CN115317671A - 一种壳聚糖基肝组织工程支架材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种壳聚糖基肝组织工程支架材料及其制备方法和应用，将葛根素或槲皮素与戊二醛、氧化蔗糖和壳聚糖溶液混合，进行聚合反应，反应所得产物冷冻干燥，得到壳聚糖基肝组织工程支架材料。本发明制备的壳聚糖@槲皮素/壳聚糖@葛根素支架材料具有更高的稳定性与力学性能，缩短支架具有良好的生物相容性、力学性能和稳定性，可以满足细胞接种支架并支持细胞在支架上生长；通过体外细胞实验结果得到，支架具有促进BMSC细胞增殖的作用，能在两周内支持BMSC生长并保证细胞拥有更加良好的形态与进一步分化成肝细胞所需的数目，可以缩短体外组织构建的周期，为肝组织工程支架构建提供了新的思路和方向。

Description

一种壳聚糖基肝组织工程支架材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及肝脏组织工程损伤修复领域，特别涉及促进骨髓间充质干细胞增殖以及分化为成熟肝细胞的壳聚糖基组织工程三维多孔支架及制备方法和应用。
背景技术
由于交通事故、组织创伤、先天畸形等原因，每年都有大量的组织或器官缺损患者需要紧急治疗。然而，供体短缺和移植排斥导致受损器官和组织供应严重不足，患者无法更换、修复和再生器官和组织，在器官短缺问题中，肝脏供体不足的问题尤为严重。
肝脏移植是从根本上治疗慢性肝病与肝功能衰竭的方法，其他方法包括细胞治疗、自体移植、异基因移植、异种移植和人工假体，但是由于缺乏供体、免疫排斥、凝血治疗和有限的持久性，这些方法受到限制。另外干细胞直接注射在回复肌肉功能方面显示出良好的结果，但是由于直接注射法低活性、缺乏形成细胞外基质(ECM)潜能以及注射后血管生成的能力差等方面，需要进一步发展。因此，组织工程学科应运而生。
20世纪80年代末，组织工程作为一门新兴的交叉学科崛地而起，也是修复和再生医学中一种很有前景的解决方案，近10年来，有越来越多的研究报道，包括多种组织、器官体外再造的研究方面取得突破性进展，代表性的包括骨组织修复、组织血管再生、皮肤修复。为了满足日益增长的组织修复需求，研究已从组织置换转向组织再生。组织工程的目标是通过支架、生长信号和种子细胞的协同作用来替换、修复和再生目标缺损组织。组织工程学是材料工程、生命科学、医学和计算机建模的原理、技术和方法的结合，旨在构建生物医学应用和再生医学的多学科方法，并通过适当的模型和适当的技术实现治疗效果，组织工程的目标是通过支架、生长信号(生长因子)和种子细胞的协同作用来替换、修复和再生靶缺陷组织，三要素之间的相互作用关系及常见的应用如图所示(图1)。
组织工程支架主要包括天然材料(胶原蛋白、明胶、透明质酸等)。合成材料(聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、羟基磷灰石等)。然而，由于天然材料的机械强度低，合成材料的生物相容性差，单一材料的性能难以满足支架的要求。壳聚糖因其无毒、高生物相容性、抗菌、抗炎等优异的物理、化学和生物学性能而受到研究人员的青睐。
但是，由壳聚糖制备的组织工程支架，对骨髓间充质干细胞(BMSC)生长促进作用有限，且稳定性和力学性能有限。
发明内容
为了解决上述现有技术的问题，本发明提供一种壳聚糖基肝组织工程支架材料及其制备方法和应用，具有更高的稳定性与力学性能，并能很好的促进BMSC生长、增殖、分化。
本发明通过以下技术方案实现：
一种壳聚糖基肝组织工程支架材料的制备方法，将葛根素或槲皮素与戊二醛、氧化蔗糖和壳聚糖溶液混合，进行聚合反应，反应所得产物冷冻干燥，得到壳聚糖基肝组织工程支架材料。
优选的，所述壳聚糖溶液的制备方法为：将壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，得到壳聚糖溶液。
优选的，氧化蔗糖的制备方法为：将蔗糖和高碘酸钠溶解于水中，搅拌，然后加入氯化钡，搅拌析出沉淀，分离沉淀，留取上清液，得到氧化蔗糖。
优选的，聚合反应在室温下进行。
优选的，聚合反应时间为25-30min。
