CN112842618B - 一种小口径可降解复合人工血管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可降解复合人工血管和其制备方法，采用具有多孔亲水表面空管状基质和水凝胶组份构成，其中水凝胶填充基质的孔隙，基质和水凝胶可降解。基质的孔隙率50％‑99％，孔径为0.5μm‑200μm，可由抗凝组份修饰。水凝胶同时可负载药物、细胞、生物活性物质。该多孔水凝胶复合人工血管不仅具有优异的机械力学性能，还能够防止漏血、渗血，具有优异的短期和长期抗凝效果；降低动脉瘤发生率，具有募集宿主细胞，并且促进、调控自体组织再生的功能。本发明可降解人工血管的制备方法得到的管壁厚度均匀，制备过程简单，易于工业化生产，同时可以减少水凝胶的膨胀性能，增加生物活性，作为组织工程人工血管应用具有广阔的前景。

Description

一种小口径可降解复合人工血管及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用植入领域，尤其涉及一种小口径可降解复合人工血管及其制备方法。

背景技术

心血管疾病现已成为威胁人类健康的重大疾患之一，无论是发病率还是死亡率均居各类疾病之首。据世界卫生组织预测，到2030年全世界每年死于心血管相关疾病的人数会增加到2330万。我国心血管疾病发病人数随着人们生活习惯的改变、人口老龄化加剧也呈现逐年上升的趋势，如冠心病、下肢动脉硬化性闭塞症、慢性肾功能衰竭的透析治疗等血管疾病，常规有效治疗手段包括血管搭桥术和介入治疗。对于狭窄情况严重甚至于堵塞的血管，临床上主要采用血管搭桥，通常自体大隐静脉被视为血管移植的首选，但是使用时往往需要二次手术，这不仅造成了机体损伤还需要额外的费用，而且对于已经取用过大隐静脉的患者将出现无自体血管可用的尴尬境地。再者自体静脉血管移植到动脉上也可能因为血液动力学无法恰当匹配而出现各种问题，例如引发动脉瘤，吻合口增生，腔内再狭窄，动脉粥样硬化甚至血管钙化，最终导致的移植失败。随着生物医学及材料学等学科的不断进步与发展，组织工程人工血管应运而生，这为解决自体血管供应不足提供了新的解决思路。

目前临床使用的如ePTFE、Dacron、PU等人工血管主要是提供了较大的力学支撑，很好地作为大于6mm的大口径人工血管应用了几十年，但是这些血管都是由不可降解高分子材料构成，会长期在体内存在并引发包括再狭窄在内的各种不良反应。组织工程的理念进一步发展了人工血管的构建，该理念认为理想的组织工程支架应由可降解支架、种子细胞和生物活性物质构成，其中可降解支架可以在宿主自体细胞再生、进一步实现功能化后完全消失，极大程度上避免了植入物在体内长期存在所致的不良反应。另外，由于聚四氟乙烯、聚氨酯等原有人工血管材料本身的高疏水性，使其难以避免发生内膜增生甚至于二次狭窄。而且这些移植物往往不具有较大的孔隙和孔径，自体组织很难在植入部位重塑再生。有研究表明对于人工血管而言，10-20μm大小的孔径是较为有利于自体细胞的富集和迁移的，更为适宜的尺寸为100μm，但是大孔径很容易造成血细胞、血浆等成分的渗漏，移植初期出现血小板和纤维蛋白局部富集，引发急性血栓等不利状况。

水凝胶是一类由亲水性物质通过共价键、氢键、范德华力等作用交联形成的三维网络结构材料，具有性质柔软，含水量高，生物相容性好，易成型，形状大小可控等优点，然而水凝胶本身力学性能有限，单独使用并不能满足很多应用情景，而且水凝胶持续存在也往往对宿主的自体组织再生产生不利影响，因此，将可降解水凝胶引入可降解人工血管的结构中可以扬长避短，充分发挥两者的优势，从而实现移植后凝胶组分在中短期降解，支架组分在中远期降解，起到调控可降解人工血管的各组分分批次降解，宿主细胞渐进式再生，进而功能化的作用，这些优势使得可降解水凝胶复合人工血管在三维组织工程基质具有广泛的应用前景。

