JP2009101188A - 注入可能な多糖類−細胞組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ゆっくりと重合する多糖類ヒドロゲルは、多数の単離された細胞を注入によって導入する手段として有用であることが示された。このゲルは、移植片化を促進し、新細胞の成長のための3次元の鋳型を提供する。得られる組織は、天然に生じる組織と組成的にも構造的にも同じである。この方法は、3次元組織障害に対する再構築のための細胞移植の注文成型、および一般的な組織移植を含む種々の再構築手法に用いられ得る。実施例は、筋肉および軟骨組織の構築を示し、それは、逆流および失禁のような障害を修復するのに有用である。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般に、内科的医療の分野における多糖類ヒドロゲル−細胞組成物を用いる領域に関する。より特定すれば、膀胱尿管逆流現象、失禁、および他の欠陥を矯正する方法に関する。
外傷性、先天性、または整形のためのものを問わず、頭蓋骨顔面輪郭奇形を矯正するには、現時点では、侵襲的な外科的方法を必要とする。さらに、増強を必要とする奇形の場合は、しばしば無生物材料人工装具の使用が必要であり、これには感染および突出という問題がある。付加的な自原性(autogenous)の軟骨または骨を頭蓋骨顔面の骨格に加える、侵襲性の最も小さい方法であれば、外科的外傷も最低限に抑えられ、また無生物材料人工装具を用いる必要もない。注入による移植を行い、単離された細胞を大量に植え付けることができれば、広域な外科手術を行わずに、頭蓋骨顔面の骨−軟骨骨格を自原性組織で増強し得る。
膀胱尿管逆流現象は、胚の発生および生育中に尿管芽(ureteral bud)が膀胱に入るため尿管芽が異常発達する状態である。膀胱の筋肉組織を通る尿管の経路が短くなるため、尿管抵抗が減少し、尿が膀胱溜めから尿管および腎臓まで逆流する結果となる。この状態では、逆行尿道移送により膀胱内に時折存在し得るバクテリアが腎臓に達し、再発性腎盂腎炎を引き起こし得る。さらに、尿の腎杯(calyces)および腎錐体(renal pyramids)中への一定の逆圧により、腎臓実質(renal parenchyma)に機械的な損傷が生じる結果となる。AtalaおよびCasale、Infections in Urology(泌尿器科学における感染)、39−43(1990年3/4月号)によって検討されたように、未治療のままでおくと、尿の膀胱尿道逆流現象は腎臓実質の損失、および、場合によっては、腎不全を引き起こし得る。1960年には、腎不全患者の70%が膀胱尿道逆流現象が主要な病因であると記載された。新しい診断および治療法の登場により、膀胱尿道逆流現象の患者は、現在では、腎不全患者集団の1%以下である。
尿失禁は、全てのGU疾患の中で、最も一般的で、そして最も治りにくい。尿失禁、または尿を保持しそして知らないうちに尿を排泄し得ないことは、2セットの筋肉の相互作用に依存する。1つは、排尿筋で、それは膀胱の外側の筋肉のコーティングを形成している縦方向の繊維の複合体である。排尿筋は、副交感神経によって活性化される。第2の筋肉は、平滑/横紋筋である膀胱括約筋である。排尿作用には、括約筋を随意に弛緩させるのと同時に膀胱の排尿筋を収縮させることが必要である。人間が加齢するに従って、括約筋を随意に制御する能力は、総体的な筋肉の状態が年齢と共に低下するのと同じように失われる。このことはまた、下半身麻痺(paraplegia)のような急激な事象が副交感神経系を「切断」し、括約筋の制御を失わせるような場合にも起こり得る。別の患者においては、尿失禁は異なるレベルの重篤度を示し、そしてレベルに応じて分類される。