采用所述的制备方法得到的壳聚糖基肝组织工程支架材料。
一种接枝碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖基肝组织工程支架材料，在所述的壳聚糖基肝组织工程支架材料上接枝接枝碱性成纤维细胞生长因子得到。
所述的壳聚糖基肝组织工程支架材料在细胞培养中的应用。
优选的，所述细胞为骨髓间充质干细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明利用壳聚糖作为支架主体材料，利用戊二醛和氧化蔗糖作为交联剂，将葛根素或槲皮素交联到壳聚糖上构建的肝组织工程支架。本发明制备的壳聚糖@槲皮素/壳聚糖@葛根素支架材料经过理化性质表征，证明相较于未添加葛根素和槲皮素的壳聚糖支架具有更高的稳定性与力学性能，缩短支架具有良好的生物相容性、力学性能和稳定性，可以满足细胞接种支架并支持细胞在支架上生长；通过体外细胞实验结果得到，支架具有促进BMSC细胞增殖的作用，能在两周内支持BMSC生长并保证细胞拥有更加良好的形态与进一步分化成肝细胞所需的数目，可以缩短体外组织构建的周期，为肝组织工程支架构建提供了新的思路和方向。
本发明在接枝碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架上观察到细胞大小、数目、密度相对更高，BMSC在支架上多层生长，说明接枝的碱性成纤维细胞生长因子具有良好的促进细胞在支架材料上粘附及增殖的作用。
附图说明
图1支架材料、生长因子和种子细胞的相互作用；
图2支架的傅里叶红外(FT-IR)图；
图3支架的扫描电镜(SEM)表征图；
图4支架的3D轮廓扫描表征图；
图5支架孔隙率表征；
图6支架孔隙大小表征；
图7支架的热水溶蚀率表征；
图8支架的吸水膨胀率表征；
图9支架的机械性能表征；
图10支架的热稳定性表征：a为单体壳聚糖支架、b为聚合壳聚糖支架、c为壳聚糖/葛根素支架、d为壳聚糖@葛根素支架、e为壳聚糖/槲皮素支架、f为壳聚糖@槲皮素支架；
图11接枝支架的细胞的CCK-8染色实验；
图12接枝支架的细胞的CV染色实验；
图13免疫荧光实验检测。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。
本发明采用的材料、试剂与仪器
1、细胞株
大鼠骨髓间充质干细胞(bMSCs)，购自西安华仁生物科技有限公司(许可证编号：SYXK(陕)2020-005)购买8周龄SD雌性大鼠，动物实验单位为西安交通大学医学部实验动物中心。质量检测单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物处理均符合国家已发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。
2、主要试剂
壳聚糖2000，葛根素/槲皮素，斯普瑞商城；蔗糖，高碘酸钠，广州源晶生物公司；24孔聚苯乙烯组织培养基板，为美国Corning康宁公司产品；普通动物饲料，西安交通大学医学部实验动物中心；DMEM低糖培养基，斯普瑞商城，美国Gibco公司；澳洲胎牛血清FBS，美国Gibco公司；胰蛋白酶美国Thermo Fisher公司；青链双抗中国solarbio公司；CCK-8试剂盒北京索莱宝科技有限公司；戊二醛、醋酸、氯化钡、无水甲醇、氢氧化钠、乙醇，中国solarbio公司；动物组织总RNA提取试剂盒北京索莱宝科技有限公司。
3、仪器
中国蔡司Gemini SEM 500场发射扫描电子显微镜；日本麦奇克拜尔BELSORP-Max全自动快速比表面与孔隙度分析仪，德国NETZSCH/耐驰STA449F5同步热分析仪；德国徕卡Leica TCS SP8 STED 3X超高分辨激光共聚焦显微镜；中国贝克曼CytoFLEX流式细胞仪；美国Bruker VERTEX70红外光谱仪；Sigma32184高速冷冻离心机；CD-269/HC-20℃冰箱容声；MDF-328E超低温冰箱(-80℃)SANYO；DK-8D数显恒温水浴锅、双向磁力加热搅拌器；ES-高压消毒锅TOMY；PL403电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司；微型离心机北京启维益成科技有限公司；FM40雪花制冰机北京长流科学仪器公司；高速离心机Hitachi Koki Co.Ltd；Elx800酶标仪、ODYSSEY扫膜仪基因有限公司；超净工作台广州科桥实验技术设备有限公司；DNP-9272电热恒温培养箱苏州威尔实验用品有限公司。