此外，对于与血液直接接触的人工血管而言，内表面粗糙度会直接影响血管中的血液动力学。简单涂覆、蘸取水凝胶所得的内表面极为粗糙不平。一方面这使得人工血管短期内可能引发凝血反应，出现急性血栓，造成人工血管移植失败；另一方面由于血流的持续冲刷可能使得内表面突出的水凝胶组分团状物会发生脱落，随着血液运行到全身，引发更小直径或毛细血管的堵塞。本发明采用插入填充物旋转的方式可获得表面光滑、副作用可控的人工血管，增强血液相容性，更有利于实现人工血管近期和远期的通畅。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种小口径可降解复合人工血管，具有优异的机械力学性能，同时防止漏血、渗血，分批次调节宿主细胞生长空间，并且促进、调控自体组织再生的功能；一种可降解水凝胶复合人工血管制备方法，能够使人工血管管壁均匀，内壁光滑，增强血液相容性，并且负载药物、生物活性物质和细胞。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种小口径可降解复合人工血管，由中空管状基质和水凝胶构成，基质具有多孔亲水表面，水凝胶填充基质的孔隙，基质和水凝胶均由可降解材料构成，水凝胶具有血液相容性。

可选地，可降解基质由高分子材料、天然生物材料之一或者两者共同构成。

可选地，基质的孔隙率为50％-99％，孔径为0.5μm-200μm。

可选地，基质的亲水表面由抗凝组份修饰，所述抗凝组分为肝素、水蛭素、透明质酸中的一种或两种以上构成。

可选地，可降解水凝胶由端基为双键的多臂聚乙二醇和多巯基或者多氨基化合物构成，双键和巯基或氨基摩尔比为0.6-1.4。

可选地，水凝胶中负载药物、多肽、生长因子、和细胞中的一种或者两者及以上。

一种制备上述小口径可降解复合人工血管的方法，其中中空基质内有填充棒状填充物，两者共同喷涂、粘取或者浸入水凝胶溶液，旋转棒状填充物，用改变温度、光照、浸泡溶液辅助形成水凝胶，静置至无液体流动后取出棒状填充物。