ゆっくりと重合し、生体適合性であり生物分解性であるヒドロゲルが、多数の単離細胞を患者に導入して、器官等価物または軟骨のような組織を生成する手段として有用であることが示された。このゲルは、移植片化を促進し、そして新細胞の生育のために3次元の鋳型(template)を提供する。得られた組織は、天然に生じた組織と組成的にも組織学的にも同じである。一つの実施態様においては、細胞はヒドロゲル溶液に懸濁され、そして患者の部位に直接注入される。ここで、ヒドロゲルは硬化してマトリックスを形成し、マトリックス内部に細胞が分散されている。第2の実施態様において、細胞をヒドロゲル溶液に懸濁し、それを型に流し込むかまたは注入して所望の解剖学的形状を有するようにし、次いで、硬化してマトリックスを形成し、このマトリックスは、内部に細胞が分散されており患者に移植される。最終的には、そのヒドロゲルは分解され、生じた組織のみが残される。
生体適合性ポリマーの足場(scaffold)を使用する組織工学(tissue engineering)の技術は、頭蓋顎顔面(craniomexillofacial)外科で、現在使用されている補てつ材料の代替物を作製する手段、ならびに同時に、疾病の、欠損、または損傷した組織を置換する器官等価物(organ equivalent)の形成の手段として有望である。しかし、これらの足場を作製するために使用されるポリマー、例えば、ポリ酢酸(polyactic acid)、ポリオルトエステル(polyorthoester)、およびポリ無水物(polyanhydride)のようなポリマーは、成型が困難であり、かつ疎水性であるので、その結果、細胞付着性に劣る。さらに、これらのポリマーの操作はすべて、このポリマー性材料の移植に先立って行われなければならない。
細胞は、直接ドナーから、ドナーからの細胞の細胞培養から、あるいは確立された細胞培養株から得られ得る。好ましい実施態様においては、同種の、そして好ましくは免疫学的プロファイルが同じ細胞を、バイオプシーによって、患者から、または近親から得、次いでこれを、標準的条件(例えば下記の実施例1のような)を用いて、培養物がコンフルエントになるまで培養し、そして必要に応じて使用する。免疫学的に異なる個体からのヒト筋肉細胞のような免疫反応を誘発しやすい細胞を用いる場合、受容者は必要に応じて、例えば、ステロイドおよびサイクロスポリン(cyclosporine)のような他の免疫抑制剤を計画的に使用して、免疫抑制され得る。しかし、最も好ましい実施態様において、細胞はオートロガス(autologous)である。
成する他の細胞、骨芽細胞および骨を形成する他の細胞、筋肉細胞、繊維芽細胞、および器官細胞が包含される。本明細書では、「器官細胞」は、肝細胞、ランゲルハンス島細胞、腸由来の細胞、腎臓由来の細胞、および他の、主として物質を合成および分泌しまたは代謝するために作用する細胞を包含する。
細胞の移植とグラフト化(transplantation and engraftment)を促進するために、ポリマー性マトリックスは液性因子と組み合わされ得る。例えば、ポリマー性マトリックスは、血管新生促進因子、抗生物質、消炎鎮痛剤、成長因子、分化を誘導する化合物、および細胞培養の分野の当業者に公知の他の因子と組み合わされ得る。
本明細書中で記載する好ましい実施態様において、展性のある、アルギン酸カルシウム(calcium alginate)およびイオン性ヒドロゲルを形成し得るある種の他のポリマーが、細胞をカプセル化するために用いられる。このヒドロゲルはアルギン酸(alginic acid)、海草から単離された炭水化物ポリマー、のアニオン性塩をカルシウムカチオン(calcium cation)で架橋することによって製造され、この強度はカルシウムイオン濃度またはアルギネート(alginate)濃度のいずれかを増加させることによって増大する。アルギネート溶液(alginate solution)を移植する細胞と混合し、アルギネート懸濁液(alginate suspension)を形成する。次いで、この懸濁液を硬化させる前に、患者に直接、懸濁液を注入する。次いで、この懸濁液は、インビボの生理学的濃度のカルシウムの存在に依存して、短時間で硬化する。