实施例1壳聚糖@葛根素支架材料的制备
(1)壳聚糖溶液的获得
称取1.0g壳聚糖粉末，将其溶解于浓度为2％的50ml醋酸溶液中，搅拌均匀至壳聚糖完全溶解，得到透明壳聚糖溶液。
(2)制备氧化蔗糖交联剂
按比例称取10.26g蔗糖和19.50高碘酸钠溶解于300g去离子水中，在25℃条件下搅拌24h，然后加入11.20g氯化钡，并在4℃条件下搅拌1h以保证充分沉淀。然后将混合液过滤，留取滤液为澄清透明且包含质量分数为6％的氧化蔗糖，放置在4℃条件下保存待用。
(3)交联葛根素
称取0.25g的葛根素，加入4ml的2％戊二醛溶液与1.0g的壳聚糖溶液相混合，加入2mL的氧化蔗糖交联剂加强交联稳定性，室温下搅拌30min，制得壳聚糖@葛根素，可4℃冰箱静置24h后得到壳聚糖@葛根素支架保存。
另外，作为对照，将同比例的葛根素与壳聚糖溶液混合，不添加交联剂，制得壳聚糖/葛根素组，可4℃冰箱静置24h后得到壳聚糖/葛根素支架保存。作为对照，将4ml的2％戊二醛溶液与1.0g的壳聚糖溶液相混合，加入2mL的氧化蔗糖交联剂反应，得到聚合壳聚糖支架。
作为对照，单体壳聚糖支架：将制备好的壳聚糖溶液等量置入96孔培养板中，60℃水浴1h后得到黄色半透明胶样壳聚糖胶体，置于4℃保存；将制备好的壳聚糖胶体置于-20℃冷冻30min冷冻干燥24h后，获得黄色半固体样壳聚糖水凝胶。将壳聚糖水凝胶进行冷冻干燥48h，制得单体壳聚糖支架材料，取出后继续浸入无水甲醇/氢氧化钠溶液24h，冻干后取出继续浸入含50mmol/L的EDC、18mmol/L的NHS的体积分数95％乙醇溶液中，去离子水冲洗，干燥得单体壳聚糖支架。
实施例2壳聚糖@槲皮素支架材料的制备
(1)壳聚糖溶液的获得
称取1.0g壳聚糖粉末，将其溶解于浓度为2％的50ml醋酸溶液中，搅拌均匀至壳聚糖完全溶解，得到透明壳聚糖溶液。
(2)制备氧化蔗糖交联剂
按比例称取10.26g蔗糖和19.50高碘酸钠溶解于300g去离子水中，在25℃条件下搅拌24h，然后加入11.20g氯化钡，并在4℃条件下搅拌1h以保证充分沉淀。然后将混合液过滤，留取滤液为澄清透明且包含质量分数为6％的氧化蔗糖，放置在4℃条件下保存待用。
(3)交联槲皮素
称取0.25g的槲皮素，加入4ml的2％戊二醛溶液与1.0g的壳聚糖溶液相混合，加入2mL的氧化蔗糖交联剂加强交联稳定性，室温下搅拌30min，制得壳聚糖@槲皮素，可4℃冰箱静置24h后得到壳聚糖@槲皮素支架保存。
另外，作为对照，将同比例的槲皮素与壳聚糖溶液混合，不添加交联剂，制得壳聚糖/槲皮素组，可4℃冰箱静置24h后得到壳聚糖/槲皮素支架保存。
实施例3
(1)配置20ml DMF/PBS(4:1)溶液；
(2)称量琥珀酰亚胺基4-叠氮基苯甲酸酯7.39mg溶于10ml DMF/PBS溶液中；
(3)稀释得终浓度为7.39×10-3mg/ml的溶液；取1ml加入棕色瓶中，加入5μg bFGF与4ml DMF/PBS溶液，反应总体积为5ml；4℃磁搅拌48h；超滤管超滤：4℃，4000rp/min，1h离心，循环6次，循环间隔0.5h；加入0.4ml PBS，配成10ng/μl药品；
(4)取0.1ml药品，加入0.9ml PBS，成1ng/ml；分装，4℃保存。
(5)将药品滴在支架上，自然风干(避光)，后置于光学装置中，365nm，3w功率紫外光照射2min，形成生长因子接枝修饰支架；
按照该方法分别在壳聚糖@葛根素支架接枝碱性成纤维细胞生长因子，在壳聚糖@槲皮素支架接枝碱性成纤维细胞生长因子。
作为对照，分别在单体壳聚糖支架、聚合壳聚糖支架、壳聚糖/葛根素支架、壳聚糖/槲皮素支架上接枝碱性成纤维细胞生长因子。
本发明制备的支架材料的表征