可选地，填充物旋转速度为5-150rad/min。

可选地，对小口径可降解复合人工血管进行冷冻干燥处理。

可选地，冷冻干燥处理后的小口径可降解复合人工血管浸泡在含有药物、多肽、生长因子中的一种或者两者及以上的水溶液中。

本发明的有益之处在于：

(1)可降解水凝胶复合人工血管基质具有较大的孔隙率和孔径，有利于自体组织 的重塑、修复和再生；

(2)小口径人工血管中管状基质和水凝胶具有不同的降解速度，可随时间提供宿 主细胞所需的生长空间，引导组织逐步再生；

(3)防渗血、漏血，抗凝组分于不同时间释放，具有优异的短期和长期抗凝效果；

(4)小口径人工血管的力学性能显著增强，减少血管瘤的发生率和血管破裂率，提 升安全性；

(5)小口径人工血管具有抗钙化、调控平滑肌细胞构型表达、募集自体细胞的多重 效果，调节自体组织修复、重塑、再生；

(6)制造工艺过程简单，易于工业化生产；

附图说明

图1是本发明的小口径可降解水凝胶复合血管制备示意图；

图2是肝素修饰聚己内酯基质和PEG小口径可降解水凝胶复合血管的力学柱状图；

图3是降解过程中肝素修饰聚己内酯静电纺丝基质支架和末端双键PEG-二硫代苏糖醇水凝胶复合基质支架断裂强力4周变化的折线图；

图4是小口径可降解水凝胶复合静电纺丝血管旋转涂胶和刷沾涂胶干燥后内表面扫描电镜图；

图5是基质、可降解水凝胶复合静电纺丝血管及负载肝素后的内皮细胞、平滑肌细胞增殖情况柱状图；

图6是肝素修饰聚己内酯基质和PEG小口径可降解水凝胶复合静电纺丝血管在大鼠腹主动脉移植的动脉瘤率折线图；

图7是末端双键PEG-二硫代苏糖醇小口径可降解水凝胶复合血管的大鼠移植6个月的H&E染色图；

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的介绍。

实施例1

盐析法制备的多孔中空管状聚乳酸(Mn＝130000)基质，长10cm，内径5mm，厚度3mm，配置0.1mol/L的NaOH水溶液，将基质浸没碱性溶液中37℃震荡36h，取出清洗，另外配置降冰片烯修饰的胶原30mg/mL，十八硫醇10mg/mL，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐1mg/mL，腐蚀后的基质内插入直径为4.8mm的长度为20cm的聚四氟乙烯棒浸没在该溶液中20min直到水凝胶前液充满基质孔隙，取出以转速20rad/min旋转在365nm紫外光下照射3min催化成胶，得到人工血管，该水凝胶复合血管内表面较为光滑。将该复合人工血管冷冻干燥，采用型号为TIME 3230，传感器型号为TIME3230标准传感器(4mm)粗糙度仪测得表面粗糙度为1.173μm。

实施例2

静电纺丝可降解聚氨酯(Mn＝60000，聚ε己内酯作为软段，六亚甲基二异氰酸酯作为扩链剂自行合成)接收距离20cm，溶剂N，N-二甲基甲酰胺，浓度20％，电压17kv，接收装置转速5rad/min，得到基质内径4mm的Y形管，其中Y形两个上段长度5cm，下段长8cm，厚度0.3mm，孔隙率约70％，孔径约2μm，配置多巴胺溶液浓度2mg/ml，PH为8.3的缓冲溶液，氮气保护將基质浸没在溶液中24h后，配置0.05g/ml透明质酸水溶液150ml，称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)0.5g和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.3g，冰水浴2h，将基质浸没在含透明质酸的水溶液20℃静置24h，取出水洗三次，冷冻干燥。另配置海藻酸钠的水溶液1％(含0.01mg/mL肝素钠)，氯化钙水溶液5％，将处理后的Y型管内放入可拆卸棒状物(外径3.6mm，单根长度10cm)，两者一同浸入海藻酸钠溶液中浸泡1h，再次浸入到氯化钙溶液中5min，取出旋转棒状物，以速度为40rad/min旋转0.5h，凝固成胶后得到可降解水凝胶复合人工血管，肉眼观察内部较为平整。

实施例3

将天然蚕丝浸泡在0.05％碳酸钠水溶液中脱胶，经过干燥后得到固体，再次用9mol/L溴化锂水溶液溶解，将水溶液放置在3500的透析带中使用去离子水透析96h，得到丝素蛋白水溶液。取自行合成的聚癸二酸丙三醇酯(Mn＝10000)和聚左旋乳酸(Mn＝50000)，按照质量比为1:3，采用六氟异丙醇配置成25％质量体积比的溶液，在30℃时，正电压20kv，接收距离15cm，采用直径为3mm棒状物接收，注射射泵流速2.5ml/h，静电纺丝4h，得到管状支架长10cm，厚0.2mm，使用含有5％己二胺的异丙醇溶液浸泡1h，去离子水清洗3次。称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)0.5g和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.3g，肝素钠0.2g在10ml的pH＝5.5的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液里，冰浴1h，将管状支架放入后，放置到室温静置24h，去离子水清洗3次，冷冻干燥。该支架内部中放置有长度20cm，外径2.8mm聚四氟乙烯的棒状物，两者同时浸泡在0.2g/ml丝素蛋白溶液中，依次加入12U/ml辣根过氧化物酶和15mg/ml双氧水在30℃进行交联10min，取出按照旋转速度35rad/min，处置0.5h得到复合人工血管，经过冷冻干燥后，再次在4℃下浸泡在富含内皮生长因子200ng/ml、肝素钠5mg/ml短肽(Arg-Glu-Asp-Val，REDV)200ng/mL的无菌水中2h，得到凝胶复合人工血管。采用型号为TIME3230，传感器型号为TIME3230标准传感器(4mm)粗糙度仪测得表面粗糙度为0.819μm。