コポリマー、ポリ(酢酸ビニル)(poly(vinyl acetate))、およびスルホン化ポリスチレン(sulfonated polystyrene)のようなスルホン化ポリマーである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはポリマーとの反応によって形成される、酸性側基を有するコポリマーもまた使用し得る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化(好ましくはフッ素化)アルコール基、フェノール性OH基、および酸性OH基である。
Amines and Ammonium Salts、E.Goethals編(Pergamen Press,Elmsford,NY 1980)を参照。ポリ(アクリル酸)のような多くのポリマーが市販されている。
チオンの濃度が高い程、または価数が高いほど、ポリマーの架橋度は高くなる。0.005Mという低濃度からポリマーを架橋させることが示されている。高濃度は、塩の溶解度によって規定される。
amine))である。これらはまた、多糖類、キトサン(chitosan)のような天然ポリカチオンである。
好ましくはこのポリマーを、水溶液、好ましくは0.1Mリン酸カリウム溶液に、生理学的なpHで、ポリマーのヒドロゲルを形成する濃度まで、例えば、アルギネート(alginate)については、0.5から2重量%の間、好ましくは1%の濃度で溶解する。単離細胞を、このポリマー溶液に1百万と5千万細胞/mlとの間、最も好ましくは1千万と2千万細胞/mlとの間の濃度に懸濁する。
本明細書中に記載した技法は、異なる多くの細胞タイプを導入し、異なる組織構造を達成するために使用し得る。好ましい実施態様においては、細胞を、ヒドロゲル溶液と混合し、そしてヒドロゲルの硬化の前に細胞を移植することが望まれる部位に直接注入する。しかし、このマトリックスはまた、特定の適用形態に適するように成型され、そして身体の1またはそれ以上の異なる領域に移植され得る。この適用は、特に、特定の構造的設計が望まれる場合、あるいは細胞が移植されるべきの領域が特定の構造または支持を有しないような場所で細胞の成長および増殖を促進させる場合に適切である。
ートの凝固は、それが分解されるまで、その移動を妨げる。懸濁液は、例えば膀胱尿管逆流または尿失禁の治療のために、膀胱鏡を用いて問題の領域に直視的に接近が可能である膀胱鏡の注射針により注入され得る。逆流および失禁の治療に対する細胞−ポリマー懸濁液の使用に加えて、この懸濁液はまた、復元手術に適用し得、生体適合性の恒久性の注入可能材料が必要である人体の任意の部位にも同様に適用され得る。この懸濁液は、内視鏡下に注入され得る。例えば、発声障害治療のための声帯への注入に対しては喉頭鏡により、あるいは患者を不妊にする方法としての輸卵管への注入に対しては子宮鏡により注入され得、あるいは直腸周囲の括約筋領域へのこの物質の注入に対しては直腸鏡により注入され、それにより括約筋の抵抗が増大し、そして患者が排便を制御できるようになる。
アルギン酸カルシウム(calcium alginate)混合物を、硫酸カルシウム(貧溶解性のカルシウム塩)を0.1Mリン酸カリウム緩衝液液(pH 7.4)に溶解された1%アルギン酸ナトリウムと合わせることによって得た。この混合物を4℃で30分間〜45分間、液体状態で保持した。子牛の前肢の関節表面から単離された軟骨細胞を、混合物に添加して、1×107/mlの最終細胞密度(ヒト児童の関節軟骨の約10%の細胞密度を表す)を生成させた。
子牛の前肢の関節表面から単離された軟骨細胞の数を変えて、1.5%アルギン酸ナトリウム溶液と混合し、0.0、0.5、1.0、および5.0×106軟骨細胞/mlの最終細胞密度(ヒト児童の関節軟骨の約0.0、0.5、1.0、および5.0%の細胞密度)を生成させた。軟骨細胞−アルギネート溶液のアリコートを直径9mmの円形の型(mold)に移し、そして型の底の半透膜を通じて塩化カルシウム(calcium chloride)溶液の拡散によって、室温で重合させた。ゲルは、高さ2mmおよび直径9mmの寸法のディスクを形成した。