1、红外检测
将支架碾碎后和KBr在干燥机中进行干燥处理，将1.5mg试样与200mg纯KBr混合并研磨均匀，并将混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响。将混合物置于模具中，在油压机上用10MPa压力将混合物压成透明薄片，上机待定；同时，将空白支架与经过修饰的支架进行干燥处理，上机测定。
如图2结果表明，普通壳聚糖的红外特征峰和其后经修饰的材料存在不同，单体壳聚糖在经过戊二醛的交联后产生聚合壳聚糖，随后分别通过物理沉积(壳聚糖/葛根素，壳聚糖/槲皮素)和化学交联(壳聚糖@葛根素，壳聚糖@槲皮素)的方法与葛根素和槲皮素构建三维支架材料；单体壳聚糖的红外特征峰和聚合壳聚糖的基本一致，差异在于3250cm-1-3400cm-1之间的-OH键峰；与聚合壳聚糖支架相比，通过化学合成的壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架在3200cm-1处有较大的变化，峰普遍变大。结果初步断定，壳聚糖与葛根素/槲皮素成功交联，葛根素和槲皮素分别成功的修饰在壳聚糖表面。
2、扫描电镜观察
将多组壳聚糖基支架进行自然风干，将风干后的支架样品粘贴固定于样品台上并做喷金处理，将样品置于扫描电镜样品室内，将样品室抽成真空，进行扫描电镜观察。
如图3所示，上下两行图分别为聚合壳聚糖支架、壳聚糖@葛根素支架、壳聚糖@槲皮素支架在不同倍数下电镜图片。第一行是三种支架材料在扫描电镜×500的结果，第二行是×1000倍数的放大区域。第一列图片为聚合壳聚糖支架在×500和×1000倍数下的电镜图片，上图中白色边框中的部分经过放大处理即得到下面的扫描电镜图，在第二列、第三列的壳聚糖@葛根素以及壳聚糖@槲皮素支架的扫描电镜图片中，放大倍数处理方式同理。
扫描电镜结果可以看出三种支架材料形貌并不完全相同，有相连通的孔隙且孔径大小合适。聚合壳聚糖支架的扫描电镜结果显示，支架的孔径由于支架断裂的关系，可以看到呈现不规则的形状和大小，放大后可看到聚合壳聚糖支架的孔径大小满足细胞生长的要求。
在壳聚糖@葛根素以及壳聚糖@槲皮素两种支架的扫描电镜图片中，可以看到较为清楚的分层式断面结构，并且孔隙大小及形状更加适合细胞生长，孔隙有很好的连通性，可以满足细胞迁移活动的需求。除此之外，三种支架材料的扫描电镜图初步证明，支架的表面的粗糙面，这有更利于细胞粘附在支架表面上进行生长、增殖、分化等一系列细胞行为。总体来说，三种支架孔隙率较高，且孔径形态满足壳聚糖@葛根素、壳聚糖@槲皮素支架作为肝组织工程支架的要求。
3、表面粗糙度检测
使用3D轮廓仪(白光干涉模式)对壳聚糖基支架进行支架表面的检测。
如图4所示，a、b、c三个图分别为聚合壳聚糖支架、壳聚糖@葛根素支架、壳聚糖@槲皮素支架在3D轮廓仪(白光干涉模式)下进行的表面粗糙度检测。样品制备的二维规格为x：0.88mm，y：0.66mm，支架表面的粗糙度由颜色深浅表现，暗处为基础测试面，亮处为突出测试面。
由图可见，在a图中，支架粗糙度误差为0.99mm，且支架粗糙程度适中，有较大的粗糙平台。在b图中，支架粗糙度为0.52mm，支架粗糙程度较低，且大部分粗糙突出较为尖锐。在c图中，支架粗糙度为1.12mm，支架粗糙程度适中，有较大的粗糙平台和粗糙平面。综上所述，三种支架的表面粗糙度无明显差异，具有促进细胞粘附的功能。
4、孔隙率分析
支架作为细胞生长的支撑和环境，需要满足细胞在支架上生长所需要的必要条件，其中之一就是支架材料内部空间必须要有足够的空间来满足细胞生存，包括细胞代谢活动等重要环节，所以支架内部具有足够的空间是组织工程支架必须要满足的条件。为测定支架的孔隙率，这里使用阿基米德法、以95％乙醇在量筒中进行五次测定，取平均值并计算方差，所得六组实验组的数据测量制成如图结果。
支架的孔隙率使用下面公式计算：
P＝(m2-m1)/(m2-m3)
其中，m1为支架的干重，m2为支架吸饱乙醇后的质量，m3为支架浮于乙醇中的质量。