实施例4

将聚ε-己内酯(Mn＝80000)经过盐析法制成孔径为30μm，孔隙率67％，内径4mm，长度为12cm厘米，厚度3mm的人工血管，浸泡在10％的己二胺的异丙醇溶液37℃震荡1h，取出后多次水清洗，配置水蛭素溶液1mg/ml，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.3g，羟基苯并三唑0.15g，冰浴1h，后在25℃反应24h，去离子水洗涤3次。配置无菌水溶液四臂聚乙二醇丙烯酸酯(4PEGA，Mn＝10000)165mg/ml，二硫代苏糖醇(DTT)3.64mg/ml，肝细胞生长因子50ng/ml，CD133浓度25ng/ml的溶液，内置有长度大于人工血管的聚四氟乙烯的棒状物浸入该溶液浸泡15min，取出后以速度65rad/min旋转40min，得到可降解水凝胶复合人工血管，内表面较为平整，凝胶经过溶血测试。采用型号为TIME3230，传感器型号为TIME3230标准传感器(4mm)粗糙度仪测得表面粗糙度为1.309μm。

实施例5

配置水解弹力蛋白2％，聚乳酸(Mn＝100000)10％的六氟异丙醇溶液，在30℃下，距离15cm，正压18kv，接收棒外径1.5mm，采用溶液静电纺丝，注射泵推动速率1.5mL/h，接收到长度为12cm，厚度为0.3mm的管状支架，内置长20cm，直径为1.3mm的聚四氟乙烯棒，配置含有1％的京尼平的乙醇溶液，将基质和棒状物浸入京尼平的乙醇溶液40min，取出于4℃静置12h，再配置50mg/ml的肝素钠溶液，在4℃浸入该溶液12h。再配置无菌水溶液四臂聚乙二醇丙烯酸酯(4PEGA，Mn＝5000)100mg/ml，端基为氨基的聚乙二醇(Mn＝1000)40mg/ml，将支架浸没在上述溶液中2h直至水凝胶前液浸润基质的孔隙，取出后维持转速100rad/min，环境温度40℃旋转4h，静置2h，冷冻干燥得到可降解水凝胶复合人工血管，目测内表面平整。取该支架1cm长移植入大鼠的肾下腹主动脉，平行实验为6只。3个月后，超声检查通畅率为100％，血管瘤发生率为0％。

实施例6

同轴静电纺丝内层20％ε-己内酯乳酸无规共聚物(己内酯：乳酸＝7:3，Mn＝100000)的六氟异丙醇溶液，外层胶原10％六氟异丙醇溶液，内核速度2ml/h，外层速度0.3ml/h，接收距离20cm，得到内径3mm，长度14cm，厚度0.2mm，干燥24h，取出管状支架，中空管状支架内插入2.8mm长20cm的金属棒，配置含有1.5％的京尼平的乙醇溶液，浸泡12h，配置含有0.05g/ml的肝素钠和0.02g/ml透明质酸溶液，再次浸泡12h，水洗数次得到人工血管前体，用无菌水溶液四臂聚乙二醇丙烯酸酯(4PEGA，Mn＝2000)100mg/ml，端基为氨基的聚乙二醇(Mn＝1000)71.42mg/ml，肝素钠5mg/mL,将金属棒和其上的人工血管前体浸泡在水凝胶前液溶液中1h至水凝胶前液充满基质孔隙，在37℃时按照120rad/min旋转3h，得到内表面光滑的可降解水凝胶复合人工血管。在血小板粘附实验中复合人工血管相对于基质能明显减少血小板吸附。在肝素钠透明质酸修饰的基质，仅含有水凝胶的管状支架以及负载肝素钠的水凝胶管状支架的表面分别种植10⁵个/mL浓度的人源内皮细胞、人源平滑肌细胞，发现含有肝素钠的凝胶组分明显抑制平滑肌细胞增殖。负载肝素钠的水凝胶复合人工血管在新西兰白兔进行左侧颈动脉移植，长度为3cm，1个月von Kossa结果显示该人工血管无钙化现象。