単離された軟骨細胞懸濁液の250μlのアリコートを、750μlの2%(w/v)アルギン酸ナトリウム溶液(0.1M K2HPO4、0.135M NaCl、pH 7.4)と混合した。125μlのアリコートを、孔径0.45μmの半透膜を有する直径9mmの細胞培養注入物中に置いた。細胞−アルギネート混合物を、30mM CaCl2の浴に接触させ、そして37℃で90分間重合させた。90分後、細胞−アルギネートゲル構築物を型から取り出し、そしてそれは直径9mmおよび高さ2mmを有していた。ディスクを24ウェル組織培養プレートのウェルに入れ、そして5%CO2の存在下、HammのF−12培養培地(Gibco、Grand Island、N.Y.)および10%子ウシ胎児血清(Gibco、Grand Island、N.Y.)を含む0.5mlの溶液で、L−グルタミン(L−glutamine)(292μg/ml)、ペニシリン(penicillin)(100U/ml)、ストレプトマイシン(streptomycin)(100μg/ml)およびアスコルビン酸(ascorbic acid)(5μg/ml)と共に、48時間、37℃でインキュベートした。
上述の方法論を用いて、ウシ骨芽細胞を軟骨細胞に代用し、そしてヒドロゲルマトリックスを用いて動物に注入した。
上記のように細胞−アルギネート構築物を作製することによって、ヒドロゲルマトリックスを用いてカプセル化された細胞を宿主の免疫系から立体化学的に(sterically)単離し得、そのようにして、同種異系細胞の移植片で、免疫抑制なしで、新しい組織または器官を形成することが可能となる。
(細胞培養:)
ヒト組織由来。 ヒト膀胱組織検体を、ボストンのChildren’s Hospitalにおける外科的除去から得、そして1時間以内に処理した。検体は1cm2から4cm2の範囲で大きさが異なっていた。検体を、10mMのHEPESおよびI00KIUのアポタンパク質を含むハンクスの平衡塩溶液に移した。
れらを、10%ウシ胎児血清を補充した10mLのDMEMを入れた100mmの組織培養皿中で、体外移植片として用いた。同様の大きさの約30個の体外移植片を、各皿に加えた。培地を1週間に2回変えた。体外移植片を培養中に置いてから72時間後に、成長(outgrowth)をルーチンで観察した。培養物が80%コンフルエントになった時点で、細胞をトリプシン処理し、そして継代した。細長い、横紋のある細胞が高度に濃縮された細胞集団を、この方法を用いてルーチンで得た。細胞株をa−アクチン抗体によって染色し、それらの筋肉表現型を確認した。
22ゲージの針を用いて、20匹のヌードマウスに、筋肉細胞およびアルギネート溶液を500μl注入した。各マウスは、対照用および1ccのアルギネート当たり1000万個のヒト膀胱細胞溶液用(32注入部位)からなる2つの注入部位を有した。アルギネート単独または膀胱筋細胞単独の注入を対照とした。移植後2、4、6、および8週目に動物を屠殺した。注入領域の組織学的試験は、筋肉/アルギネート注入部位における筋肉形成の証拠を示した。抗desmin抗体を用いる免疫組織学的分析は、その細胞が筋肉分化のプログラムを維持していたことを示した。時間を経た注入部位の検査は、アルギネートが漸進的に筋肉によって置き換わることを示した。筋肉−アルギネート複合体の大きさは、均一で安定しているようであった。2つの対照グループ(アルギネート単独および筋肉細胞単独)においては、筋肉細胞は明らかではなかった。離れた器官の組織学的分析は、膀胱筋細胞またはアルギネートの移動、または肉芽腫の形成の証拠を示さなかった。
(材料および方法)
(膀胱尿管逆流の動物モデル)