如图5所示，将支架材料分为六组，通过模具制备成大小和形状尽量完全相同的正方体，并进行孔隙率的测定。六组样品进行孔隙率测量的条件均没有差别。处理上述数据所得结果如图所示，孔隙率处于50％-80％之间，最高为壳聚糖组为82％，最低为壳聚糖/槲皮素组为56％。结果表明实验组孔隙率适中，适合细胞生长，且满足吸附增殖的要求。
5、支架孔隙大小表征
具体来说，制备生物支架对其中的孔隙大小要求较高，一般的细胞直径约为10-50μm，如果支架的孔径是上百微米，那细胞在支架上面，就和在平面上一样，无法贴合生长。另一方面，组织工程一般会采用水凝胶材料作为生物墨水，而水凝胶的孔隙又特别小。材料中的高分子链纠缠在一起，会形成非常多的孔隙，就像海绵一样，只不过水凝胶的孔隙尺寸一般在10～100nm之间。
不同组成的三维多组分多孔支架的SEM显微照片和孔径大小分析结果显示，随着葛根素和槲皮素进入支架中，支架的微观结构相互连接，并不影响多孔支架的微观结构互联。单体壳聚糖、聚合壳聚糖、壳聚糖/葛根素、壳聚糖@葛根素、壳聚糖/槲皮素、壳聚糖@槲皮素三维多孔支架的平均孔径分别为63.42-14.54μm、62.75-14.93μm、79.08-15.69μm、69.17-8.74μm、69.42-16.17μm和89.92-19.81μm(图6)。增加葛根素和槲皮素进入支架后，对支架的平均孔径无显著影响。壳聚糖/葛根素、壳聚糖@葛根素、壳聚糖/槲皮素、壳聚糖@槲皮素支架的平均孔径大小高于单体壳聚糖、聚合壳聚糖支架。
因此，可以得出随着葛根素和槲皮素进入支架，支架的平均孔径增大，平均孔隙大小满足各种壳聚糖三维多孔支架处于50-200μm的要求。
6、热水溶蚀率分析
支架材料的热水溶蚀率可以显示支架在人体内温度条件下的溶蚀速率以及溶蚀率，从而可以简单的推测出支架在体内的存在时间，讲解速率等表现项目，与热稳定性实验以及吸水膨胀率互相弥补。
如图7所示，六组支架材料的热水溶蚀率位于3％-15％之间，尤其是经过化学交联的实验组支架于热水(37℃)中的稳定性较为良好，降解度较低，可以在体内稳定存在。对照组的单体壳聚糖组和聚合壳聚糖组的实验结果与本课题组之前的研究无显著性差异，在壳聚糖/葛根素和壳聚糖@葛根素以及壳聚糖/槲皮素和壳聚糖@槲皮素四个实验组中，未进行化学交联的壳聚糖/葛根素和壳聚糖/槲皮素组的热水溶蚀率较低，可能是因为支架各组分堆积在一起，并没有通过化学键形成一个整体，在实验准备阶段的清洗过程导致支架损失较多。而壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素经过化学交联反应后形成一个整体，在清洗阶段并未有大量的材料损失，可能是因为支架处理时不到位，干燥不彻底导致支架上有些许水分残留，从而改变了支架的热水溶失率结果显示。热水溶失率均低于15％，对于支架整体的质量和体积可忽略，而相对于吸水膨胀率的结果数据呈现更为稳定。
7、吸水膨胀率
支架材料的吸水膨胀率可以显示支架材料在体内，尤其是当支架材料需要与体内各种体液或组织液接触时，支架吸水情况及支架材料的体积变化可以通过吸水膨胀率的变化来反映。
本实验结果是在本实验室的研究条件下完成的。如图8所示六个实验组的支架材料吸水膨胀率位于2％-25％之间，其中单体壳聚糖组的吸水膨胀率较低，在5％之下，而聚合壳聚糖组较高，达到了25％，可能是由于准备实验处理不完善造成的。而实验组中壳聚糖/葛根素和壳聚糖@葛根素以及壳聚糖/槲皮素和壳聚糖@槲皮素中，吸水膨胀率较为稳定，满足孔隙率实验结果，其中壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素两个实验组结果满足实验预期，为10％左右。这一现象说明本支架的膨胀稳定性较为良好，可以在体内稳定存在，总体趋势为上升趋势，此现象可能是由于支架内部孔隙率过高，且支架吸水性能良好，造成支架吸水膨胀。支架孔隙率虽然满足细胞增长的最适范围，但支架吸水膨胀率过高可能会支架孔隙率对造成一定的影响，合适的内部孔隙率才能够为细胞生长分化代谢提供充足空间。
8、支架的力学性能表征
本实验结果是在华南理工大学分析测试中心所得，所用仪器为日本的AG-IC 50kN型号电子万能试验机。支架材料的机械强度是组织修复的重要前提之一，要保证支架在移植过程后在体内可以支撑空间，并且满足细胞在支架材料上进行一系列的细胞活动，尤其是体内实验的支架材料对机械性能的要求更加严格。