实施例7

取盐析法制备的聚ε-己内酯(Mn＝45000)和聚乳酸(Mn＝130000)(质量比3:7)人工血管，长度6cm，内径5mm，厚度0.5mm，孔隙率50％，孔径200μm，表面经过0.2mol/L的氢氧化钠水溶液在30℃浸泡震荡48h，取出后去离子水清洗，称取0.1g透明质酸、50mg水蛭素、EDCI0.1 g、NHS0.06 g配置pH5.3的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液冰水浴1h，人工血管浸没其中25℃搅拌24h，取出后水洗干燥。配置四臂聚乙二醇降冰片烯酯(Mn＝1000)0.33g，二硫代苏糖醇0.1g的pH7.4的水溶液5ml，将0.1μg内皮细胞生长因子、浓度为10⁵个/ml内皮细胞、2mg多肽(序列VPMSMRGG)和0.1g肝素钠混合其中，无菌情况下喷涂装置在人工血管的内表面均匀喷出水凝胶前液，插入内径为4.8mm长度为15cm的聚四氟乙烯棒，以15rad/min室温下在超净台上旋转25min，得到内表面光滑的可降解水凝胶复合人工血管。

实施例8

聚ε-己内酯(Mn＝80000)接收距离20cm，溶剂三氯甲烷：甲醇(体积比3:1)浓度20％，电压17kv，接收装置转速10rad/min，得到基质内径1.5mm，长度14cm，厚度0.3mm的中空管状物，该管状物压汞法的孔隙率约为87％，孔径5.6μm，浸泡在15％的己二胺的异丙醇溶液37℃震荡0.75h，取出后多次水清洗，配置低分子量肝素钠溶液60mg/ml，另外溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.3g，羟基苯并三唑0.15g在15ml pH为5.0的缓冲溶液中，将基质放入其中冰浴1h，后在25℃静置24h，去离子水洗涤3次，乙醇梯度脱水裁剪成1cm长的中空管并无菌真空干燥。配置无菌水溶液四臂聚丙烯酸乙二醇酯(Mn＝10000)165mg/ml，二硫代苏糖醇8.48mg/ml，在超净台上内置直径为1.2mm，长度为5cm的聚四氟乙烯实心棒，并以20rad/min速度旋转，将水凝胶前液均匀涂在管状支架外层，继续旋转1h，静置1h后，获得内表面较为光滑的复合水凝胶人工血管，部分凝血酶原时间检测水凝胶人工血管为47.3s，与基质没有显著性差异。水凝胶复合人工血管的缝合强度为2N，爆破压0.9MPa和断裂强力1.68MPa，均高于基质人工血管。将其用端-端吻合的方式移植到大鼠肾下腹主动脉，移植物长度为0.9mm，超声检测发现通畅率100％，6个月动脉瘤发生率为1/9，基质人工血管的动脉瘤发生率为4/7。