ブタとヒトとの間の膀胱および腎臓の類似性により、ブタをこの研究に用いた。Hanford mini−pigを、その小さいサイズという簡便さの故に用いた。開腹(open)膀胱技法を用いて両側面の膀胱尿管逆流を4匹のミニブタに作製した。この技法は、Vacantiらによる「軟骨細胞が接種された合成ポリマーは、新しい軟骨形成の鋳型を提供する」、Plastic and Recon.Surg.88:753(1991)に記載されたように、全ての膀胱内部の尿管の覆いをはがすことからなる。
膀胱筋肉切片を各動物から得た。筋肉細胞を採取し、インビトロで別々にプレート化した。増殖の後、その細胞を個々に定量し、そして1cc当たり20×106細胞に濃縮し
た。
2%w/vアルギン酸ナトリウム(0.1M K2PO4、0.135M NaCl、pH7.4、Protan、Portsmouth、NH)を作製し、エチレンオキサイド(ethylene oxide)中で滅菌した。20×106細胞/mlの膀胱筋細胞懸濁液の1.5mlのアリコートを、最終アルギネート濃度が1%になるように同容量のアルギン酸ナトリウムに添加した。膀胱筋細胞−アルギン酸ナトリウムの懸濁液を32℃に保持した。注入直前に硫酸カルシウム(0.2g/ml)を膀胱筋細胞−アルギン酸ナトリウム懸濁液に添加した。この混合物をボルテックスして混合し、そして注入まで氷中に保持した。ゲル化プロセスは、硫酸カルシウムの添加により開始し、その懸濁液は約40分間の間液体状態にある。
ミニブタに筋肉内注射により25ml/kgケタミン(ketamine)、および1ml/kgアシルプロマジン(acylpromazine)で麻酔した。別の麻酔は25mg/kgケタミンおよび10mg/kgキシラジン(xylazine)の筋肉内投与により得た。動物を仰向けにおいた。15.5 French膀胱鏡を膀胱に挿入し、21ゲージ針を右側の逆流尿管の尿管下領域に挿入した。約2〜3mlのオートロガス膀胱筋細胞−アルギネート懸濁液(40〜60×106膀胱筋細胞)を、尿管開口部を持ち上げながら内視鏡により視て、針を通じて注入した。左側の尿管開口部は処置しないままにし、対照とした。一連の膀胱造影、膀胱鏡、および排泄尿路造影研究を、屠殺まで8週間間隔で行った。ミニブタを、処置後の8週目(1)、16週目(1)および26週目(2)に屠殺した。膀胱注入部位を切除し、肉眼でおよび顕微鏡で検査した。検体をヘマトキシリン(hematoxylin)およびエオシン(eosin)、およびpH1.0および2.5のアルシアンブルーで染色した。膀胱尿管、局所リンパ節、腎臓、肝臓、および脾臓の組織学的分析を行った。
4匹のミニブタが両側面の逆流を受けた。4匹全てが、処理の3ヶ月後で障害の証拠がなく両側面の逆流を有することが見出された。膀胱筋細胞は、それぞれの各ミニブタに由来し、インビトロで増殖された。次いでこの動物を、注入可能なオートロガス膀胱筋細胞−アルギネートゲル溶液を用いて逆流の内視鏡的修復を右側のみに行った。
オートロガス膀胱筋細胞は、容易に採集され、インビトロで増殖され、そして膀胱鏡的に注入され得る。この細胞は生存し、そして非免疫原性の筋肉核(muscle nidus)を形成する。この系は、いかなる障害の証拠も示さずに、逆流を矯正し得る。
ヒアリン軟骨を仔ウシの肩の関節表面から得、そして軟骨細胞を採取した。軟骨細胞懸濁液を20、30、および40×106細胞/ccまで濃縮し、そして乾燥アルギネート粉末と混合し、ゲルを形成した。12匹の無胸腺マウスに、軟骨細胞/アルギネート溶液を皮下注射した。各マウスは、対照、10、15、および20×106軟骨細胞からなる4つの注入部位を有した(48注入部位)。マウスを、注入後2、4、6、および12週で屠殺した。
動物−若い成熟無胸腺nu/nuマウスを細胞受容体として用いた。動物は、個々に飼育され、所望のとおり食糧および水に接近でき、そして12時間の照明および暗闇の間隔で維持した。麻酔を麻酔吸入器投与によりメトキシフルラン(methoxyflurane)で行った。