如图9所示，为本研究的三个实验组(聚合壳聚糖、壳聚糖@葛根素、壳聚糖@槲皮素)支架力学机械性能表征结果。
图中数据显示，样品组数据呈现为不规则现象，并且趋势曲线的最高点说明三种支架的抗压缩能力最大分别为26.8382N，48.10N，32.61N，其他测量位点都在区间之内，证明支架的抗压缩能力在2-8N之间。
综上所述，壳聚糖@葛根素、壳聚糖@槲皮素相比于聚合壳聚糖支架力学性能提升，壳聚糖@葛根素、壳聚糖@槲皮素的抗压缩能力良好，即支架的力学性能可以满足细胞在支架上的正常生长、增值及分化活动所需的机械强度要求。
9、支架的热重表征表明支架具有良好的热稳定性
热稳定性是指该物质的耐热性，物体在温度的影响下的形变能力，形变越小，稳定性越高。试样在特定加热条件下，加热期间内一定时间间隔的粘度和其它现象的变化。
如图10所示，六组实验组的热稳定性无显著性差异。未加载葛根素和槲皮素的壳聚糖支架在81.71℃的时候降解了20％、剩余了80％的支架，而加载了葛根素和槲皮素的壳聚糖支架在降解20％、剩余80％时是194.94℃处，未加载葛根素和槲皮素的壳聚糖支架在194.94℃时，支架降解了33％、剩余67％左右，两支架在350℃时的降解量分别为30％、36％左右。
未加载葛根素和槲皮素的壳聚糖支架在温度为100℃左右以后，热稳定性较为良好，在温度升高至350℃时，降解了整体支架的大约10％，由此可见，加入葛根素和槲皮素之后的壳聚糖支架稳定性有所提高，并且在200℃之前较为明显。在人体或哺乳动物体内正常温度约37℃、最高约40℃的温度范围内，两支架剩余量接近100％完整支架，完全可以发挥其作用，支持支架上面细胞生长，生成组织或器官。
10、CCK-8染色实验
大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)，显微镜下观察BMSCs的形态应为梭形星状。用无菌的PBS缓冲液洗去贴壁不牢的细胞，用含胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液消化2min左右，加入等量低糖含血清DMEM培养液用灭过菌的滴管轻轻吹打，收集细胞悬液至无菌的离心管。1000r/min离心5min。弃去上清，接种至培养瓶中。放于37℃，5％CO2的培养箱中培养。当细胞融合达80％左右时，即可以1:2-1:3比例传代。
BMSCs的体外培养(在温度37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养)，将增殖旺盛、活力良好的细胞，按20*103/cm2接种，用0.01mol/L PBS洗涤两次后给予诱导，每两天换液1次，于诱导的21d收集将支架用紫外线消毒15min后置于24孔板中，向每孔中加入40μL的BMSCs。
如图11所示，从左到右依次空白对照组(无支架)、单体壳聚糖支架组、聚合壳聚糖支架组、壳聚糖/葛根素支架组、壳聚糖/槲皮素支架组、壳聚糖@葛根素支架组、壳聚糖@槲皮素支架组培养BMSC细胞后，收集细胞进行CCK-8染色的实验结果。
从图中可以看出，空白对照组、壳聚糖单体支架组、壳聚糖支架组的差距很小，且平行组之间波动较小，证明本实验中所用的孔板以及细胞无问题；壳聚糖/葛根素支架组的细胞活性略高于前三个组，其中接枝了生长因子的实验组稍高于未接枝生长因子的实验组；另外壳聚糖/槲皮素支架组、壳聚糖@葛根素支架组、壳聚糖@槲皮素支架组中接枝了生长因子的实验组的细胞活性均高于未接枝生长因子的实验组，说明接枝的碱性成纤维细胞生长因子具有良好的促进细胞在支架材料上粘附及增殖的作用；除此之外，支架中含有槲皮素的两个实验组的细胞活性明显高于其他实验组，尤其壳聚糖@槲皮素支架组的细胞活性，说明葛根素和槲皮素有明显的的促进细胞增殖的作用，其中槲皮素的效果最好，可以作为促进细胞在支架上增殖的有利条件，与CV结果比较吻合。
11、CV染色实验
如图12所示，从左到右依次空白对照组、壳聚糖单体支架组、聚合壳聚糖支架组、壳聚糖/葛根素支架组、壳聚糖/槲皮素支架组、壳聚糖@葛根素支架组、壳聚糖@槲皮素支架组培养BMSC细胞后，收集细胞进行的CV结晶紫染色的结果。