实施例9

采用静电纺丝的方法制备端基由肝素修饰的聚ε-己内酯(Mn＝80000)管状支架，具体条件为配置20％六氟异丙醇溶液，接收距离20cm，电压17kv，旋转接收速率为30rad/min，聚合物层使用金属棒接收，室温真空干燥12h，得到厚度为0.15mm，内径1.5mm，长度为10cm的管状血管支架。配置无菌水溶液八臂聚乙二醇降冰片烯酯(Mn＝2000)50mg/ml，赖氨酸24.365mg/mL，另外添加10⁴个/ml的大鼠平滑肌细胞和1mg/ml的短肽REDV和5mg/ml小牛血清白蛋白，将内径为1mm的，长为20cm的金属棒插入管状支架内腔，两者一并在室温浸泡在水凝胶前液中0.5h至充满基质孔隙，取出升温至37℃以转速20rad/min旋转2.5h，静置0.5h后得到内表面光滑的可降解水凝胶复合人工血管。该复合人工血管移植到大鼠的肾下腹主动脉，移植长度为1.2mm，平行试验为3只，1个月显示通畅率为100％，无动脉瘤发生，组织再生状况良好。

实施例10

取用新鲜猪心肌组织100g，PBS清洗后置入含有700mU/mL胃蛋白酶溶液500ml中72h，随后用等体积的0.1M的HCL溶解胃蛋白酶，细胞外基质(ECM)继续搅拌48h，直到获得均质液体，冷冻干燥将其4℃保存，该ECM水凝胶未发生溶血反应。采用溶液静电纺丝制备成多孔管状支架，具体条件为配置7％聚乳酸(Mn＝130000)的三氯甲烷溶液，接收距离15cm，电压17kv，接收棒直径4mm，旋转速率为10rad/min，注射泵推动速率为2ml/h，接收时长3h，获得厚度为0.24mm，长度为15cm中空管状支架，测得孔隙率为73％。将该支架在0.15mol/L的NaOH水溶液于37℃浸泡12h，pH7.4的磷酸缓冲液清洗3次，称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)0.6g和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.35g，肝素钠0.4g在10ml的pH＝5.5的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液里，冰浴1.5h，将管状支架放入后，放置到室温静置24h，去离子水清洗3次，冷冻干燥。无菌水配置5％的ECM溶液10ml，在肝素处理后的管状支架内部插入内径为3.5mm，长度为20cm的铝合金棒，合金棒以130rad/min速率保持旋转，喷雾装置将ECM水凝胶前液均匀喷到支架外表面，采用外部加热，迅速将温度升至37℃，继续旋转0.3h，至无液体流动，冷干后获得可降解水凝胶复合支架，内表面较为光滑。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.一种小口径可降解复合人工血管，其特征在于，由以下步骤制备得到：

步骤一、取质量比为3:7的聚ε-己内酯和聚乳酸，以盐析法制备得到人工血管，其中聚ε-己内酯的数均分子量为45000，聚乳酸的数均分子量为130000；以盐析法制备得到所述人工血管的长度为6cm，内径为5mm，厚度为0.5mm，孔隙率为50％，孔径为200μm；

步骤二、将步骤一得到的所述人工血管的表面经过0.2mol/L的氢氧化钠水溶液并在30℃浸泡震荡48h，取出后用去离子水清洗，得到碱处理人工血管；

步骤三、称取0.1g透明质酸、50mg水蛭素、0.1g EDCI和0.06g NHS配置到pH5.3的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，冰水浴1h后得到溶液A；

将所述碱处理人工血管浸没在所述溶液A中，并在25℃搅拌24h，随后取出碱处理人工血管并水洗干燥；

步骤四、取四臂聚乙二醇降冰片烯酯0.33g、二硫代苏糖醇0.1g配置得到5ml的pH7.4的水溶液，其中四臂聚乙二醇降冰片烯酯的数均分子量为1000；

将0.1μg内皮细胞生长因子、浓度为10⁵个/ml内皮细胞、2mg多肽和0.1g肝素钠混合在所述水溶液中，得到水凝胶前液，其中，所述多肽的序列为VPMSMRGG；

步骤五、在无菌情况下，采用喷涂装置在步骤三得到的人工血管的内表面均匀喷出所述水凝胶前液；插入内径为4.8mm、长度为15cm的聚四氟乙烯棒，并在超净台上以15rad/min的转速室温下旋转25min，得到内表面光滑的可降解复合人工血管。

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