ロリットルの細胞懸濁液を皮下注入した。
図1aは、用いた一般方法の概略図である。注入部位の組織学的検査は、36の軟骨細胞/アルギネート移植片のうち34で軟骨形成の証拠を示した。軽い炎症応答は、4週間までに解消しているようであった。これは、急性期のおよび慢性の異物身体反応を示す炎症応答からなった。線維芽細胞浸潤は、注入後2週間まで見られた。増殖期の注入部位の全体検査は、ポリマーゲルが、累進的に軟骨により置換されることを示した。全体検査は、正常に見える、ゴム状から硬質の軟骨構造を示した。形成された軟骨の最終サイズは、注入された最初の容量および軟骨細胞の濃度に関連するようであり、そして各カテゴリー内で均一であるようであった。回復した軟骨構造の重量は、持続的に安定であるようであった。6つのポリマーゲル対照注入では(軟骨細胞を含まない)、軟骨形成の目に見える証拠はなかった。第二の対照グループでは(軟骨細胞懸濁液単独)、軟骨形成は、どこの部分でも明らかでなかった。注入周辺部位および離れた器官の組織学的分析は、軟骨の証拠またはアルギネートゲル移動を示さなかった。
(材料および方法)
膀胱尿管逆流の動物モデル。 ブタとヒトとの膀胱および腎臓の間の類似性により、ブタをこの研究に用いた。Hanfordミニブタをそのより小さなサイズの便利さにより用いた。両側面の膀胱尿管逆流が、開腹膀胱技術を用いて4匹のミニブタで作られた。その技術は、Vacantiら、「軟骨細胞を接種した合成ポリマーは、新たな軟骨形成の鋳型を提供する」Plastic and Recon. Surg. 88:753(1991)に記載のように、膀胱内尿管の全体の覆いを取ることからなる。
細胞懸濁液を最小必須培地−199(Gibco)中に40×106細胞/mlまで濃縮した。
French膀胱鏡を用い、22ゲージの針を右の逆流尿管の尿管下領域に挿入した。内視鏡で見て尿管口を持ち上げながら約2〜3mlのオートロガス軟骨−アルギネート懸濁液(40〜60×106軟骨細胞)を針を通じて注入した。左の尿管口は未処理のままにし、そして対照として供した。一連の膀胱造影、膀胱鏡検査、および排泄尿路造影研究を屠殺まで8週間間隔で行った。ミニブタを処置後8週(1)、16週(1)、および26(2)週で屠殺した。膀胱の注入部位を切除し、そして肉眼および顕微鏡で検査した。検体をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そしてpH1.0および2.5でアルシアンブルーで染色した。膀胱、尿管、局部リンパ節、腎臓、肝臓、および脾臓の組織学的分析を行った。
4匹のミニブタは、両側面の逆流の生成を経験した。4匹全ては、処理後3カ月で障害の証拠なしに両側面の逆流を有することが見出された。軟骨細胞を各ミニブタの左耳表面から採取し、そしてインビトロで5〜8週間増殖させ、動物1匹につき50〜150×106生存細胞の最終濃度とした。次いで、動物は、右側だけを注射可能なオートロガス軟骨細胞−アルギネートゲル溶液を用い、内視鏡を用いて逆流の修復を受けた。
軟骨細胞は、容易に成長し得そして培養液で増殖し得る。新規軟骨形成は、合成生分解性ポリマー上で培養された軟骨細胞を用いてインビトロおよびインビボで達成され得る。
これらの実験では、軟骨マトリックスは、生分解される多糖類ポリマーとしてアルギネートを置換した。6匹のミニブタは、両側面の逆流作成を経験した。6匹全てが処理後3カ月で障害の証拠なく両側面の逆流を有することを見出された。軟骨細胞を各ミニブタの左耳表面から採取し、そして動物1匹につき50〜150×106生存細胞の最終濃度まで増殖させた。次いで動物は、右側だけ注入可能なオートロガス軟骨細胞−アルギネートゲル溶液を用い、内視鏡を用いて逆流の修復を受けた。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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