从图中可以看出，空白对照组、壳聚糖单体支架组、聚合壳聚糖支架组的差距很小，且平行组之间波动较小，证明本实验中所用的孔板以及细胞无问题；壳聚糖/葛根素支架组的细胞活性略低于前三个实验组，其中接枝了生长因子的实验组稍高于未接枝生长因子的实验组。造成原因可能是细胞收集过程，包括细胞消化不完全等操作或者染色过程中出现失误，影响了该实验结果；另外壳聚糖/槲皮素支架组、壳聚糖@葛根素支架组、壳聚糖@槲皮素支架组中接枝了生长因子的实验组的细胞活性均高与未接枝生长因子的实验组，说明接枝的碱性成纤维细胞生长因子具有良好的促进细胞在支架材料上粘附及增殖的作用；除此之外，壳聚糖@葛根素、壳聚糖@槲皮素两个支架组中的细胞数量明显高于其他实验组，尤其壳聚糖@槲皮素支架组，说明葛根素和槲皮素有明显的的促进细胞增殖的作用，可以作为促进细胞在支架上增殖的有利条件，与CCK-8结果较为吻合。
12、免疫荧光
24孔板中的细胞培养后，PBS溶液摇床清洗3次，每次5min后，采用4％多聚甲醛固定30min，PBS清洗后，将实验组一分为二：直接进行染色或消化细胞后制成细胞涂片(涂片方法：胰酶浸泡样本4min后，含血清培养液终止消化，滴管吹打支架，2500rpm/min离心收集细胞，涂布于载破片上)。0.2％Triton X-100透化20min；PBS再次清洗后，避光孵育荧光抗体Rb-PE(IF8，SCBT)和/或p53-FITC(DO-7，SCBT)，2h，DAPI染液孵育3min。PBS清洗，镜检。
另外，本发明对支架上接枝的细胞进行收集并通过免疫荧光实验检测ki-67的结果，如图13所示，为壳聚糖@槲皮素实验组的实验结果，a为染色结果，b为Ki-67的染色结果，代表被荧光抗体标记的细胞增殖；c是DAPI的细胞核染色结果，代表被荧光抗体标记的DAPI细胞核；d为a的灰度图。b中细胞亮度较强，说明细胞具有良好的增殖效果，并且DAPI染色核说明细胞并无不良反应，细胞核形态完好，细胞数量充足。
13、统计学分析
本实验采用Prism 5.01统计软件进行方差分析，死亡率用平均值表示，分析函数为LSD和Duncan，P<0.05表示差异显著。
本发明所制备的壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架具有为正常肝细胞附着所需的孔隙结构并使用天然材料合成，可以在保证材料本身与代谢物对细胞无害的前提下为细胞生长并在体外发育成完整组织提供支持，是一种可合成的、可标准化的、易于实现的体外培养人肝细胞培养体系。通过戊二醛和氧化蔗糖交联壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素并通过冷冻干燥的手段，合成了一种高度多孔的体外细胞培养结构，然后利用光接枝的手段接枝bFGF。本发明证明该支架相较于未添加葛根素和槲皮素的壳聚糖支架具有更高的稳定性与力学性能，并能在两周内支持BMSC生长并保证细胞拥有更加良好的形态与进一步分化成肝细胞所需的数目。在接枝bFGF的壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架上观察到细胞大小、数目、密度相对更高，BMSC在支架上多层生长，符合预期设想。我用冷冻干燥法合成壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架，这种方法可以再短时间内通过冻干水凝胶材料大批量生产大孔径支架，冷冻干燥法的原理冷冻干燥法制备组织工程支架可以保证支架孔隙率达到70％，与测定支架孔隙率结果相符。根据Cui Z等人的研究，60％以上的孔隙率可以支持细胞在支架上附着并生长，符合本发明对BMSCs在壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架生长检测的结果。
壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架利用戊二醛和氧化蔗糖交联剂通过形成酰胺键结合，根据SEM结果可以看出支架孔隙大小及孔隙率已经结合到支架中，由FTIR的结果也发现氧化蔗糖与葛根素和槲皮素间形成的酰胺键吸收峰存在，符合预期设想。而且壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架相较于壳聚糖支架在热重结果与力学性能尤其是抗压性能上均有明显提高，说明氧化蔗糖交联剂能良好实现壳聚糖分子交联同时提高壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架的稳定性从而在保证支架本身可以正常被人体降解吸收的前提下为肝细胞生长提供更稳定的结构支持。葛根素和槲皮素对BMSCs在支架上的生长具有促进作用，符合预期设想。
本发明使用bFGF接枝到壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架上来进一步为BMSC提供促进其生长的信号。细胞实验结果也表明bFGF接枝的壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架相较于未接枝任何生长因子的支架可以更好的促进BMSC的生长，同时相对于未接枝任何生长因子的壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架，在接枝了生长因子bFGF的壳聚糖@葛根素和壳聚糖@槲皮素支架上生长的BMSC的细胞大小、细胞密度都相对更大，符合预期设想，并为课题进一步使用其他生长因子辅助BMSC分化成肝细胞提供基础条件。
综上所述，壳聚糖交联葛根素和槲皮素从多个方面和角度出发，都更有利于细胞在支架上的生长分化，也更有利于细胞在体内顺利的生长，同时也有利于支架在体内所需要的稳定性及降解程度。

Claims (9)

1.一种壳聚糖基肝组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，将葛根素或槲皮素与戊二醛、氧化蔗糖和壳聚糖溶液混合，进行聚合反应，反应所得产物冷冻干燥，得到壳聚糖基肝组织工程支架材料。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖基肝组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的制备方法为：将壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，得到壳聚糖溶液。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖基肝组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，氧化蔗糖的制备方法为：将蔗糖和高碘酸钠溶解于水中，搅拌，然后加入氯化钡，搅拌析出沉淀，分离沉淀，留取上清液，得到氧化蔗糖。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖基肝组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，聚合反应在室温下进行。
5.根据权利要求1所述的壳聚糖基肝组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，聚合反应时间为25-30min。
6.采用权利要求1-5任一项所述的制备方法得到的壳聚糖基肝组织工程支架材料。
7.一种接枝碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖基肝组织工程支架材料，其特征在于，在权利要求6所述的壳聚糖基肝组织工程支架材料上接枝接枝碱性成纤维细胞生长因子得到。
8.权利要求6或7所述的壳聚糖基肝组织工程支架材料在细胞培养中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞为骨髓间充质干细胞。
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