 부위는 손상 후 9일째에 재차 노출되었다. 5×105 세포/2ul의 세포가 정위 인젝터(stereotaxic injector)(KDS310, 일본 도쿄토에 소재한 Muromachi-kikai) 상에 장착된 유리제의 마이크로피펫을 이용해서 0.5 ul/min의 속도로 해당 병변 영역의 중앙에 도입되었다. 이 예에서, iPS-TNS용의 253G1 및 201B7의 클론, 그리고 ES-SNS용의 KhES1의 클론이 이용되었고, 그들의 각각의 신경구를 그들의 이식 전에 부분적으로 분리시켰다. 대조군으로서, PBS(비히클)이 상기 세포 이식과 동일한 방법으로 주입되었다.
뒷다리의 운동 기능은 42일까지 매 7일마다 BBB(Basso-Beattie-Bresnahan) 스코어(NPL 12)로 평가되었다. 그 결과는 도 3에 표시되어 있다.
4개의 군 모두에 있어서, 마우스들은 척수 손상의 유도 직후에 완전히 마비되었지만, 이들은 모두 점차적으로 회복되었다. 그러나, 수술로부터 3주 후, 세포가 없는 배지만을 주입한 군으로부터는 유의한 차이가 있었지만, BBB 스코어를 비교함으로써 iPS-TNS 및 SNS-이식된 군의 양쪽 모두에서 동일한 정도의 회복이 관찰되었다. 또한, 임상적 관찰에서, iPS-TNS-이식된 마우스들은 체중을 지지하는 발걸음을 하기에 충분한 현저한 회복을 보였다.
결론적으로, 척수-손상 마우스의 신경 손상은 체외에서 아교 세포로 분화되지 않은 상태에서도 인간 iPS 세포로부터 유래된 신경구를 이식함으로써 치료될 수 있다.
<실험 4> LIF 를 이용하거나 이용하지 않은 EB 로부터 분화된 신경구들 간의 분화 및 증식 특성의 비교
1차, 2차 및 3차 신경구가 형성되었고, 이들은 신경 세포로 분화되었으며, 그들의 세포 형은 실험 1에 기재된 방법에 따라 분석되었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 3개의 클론 모두에서, 녹색 형광으로 표시된 신경원은 LIF가 있든지 없든지 간에 분화된 반면, 적색 형광으로 표시된 별아교세포는 LIF 없이 분화되었지만 LIF를 첨가한 경우에는 분화되지 않았다. 이와 같이 해서, LIF를 첨가한 배지에서 EB 및 신경구를 배양함으로써, 2차 배양된 신경구는 아교 세포로가 아니라 실질적으로 단지 신경원으로만 분화될 수 있는 분화 잠재성을 유지한다.
단, 신경구는 LIF 없이 배양된 것보다 LIF를 첨가한 배지에서 더욱 신속하게 성장한다. 201B7을 이용한 예는 도 5에 표시되어 있다. LIF를 첨가하여 배양된 신경구가 일반적으로 LIF 없이 배양된 것보다 크다는 것은 명확하다.
<실험 5> LIF -함유 배지에서 배양된 고차 신경구로부터 분화되는 신경원의 아형들
인간 iPS 클론 201B7 및 인간 ES 클론 KhES1(대조군)의 3차 신경구가 형성되었고, 이들은 신경세포로 분화되었으며, 아형들은 실험 1에 기재된 방법에 따라서 마커 항체를 이용해서 분화된 신경원에 대해서 분석되었다. 이 실험에 사용된 항체는 항-Islet-1(39.4D5, 마우스 IgG2b, 1:200, Developmental Studies of Hybridoma Bank: DSHB), 항-베타 III-튜불린(SIGMA T8660, 마우스 IgG2b, 1:1000), 항-CNPase(SIGMA C5922, 마우스 IgG1, 1:1000), 항-GFAP(토끼 IgG, DAKO ZO334, 토끼 IgG, 1:4000), 항-TH-1(Chemicon AB152, 토끼 IgG, 1:100)이다. CNPase 및 GFAP는 각각 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 및 별아교세포용의 아교세포 마커이고, Islet-1 및 TH-1는 조기에 생긴 신경원용의 마커이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 거의 모든 분화 세포는 베타 III-튜불린-양성 신경원 세포이고, CNPase- 혹은 GFAP-양성 아교 세포는 3차 신경군으로부터 분화되지 않았다. 신경원 세포의 아형에 대해서, Islet-1- 또는 TH-1-양성 신경원이 분화되었고, 이것은 해당 분화된 신경원이 조기에 생긴 유형의 신경원인 것을 나타낸다.
신경 줄기세포의 신경원 분화에 적합한, 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 배아체 및/또는 신경 줄기세포의 배양 조건이 본 발명에 의해 개발되었다.

Claims (10)

  1. 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포(human differentiated cell-derived pluripotent stem cells)로부터 유래된 배아체(embryoid bodies) 및/또는 상기 배아체로부터 유래된 신경 줄기세포를 배양하기 위한 배양제로서,
    LIF를 포함하는 배양제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 LIF의 농도가 10 내지 100 ng/㎖인 것인 배양제.
  3. 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 배아체를 신경 줄기세포로 분화시키는 방법으로서,
    LIF를 포함하는 배지에서 상기 배아체를 배양하여 신경 줄기세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 배아체의 신경 줄기세포로의 분화방법.
  4. 제3항에 있어서, LIF를 포함하는 배지에서 상기 신경 줄기세포를 2차 배양하는(subculturing) 단계를 더 포함하는, 배아체의 신경 줄기세포로의 분화방법.
  5. 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 신경 줄기세포를 배양하는 방법으로서,
    LIF를 포함하는 배지에서 상기 신경 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 신경 줄기세포의 배양방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LIF의 농도가 10 내지 100 ng/㎖인 것인 방법.
  7. 신경 손상을 치료하기 위한 의약을 제조하는 방법으로서,
    상기 의약은 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 신경 줄기세포를 포함하며,
    상기 방법은
    LIF를 포함하는 배지에서 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 배아체를 배양하여 신경 줄기세포로 분화시키는 단계; 및
    상기 신경 줄기세포를 이용해서 상기 의약을 제조하는 단계를 포함하는, 신경 손상 치료용의 의약의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, LIF를 포함하는 배지에서 상기 신경 줄기세포를 2차 배양하는 단계를 더 포함하는, 신경 손상 치료용의 의약의 제조방법.
  9. 신경 손상을 치료하기 위한 의약을 제조하는 방법으로서,
    상기 의약은 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 신경 줄기세포를 포함하며,
    상기 방법은
    LIF를 포함하는 배지에서 인간 분화 세포-유래 다능성 줄기세포로부터 유래된 신경 줄기세포를 배양하는 단계; 및
    상기 신경 줄기세포를 이용해서 상기 의약을 제조하는 단계를 포함하는, 신경 손상 치료용의 의약의 제조방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LIF의 농도가 10 내지 100 ng/㎖인 것인 방법.
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